Validering af A1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) ved metodesammenligning og holdbarhedsforsøg

Transkript

1 Professionsbachelorprojekt, University College Lillebælt Efteråret 2014 Validering af A1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) ved metodesammenligning og holdbarhedsforsøg Udført af: Sandra Gaedt Schmidt, SB511 Stud. Nr Klinisk Vejleder: Helle Isak Aadal Wihan, Bioanalytiker underviser, Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital Teoretisk vejleder: Tone Elisabeth Bernchou, Ajunkt, University College Lillebeælt, Odense Øvrige gruppemedlemmer: Lisa Maria Mathiesen, Camilla Thinggård Jacobsen og Ida N. M. Hausted Sandra Gaedt Hewlett-Packard Kilde: Antal anslag:

2 Resumé Baggrund: På KIA, OUH fænotypebestemmes donorprøver primært automatiseret på NEO (Immucor), mens A 1, Lu a og Lu b bestemmes manuelt. Afdelingen ønsker at bestemme disse, vha. Hæmagglutination Assay og Capture- R SELECT metoden på NEO (Immucor) én gang ugentligt, med mulighed for, at prøver kan stå i op til 14 dage ved stuetemp.. Formål: Undersøgelserne skal opklare om NEO (Immucor), kan anvendes til fænotypebestemmelse af A 1, Lu a og Lu b, samt hvorvidt resultaterne, påvirkes af opbevaring i op til 14 dage, ved hhv. 4 o C og stuetemp.. Materialer og Metoder: I metodesammenligningen blev de anvendte EDTA- blodprøver analyseret manuelt, samt på NEO (Immucor). I holdbarhedsforsøget blev prøverne delt, opbevaret ved hhv. 4 o C og stuetemp., samt analyseret dag 1,2,4,7,10 og 14 på NEO (Immucor). Resultater: Der sås fuld overensstemmelse mellem metoderne ved A 1. Signifikant forskel mellem antallet af inkonklusive prøver ved hver metode ved Lu a, men ingen signifikant forskel mellem metoderne ved Lu b, kunne påvises. A 1 påvirkes hverken af opbevaringstid- eller temp.. Ved Lu a sås signifikant forskel dag 14, ved begge temperaturer, mens den klinisk relevante forskel sås før, samt stærkere reaktionsstyrker ved 4 o C. Ved Lu b sås hverken signifikant eller klinisk relevant forskel mellem dagene ved 4 o C, men ved stuetemp.. Konklusion: Det er muligt at anvende NEO (Immucor) til A 1 og Lu b bestemmelse. Justeringer af metoden, samt yderligere validering er nødvendig, før NEO (Immucor), kan anvendes til Lu a bestemmelse. Prøver til A 1 bestemmelse kan opbevares ved stuetemp. i 14 dage. Usikkerhed på resultater fra Lu a og Lu b bestemmelsen gør yderligere undersøgelser nødvendige. 1

3 Forord Nærværende Bachelor rapport er udarbejdet af Bioanalytikerstuderende, Sandra Gaedt Schmidt, på baggrund af Laboratorieundersøgelser udført i Modul 14, perioden uge 41-45, Laboratorieundersøgelserne fandt sted i Erytrocytlaboratoriet på Klinisk Immunologisk Afdeling (KIA), Odense Universitetshospital (OUH), og resultatet heraf forventes at kunne anvendes af afdelingen, i forbindelse med validering af NEO (Immucor). Der rettes en tak til afdelingsbioanalytikerne i Erytrocytlaboratoriet, Marianne Grønholdt Pedersen og Berit Antonsen, analyseansvarlige Overlæge på KIA, Ulrik Sprogøe, afdelingsbioanalytiker i Tappe- og Fraktioneringsafsnittet Anne- Mette Henneby og sekretærerne i Donorsekretariatet, for hjælp i forbindelse med projektet. Desuden rettes en tak til medarbejdere i Erytrocytlaboratoriet, for villighed til at svare på tvivlsspørgsmål, og til øvrige gruppemedlemmer Lisa Maria Mathiesen, Camilla Thinggård Jakobsen og Ida Niebuhr Moser Hausted, for konstruktivt samarbejde, og sparring i forbindelse med teoretisk arbejde, samt udførsel af Laboratorieundersøgelserne. 2

4 Indhold Validering af A 1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) ved metodesammenligning og holdbarhedsforsøg... 0 Resumé... 1 Forord... 2 Introduktion... 7 Problembaggrund... 7 A 1, Lu a og Lu b antigenernes opbygning og kliniske relevans... 9 A Lu a og Lu b... 9 Fænotypebestemmelse af A 1, Lu a og Lu b...10 Manuel Glasteknik til bestemmelse af A Manuel Søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort til bestemmelse af Lu a og Lu b...11 Automatiseret fænotypebestemmelse på NEO (Immucor)...11 Hæmagglutination Assay...11 Capture- R SELECT...12 Afgrænsning...12 Problemformulering...13 Metodiske overvejelser...13 Udvælgelse af prøver til projektet...14 Metodesammenligning...14 Holdbarhedsforsøget...15 Sammenligning af resultater og statistik...16 Materialer og Metoder...17 Apparatur...17 Utensilier...17 Kemikalier og Reagenser...18 Anvendt ved manuelle teknikker...18 Anvendt på NEO (Immucor)...19 Prøvemateriale...19 Metode

5 Manuel fænotypebestemmelse...20 Glasteknik, A 1 :...20 Søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, Lu a og Lu b :...21 Automatiseret fænotypebestemmelse...21 Hæmagglutination Assay på NEO (Immucor), A 1 (Se Bilag 12)...21 Capture- R SELECT på NEO (Immucor), Lu a og Lu b (Se bilag 13 og 14)...22 Tolkning af resultater på NEO (Immucor)...23 Databehandling...23 Metodesammenligning...23 Holdbarhedsforsøg...24 Resultater...25 Metodesammenligning mellem manuel teknik og NEO (Immucor)...25 A Lu a...25 Lu b...26 Holdbarhedsforsøg...27 A Prøver til A 1 bestemmelse opbevaret ved 4 o C...27 Prøver til A 1 bestemmelse opbevaret ved stuetemperatur...29 Lu a...29 Prøver til Lu a bestemmelse opbevaret ved 4 0 C...30 Prøver til Lu a bestemmelse opbevaret ved stuetemperatur...31 Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur...33 Lu b...34 Prøver til Lu b bestemmelse opbevaret ved 4 o C...34 Prøver til Lu b bestemmelse opbevaret ved stuetemperatur...35 Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur...37 Diskussion...38 Metodesammenligning...38 Udledte sammenhæng af A 1 bestemmelsen...38 Udledte sammenhænge af Lu a bestemmelsen

6 Udledte sammenhænge af Lu b bestemmelsen...38 Kvaliteten af resultaterne og metodiske overvejelser...39 Diskussion af udledte sammenhænge for A 1 bestemmelsen...40 Diskussion af udledte sammenhænge for Lu a bestemmelsen...40 Diskussion af udledte sammenhænge for Lu b bestemmelsen...42 Fast fase teknologi og Genotypisk blodtypebestemmelse...42 Holdbarhedsforsøget...44 Udledte sammenhænge ved A 1 bestemmelserne...44 Udledte sammenhænge ved Lu a bestemmelserne...44 Udledte sammenhænge for Lu b bestemmelserne...46 Kvaliteten af Resultaterne og Metodiske overvejelser...47 Diskussion af udledte sammenhænge for A 1 bestemmelserne...48 Diskussion af udledte sammenhænge for Lu a bestemmelserne...48 Diskussion af de udledte sammenhænge for Lu b bestemmelserne...50 Konklusion og Perspektivering...50 Litteratur...51 Bilag 1- Indlægsseddel Capture- R SELECT Bilag 2- Indlægsseddel Anti- A1 Lectin...58 Bilag 3- Indlægsseddel Capture LISS...60 Bilag 4- Priser for analyser på NEO (Immucor)...62 Bilag 5- Indlægsseddel, immuclone Rh Hr- Control Bilag 6- Konklusion ud fra graduering, Manuelle teknikker...65 Bilag 7- Konklusion på NEO (Immucor) ud fra gradueringer og omsætning af rådata...66 Bilag 8- Fremgangsmåde glasteknik bestemmelse af A 1 (Øverst)...70 Bilag 9- Aflæsningsskema Glasteknik...70 Bilag 10- Fremgangsmåde søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, Lu a og Lu b (grøn)...72 Bilag 11- Aflæsningsskema Søjleagglutinationsteknik...73 Bilag 12- Flowskema Fænotypebestemmelse af A 1 på NEO (Immucor)...74 Bilag 13 Flowskema fænotypebestemmelse af Lu a på NEO (Immucor)

7 Bilag 14- Flowskema over fænotypebestemmelsen af Lu b på NEO (Immucor) Bilag 15 Databehandling af rådata Bilag 16- Oversigt resultater fra Metodesammenligning A Bilag 17- Oversigt Resultater fra metodesammenligning Lu a...87 Bilag 18- Oversigt Resultater Metodesammenligning Lu b Bilag 19- Oversigt Resultater fra Holdbarhedsforsøget A Bilag 20- Oversigt resultater fra Holdbarhedsforsøget Lu a...90 Bilag 21- Oversigt Resultater fra Holdbarhedsforsøget Lu b...91 Bilag 22- Estimerede priser for A 1, Lu a og Lu b bestemt ved manuel teknik...92 Bilag 23- Indlægsseddel Capture- R Ready Indicator Red Cells

8 Introduktion Problembaggrund Ved fænotypebestemmelse af blodtypeantigener forstås bestemmelse af sammensætningen af blodtypeantigener der udtrykkes på erytrocytterne. På nuværende tidspunkt er der 339 kendte blodtypeantigener inddelt i 33 blodtypesystemer, hvilke adskiller sig ved at være kodet af forskellige gener, og komplekser af homologe gener (3)(4). På Klinisk Immunologisk Afdeling (KIA), Odense Universitetshospital (OUH) dobbeltbestemmes klinisk relevante fænotyper på alle bloddonorer. Bestemmelsen foregår på to separate blodprøver udtaget ved to forskellige tapninger (15). Dette gøres for at kunne give patienter, der har dannet irregulære antistoffer, og f.eks. patienter med seglcelleanæmi, som modtager transfusioner hele livet, fænotypeudvalgt blod ved transfusioner og derved undgå Hæmolytiske Transfusionskomplikationer (HTK). HTK opstår når en patients immunsystem, ved behandling med blod, responderer på blodtypeantigener, der udtrykkes på donors erytrocytter, men ikke patientens. Dette respons, der medfører destruering af donorerytrocytter, kan forekomme i mild, moderat eller stærk grad umiddelbar, dvs. akut, eller ca. 1 uge efter transfusionen(tardiv). I sjældne tilfælde kan disse komplikationer være med døden til følge. De svære akutte tilfælde af HTK ses ved AB0- major uforlig, mens forsinket HTK kan ses hos patienter der tidligere er immuniserede imod det pågældende blodtypeantigen. Transfusion med antigenpositive erytrocytter til disse patienter, kan initiere et sekundært immunrespons med destruering af donorerytrocytter til følge(12)(17)(23). På KIA foregår fænotypebestemmelsen af donorer primært automatiseret, ved hæmagglutination i mikrotiterplader (Hæmagglutination Assay), og fast fase teknologi i mikrotiterplader (Capture- R SELECT), på apparaturet NEO (Immucor). KIA ønsker fremadrettet, ligeledes at bestemme blodtypeantigenet A 1, automatiseret ved Hæmagglutination Assay, og blodtypeantigenerne Lu a og Lu b med Capture- R SELECT metoden. Fænotypebestemmelsen af disse blodtypeantigener foregår på nuværende tidspunkt manuelt, hvor A 1 bestemmes ved glasteknik, og Lu a og Lu b bestemmes ved søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs kort. Automatisering af disse fænotypebestemmelser vil være tidsbesparende, idet en større mængde prøver kan analyseres ad gangen, og da resultater fra NEO (Immucor), kan overføres direkte til afdelingens EDB- system, ProSang. Desuden vil automatisering af disse analyser også medføre standardiseret, og dermed objektiv aflæsning af resultater (Se Bilag 1)(23). Capture- R SELECT metoden på NEO (Immucor), er bl.a. udviklet på baggrund af metoden præsenteret i studiet af Plapp et al. fra 1984 (16). Her blev fast fase teknologien med anti-rbc coatede mikrotiterplader, til anvendelse ved serologiske undersøgelser, 7

9 sammenholdt med en allerede anvendt antiglobulin test (Se bilag 1)(16). Capture- R metoden er derefter blevet anvendt i Canada og USA fra midten af 1980 erne (19). I 2000 undersøgte Sandler et al.(20) AB0 blodtypebestemmelse ved hæmagglutination i mikrotiterplader, svarende til Hæmagglutination Assay. De fandt en overensstemmelse på 99,8 % mellem denne teknologi og den daværende anvendte manuelle metode (20). I nærværende projekt undersøges, om NEO (Immucor) fremover kan anvendes til fænotypebestemmelse af A 1, Lu a og Lu b, ved metodesammenligning mellem NEO (Immucor) og den, på afdelingen, allerede anvendte manuelle metode. På KIA opbevares EDTA- prøver til fænotypebestemmelse, på nuværende tidspunkt, ved stuetemperatur, op til en uge. Afdelingen ønsker fremadrettet at analysere A 1, Lu a og Lu b én gang ugentligt, med mulighed for, at prøver kan stå i op til 14 dage ved stuetemperatur. Producenten af NEO (Immucor) oplyser, at EDTA prøver til fænotypebestemmelse med Capture- R SELECT, har en holdbarhed op til 14 dage ved 1-10 o C. Dog anbefales det at prøverne analyseres inden 7 dage, da risikoen for at donorerytrocytterne ikke binder korrekt til anti-rbc i brønden (ujævnt monolayer) øges (Bilag 1). KIA har, ligesom producenten angiver, erfaret ujævnt monolayer ved analysering af 7 dage gamle prøver, med IgG antistoffer i Capture- R SELECT, på NEO (Immucor) (14). Af indlægssedlen til testsera Anti- A 1 Lectin, som anvendes til bestemmelse af A 1 i Hæmagglutination Assay, fremgår det, at EDTA prøver har en holdbarhed på op til 14 dage ved 2-8 o C (Se Bilag 2). Ved opbevaring af blod kan der ske forskellige biokemiske og morfologiske ændringer af erytrocytterne, så som reducering af membranen, hvilket kan medføre reducering eller tab af blodtypeantigener (7)(22). Ved opbevaring, ses det at leukocytter i blodprøven over tid nedbrydes, og frigiver enzymer heriblandt proteaser og lipaser. Enzymer kan nedbryde overfladen af erytrocytmembranen, og tab af lipider og proteiner, herunder proteinantigener kan forekomme(7)(22). Et studie af Seghatchian et. al. (21) undersøgte erytrocytlæsioner i opbevaret blod ved både 4 o C og ved stuetemperatur ud fra bl.a. mængden af Annexin V, der er en anerkendt markør for celleskade, i supernatanten. Resultaterne viste allerede efter 7 dage, en stigning af Annexin V i blod opbevaret ved stuetemperatur (21). Et studie af Sparrow et al. (22) fandt også en markant stigning i niveauet af Annexin V ved opbevaring af blod. Studiet undersøgte desuden, hvordan opbevaring af ikke- leukocytdepleteret blod, svarende til blod i en blodprøve, påvirker ekspressionen af bestemte IgSF glykoproteiner på erytrocytterne, tilsvarende Lutheran antigenerne (3)(22). De fandt at ekspressionen af disse glykoproteiner aftog signifikant efter opbevaring i 28 dage (22). I nærværende projekt undersøges om opbevaring af EDTA- donorprøver over 14 dage påvirker blodtypeantigenerne A 1, Lu a og Lu b således at der ses en ændring i resultatet af fænotypebestemmelserne 8

10 på NEO (Immucor). Desuden er det relevant at undersøge, om opbevaring af prøverne ved hhv. 4 o C og stuetemperatur har betydning for reaktionsstyrkerne. A1, Lu a og Lu b antigenernes opbygning og kliniske relevans A 1 Antigenerne i AB0 blodtypesystemet består af oligosakkarider, bundet til enten proteiner eller lipider på erytrocytoverfladen. A 1 - og A- antigener er bundet til lipider (3). Individer med fænotypen A kan opdeles i flere subtyper, hvor de to hyppigst forekommende er A 1 og A 2. Ud af alle A positive kaukasere er 80 % A 1 mens 20 % er A 2. Den største forskel mellem de to fænotyper er at A 1 individer gennemsnitligt bærer 8-12 x 10 5 antigener på erytrocytterne, mens A 2 individer gennemsnitligt bærer 1-4 x 10 5 antigener på erytrocytoverfladen, hvorfor A 2 fænotypen også betegnes en svag A type. Dog menes det at A 1 individer udtrykker strukturer på erytrocytterne svarende til A- antigen og A 1 - antigen, mens A 2 individer kun udtrykker A- antigener. Dette er påvist på baggrund af at nogle A 2 individer danner antistoffer(anti- A 1 ) imod strukturer på A 1 individers erytrocytter (A 1 - antigen). Anti- A 1 reagerer kun i sjældne tilfælde ved 37 o C, og har derfor normalt ikke nogen klinisk relevans (4)(13). Den præcise forskel mellem strukturerne individer med A 1 og A 2 fænotyperne bærer på erytrocytterne, er stadig uklar(3)(4)(13)(18). KIA ønsker at automatisere differentieringen mellem A 1 og A 2, for fremadrettet at kunne fremsøge A 2 donorer, da A 2 som en svag A-type, anvendes til validering af nyt udstyr, analyser og til modtagekontrol hvor gelkort og testsera til blodtypebestemmelse afprøves og godkendes. Lu a og Lu b Lutheran systemet består af 20 antigener, hvoraf Lu a og Lu b antigenerne er de hyppigst forekomne. Disse er lokaliseret på to glykoproteiner på erytrocytmembranen (CD239, Lu-gps) der tilhører immunoglobulin superfamilien (IgSF) (3)(18). Lu a og Lu b er antitetiske, hvilket betyder at enten et LU*A eller LU*B allel nedarves fra faren og moren. LU*A og LU*B allelerne nedarves desuden codominant, hvormed begge fænotyper kan udtrykkes samtidig. Der ses nedarvet variation i styrken af Lutheran antigener, samt forskel på antigenisiteten mellem hetero- og homozygote individer. Denne forskel skyldes en kvantitativ forskel i antallet af bindingssteder på erytrocytten der eks. for Lu(b+) fænotypen er estimeret til hos Lu(a- b+) individer og ved Lu(a+ b+) individer. Desuden kan der ved Lu a fænotypen forekomme variation mellem antigenisiteten på de enkelte erytrocytter hos samme person. (2)(3)(10). I flertallet af befolkningsgrupper har ca. 92 % fænotypen Lu(a- b+), 7 % Lu(a+ b+), 0,2 % Lu(a+ b-) mens < 0,1 % har Lu(a- 9

11 a Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt b-) også kaldet Lu null. Denne fænotype ses hos personer der er homozygote for inaktivering af genet LU, der koder for Lutheran antigenerne (Bilag 2)(18). Antistofferne mod Lu a (Anti-Lu a ) reagerer normalt ikke ved 37 o C, og er derfor af mindre klinisk relevans. Ved tilstedeværelse af føtale Lu a antigener ses at maternelle antistoffer imod Lu a antigener absorberes på placenta, hvilket skyldes at anti- Lu a ofte er af IgM karakter. Dette gør antistoffet klinisk irrelevant i forbindelse med Hæmolytisk Sygdom hos Fostre og Nyfødte (HDFN)(10)(17)(18). Antistoffer imod Lu b (anti-lu b ) kan i sjældne tilfælde forårsage mild og/eller forsinket HTK. Samtidig er Lu b antigener kun lidt udviklede hos fostre og nyfødte, og anti-lu b forårsager derfor sjældent HDFN (10)(17). På KIA er Lu a og Lu b antigener inkluderet i screentesten, hvilket gør det muligt at finde patienter som har dannet enten anti- Lu a eller anti- Lu b. Derfor er det nødvendigt at afdelingen fænotypebestemmer donorer for Lu a og Lu b, således at Lu(a-) og Lu(b-) erytrocytsuspensioner kan fremskaffes, i tilfælde hvor det ses, at en patient har dannet anti-lu a eller meget sjældent anti- Lu b. Fænotypebestemmelse af A1, Lu a og Lu b Manuel Glasteknik til bestemmelse af A 1 I glasteknik sker direkte hæmagglutination i et reagensglas, baseret på agglutinationsreaktioner mellem blodtypeantigener på erytrocytterne og specifikke IgM antistoffer i testsera. Ved positiv reaktion bindes antistoffet i testsera til donorerytrocytterne som udtrykker det pågældende blodtypeantigen, og danner et agglutinat. Ved negativ reaktion ses intet agglutinat. Se figur 1 Figur 1: Billedet til venstre viser et eksempel på en positiv reaktion ved glasteknik, mens billedet til højere viser eksemplet på en negativ reaktion. Kilde: gradueringsskema til glasteknik fra KIA. 10

12 Manuel Søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort til bestemmelse af Lu a og Lu b Figur 2 Ses eksempel på et LISS Coombs kort, anvendt til bestemmelse af Lua og Lub. I 1. brønd fra venstre ses en positiv reaktion, mens der i 2. brønd fra højere ses en negativ reaktion. Ved søjleagglutinationsteknik anvendes Indirekte agglutinations teknik (IAT) i LISS Coombs kort. Gelen i LISS Coombs kortene er opbygget som et netværk, og tilsat Lav Ion Saltvand (LISS), hvor mængden af ioner er reducerede, hvilket muliggør bindingen mellem IgG antistoffer og deres korresponderende blodtypeantigener (11). Gelkortet er desuden tilsat anti- IgG og anti- C3d. Anti- IgG og anti- C3d synliggør en evt. sensibilisering af donorerytrocytterne med antistoffer fra testsera, ved at bindes til to antistoffer af IgG karakter, og dermed danne bro mellem erytrocytterne. Ved agglutination vil erytrocytterne blive liggende øverst i gelen, da agglutinaterne ikke kan trænge gennem gelen, og resultatet er positivt. Hvis der ikke sker nogen agglutination bliver ikke-agglutinerede erytrocytter centrifugeret ned i bunden af gelen og resultatet er negativt, se figur 2 Automatiseret fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) Ved fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) skelnes mellem to metoder: Hæmagglutination Assay, hvor der anvendes testsera med IgM antistoffer og Capture- R SELECT, hvor der anvendes testsera med IgG antistoffer. Disse er begge baseret på antigen-antistof reaktion i en mikrotiterplade. Hæmagglutination Assay Ved bestemmelse af A 1 i Hæmagglutination Assay, tilsættes donorerytrocytter og testsera til en neutral mikrotiterplade. Antistoffer i testsera vil bindes til donorerytrocytterne, hvis det korresponderende blodtypeantigen udtrykkes derpå, og dermed danne et agglutinat (positiv reaktion) (Bilag 2). Ved negativ reaktion dannes intet agglutinat, men derimod ses en rød sky fordelt i brønden. Se figur 3 Reaktionerne fra både Hæmagglutination Assay og 11 Figur 3 Viser et eksempel på en plade fra hæmagglutination assay, hvor positive reaktioner ses i A1, C1 og E1, mens negative reaktioner ses i B1, D1 og F1.

13 Capture- R SELECT aflæses med et elektronisk Charge- Coupled Device (CCD) kamera, hvor et på forhånd afgrænset område i brønden, aflæses og sammenholdes med en Negativ plade (score < 12). Capture- R SELECT Til Capture- R SELECT anvendes en mikrotiterplade coatet med antistoffer imod erytrocytter (Anti- RBC), hvor donorerytrocytterne immobiliseres, hvilket betegnes monolayer. Ved bestemmelse af Lu a og Lu b antigenerne tilsættes sammen med testsera, indeholdende antistoffer, LISS (Bilag 3). Hvis det pågældende antigen udtrykkes på donorerytrocytterne, bindes antistoffer i testsera dertil. Indikatorceller sensibilisererede med anti- humant IgG, vil ved tilsætning bindes til de antistoffer fra testsera, som er bundet til donorerytrocytterne. Hvis antistofferne ikke er bundene (negativ reaktion) vil indikatorcellerne lægge sig som en pellet. Ved en positiv reaktion vil indikatorcellerne binde til de bundne antistoffer, hvilket ses som en rød sky fordelt i brønden (Bilag 1), se figur 4. Figur 4 Angiver de steps der forekommer i Capture- R SELECT. Kilde: NEO (Immucor) brochure, Immucor Inc. Afgrænsning Formålet med validering af nye analyser er at fastlægge analysens nøjagtighed, repeterbarhed, reproducerbarhed og særlige kritiske områder ved metoden (5). Ved planlægning af metodevalidering besluttes, hvilke elementer der skal indgå i valideringen ud fra vurdering af hvilke af disse der kan være problematiske for sikkerheden og kvaliteten af analysen. Nedenstående elementer kan medtages i valideringen jf. Transfusionsmedicinske Standarder (6): - Design Qualification (DQ) - Installation Qualification(IQ) - Operational Qualification (OQ) 12

14 - Performance Qualification (PQ) - Proces Validation (PV) Ved DQ dokumenteres at apparaturet opfylder det ønskede formål. Ved IQ dokumenteres at apparaturet er installeret korrekt jf. relevante bekendtgørelser, manualer og lovgivninger. Ved OQ dokumenteres at apparaturet driftsmæssigt fungerer. Ved PQ dokumenteres analysens repeterbarhed og reproducerbarhed med afprøvning af analysens præstation med eks. vand, gamle blodprøver eller testprøver. Ved PV vurderes apparaturets præstation ved afprøvning med rutineprøver under rutinemæssige forhold. I tilfælde hvor der er tale om at en analyse skal erstatte en anden er det et krav at disse to metoder sammenlignes ved en opsætning overfor hinanden (6). Der er i dette projekt fokus på validering af fænotypebestemmelse af A 1, Lu a og Lu b med PV i form af metodesammenligning mellem de nuværende manuelle teknikker og NEO (Immucor), og PQ hvor reproducerbarheden undersøges ved et holdbarhedsforsøg med fokus på opbevaring af EDTA-prøver til fænotypebestemmelse over 14 dage, samt opbevaring ved hhv. 4 o C og stuetemperatur. Det er ikke relevant at medtage andre parametre i denne del af valideringen, da apparaturet allerede er taget i brug til fænotypebestemmelse af andre blodtypeantigener. Konklusionerne af de fundne resultater ved metodesammenligningen og holdbarhedsforsøget vil fremadrettet kunne anvendes, som et led i validering af A 1, Lua og Lub fænotypebestemmelserne på NEO (Immucor). Begge undersøgelser finder sted på KIA, OUH. Problemformulering Hvilken betydning har det for resultatet af A 1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelsen at anvende Hæmagglutination Assay, og fast fase teknologi på NEO (Immucor) frem for manuel glasteknik, og søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs kort, og hvordan påvirker opbevaring af donorblodprøver ved hhv. 4 o C og stuetemperatur i op til 14 dage, resultatet af A 1, Lua og Lub fænotypebestemmelsen på NEO (Immucor)? Metodiske overvejelser For at bestemme hvilken betydning det har for resultatet af A 1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelsen, at anvende NEO (Immucor) fremfor manuel fænotypebestemmelse i glasteknik og søjleagglutination i LISS Coombs kort, udføres en metodesammenligning mellem disse metoder. For at undersøge hvordan opbevaringstiden op til 14 dage og opbevaringstemperaturen, påvirker reaktionsstyrken og resultatet af 13

15 fænotypebestemmelsen af blodtypeantigenerne A 1, Lua og Lub på NEO (Immucor), kan udføres et holdbarhedsforsøg med udvalgte analyseringsdage i en periode over 14 dage, på prøver opbevaret ved hhv. 4 o C og stuetemperatur. Udvælgelse af prøver til projektet Til projektet anvendes donorblodprøver opsamlet i EDTA- glas, indsamlet blandt prøver til rutine fænotypebestemmelse på afdelingen fra donorer i hele Region Syddanmark. Der tages højde for, hvor mange blodprøver det er realistisk at indsamle til projektet, da der skal bruges prøver med bestemte fænotyper, hvor nogle er sjældne og derfor mere vanskelige at skaffe. Desuden er det nødvendigt at indsamle en passende mængde prøver, således at afdelingen efterfølgende kan bruge materialet i deres validering af NEO (Immucor). Samtidig sikres det at antallet er passende i forholdet til afdelingens økonomi, da analysering af Lu a og Lu b på NEO (Immucor) er estimeret til 35 kr. pr. analyse på baggrund af lignende analyser på NEO (Immucor) (Se Bilag 4). Antallet af prøver skal desuden være tilstrækkeligt, til at vurdere resultaterne statistisk. I projektet arbejdes med fænotypebestemmelse, hvor et brugbart resultat har to mulige udfald, positiv eller negativ. Det er dog kendt fra undersøgelse af andre blodtypeantigener på NEO(Immucor) at inkonklusive resultater kan forekomme, hvilket giver 3 svar muligheder. Da A 1 er en stærk A- type forventes lille variation i reaktionsstyrkerne, og derfor er det tilstrækkeligt med 10 A 1 og 5 A 1 - prøver til metodesammenligningen (3). Indenfor Lutheran systemet er der en meget lille biologisk variation med tre kombinationsmuligheder af fænotyper, hvilket fremgår af tidligere nævnte frekvenser. Ud fra et statistisk synspunkt, må antallet af prøver tilstrækkeligt til metodesammenligningen af Lu a og Lu b, være 10 heterozygote, 5 homozygote og 5 negative, for hver fænotype, da det ikke forventes at nogle prøver afviger markant. Til holdbarhedsforsøget må det være tilstrækkeligt med 5 A 1 samt 5 heterozygote og 5 homozygote prøver til Lu a og Lu b bestemmelserne, da det selvom én prøve afviger stadig er muligt at konkludere ud fra resultaterne. Det er nødvendigt at booke 5 donorer med fænotypen Lu(a+ b-) med hjælp fra donorsekretariatet da denne fænotype forekommer sjældent. Metodesammenligning For bestemme om NEO (Immucor) både kan detektere forventede svage og stærke reaktioner ved fænotypebestemmelsen af Lu a og Lu b, skal medtaget blodprøver fra både heterozygote og homozygote individer. Da det er vigtigst at metoden kan detektere de svageste reaktioner, medtages et større antal heterozygote prøver. Der serologisk ikke skelnes mellem homo- og heterozygote indenfor AB0- systemet. Metodesammenligningen skal også påvise om NEO (Immucor), kan differentiere mellem positiv og negativ. 14

16 Derfor er medtaget negative prøver for hver fænotype. Ved A 1 og Lu a bestemmelsen er der desuden medtaget Rh- kontrol. Denne kontrol medtages ved A 1 bestemmelsen, hvor testsera indeholder IgM antistoffer, for at sikre at donorerytrocytterne ikke agglutinerer spontant. I Lu a bestemmelsen, hvor testsera indeholder IgG antistoffer, medtages kontrollen for at sikre at donorerytrocytterne ikke er in vivo sensibiliserede (Bilag 5). Det er kun nødvendig at medtage kontrollen én gang for hver blodprøve, hvorfor den ikke medtages ved Lu b bestemmelsen. Ved de manuelle teknikker medtages ved glasteknik positive og negative kontroller. Den positiv kontrol sikrer, at der ikke forekommer falsk negative resultater på baggrund af fejl i analysering eller dårligt testsera, mens den negative kontrol sikre at der ikke forekommer falsk positive resultater på baggrund af spontan agglutination af erytrocytterne eller fejl ved analyseringen. I Søjleagglutinationsteknikken i LISS Coombs kort medtages en heterozygot positiv kontrol, og en negativ kontrol. Den positive kontrol medtages af samme årsag som nævnt ved glasteknik, samt for at sikre at en svag positiv reaktion detekteres. Den negative kontrol medtages for at sikre, at der ikke forekommer falsk positive reaktioner på baggrund af in vivo sensibilisering af erytrocytterne eller fejl i analysering. Resultaterne vurderet subjektivt, og for at sikre sammenlignelige resultater er det vigtigt at resultaterne aflæses ens hver gang. Ved glasteknik er det kun muligt at én aflæser ad gangen, da glasset under aflæsning vippes henover et spejl. Derfor skal alle resultater fra glasteknikken aflæses af den samme person. I søjleagglutinationsteknikken i LISS Coombs kort er resultaterne fikseret i gelen, og dermed er et muligt at være flere om at vurdere resultaterne. Derfor vil de to samme personer vurderer resultaterne fra søjleagglutinationsteknikken i LISS Coombs kort, hvilket giver mulighed for sparring. Alle prøver til metodesammenligning analyseres både manuelt, og på NEO (Immucor) samme dag, for at sikre at opbevaring eller anden behandling af blodprøven ikke har indflydelse på resultatet. Eventuelle resultater der ved manuelteknik bliver inkonklusive (+) reanalyseres for at sikre resultatet. (Bilag 6)For at reducere mængden af prøver der skal indsamles til projektet, bliver resultater fra dag 1 på alle prøver, anvendt både i holdbarhedsforsøget, og metodesammenligningen. Holdbarhedsforsøget I holdbarhedsforsøget analyseres prøverne over en periode på 14 dage. Dagene 1,2,4,7,10 og 14 udvælges. Dag 1, for at få udgangspunktet for prøven. Dag 2, 4 og 7, da det er interessant at undersøge, om der kan detekteres en forandring den første uge, når producenten og afdelingen har oplevet problemer med monolayer i Capture- R SELECT, ved prøver der er en uge gamle. Dag 14 er valgt da producenten angiver en holdbarhed på 14 dage(bilag 1 og Bilag 2). For at detektere en eventuel forandring mellem dag 7 og 14 15

17 medtages også dag 10. Afdelingen følger på nuværende tidspunkt ikke producentens anbefaling, vedr. opbevaring af prøver til fænotypebestemmelse (Bilag 1 og Bilag 2). Derfor undersøges om opbevaringstemperaturen har betydning for resultaterne af fænotypebestemmelserne. For at få parrede, og dermed sammenlignelige data, deles prøverne således at én del af materialet kan opbevares i afdelingens kølerum (ca. 4 o C), mens den anden del opbevares i blodtypelaboratoriet (stuetemperatur), hvor prøverne til fænotypebestemmelse normalt opbevares inden analysering. For at kunne sammenholde hver prøve direkte og dermed mindske ombytning, skal hvert widalglas påsættes tappemærkat printet ud fra hovedglasset. Sammenligning af resultater og statistik Metodesammenligningen Gradueringerne fra de manuelle teknikker, og NEO(Immucor) kan ikke sammenholdes direkte, hvorfor resultaterne fra disse i metodesammenligningen omsættes til Positive, Inkonklusive og Negative. Denne inddeling foretages både ud fra afdelingens fastsatte cut-off, og ud fra NEO (Immucor)s cut-off værdier, der begge medtages, for at kunne vurdere den kliniske betydning af inkonklusive resultater, ud fra hver af disse (Se bilag 7). Resultater fra metodesammenligningen opstilles i en kontingenstabel i 3x3 format. Det kunne være relevant at beregne sensitivitet og specificitet for NEO (Immucor), da det ifølge analyseansvarlige Overlæge på KIA, Ulrik Sprogøe, er muligt at anvende de manuelle teknikker som golden standard. Det forventes ikke at metoderne får ukorrekte resultater, hvor prøver bestemmes positive med den ene metode og negative ved den anden, men at der kan forekomme inkonklusive resultater ved begge metoder. Derfor ønskes metoderne sammenholdt ud fra antallet af Inkonklusive resultater. Da det kræver en stikprøvestørrelse på min. 40 for at anvende Chi^2 test konverteres data til 2x2 tabel ved at opstille inkonklusive og konklusive resultater for hver metode op mod hinanden. Ud fra disse data foretages Fishers eksakte test, der kan påvise en evt. signifikant forskel mellem antallet af inkonklusive resultater opnået ved de to metoder. Signifikansniveauet α=0,05 anvendes. Ved fænotyper hvor der ikke forekommer resultater, beregnes ikke Fishers eksakte test. Følgende hypoteser er valgt: H 0 hypotesen: Antallet af inkonklusive resultater afhænger ikke af hvilken metode der anvendes. H A hypotesen: Antallet af inkonklusive afhænger af hvilken metode der anvendes. Holdbarhedsforsøget I holdbarhedsforsøget er det muligt at anvende rådata fra NEO (Immucor) beregnet som score fra

18 Dette giver mulighed for at anvende et bredere udvalg af statistiske værktøjer. Såfremt data er normalfordelte er det muligt at anvende en tosidet ANOVA til at sammenholde analyseringsdagene for hver temperatur, og dermed vurdere om der er en signifikant forskel mellem disse. Findes det at data ikke er normalfordelte, er det muligt at sammenholde analyseringsdagene for hver temperatur i den non- parametriske Friedmantest. Signifikansniveauet α=0,05 anvendes. Følgende hypoteser er valgt: H 0 hypotese: Resultatet af fænotypebestemmelsen er uafhængigt af antal dage blodprøven opbevares. H A hypotese: Resultatet af fænotypebestemmelsen afhænger af antal dage blodprøven opbevares. Desuden fremstilles en xy- plots for hver fænotype, hvor hver prøves reaktionsstyrke over analyseringsdagene afbildes, samt afdelingens og NEO s (Immucor) cut- off værdier er indtegnet. Dette kan give overblik over den klinisk relevans, af den eventuelle signifikante forskel der kan påvises mellem analyseringsdagene, både ved anvendelse af NEO (Immucor) og afdelingens cut-off. For direkte at kunne sammenholde opbevaringstemperaturernes betydning for resultaterne opnået i holdbarhedsforsøget, fremstilles xy- plots for hver dag med reaktionsstyrkerne ved hver opbevaringstemperatur, for hver fænotype. Her indtegnes identitetslinjen x=y. Materialer og Metoder Apparatur - Hettich Zentrifugen Rotina 46 (Tyskland), anvendt til centrifugering af blodprøver samt glas anvendt i glasteknik. - ID centrifuge 24 S fra DiaMed ID Micro Typing System (Schweiz) blev anvendt til centrifugering af LISS Coombs kort. - ID inkubator 37 sii fra DiaMed (Schweitz), anvendt til inkubation af LISS Coombs gelkort. - Galileo NEO fra Immucor GAMMA (Rödermark, Tyskland) anvendt til fænotypebestemmelse af A 1, Lu(a) og Lu(b). Utensilier - LISS Coombs kort fra BIO-RAD (Schweiz) blev anvendt til manuel bestemmelse af Lu a og Lu b. 17

19 - Reagensglas 75 X 9,85 X 0,7 mm fra Buch og Holm (Herlev, Danmark), anvendt til manuel bestemmelse af A 1 i glasteknik. - Widalglas (Rundbodengläser) 75 X 12 X 0,8-1 mm Buch og Holm (Herlev, Danmark), anvendt til fremstilling af erytrocytsuspensioner ved både glasteknik og søjleagglutination i LISS Coombs kort, samt til deling af blodprøver. - Spejl, blev anvendt ved aflæsning af resultater i glasteknik. - Neutrale Mikrotiterplader fra Triolab (Danmark) (96 brønde), anvendt til bestemmelse A 1 i Hæmagglutination Assay på NEO (Immucor). - Capture- R SELECT mikrotiterplader fra Immucor, GAMMA (USA)(96 brønde), anvendt til bestemmelse af Lu a og Lu b med Capture- R SELECT metoden på NEO (Immucor). Kemikalier og Reagenser Anvendt ved manuelle teknikker - Anti- Lu(a) fra BIO- RAD (Tyskland), anvendt som testsera til bestemmelse af Lu a ved søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort. - Anti- Lu(b) fra BIO-RAD (Tyskland) anvendt som testsera til bestemmelse af Lu b ved søjleagglutination i LISS Coombs gelkort. - Seraclone anti- A 1 fra BIO-RAD (Tyskland), anvendt som testsera til bestemmelse af A 1 i glasteknik. - ID- Cellstab fra BIO-RAD (Schweitz) blev anvendt som suspensionsmedie ved fænotypebestemmelse i de manuelle metoder. - Test erytrocytter fra panel i 0,8 % fortynding, godkendt og (1,2,5) fra KIA, OUH (Danmark) panel 1 anvendt som Lu(a-) kontrol, panel 3 anvendt som Lu(b-) kontrol, Panel 5 anvendt som heterozygot kontrol ved Lu a og Lu b fænotypebestemmelse ved søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs kort. - Test erytrocytter fra panel i 5 % fortynding godkendt (16) fra KIA, OUH (Danmark) anvendt som positiv kontrol ved A 1 fænotypebestemmelsen i glasteknik. - Blodprøver tilhørende komponent fra A 1 - bloddonor (tappenummer: V og V ) anvendt som negativ kontrol ved A 1 fænotypebestemmelse i glasteknik. - EDTA stabiliseret blod fra bloddonorer i Region Syddanmark. 18

20 Anvendt på NEO (Immucor) - Anti- Lu(a) fra Immucor GAMMA (Tyskland) anvendt som testsera ved bestemmelse af Lu a i Capture- R SELECT. - Anti- Lu(b) fra Immucor GAMMA (Tyskland) anvendt som testsera til bestemmelse af Lu b i Capture- R SELECT. - Anti- A 1 Lectin Galileo fra Immucor GAMMA (Tyskland), anvendt som testsera ved bestemmelse af A 1 i Hæmagglutination Assay. - Capture LISS fra Immucor GAMMA (Tyskland), anvendt som ionreducerende opløsning på NEO (Immucor) i Capture R- Select metoden. - Capture- R Ready Indikator erytrocytter fra Immucor GAMMA (Tyskland) anvendt af NEO (Immucor) som indikatorer for om antigen-antistof reaktion er fundet sted ved Capture R- Select metoden. - Stirballs fra Immucor GAMMA (Tyskland) anvendt i Capture- R SELECT metoden hvor de tilsættes indikatorcellerne og fungerer som magnetomrører. - Galileo Diluent fra Immucor GAMMA (Tyskland) anvendt af NEO til fortynding af pakkede erytrocytter ved Hæmagglutination Assay. - System Liquid Concentrate fra Immucor GAMMA (Tyskland) anvendt af NEO til fortynding af pakkede erytrocytter og til vask af mikrotiterpladen i Capture R- Select metoden. - ImmuClone Rh- Hr kontrol reagens fra Immucor GAMMA (Tyskland) blev anvendt som Rh- kontrol ved analysering af alle prøver for Lu a og A 1. - EDTA stabiliseret blod fra bloddonorer i Region Syddanmark, blev anvendt til både metodesammenligningen og holdbarhedsforsøget. Prøvemateriale Forinden projektets start blev, booket fem donorer med fænotypen Lu(a+ b-). Disse donorprøver blev indsamlet fra donorer i Region Syddanmark i uge 41, Blodprøver med fænotyperne A 1, A 1 -, Lu(a+ b+) og Lu(a- b+) blev indsamlet blandt daglige prøver til fænotypebestemmelse i blodtypelaboratoriet. Disse prøver er fra donorer i Region Syddanmark, indsamlet i uge 41-43, Prøvernes fænotype er fremsøgt i afdelingens EDB- system, ProSang, patient rutine 386, hvor det fremgår under fænotyper om donors Lutheran og A 1 fænotype er bestemt. Holdbarhedsforsøget blev startet op i flere hold, i alt fire, afhængigt af hvornår prøver med de ønskede fænotyper kunne indsamles. 19

21 Resultater fra dag 1 i holdbarhedsforsøget blev også anvendt til metodesammenligningen. Derfor blev alle prøver til Lutheran bestemmelse analyseret både for antigenerne Lu a og Lu b. Der blev indsamlet 10 A 1, 5 A 1, 10 prøver med fænotypen Lu(a+ b+), 5 prøver Lu(a+ b-), 5 prøver Lu(a- b+). I holdbarhedsforsøget blev medtaget 5 A 1 prøver, 5 Lu(a+ b+ )hvorpå der kun blev bestemt Lu a, 5 Lu(a+ b+) hvorpå der kun blev bestemt Lu b, 5 Lu(a+ b-) og 5 Lu(a- b+). Metode Indsamlede blodprøver til holdbarhedsforsøget blev vendt grundigt for at opnå homogenitet, og derefter delt for at kunne opbevare én del af prøvematerialet ved 4 o C og én del ved stuetemperatur. 2 ml blod blev afpipetteret fra EDTA-prøveglasset til et widalglas. Forinden blev udskrevet ekstra tappeformularer på blodprøveglassene, disse blev påsat det tilhørende widalglas. Prøverne blev derefter centrifugeret i Rotina 46 (Hettich Zentrifugen) i 5 min. ved 3000 rpm, 1800 g. Prøver til opbevaring på køl, blev placeret i kølerummet således, de så vidt muligt kunne opfylde anbefalingen om, at prøver skal på køl senest 24 timer efter tapning (Bilag 1 og bilag 2). Manuel fænotypebestemmelse Alle prøver fra dag 1 til opbevaring ved stuetemperatur blev også analyseret manuelt, såedes at resultatet kunne bruges i metodesammenligningen. Ved den manuel analysering blev medtaget negative kontroller til alle fænotypebestemmelserne og en positiv heterozygot kontrol til hhv. Lu a og Lu b samt en positiv kontrol til A 1. Som kontroller til Lu a og Lu b fænotypebestemmelserne blev anvendt paneldonor 1,3 og 5 fra afdelingens donorpanel af testerytrocytter (0,8 %), et panel af 0,8 % erytrocytsuspensioner med kendte fænotyper, der anvendes som bl.a. kontroller ved serologiske undersøgelser på KIA. Som positiv kontrol til A 1 fænotypebestemmelsen, blev anvendt paneldonor 16 fra afdelingens panel af testerytrocytter (5 %), mens den negative kontrol (A 1 -) blev fremsøgt i afdelingens EDB- system, ProSang, rutine 330. Alle prøver som ved manuel analysering blev vurderet inkonklusive (+) blev jf. afdelingens praksis reanalyseret. (Bilag 6) Glasteknik, A 1: Et widalglas blev tilført 1 ml Cellstab og 50 µl pakkede erytrocytter fra de respektive donorblodprøver, for at fremstille 5 % erytrocytsuspensioner. Ligeledes blev erytrocytsuspensioner af blodprøver, tilhørende de fremsøgte A 1 - blodkomponenter (negativ kontrol) fremstillet ved samme metode. 50 µl 5 % erytrocytsuspension blev afpipetteret i et reagensglas, hvortil 50 µl testsera Seraclone anti-a 1 ligeledes blev afpipetteret. Reagensglassene blev inkuberet ved stuetemperatur i 5 min. og centrifugereret i Rotina 20

22 46 (Hettich Zentrifugen) ved 1000 rpm, 200 g i 1 min.. Ved brug af aflæsningsskema blev reaktionerne gradueret med til ++++ hvor - angav, når glasset vippes forsigtigt, at blodet blev en homogen blanding mens ++++ angav et fuldkomment agglutinat uden frie erytrocytter i supernatanten. Aflæsningen foregik over et spejl. (Se bilag 8 og Bilag 9) Den samme person aflæste resultaterne fra glasteknik. Søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, Lu a og Lu b : Et widalglas blev tilført 1 ml Cellstab og 8 µl pakkede erytrocytter fra de respektive donorblodprøve for at fremstille 0,8 % erytrocytsuspensioner. 50 µl 0,8 % erytrocytsuspension blev afpipetteret øverst i de respektive brønde ovenover gelen i LISS Coombs gelkortet. Derefter blev 25 µl testsera, til bestemmelse af den pågældende fænotype (anti-lu a og anti-lu b ), afpipetteret øverst i brønden ovenover gelen. LISS Coombs gelkortet blev inkuberet i 15 min. ved 37 C i ID- Inkubator 37 sii og derefter centrifugeret i ID- Centrifuge 24S i 10 min. ved 910 rpm, 85 g. Ud fra aflæsningsskema blev reaktionerne gradueret med - til ++++, hvor - angiver at alle erytrocytter er centrifugeret ned i bunden af gelen mens ++++ betyder at alle erytrocytter pga. agglutination ligger i toppen. Ved tvivl blev der konfereret med erfarne bioanalytikere på afdelingen. De samme to personer vurderede resultaterne i søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort. (Bilag 10 og Bilag 11) Automatiseret fænotypebestemmelse Hold 2,3 og 4 til holdbarhedsforsøget blev analyseret dag 1, 2, 4, 7, 10 og 14 efter tapning. Prøve nr (Lu(a+ b+)) fra hold 3 opbevaret ved 4 o C blev pga. clot, og problemer med Lu b profilen på NEO (Immucor) ikke analyseret dag 7. På dag 14 blev detekteret clot i prøve nr (Lu(a+ b+)) fra hold 3, opbevaret ved 4 o C. Pakkede erytrocytter fra prøven blev vasket 2 x med PBS, og reanalyseret. Lu(a- b+) prøver fra hold 1 i holdbarhedsforsøget, blev analyseret dag 16 i stedet for dag 14 pga. problemer med Lu b profilens software. Resterende prøver fra hold 1 blev analyseret dag 1,2,4,7,10 og 14. Fænotypebestemmelserne foregik på NEO (Immucor), hvor der var medtaget Rh-kontrol til hver prøve ved Lu a og A 1 bestemmelserne. Hæmagglutination Assay på NEO (Immucor), A 1 (Se Bilag 12) Reagenser (Galileo Diluent, anti-a1 Lectin testsera, immuclone Rh-Hr kontrol reagens) blev tempereret til stuetemperatur samt holdbarhed kontrolleret. Herefter blev prøver, reagenser og neutrale mikrotiterplader loadet på NEO (Immucor). Mikrotiterpladen blev aflæst med CCD kamera for at sikre at pladen var ok, og at det korrekte antal brønde var til rådighed. Herefter blev diluent og pakkede 21

23 erytrocytter fra den enkelte prøve, afpipetteret til de respektive brønde for at fremstille en 0,9 % erytrocytsuspension. 53 µl erytrocytsuspension blev overført til Rh- kontrol brønden. Testsera og Rh- Hr kontrol reagens blev afpipetteret til de respektive brønde, hvorefter mikrotiterpladen blev inkuberet ved 20 o C i 5 min. Mikrotiterpladen blev centrifugeret og reaktionsstyrkerne aflæst med CCD kamera. Positiv reaktion ses som et agglutinat eller flere mindre, mens der ved en negativ reaktion ikke ses agglutination. Efter endt analyse blev Rh-kontrollerne kontrolleret og godkendt hvis de på NEO (Immucor) blev vurderet som negative ( ) og evt. fejlmeddelelser blev gennemset. Capture- R SELECT på NEO (Immucor), Lu a og Lu b (Se bilag 13 og 14) Reagenser (Capture LISS, Capture-R Ready indikatorceller, immuclone Rh- Hr kontrol, anti-lu(a) og anti- Lu(a) testsera) blev tempereret til stuetemperatur, der blev tilsat en stirball til nye indikatorceller og holdbarhed blev kontrolleret. Herefter blev blodprøver, reagenser og Capture-R SELECT mikrotiterplader loadet på NEO (Immucor). Mikrotiterpladen blev aflæst med CCD kamera for at kontrollere om mængden af strips stemte overens med det bestilte antal analyseringer, og om stripsene var anvendelige. For at undgå kontaminering med respektive erytrocytsuspensioner, og spild til øvrige brønde, blev først afpipetteret 50 µl System Liquid Solution til hver brønd anvendt i Lu a fænotypebestemmelsen. 3,2 % erytrocytsuspensioner til Lu a og 4,1 % erytrocytsuspension til Lu b fænotypebestemmelsen, blev fremstillet af pakkede erytrocytter fra de respektive prøver fortyndet med System Liquid Solution direkte i brønden. Ved Lu a fænotypebestemmelsen blev en mængde erytrocytsuspension overført videre til Rh- kontrol brønden. Mikrotiterpladen blev centrifugeret, for at fremme bindingen mellem anti- RBC coatet i brøndene, og donorerytrocytter (monolayer). Herefter blev pladen vasket med System Liquid Solution, for at fjerne ikke bundede erytrocytter. For at sikre et tilfredsstillende monolayer i brønden, blev mikrotiterpladen aflæst med CCD kamera. Ved Lu a bestemmelsen blev 25 µl anti- Lu(a) testsera, 15 µl immuclone Rh- Hr kontrol reagens og 50 µl Capture LISS afpipetteret, mens 25 µl anti- Lu(b) testsera og 50 µl Capture LISS blev afpipetteret til de respektive brønde, ved Lu b bestemmelsen. Mikrotiterpladen blev aflæst, for at kontrollere at testsera, kontrolreagens og LISS blev afpipetteret korrekt, og herefter inkuberet ved 39 o C i 20 min. ved Lu a bestemmelsen og 15 min. ved Lu b bestemmelsen. Efter endt inkubation blev mikrotiterpladen vasket, for at fjerne alt ubundet materiale fra brønden, og dernæst aflæst for at kontrollere at ubundet materiale var fjernet. 55 µl Capture- R indikatorceller blev afpipetteret til brøndene, for at visualisere en evt. antigen- antistof reaktion, hvorefter mikrotiterpladen blev centrifugeret for at fremme binding af indikatorceller til evt. bundne antistoffer fra testsera. Reaktionsstyrkerne for hver brønd blev herefter 22

24 aflæst med CCD kamera. En positiv reaktion ses som en sky af indikatorceller bundet i brønden, mens en negativ reaktion ses om en pellet. Efter endt analyse på NEO (Immucor), blev Rh-kontrollerne ved Lu a undersøgelsen kontrolleret og godkendt, hvis disse på NEO (Immucor) blev vurderet negative (score ) og evt. fejlmeddelelser blev gennemset. Tolkning af resultater på NEO (Immucor) Resultater på NEO (Immucor) kan tolkes som graduering - til ++++, ved et billede, beregnet score eller inddelt som positiv/negativ. I holdbarhedsforsøget blev anvendt rådata i form af den score NEO (Immucor) beregner, mens resultater fra metodesammenligningen blev omsat til positive, inkonklusive eller negative ud fra apparaturets og afdelingens fastsatte cut-off værdier, se tabel 1. Afdelingen vurderer resultater for fænotypebestemmelser på NEO (Immucor) der giver + og ++ som inkonklusive. (Se bilag 7) Tolkning af resultater på NEO (Immucor) A 1 Lu a Lu b Negativ 0,000-23,000 0,000-20,000 0,000-20,000 Inkonklusiv 23,000-50,000 20,000-40,000 20,000-40,000 Positiv (+) 50,000-50,000 40,000-50,000 40,000-50,000 Positiv (++) 50,000-50,000 50,000-72,000 50,000-72,000 Positiv (+++) 50,000-80,000 72,000-90,000 72,000-90,000 Positiv(++++) 80,000-99,999 90,000-99,999 90,000-99,999 Tabel 1 Viser hvordan scoren på NEO (Immucor) tolkes for fænotyperne A 1, Lu a og Lu b. KIA vurderer resultater med + og ++ som inkonklusive. Databehandling Metodesammenligning Til behandling af rådata i metodesammenligningen blev opstillet en kontingenstabel i 3x3 format for hver fænotype, hvor resultater fra den manuelle teknik blev sammenholdt med resultater fra automatiseret teknik på NEO (Immucor). Resultaterne blev inddelt i Positive, Inkonklusive og Negative efter afdelingens krav til et positivt resultat samt NEO s (Immucor) cut-off værdier. Der er ikke foretaget yderligere beregninger på resultater fra A 1 bestemmelsen. Resultater fra Lu a og Lu b bestemmelserne blev konverteret 23

25 til 2x2 tabel, hvor inkonklusive og konklusive for hver metode blev sammenholdt i Fishers eksakte test. Beregningerne blev udført vha. det statistiske værktøj I Gp 1, Class 1 blev indsat antallet af inkonklusive resultater ved manuel teknik. I Gp 1, Class 2 er indsat antal konklusive resultater ved manuel teknik. I Gp 2, Class 1 er indsat antallet af inkonklusive resultater på NEO (Immucor) og i Gp 2, Class 2 er indsat antal konklusive resultater på NEO (Immucor). Ved beregning af Fishers eksakte test, fås en p- værdi, der angiver sandsynligheden for at H 0 hypotesen fejlagtigt forkastes. P-værdier opnået ved Fishers eksakte test, blev sammenholdt med signifikansniveauet α= 0,05, hvor der accepteres en sandsynlighed for ved en fejl at forkaste H 0 hypotesen, på op til 5 %. Ved en p- værdi > 0,05 accepteres H 0 hypotesen dermed, og ved en p-værdi < 0,05 kan H 0 hypotesen ikke accepteres, men i stedet accepteres H A hypotesen (Se bilag 15). Holdbarhedsforsøg Af resultater fra holdbarhedsforsøget blev fremstillet xy- plots, der gav overblik over hver prøves reaktionsstyrke for hver analyseringsdag. Der blev ikke foretaget yderligere beregninger på resultater fra A 1 bestemmelsen. Ud fra resultaterne for Lu a og Lu b bestemmelserne, blev fremstillet xy-plots, hvor resultaterne fra hver opbevaringstemperatur blev sammenholdt. Heri blev indtegnet identitetslinjen x=y, der er en ret linje med skæring i 0,0, som angiver hvor punkterne bør ligge hvis reaktionsstyrkerne for hver opbevaringstemperatur er ens. Vha. probit-plot for hver prøve for hver dag hhv. ved 4 o C og stuetemperatur, blev det undersøgt om data var normalfordelte. Det kunne ikke antages, og resultaterne fra alle analyseringsdage 1,2,4,7,10 og 14 blev sammenholdt i en Friedmantest. Ud fra denne test blev beregnet en p-værdi, som blev sammenholdt med signifikansniveauet α=0,05. Ved p-værdier > 0,05 blev H 0 hypotesen accepteret og ved p-værdier< 0,05 kunne H 0 hypotesen ikke accepteres, men i stedet måtte H A hypotesen accepteres. På resultaterne fra Lu a bestemmelsen ved begge temperaturer, blev desuden beregnet Friedmantest, hvor kun analyseringsdagene 1,2,4,7 og 10 blev sammenholdt. Til beregning af Friedmantesten blev anvendt XLSTAT version (Addinsoft ), og til fremstilling af xy-plots blev anvendt Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation) (Se bilag 15). 24

26 Resultater Metodesammenligning mellem manuel teknik og NEO (Immucor) A1 Resultaterne fra analysering af 15 prøver for blodtypeantigenet A 1 med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) ses i tabel 2, og er inddelt som positive, inkonklusive og negative ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier, der for denne fænotype er ens. Af tabel 2 ses at ingen af de 10 positive prøver bestemt ved manuel teknik, blev bestemt negative på NEO (Immucor). Af de 5 negative prøver bestemt ved manuel teknik, blev ingen bestemt positive på NEO (Immucor). Hverken ved manuel teknik eller på NEO (Immucor) er der ved A 1 fænotypebestemmelsen fundet inkonklusive resultater, hvorfor Fishers eksakte test kan undlades. (Bilag 16) Manuelteknik Positiv Inkonklusiv Negativ Total Positiv NEO Inkonklusiv Negativ Total Tabel 2: Kontingens tabel i 3x3 format der angiver antallet af positive, inkonklusive og negative resultater ved bestemmelse af A 1 med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor). Disse er inddelt efter afdelingens og NEO (Immucor)s cutoff værdier, der for denne fænotype er ens. Lu a Resultater fra analysering af 20 prøver for blodtypeantigenet Lu a med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) ses i tabel 3, og er inddelt som positive, inkonklusive og negative ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Væsentligste resultater er præsenteret herunder. Ud fra afdelingens cut- off værdier ses at ingen af de 13 positive prøver bestemt ved manuel teknik er bestemt negative på NEO (Immucor), og ingen af de 6 prøver bestemt positive på NEO (Immucor), er negative ved manuel teknik. Ud af de 13 positive prøver bestemt ved manuel teknik, blev 8 bestemt inkonklusive på NEO (Immucor). Ud af 2 inkonklusive prøver bestemt ved manuel teknik, blev 1 bestemt inkonklusiv og 1 bestemt positiv på NEO (Immucor). Ud fra NEO s (Immucor) cut- off værdier, ses det at 25

27 ingen af de 13 positive bestemt ved manuel teknik er bestemt negative på NEO (Immucor), og at ingen af de 12 positive bestemt på NEO (Immucor) er bestemt negative ved manuel teknik. Ud af de 13 positive prøver bestemt ved manuel teknik, er 2 inkonklusive og 11 positive på NEO (Immucor). (Bilag 17) Manuelteknik Positiv Inkonklusiv Negativ Total Positiv 5 (11) 1 (1) 0 (0) 6 (12) NEO Inkonklusiv 8 (2) 1 (1) 1 (1) 10 (4) Negativ 0 (0) 0 (0) 4 (4) 4 (4) Total Tabel 3: Kontingenstabel i 3x3 format, der angiver antallet af positive, inkonklusive og negative resultater ved bestemmelse af Lu a med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor), ud fra afdelingens positive og negative cut- off værdier for begge metoder. Tallene i parentes angiver antallet af prøver der er angivet hhv. positive, inkonklusive eller negative sammenholdt med NEO (Immucor)s positive og negative cut-off værdier. Ud fra afdelingens cut- off værdier sammenholdes antallet af inkonklusive og konklusive prøver fra hver metode overfor hinanden i Fishers eksakte test. P-værdien fås til 0,0069, hvilket angiver en sandsynlighed på 0,69 % for, at der begås en fejl når H 0 hypotesen forkastes. Ved signifikans niveau på 0,05 fås at 0,0069<0,05 og dermed forkastes H 0 hypotesen og H A hypotesen accepteres. Tilsvarende er antallet af inkonklusive og konklusive resultater ud fra NEO (Immucor)s cut- off for hver metode, sammenholdt i Fishers eksakte test. P- værdien fås til 0,33. Ved signifikansniveau 0,05 får at 0,33>0,05 og dermed kan H 0 hypotesen accepteres (Bilag 15). Lu b Resultaterne fra analysering af 20 prøver for blodtypeantigenet Lu b med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) ses i tabel 4, og er inddelt i positive, inkonklusive og negative ud fra afdelingens og NEO (Immucor)s positive og negative cut-off værdier. Væsentligste resultater er præsenteret herunder. Ud fra afdelingens cut-off værdier ses, at ingen af de 11 positive prøver bestemt ved manuel teknik er bestemt negative på NEO (Immucor), og at ingen af de 15 positive prøver bestemt på NEO (Immucor), er bestemt negative ved manuel teknik. Ud af de 11 positive prøver bestemt ved manuel teknik blev 11 bestemt positive på NEO (Immucor). Ud af 5 inkonklusive prøver, bestemt ved manuel teknik blev 1 26

28 bestemt inkonklusiv og 4 positive på NEO (Immucor). Ud af 2 prøver bestemt inkonklusive på NEO (Immucor) er 1 inkonklusiv og 1 negativ ved manuel teknik.(bilag 18) Manuelteknik Positiv Inkonklusiv Negativ Total Positiv 11 (11) 4 (5) 0 (0) 15 (16) NEO Inkonklusiv 0 (0) 1 (0) 1 (1) 2 (1) Negativ 0 (0) 0 (0) 3 (3) 3 (3) Total Tabel 4: Kontingenstabel i 3x3 format, der angiver antallet af positive, inkonklusive og negative resultater fundet ved Lu b bestemmelsen med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor), ud fra afdelingens positive og negative cutoff værdier for begge metoder. Tallene i parentes angiver antallet af positive, inkonklusive eller negative inddelt efter NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. 1 prøve var i ProSang angivet som Lu(b-), men blev ved begge metoder bestemt som Lu(b+) og blev fortsat medtaget. Ud fra afdelingens cut- off værdier sammenholdes antallet af inkonklusive og konklusive prøver bestemt ved hhv. manuel teknik overfor automatiseret teknik på NEO (Immucor)i Fishers eksakte test. P-værdien fås til 0,2037, hvilket angiver en sandsynlighed på 20 % for at der begås en fejl hvis H 0 hypotesen forkastes. Ved signifikans niveau på 0,05 fås at 0,2037>0,05 og H 0 hypotesen accepteres (Bilag 15). Holdbarhedsforsøg A1 Ved analysering af 5 donorblodprøver med fænotypen A 1 på hhv. dag 1,2, 4, 7, 10 og 14 opbevaret ved hhv. 4 C og stuetemp. på NEO (Immucor), er reaktionsstyrkerne inddelt ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Prøver til A1 bestemmelse opbevaret ved 4 o C Ud fra figur 5, ses at alle 5 prøver opbevaret ved 4 o C, dag 1-14 bestemmes positive for A 1 ud fra afdelingens og NEO (Immucor)s cut-off, hvorfor Friedmantest samt yderligere xy- plots kan undlades. (Bilag 19) 27

29 Reaktionsstyrke, score Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Holdbarhedsforsøg over 14 dage på A 1 ved 4 o C Analyseringsdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr NEO/ Afd. Positiv cutoff Negativ cutoff Figur 5: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen A 1 opbevaret ved 4 o C. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO s (Immucor) krav til positive og negative cut- off værdier 28

30 Reaktionsstyrke, score Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Prøver til A1 bestemmelse opbevaret ved stuetemperatur Ud fra figur 6, ses at alle 5 prøver opbevaret ved stuetemp., dag 1-14 bestemmes positive for A 1 ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) cut-off, hvorfor Friedmantest samt yderligere xy- plots kan undlades (Bilag 19) Holdbarhedsforsøg over 14 dage på A 1 ved stuetemp Analyseringsdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr NEO/ Afd. Positiv cutoff Negativ cutoff Figur 6: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen A 1 opbevaret ved stuetemp.. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO (Immucor)s krav til positive og negative cut- off værdier. Lu a Ud fra xy- plot ses reaktionsstyrkerne ved analysering af 10 donorblodprøver med fænotypen Lu a opbevaret ved hhv. 4 o C (figur 1) og stuetemperatur (figur 2) analyseret på dag 1,2, 4, 7, 10 og 14 på NEO (Immucor). Af grafen fremgår desuden NEO s (Immucor) positive og negative cut- off værdier. Væsentligste resultater er præsenteret herunder. 29

31 Reaktionsstyrke, score Reaktionsstyrke, score Reaktionsstyrke, score Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Prøver til Lu a bestemmelse opbevaret ved 4 0 C Af figur 7 ses det dag 1, at 6 prøver accepteres som positive og 4 prøver som inkonklusive ud fra afdelingens cut- off, mens 8 prøver er positive og 2 prøver er inkonklusive ud fra NEO (Immucor)s cut- off værdier. Dag 7 accepteres 2 prøver som positive, 7 prøver som inkonklusive og 1 prøve som negativ ud fra afdelingens cut- off værdier, mens 7 prøver er positive, 2 inkonklusive og 1 prøve negativ ud fra NEO (Immucor)s cut- off værdier. Dag 10 accepteres 5 prøver som positive, 4 prøver som inkonklusive og 1 prøve som negativ ud fra afdelingens cut- off, mens 7 prøver er positive, 2 inkonklusive og 1 negativ ud fra NEO (Immucor)s cut- off værdier. Dag 14 ses at 8 prøver er inkonklusive og to prøver negative ud fra afdelingens cut- off, mens 3 prøver er positive, 5 inkonklusive og 2 negative ud fra NEO (Immucor)s cut- off (Bilag 20) Holdbarhedsforsøg på Lu a ved 4 o C (1) Analyseringdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positive cut-off NEO positiv cut-off Negativ Cut-off Holdbarhedsforsøg på Lu a ved 4 o C (2) Analyseringdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positive cut-off NEO positiv cut-off Negativ Cutoff Figur 7: xy-plots ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lu a 30 opbevaret ved 4 o C. Reaktionsstyrkerne beregnet som en score på NEO (Immucor) er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO (Immucor)s krav til positive og negative cut- off værdier. (1) Alle prøver er afbildet, (2) Prøver som ud fra afdelingens cut- off er positive dag 1 er afbildet, (3) Prøver som ud fra afdelingens og NEO (Immucor)s cut- off er vurderet inkonklusive dag 1 er afbildet Holdbarhedsforsøg på Lu a ved 4 o C (3) Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positive cut-off Analyseringdage NEO positiv cut-off Negativ Cutoff

32 Reaktionsstyrker for analysering af Lu a ved 4 o C for alle analyseringsdage, sammenholdes i en Friedmantest og p-værdien fås til 0,002, der angiver en sandsynlighed på 0,2 % for at der begås en fejl hvis H 0 hypotesen forkastes. Ved signifikans niveau på 0,05 ses at 0,002< 0,05 og H 0 hypotesen forkastes. Ved derefter at sammenholde analyseringsdagene 1,2,4,7 og 10, dvs. dag 14 undlades, fås p-værdien 0,573. Ved signifikansniveau 0,05 fås at 0,573>0,05 og H 0 hypotesen accepteres (Bilag 15). Prøver til Lu a bestemmelse opbevaret ved stuetemperatur Af figur 7 ses det dag 1, at 5 prøver accepteres som positive og 5 prøver som inkonklusive ud fra afdelingens cut- off, mens 8 prøver er positive og 2 prøver er inkonklusive ud fra NEO (Immucor)s cut- off værdier. Dag 4 accepteres 1 prøve som positiv, 8 prøver som inkonklusive og 1 prøve som negativ ud fra afdelingens cut- off, mens 5 prøver accepteres som positive og 4 inkonklusive og 1 negativ ud fra NEO (Immucor)s cut- off værdier. Dag 14 ses at 8 prøver er inkonklusive og 2 prøver negative ud fra afdelingens cut- off, mens 2 prøver er positive, 6 inkonklusive og 2 negative ud fra NEO (Immucor)s cut- off (Bilag 20). 31

33 Reaktionsstyrke, score Reaktionsstyrke, score Reaktionsstyrke, score Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Holdbarhedsforsøg på Lu a ved stuetemp.(2) Analyseringsdage Holdbarhedsforsøg på Lu a ved stuetemp.(1) Analyseringsdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positive cut-off NEO positiv cut-off Negativ Cutoff Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positive cut-off NEO positiv cut-off Negativ Cut-off Figur 8: xy-plots ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lu a opbevaret ved stuetemp.. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO (Immucor)s krav til positive og negative cut- off værdier. (1) Alle prøver er afbildet, (2) Prøver som ud fra afdelingens cut- off er positive dag 1 er afbildet, (3) Prøver som ud fra afdelingens og NEO (Immucor)s cut- off er vurderet inkonklusive dag 1 er afbildet Holdbarhedsforsøg på Lu a ved stuetemp.(3) Analyseringdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positive cut-off NEO positiv cut-off Negativ Cutoff Reaktionsstyrker for alle analyseringsdage ved analysering af prøver med Lu a, opbevaret ved stuetemp., sammenholdes i en Friedmantest og p-værdien fås til 0,014, hvilket angiver at sandsynligheden er 1,4 % for at der begås en fejl hvis H 0 hypotesen forkastes. Ved signifikans niveau på 0,05 ses det at 0,014< 0,05 og H 0 hypotesen forkastes, hvorved H A hypotesen må accepteres. Når analyseringsdagene 1,2,4,7 og 10 sammenholdes, dvs. dag 14 undlades, fås p-værdien 0,181. Ved signifikansniveau 0,05 fås at 0,181>0,05 og H 0 hypotesen accepteres (Bilag 15). 32

34 Reaktionsstyrker, 4 O C Reaktionsstyrker, 4 O C Reaktionsstyrker, 4 O C Reaktionsstyrker, 4 O C Reaktionsstyrke, 4 o C Reaktionsstyrker, 4 O C Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur Af figur 9 ses, at de målte reaktionsstyrker ved hhv. 4 o C og stuetemperatur dag 1, 2 og 4 ligger ligeligt fordelt omkring den indtegnede identitetslinje (x=y). Dag 7 ligger 6/10 prøver over identitetslinjen. Dag 10 ses at 5/10 punkter ligger over identitetslinjen. Dag 14 ligger 6/10 prøver over identitetslinjen Dag 1 Lu a (a) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 4 Lu a (c) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 10 Lu a (e) Reaktionerstyrker, stuetemp. Dag 1 Lu(a+) (a) Lineær (Dag 1 Lu(a+) (a)) 0 Dag 4 Lu(a+) (c) Lineær (Dag 4 Lu(a+) (c)) Dag 10 Lu(a+) (e) Lineær (Dag 10 Lu(a+) (e)) Dag 2 Lu a (b) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 7 Lu a (d) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 14 Lu a (f) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 2 Lu(a+) (b) Lineær (Dag 2 Lu(a+) (b)) Dag 7 Lu(a+) (d) Lineær (Dag 7 Lu(a+) (d)) Dag 14 Lu(a+) (f) Lineær (Dag 14 Lu(a+) (f)) Figur 9: xy-plot hvor reaktionsstyrker ved 4 o C er sat som funktion af reaktionsstyrker ved stuetemperatur. Grafen viser sammenhængen mellem reaktionsstyrkerne ved Lu(a+) fænotypebestemmelsen på 10 prøver opbevaret hhv. 4 o C og stuetemperatur Der er indtegnet identitetslinje hvor x=y. 33

35 Lu b Ud fra xy- plot, ses reaktionsstyrkerne ved analysering af 10 donorblodprøver for Lu b opbevaret hhv. 4 o C (figur 4) og stuetemperatur (figur 5) analyseret dag 1,2, 4, 7, 10 og 14 på NEO (Immucor). Af grafen fremgår desuden afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut- off værdier. Herunder er væsentligste resultater præsenteret. Prøver til Lu b bestemmelse opbevaret ved 4 o C Af figur 10 ses dag 2, at 8 prøver accepteres som positive og 2 prøver inkonklusive ud fra afdelingens cut- off, mens 10 prøver er positive ud fra NEO s (Immucor) cut- off værdier. Dag 7 udgik prøve nr pga. clot og ud fra afdelingens cut- off ses det at 8 prøver er positive og 1 inkonklusiv, mens 9 prøver er positive ud fra NEO (Immucor)s cut- off. Dag 14 er 10 prøver positive både for afdelingens og NEO s (Immucor) cut- off værdier (Bilag 21). 34

36 Reaktionsstyrke, score Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Holdbarhedsforsøg over 14 dage ved på Lu b ved 4 o C Analyseringsdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positiv cut-off NEO positiv cut-off Negativ cut-off Figur 10: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lu b opbevaret ved 4 o C. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO (Immucor)s krav til positive og negative cut- off værdier. Reaktionsstyrker for alle analyseringsdage ved analysering af prøver med fænotypen Lu(b+), opbevaret ved 4 o C sammenholdes i en Friedmantest. Prøve nr er ikke medtaget i beregningerne af Friedmantesten, da der ikke er data for dag 7. P-værdien fås til 0,874, hvilket angiver en sandsynlighed på 87 % for at der begås en fejl hvis H 0 hypotesen forkastes. Ved signifikans niveau på 0,05 ses det at 0,874 >0,05 og H 0 hypotesen accepteres (Bilag 15). Prøver til Lu b bestemmelse opbevaret ved stuetemperatur Ud fra figur 11 ses dag 7, at 6 prøver er positive og 4 inkonklusive ud fra afdelingens cut- off, mens 9 prøver er positive og 1 inkonklusiv ud fra NEO s (Immucor) cut- off værdier. Dag 10 er 7 prøver positive og 3 inkonklusive ud fra afdelingens cut- off, mens 9 prøver er positive og 1 inkonklusive ud fra NEO (Immucor)s cut- off værdier. Dag 14 blev pakkede erytrocytter fra prøve nr vasket 2 x med PBS pga. clot. Herefter bestemmes 8 prøver positive og 2 som inkonklusive ud fra afdelingens cut- off, mens 10 prøver bestemmes positive ud fra NEO s (Immucor) cut- off værdier (Bilag 21). 35

37 Reaktionsstyrke, score Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Holdbarhedsforsøg over 14 dage på Lu b ved stuetemp Analyseringsdage Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Prøvenr Afd. Positiv cut-off NEO positiv cut-off Negativ cut- off Figur 11: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lu b opbevaret ved stuetemp.. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO (Immucor)s krav til positive og negative cut- off værdier. Reaktionsstyrker for alle analyseringsdage ved analysering af prøver med fænotypen Lu b, opbevaret ved stuetemp., sammenholdes i en Friedmantest og p-værdien fås til 0,026, hvilket angiver en sandsynlighed på 2,6 % for at der begås en fejl hvis H 0 hypotesen forkastes. Ved signifikans niveau på 0,05, ses det at 0,026< 0,05 og H 0 hypotesen forkastes og derved må H A hypotesen accepteres (Bilag 15). 36

38 Reaktionsstyrker, 4 o C Reaktionsstyrker, 4 o C Reaktionsstyrker, 4 o C Reaktionsstyrker, 4 o C Reaktionsstyrker, 4 o C Reaktionsstyrker, 4 o C Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur Af figur 6 ses det, at de målte reaktionsstyrker på prøver med fænotypen Lu b, opbevaret ved hhv. 4 o C og stuetemperatur dag 1, 2, 4, 7, 10 og 14, ligger ligeligt fordelt omkring identitetslinjen Dag 1 Lu b (a) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 4 Lu b (c) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 10 Lu b (e) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 1 Lu(b+) (a) Lineær (Dag 1 Lu(b+) (a)) Dag 4 Lu(b+) (c) Lineær (Dag 4 Lu(b+) (c)) Dag 10 Lu(b+) (e) Lineær (Dag 10 Lu(b+) (e)) Figur 12: xy-plots hvor reaktionsstyrker ved 4 oc er sat som funktion af reaktionsstyrker ved stuetemperatur. Grafen viser sammenhængen mellem reaktionsstyrkerne ved Lu(b+) fænotypebestemmelsen på 10 prøver opbevaret hhv. 4 o C og stuetemperatur. Der er indtegnet identitetslinje x=y Dag 2 Lu b (b) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 7 Lu b (d) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 14 Lu b (f) Reaktionsstyrker, stuetemp. Dag 2 Lu(b+) (b) Lineær (Dag 2 Lu(b+) (b)) Dag 7 Lu(b+) (d) Lineær (Dag 7 Lu(b+) (d)) Dag 14 Lu(b+) (f) Lineær (Dag 14 Lu(b+) (f))

39 Diskussion Metodesammenligning Udledte sammenhæng af A 1 bestemmelsen Ud fra de opnåede resultater af A 1 bestemmelsen angivet i tabel 2, ses ingen diskrepans mellem den manuelle teknik og NEO (Immucor) ved fænotypebestemmelse af A1, og at ingen inkonklusive resultater er opnået hverken ved manuel teknik eller på NEO (Immucor). Udledte sammenhænge af Lu a bestemmelsen Ud fra de opnåede resultater af Lu a bestemmelsen angivet i tabel 3, ses ikke diskrepans, hvor nogle prøver bestemmes positive ved den ene metode, mens de bestemmes negative ved den anden metode. I stedet ses det, at der opnås inkonklusive resultater ved begge metoder. Det ses at en stor del af prøverne, 8/13, bestemt positive ved manuel teknik, er inkonklusive på NEO (Immucor). Antallet af inkonklusive resultater opnået ved Lu a bestemmelse på NEO (Immucor), er 10/20, sammenholdt med 2/20 prøver der bestemmes inkonklusive ved manuel teknik. Dette viser at der ikke er direkte ukorrekte resultater, men at der opstår langt flere reanalyseringer ved Lu a bestemmelse på NEO (Immucor). Beregningerne af Fishers eksakte test, bekræfter som observeret, en signifikant forskel mellem antallet af inkonklusive resultater opnået ved de to metoder. Resultater inddelt med NEO s (Immucor) cut- off, viser at antallet af inkonklusive der bestemmes positive ved manuel teknik ændres fra 8/13 til 2/13. Ved beregninger af Fishers eksakte test ud fra resultaterne, inddelt efter NEO s (Immucor) cut- off værdier, bekræftes at der ingen signifikant forskel er mellem antallet af inkonklusive og konklusive resultater opnået ved metoderne. Udledte sammenhænge af Lu b bestemmelsen Ud fra tabel 4, ses resultater opnået ved metodesammenligning af Lu b bestemmelsen. Der ses ingen diskrepans mellem metoderne, hvor prøver er bestemt positiv ved den ene metode, men negative ved den anden. Det ses at NEO (Immucor) har et større antal positive prøver end den manuelle teknik, og at antallet af inkonklusive prøver for en manuelle teknik er 5/20, mens 2/20 prøver vurderes inkonklusive på NEO (Immucor). Ved beregning af Friedmantest, kan der dog ikke påvises signifikant forskel mellem antallet af inkonklusive og konklusive prøver bestemt ved de to metoder, hvilket betyder at det ikke ud fra testen kan påvises at NEO (Immucor) er bedre til at bestemme Lu b selvom resultaterne kunne indikere dette. 38

40 Kvaliteten af resultaterne og metodiske overvejelser Det kan antages at resultaterne fra den manuelle bestemmelse af A 1, Lu a og Lu b er valide, da de medtagede positive og negative kontroller alle blev godkendt, hvilket nedsætter risikoen for at der ved analysering har været falsk positive eller falsk negative resultater. Desuden er opnået ensartet aflæsning af resultaterne. Resultaterne fra A 1, Lu a og Lu b bestemmelsen på NEO (Immucor), kan antages at være valide da ensartet analysering blev opnået, og den medtagende Rh- kontrol blev godkendt i alle tilfælde, hvilket betyder at falsk positive resultater pga. spontan agglutination eller in vivo sensibilisering ikke forekommer. Idet alle prøver blev analyseret samme dag, både manuelt og på NEO (Immucor), er risikoen for at andre variabler, så som opbevaringstid har haft indflydelse på det enkelte resultat, nedsat. Dermed er resultaterne fra den manuelle bestemmelse og bestemmelsen på NEO (Immucor) sammenlignelige. Stikprøven i A 1 bestemmelsen er på 15 prøver, hvilket ved denne fænotypebestemmelse viser sig tilstrækkeligt til at påvise om der er forskel mellem metoderne, da det bliver tydeligt ud fra nærværende resultater at variationen mellem målingerne af prøverne i A 1 fænotypebestemmelsen er meget lille. For at styrke undersøgelsen yderligere og få et mere repræsentativt billede af hele populationen, kunne have været medtaget flere prøver. Dog kan det antages at resultaterne fra A 1 bestemmelsen er kvalitetssikrede og valide, og dermed kan give svar på om det har betydning for resultatet af A 1 bestemmelsen at anvende NEO (Immucor) sammenholdt med manuel teknik. Det var forventet at se en relativt lille variation i Lu a og Lu b bestemmelsen, og derfor var stikprøven valgt til 20 prøver, sammensat af hetero- og homozygote prøver (3). Variationen i bestemmelsen af Lu a er i nærværende studie blevet påvist at være større end forventet inden undersøgelsens begyndelse. Det kunne have styrket undersøgelsen, at bestemme flere prøver for Lu a på NEO (Immucor), og eventuelt bestemme de enkelte prøver flere gange, for at vurdere usikkerheden af målingerne ved Lu a bestemmelsen. Desuden kunne genomisk bestemmelse af prøver, hvor metoderne var uenige have vist et endeligt resultat. Ud fra nærværende undersøgelse er det muligt at vurdere om det har betydning for resultaterne af Lu a bestemmelsen at anvende NEO (Immucor), sammenholdt med manuel teknik. Ved bestemmelse af Lu b blev prøve nr med fænotypen Lu(a+ b-), bestemt Lu(b+) af begge metoder. Normalt vil afdelingen stole på en positiv reaktion ved manuel teknik, og derfor blev denne prøve medtaget som positiv i metodesammenligningen, hvilket er med til at styrke undersøgelsen af NEO`s (Immucor) præstation ved bestemmelse af Lu b ved heterozygote prøver. Det var ikke muligt at fremskaffe en ny prøve som kunne fungere som Lu(b-) i metodesammenligningen. Derfor blev antallet af Lu(b-) prøver reduceret til 4. Det kunne have styrket undersøgelsen at have erstattet den prøve som tidligere var fejlbestemt, således at der havde været 5 negative prøver, da disse prøver er med til at vise om NEO 39

41 (Immucor) har en god nok specificitet for Lu b. Resultater fra nærværende undersøgelse gør det muligt at vurdere, hvilken betydning det har for resultatet at anvende NEO (Immucor) til bestemmelse af Lu b. Diskussion af udledte sammenhænge for A 1 bestemmelsen De opnåede resultater for fænotype bestemmelsen af A 1, er i overensstemmelse med resultater fra Yamada et. al. fra 2008, der sammenlignede automatiseret AB0 bestemmelse i mikrotiterplader på Galileo (Immucor) med den allerede anvendte t- PEG metode på 287 prøver. Studiet fandt 100 % overensstemmelse mellem de to metoder (24). Resultaterne fra metodesammenligningen stemmer også godt overens med tidligere nævnte studie af Sandler et al. fra 2000 (20). Analyseprincipperne anvendt i ovennævnte studier, svarer til det anvendte analyseprincip i nærværende undersøgelse. Ovennævnte studier undersøger ikke specifikt A 1 antigener, men antigener som er til stede både hos A 1 og A 2 individer. (3). Det er dog muligt at anvende studierne til at underbygge fund fra nærværende undersøgelse. Det er som tidligere nævnt ikke klart hvilke strukturer der adskiller A 1 og A 2 individer og derfor er det testsera der anvendes til differentiering af A- subtyper, som anvendes i nærværende undersøgelse, ikke specifikt rettet mod strukturer på A 1 individers erytrocytter. Af indlægssedlen til Anti- A 1 Lectin testsera fremgår det, at seraen er udvundet af Dolichos biflorus (Bilag 2). Dolichos lectin testsera detekterer N- acetylgalactosamin (GalNAc), der er en struktur som indgår i både A 1 - og A- antigener, og ved stor nok koncentration vil erytrocytter fra A 2 individer også agglutinere (3). Dermed er det den kvantitative forskel af antigener på erytrocytmembranen mellem fænotyperne der udnyttes når disse subtyperes, hvilket må betyde at både A 1 og A 2 individer generelt detekteres når A bestemmes, og dermed også i ovennævnte studier (3). Resultater fra nærværende studie viser, at der ingen forskel er på de to metoders evne til at bestemme A 1, og at det uden yderligere undersøgelser og tiltag, fremover er muligt at anvende NEO (Immucor) til A 1 bestemmelse på KIA. Diskussion af udledte sammenhænge for Lu a bestemmelsen Resultaterne fra metodesammenligningen viser at NEO (Immucor), ud fra afdelingens cut- off værdier, er signifikant ringere til at bestemme Lu a, end den nuværende manuelle metode. For afdelingen vil det betyde at en stor del af de prøver der skal fænotypebestemmes for Lu a må reanalyseres. Det er ikke et problem i transfusionsmæssig forstand, da det ofte er muligt at fremsøge en anden donor med den nødvendige fænotype. Det vil dog betyde øget arbejdsbyrde, der tager tiden fra andet arbejde i laboratoriet, samt øgede omkostninger, hvor prisen som tidligere nævnt pr. analyse af Lu a på NEO (Immucor)er estimeret til 35 kr., sammenholdt med prisen ved manuelle analyser som er ca. 10 kr. (Bilag 22). I litteraturen er beskrevet betydelig variationen i antigenisiteten af Lu a, både mellem individer og mellem erytrocytterne i 40

42 det enkelte individ, og desuden var det også forventet at ses svagere reaktioner ved heterozygote individer (2)(3). Dette stiller ekstra krav til testsera, som anvendes ved detektering af blodantigenet, idet koncentrationen af antistoffer skal være tilstrækkelig, til at detektere de svageste reaktioner, men også specifikt nok således at kun Lu a detekteres (2)(3). At der i nærværende studie ikke ses entydige forskelle i resultaterne for hetero- eller homozygote prøver for Lu a, kan skyldes at denne forskel er relativt lille sammenholdt med den variation der ses i resultaterne på baggrund af nedarvet variation i antigenisiteten. (Se bilag 20) Afdelingen har tidligere ved Kell bestemmelse oplevet for svagt testsera på NEO (Immucor), hvilket også kan være tilfældet ved Lu a bestemmelsen. Resultaterne viser, at der er signifikant forskel mellem metoderne, når det er afdelingens cut- off der anvendes. Ved anvendelse af NEO s (Immucor) cut- off, ændres 6 prøver fra at være inkonklusive til positive, og derefter er enigheden om antallet af positive 11 /13 jf. tabel 2. Dette betyder at de prøver som ændrer resultat til positive, også er bestemt positive ved manuel teknik. Desuden bekræfter Fishers eksakte test, beregnet ud fra resultater inddelt efter NEO s (Immucor) cut- off, at der ikke kan påvises en signifikant forskel mellem metoderne. Dette indikerer at det kunne være relevant at nedsætte cut- off værdierne for Lu a fænotypebestemmelsen. Det bør i overvejelsen om at nedsætte cut- off værdien dog medtages, at dette vil indsnævre grænsen mellem et positivt og et inkonklusivt resultat. Resultater med scorer ml vurderes på nuværende tidspunkt inkonklusive (+, ++ på NEO (Immucor), mens resultater med scorer ml betragtes som inkonklusive ved anvendelse af NEO s (Immucor) cut- off(bilag 7). Det bør derfor overvejes om risikoen for at få et falskt positivt resultat gør usikkerheden for stor ved at medtage + som positivt. Det er dog i transfusionsmæssig sammenhæng mere problematisk at få et falsk negativt resultat ved fænotypebestemmelse af donorer, fremfor et falsk positivt. Ved falsk negative resultater af en fænotypebestemmelse, kan forekomme at en patient modtager blod, som er antigenpositivt med et blodtypeantigen som patienten ikke bærer på erytrocytterne. Dermed er der risiko for at vedkomne danner irregulære antistoffer mod det respektive blodtypeantigen. På nuværende tidspunkt gælder det for fænotypebestemmelsen af N- blodtypeantigenet på KIA, at resultater med ++ godtages som positive, og at der ved validering af N fænotypebestemmelse blev opnået flere inkonklusive svar. Dette problem blev løst ved at tilføje ekstra inkubationstid. Det kunne også være en mulig løsning ved Lu a bestemmelsen at tilføje ekstra inkubationstid, således at antistoffer får mere tid til at bindes til blodtypeantigenerne, dog vil dette også medføre lavere produktivitet (14). Ud fra nærværende studie har det stor betydning for resultatet, at anvende NEO (Immucor) til bestemmelse af Lu a, og vil medføre øget arbejdsbyrde og store økonomiske omkostninger at pga. et stort antal reanalysering. Mulige løsninger 41

43 kunne være optimering af testsera, øget inkubationsstid og ændring af cut- off værdier, dette kræver dog yderligere undersøgelser. Diskussion af udledte sammenhænge for Lu b bestemmelsen Ud fra resultaterne af Lu b bestemmelsen, ses at NEO (Immucor) har færre inkonklusive prøver sammenholdt med den manuelle teknik. Det observerede bekræftes ved beregning af Friedmantest, der ikke kan påvise nogen signifikant forskel mellem metoderne. Både i litteraturen og af erfaring med bestemmelse af Lu b på afdelingen, er det kendt at antigenisiteten af Lu b antigenerne kan udvise variation, og dermed er svage reaktioner/inkonklusive prøver ikke usædvanligt ved den manuelle metode (2)(3). Ud fra tabel 4, bekræftes at der ses flere svage reaktioner ved manuel bestemmelse af Lu b. Det kan ikke påvises ud fra nærværende studie at NEO (Immucor) er bedre til at bestemme Lu b selvom antallet af inkonklusive resultater ud fra tabel 4 nedsættes ved bestemmelse på NEO (Immucor). Dog blev prøven der var ukorrekt bestemt i ProSang meget stærkt positiv på NEO (Immucor), mens den kun blev svagt positiv ved manuel teknik. Dette indikerer at NEO (Immucor) formentlig ved undersøgelse af flere prøver kunne påvises at være en smule bedre end den manuelle metode. Dog videreføres stadig nogle af de problemer der allerede opleves ved manuel bestemmelse af Lu b ved anvendelse af NEO (Immucor). Resultaterne af nærværende studie viser at NEO (Immucor) er tilsvarende god til at bestemme Lu b som den manuelle teknik, og dermed fremover kan anvendes til Lu b bestemmelse. Fast fase teknologi og Genotypisk blodtypebestemmelse Den automatiserede Capture- R SELECT metode, er kendt som en valid metode, der har været anvendt siden 1980 erne i Canada og USA (19). En generel fordel ved automatisering af analyser er, at menneskelige fejl minimeres(19). Endvidere standardiseres aflæsningen, hvilket netop er en udfordring ved de manuelle teknikker, hvor korrekt og ensartet aflæsning kræver erfaring (19). Ifølge et review af Knight et al. fra 1996 (11) og Rumsey et al. fra 2000 (19), er en af fordelene ved anvendelse af fast fase teknologier, at store grupper af prøver kan analyseres på kort tid, sammenholdt med manuel bestemmelse, hvilket er en stor fordel for KIA, der fænotypebestemmer donorer fra hele Region Syddanmark, og hvor omkostninger samt produktivitet vægtes højt(11)(19). Som det ses i nærværende undersøgelse, kan variationen i antigenisiteten af især Lu a, men også Lu b antigenerne være stor, og bestemmelsen af disse blodtypeantigener en udfordring for Capture- R SELECT metoden, med antigen-antistof reaktionen som grundlag for detektionen. Ved analysering af Lu a og Lu b vil der dermed stadig være en større arbejdsbyrde relateret til reanalysering, og dermed også unødvendige omkostninger(23). På trods af forbedringer og automatisering af Capture- R teknologien gennem årerne, er der stadig udfordringer, som der endnu ikke 42

44 er blevet fundet løsning på (23). Testsera til mindre undersøgte fænotyper er svært tilgængeligt, og desuden kan forekomme in vivo sensibiliserede erytrocytter (positiv DAT) som vanskeliggør den serologiske undersøgelse (1). Disse problemstillinger har medført øget diskussion af anvendelse af genotypisk blodtypebestemmelse i bl.a. reveiws af David J. Antesee fra 2009 (1) og Maryse St-Louis, 2014 (28) samt studier der undersøger anvendelse af forskellige molekylærbiologiske metoder til genomisk blodtypebestemmelse (8)(9). Et studie af Karpasitou et al. 2007, undersøgte vha. microarray beads, hvor PCR opformerede SNP er, associeret med udvalgte blodtypeantigener bl.a. Lu a og Lu b, blev undersøgt ved hybridsering til mikropartikler bundet til allelspecifikke oligosakkarider (9). Resultaterne blev sammenholdt med resultater fra den allerede anvendte hæmagglutination metode. Studiet fandt at der var fuld overensstemmelse mellem metoderne for disse blodtypeantigener. I et studie af Jungbauer et al. fra 2010 (8) blev anvendelse af Multiplex Polymerase Chain Reaction (Multiplex- PCR) undersøgt til genotypisk blodtypebestemmelse af bl.a. Lu a og Lu b. Studiet fandt fuld overensstemmelse mellem den kendte fænotype bestemt serologisk, og den genomisk bestemte blodtype (8). Udfordringer for fast fase teknologien kunne måske overvindes med genotypisk blodtypebestemmelse, der dog har været forbundet med store omkostninger og tidskrævende analyser, hvor det ikke har været muligt med de eksisterende metoder at analysere flere blodtypeantigener, samt et særligt stort antal prøver ad gangen. De senere år er der dog udviklet metoder som omkostningsmæssigt bedre kan konkurrere med de serologiske analyser, men mange molekylærbiologiske analysemetoder er dog stadig tidskrævende sammenholdt med de serologiske(8)(9)(23). I overvejelserne omkring fremover at anvende genotypisk blodtypebestemmelse af donorer må det medtages at ikke alle patienter danner irregulære antistoffer, eller har brug for fænotypeudvalgt blod, hvilket betyder at informationen vedr. donors fænotype, udover AB0 og RhD ikke anvendes ved alle transfusioner. Dette betyder at det formentlig ikke er her de fleste penge ønskes brugt. Endvidere er donorfænotypebestemmelse ikke en hastesag indenfor blodbanksvirksomhed, da det ofte vil være muligt at finde en anden blodkomponent med den ønskede fænotype. I reviewet af David J. Antesee (1) diskuteres udfordringer ved at bestemme blodtyper genomisk, bl.a. med AB0 systemet, hvor mutationer med oprindelse i flere gener, afgør om en person bærer fænotypen A 1 eller O. Det vil i tranfusionsmæssig sammenhæng, være en alvorlig fejl at forveksle disse to blodtyper. Ud fra nærværende studie er bestemmelsen af A 1 blodtypeantigenerne ikke en udfordring for NEO(Immucor) (tabel 2), og skal heller ikke anvendes i forbindelse med transfusion. I modsætning til AB0 systemet, er mindre væsentlige, men dog undersøgte blodtypesystemer, så som Lutheran, relativt nemme at bestemme genotypisk, da forskellen mellem disse ligger i en enkelt nukleotid substitution(1)(8)(9). I fremtiden er det muligt at 43

45 molekylærbiologiske analysemetoder, kan erstatte de serologiske analyser, dette kræver dog yderligere undersøgelser og tilpasning af metoderne (1)(8)(23). Holdbarhedsforsøget Udledte sammenhænge ved A 1 bestemmelserne Af figur 5 og figur 6 der angiver resultater fra A 1 bestemmelserne af prøver opbevaret ved hhv. 4 o C og stuetemp., ses ikke nogen klinisk relevant forskel mellem reaktionsstyrkerne over analyseringsdagene, hverken ved 4 o C eller stuetemperatur, idet alle prøver forbliver positive, ud fra både afdelingens og NEO s (Immucor) cut- off værdier, gennem hele den undersøgte periode. Udledte sammenhænge ved Lu a bestemmelserne Af figur 7, der angiver resultater af prøver bestemt for Lu a, opbevaret ved 4 o C, ses det ud fra afdelingens cut- off dag 1, at kun 60 % af prøverne bestemmes positive. Dag 4 ses det at én prøve går fra at være inkonklusiv til at blive bestemt negativ, hvilket er klinisk relevant idet en negativ prøve ikke ombestemmes, og dermed afgives et falsk svar. Dag 7 fremgår at kun 20 % af prøverne bestemmes positive, hvilket betyder, at et større antal prøver skal reanalyseres, og dermed øges arbejdsbyrden og omkostninger i forbindelse med analysen. Dag 14 er alle prøver enten inkonklusive eller negative. Den udførte Friedmantest bekræfter, at fænotypebestemmelsen afhænger af antallet af dage blodprøverne opbevares. Anvendes testen kun på dagene 1-10, forsøges p-værdien, således at denne bliver større end signifikansniveauet, og resultatet af fænotypebestemmelsen kan antages at være uafhængigt af analyseringsdagene. Trods den signifikante forskel mellem dagene først indtræder ved 14 dage, ses der af figur 7 betydeligt fald i reaktionsstyrkerne allerede dag 7, men også en tendens til, at en del af disse prøver bestemmes positive, igen dag 10. Dag 4, 7 og 10 kan der af figur 7 observeres en sammenhæng i forløbet af prøverne , , og , hvor styrken af reaktionsstyrkerne mellem dagene varierer betydeligt. Disse prøver tilhører alle hold 2, hvilket indikerer at en anden variation end opbevaringstiden har haft betydning for disse reaktionsstyrker (Bilag 20). Forløbet ses kun ved prøver opbevaret ved 4 o C, hvilket indikerer at det ikke skyldes variation i analysering på NEO (Immucor), da prøver fra begge temperaturer blev analyseret sammen. Dog blev der dag 7 og 10 for analysering af disse prøver skiftet indikatorceller, der ved mangelfuld temperering til stuetemperatur kan give falsk positive resultater (Bilag 23). Det ses dog kun for dag 10, at resultaterne er høje, men det kunne skyldes at prøverne er blevet analyseret i en anden rækkefølge dag 7, og indikatorcellerne derved har opnået den ønskede temperatur eller at tempereringen kun har været mangelfuld dag 10. Forløbet kunne også skyldes prøvernes 44

46 opbevaring, dog opbevares alle prøverne ved 4 o C i samme kølerum, og derfor burde der ses et mere entydigt forløb ved alle prøver opbevaret ved 4 o C. Antallet af inkonklusive resultater dag 1, er 4/10 og det kan derfor forventes at en stor del af prøverne bestemmes inkonklusive førend den signifikante forskel mellem dagene indtræder. Dette er tilfældet da blot en lille ændring af reaktionsstyrken for prøver med generelt lave reaktionsstyrker, betyder at resultatet bliver inkonklusivt, selvom denne reduktion ikke kan påvises at være signifikant. Af figur 7, ses der ved anvendelse af NEO s (Immucor) cut- off værdier, sammenfald mellem den signifikante forskel og hvornår reaktionsstyrkernes reducering har betydning for afdelingen. Den kliniske relevante forskel indtræder først dag 14 hvor det ses at 5/10 prøver er inkonklusive og 2/10 prøver negative. Af figur 8, der angiver reaktionsstyrkerne for prøver opbevaret ved stuetemperatur, ses generelt lavere reaktionsstyrker efter dag 1, sammenholdt med figur 7. Dette indikerer at reaktionsstyrkerne generelt er stærkere på prøver opbevaret ved 4 o C. Af figur 8 ses dag 1 at 50 % af prøverne bestemmes inkonklusive dag 1. Dag 4, ses at kun 10 % af prøverne bestemmes positive, og at 1 prøve går fra at være inkonklusiv til at bestemmes negativ. Dag 10 ses at antallet af positive prøver øges en smule, mens 1 prøve stadig bestemmes negativ. Dag 14 bliver 80 % af prøverne inkonklusive mens 20 % er negative. Den udførte Friedmantest bekræfter det observerede, idet p-værdien er mindre end signifikansniveauet og dermed afhænger fænotypebestemmelsen af antallet af dage blodprøven opbevares. Anvendes testen kun på dagene 1-10, forsøges p-værdien således at denne bliver større end signifikans niveauet, og resultatet af fænotypebestemmelsen kan antages at være uafhængigt af analyseringsdagene. Dermed er det også dag 14, der ses en signifikant fald i reaktionsstyrkerne ved stuetemperatur. Da 5/10 prøver allerede dag 1, er inkonklusive, vil der opnås en betydelig forskel i reaktionsstyrkernes ændring for afdelingen førend en signifikante forskel indtræder. Når reaktionsstyrkerne sammenholdes med NEO s(immucor) cut- off værdier, ses det at 20 % af prøverne dag 1 bliver inkonklusive. De efterfølgende dage ses det, at variationen i reaktionsstyrkerne for flere af prøverne, betyder at det samme antal bliver inkonklusive dag 4, 7 og 10, men at eks. prøve nr går fra at være positiv dag 2 til inkonklusiv dag 4, til positiv igen dag 7 og inkonklusiv dag 10 og 14. Af figur 9, hvor reaktionsstyrkerne for hver temperatur er sammenholdt for hver dag, ses der dag 1,2 og 4 ikke nogen entydig forskel mellem opbevaringstemperaturerne. Dag 7 ses en tendens til at 4 prøver har højere reaktionsstyrke ved 4 O C og at 1 prøve har en højere reaktionsstyrke ved stuetemperatur. Dag 10 ses også at flere prøver har en højere reaktionsstyrke ved 4 o C, men denne forskel aftager på dag 14 hvor 5/10 prøver ved 4 o C har den højeste reaktionsstyrke. 45

47 Udledte sammenhænge for Lu b bestemmelserne Af figur 10 fremstillet for reaktionsstyrkerne ved Lu b opbevaret ved 4 o C, ses der ikke noget entydigt fald i reaktionsstyrkerne over analyseringsdagene. Den udførte Friedmantest, bekræfter, at resultatet for fænotypebestemmelsen af Lu b ikke afhænger af antallet af dage blodprøven opbevares. Af figur 11 fremstillet for reaktionsstyrkerne ved bestemmelse af Lu b på prøver opbevaret ved stuetemperatur, ses sammenholdt med resultater fra 4 o C generelt, at variationen mellem de enkelte målinger dag 7 og dag 10 er større ved stuetemperatur. Tre prøver der tidligere bestemmes positive, bestemmes inkonklusive dag 7, mens 2 af disse også bestemmes inkonklusive dag 10. Disse prøver , , , og , tilhører samme hold, og er dermed analyseret på samme tidspunkt (Bilag 21). Prøverne bestemmes alle positive igen dag 14, hvilket indikerer at noget andet end opbevaringstiden har haft indflydelse på resultaterne. Ud fra figur 10, ses at reaktionsstyrkerne for de nævnte prøver også reduceres væsentlig sammenholdt med andre prøver ved 4 o C dag 7 og 10, hvilket tyder på at forløbet af prøverne kunne være påvirket af en fejl opstået ved analysering. Dag 7 for analysering af disse prøver var der problemer med Lu b profilen efter analyse af disse 4 prøver. Dette en sofware fejl, der gør at prøverne slet ikke kan analyseres, og bør ikke påvirke selve analysen eller reaktionsstyrkerne. Dag 10 blev prøverne analyseret efter reparation af NEO (Immucor), hvor spejlet til CCD kameraet blev skiftet. Dette burde dog ikke nedsætte reaktionsstyrken, da et renere spejl nedsætter den mængde baggrundsstøj der fratrækkes reaktionsstyrkerne. Ovenfor nævnte usikkerhed taget i betragtning, kan det overvejes om disse prøver var blevet bestemt positive hvis kun tiden havde påvirket reaktionsstyrkerne. Ud fra NEO s (Immucor) cut- off værdier ses, at alle prøverne bestemmes positive. Prøve nr er inkonklusiv dag 1, både ved 4 o C og stuetemp. ud fra afdelingens cut- off. Reaktionsstyrken på denne prøve er dog efterfølgende stabil gennem hele undersøgelsen ved stuetemperatur, mens den bestemmes positiv dag 14, ved 4 o C. Der ses ikke nogen stor ændring i resultatet af prøver fra samme hold, analyseret på samme tidspunkt som denne prøve ( , og ) (Bilag 20)(figur 10), og derfor kan det ikke skyldes generelt stærkere reaktionsstyrker på prøver analyseret den dag. Hvis det skyldes en fejl af apparaturet ville der fremkomme fejlmeddelelser på resultatet, hvilket heller ikke var tilfældet. Den tilsvarende prøve opbevaret ved stuetemperatur blev vasket 2 X med PBS dag 14, hvilket kunne forventes at øge reaktionsstyrken. Derfor kunne det overvejes om der er sket en forveksling af prøverne i resultaterne, hvilket dog ikke er sandsynligt da der er blevet tjekket op på dette efterfølgende. Ud fra Friedmantesten ses, at p-værdien er lavere end signifikansniveauet og resultatet af fænotypebestemmelsen afhænger dermed af antallet af dage blodprøven opbevares. Af figur 12 hvor 46

48 reaktionsstyrkerne for hhv. prøver opbevaret ved 4 o C og stuetemperatur sammenholdes, ses det at der ingen af dagene forekommer entydig tendens til at reaktionsstyrkerne er stærkere ved 4 o C fremfor stuetemperatur. Kvaliteten af Resultaterne og Metodiske overvejelser Prøverne til holdbarhedsforsøget af A 1, Lu a og Lu b er delt, således at der blev opnået parrede data, hvilket gav mulighed for direkte sammenligning af disse. Prøverne anvendt i undersøgelsen var opdelt i forskellige hold, og er dermed analyseret på forskellige dage, men det er forsøgt at ensarte analysering således at ukendte variabler ikke kunne påvirke resultaterne. Dette øger dog usikkerheden på resultaterne, da det ikke er muligt fuldstændigt at undgå forskellige i analysering når denne foregår over 4 uger. Undervejs er desuden udført reparation på NEO (Immucor) som øger sandsynligheden for at ukendte variabler kan påvirke bestemmelserne. Ud fra data af A 1 bestemmelserne synes dette ikke at have påvirket resultaterne, idet ingen prøver afviger sammenholdt med de andre prøver(bilag 19). Det ses af figur 7, som tidligere nævnt at der ved analysering af prøver i Lu a bestemmelsen, på hold 2 opbevaret ved 4 o C, ses et ensartet forløb, og dermed kan det formodes at der er en betydelig usikkerhed på disse resultater, hvilket også bør indgå ved anvendelse af disse. Ved bestemmelse af Lu b ses desuden en sammenhæng ved prøverne fra hold 3 opbevaret ved begge temperaturer, hvilket også giver en betydelig usikkerhed ved disse resultater. Usikkerheden af Friedmantesten beregnet på Lu b prøver opbevaret ved 4 o C, er øget da prøve nr ikke indgår. Stikprøven i denne undersøgelse er 5 prøver for A 1 bestemmelsen, hvilket ikke er en stor stikprøve ud fra et statistisk synspunkt, men da alle prøver har et entydigt forløb ved begge temperaturer er det muligt at udlede en klar tendens ud fra resultaterne. Det kunne have styrket undersøgelsen at medtage et større antal prøver, men ud fra de opnåede resultater ses et resultaterne er entydige, og kan dermed antages at være valide. Stikprøvestørrelsen for Lu a og Lu b bestemmelsen i denne undersøgelse er på 10 prøver, hvor både heterozygote og homozygote prøver er repræsenteret, hvilket kunne give et mere nuanceret billede af bestemmelsen af disse over tid, på NEO (Immucor), og en eventuel sammenhæng mellem fænotype og holdbarhed. Det ses af figur 7 og 8 at variationen mellem målingerne for Lu a de respektive dage er stor, og dermed kunne en større stikprøve have forbedret mulighederne for at konkludere på resultaterne. At indsamle prøver kun fra OUH, kunne have øget kendskabet til opbevaring og behandling af materialet forinden undersøgelsens begyndelse, og derved nedsat en mulig variation heraf. Resultaterne af Lu a bestemmelserne i dette projekt, er omfattet af afvigelser, og stor variation. Dette betyder at resultaterne ikke kan give et klart billede af hvordan opbevaringstid og - temperaturer påvirker Lu a, men kan anvendes 47

49 til at udlede en tendens. Resultaterne af holdbarhedsforsøget på Lu b er omfattet af usikkerhed, men indikerer hvordan Lu b påvirkes af opbevaringstid- og temperaturer. Det kunne have styrket undersøgelsen, at alle prøver til bestemmelse af de respektive fænotyper, blev analyseret på samme tidspunkt, og at have medtaget flere prøver således undersøgelsen blev mere robust og dermed mindre sårbar overfor afvigelser. Diskussion af udledte sammenhænge for A 1 bestemmelserne Opbevaring af blod kan som nævnt medføre morfologiske ændringer, hvorved dele af erytrocytmembranen kan forsvinde og proteiner og lipider i membranen kan gå tabt. Da A 1 antigener er oligosakkarider bundet til lipider i membranen indikerer dette, at opbevaring af blodprøver til A 1 bestemmelse kan have betydning for ekspressionen af A 1 antigenerne(7)(21)(22). I tidligere nævnte studie af Sparrow et al., blev detekteret en signifikant stigning i niveauet af Annexin V efter 28 dage (22). Studiet af Seghatchian et al. fandt en mindre forskel i niveauet, mellem blod opbevaret ved hhv. 4 o C og stuetemp. dag 7, mens en markant forskel optrådte, dag 21 (21). Sammenhængen observeret i studierne stemmer derfor godt overens med at bestemmelsen af A 1 antigenerne ikke påvirkes klinisk relevant af opbevaringstid over 14 dage, eller af forskellige opbevaringstemperatur. Producenten af NEO (Immucor) angiver en holdbarhed for blodprøver til analysering i Hæmagglutination Assay, på 14 dage ved opbevaring ml. 2-6 o C (Bilag 2). Derfor kunne det ud fra disse anbefalinger forventes, en mindre forandring af reaktionsstyrkerne mellem opbevaringstemperaturerne over den undersøgte periode. At bestemmelsen af A 1 antigenerne ikke påvirkes af opbevaringsdage og opbevaringstemperatur kan skyldes, at antallet af antigener på erytrocytmembranen er ca x 10 5 antigener, overfor eks. Lu(a- b+) med antigener på erytrocytterne. Dette kan bevirke, at et evt. tab af antigener har relativt mindre betydning for reaktionsstyrken(7). Resultaterne i nærværende undersøgelse viser at reaktionstyrkerne af A 1 bestemmelsen ikke påvirkes af opbevaring i op til 14 dage, og at der desuden ikke ses en forskel i reaktionsstyrken ud fra opbevaringstemperaturen. Det er derfor muligt at afdelingen fremadrettet, kan opbevare blodprøver til A 1 bestemmelse ved stuetemperatur i 14 dage. Diskussion af udledte sammenhænge for Lu a bestemmelserne Ved opbevaring af blod, kan der udover tidligere nævnte erytrocytcelleskade desuden forekomme, at leukocytter i blodprøven nedbrydes, og frigiver proteaser som kan påvirke ekspressionen af protein antigener, så som Lu a (7). Sparrow et al. fandt at ekspressionen af udvalgte IgSF glykoproteiner, først aftog væsentligt efter opbevaring i 28 dage, hvilket ikke stemmer overens med, at der i nærværende studie er fundet en signifikant forskel efter 14 dage (22). At der ses en signifikant forskel dag 14 ved begge temperaturer stemmer heller ikke overens med producentens anbefaling vedr. holdbarhed, da denne 48

50 angiver at blodprøver til analysering i Capture- R SELECT må være 14 dage gamle(bilag 1). Selvom der i ovennævnte studie først dag 28, sås væsentlige forandringer i ekspressionen, er det muligt at mindre forandringer i ekspression kan påvirke Lu a bestemmelsen generelt, da der ved Lu a kan ses stor variation i antigenisiteten, individer imellem, men også mellem erytrocytterne hos samme person (2)(3). Sidst nævnte kan også forklare den store variation der ses i målingerne af den enkelte prøve over analyseringsdagene, da måleusikkerheden ved kvalitative analyser, ifølge afdelingen er så lille at denne ikke kan estimeres (5). Der var ved analysering på NEO (Immucor), ingen problemer med monolayer, da apparaturet melder fejl når ukorrekt monolayer opstår. Dette stemmer ikke overens med den oplevelse afdelingen har haft med prøver ældre end 7 dage(15). Der er til gengæld observeret en stor andel inkonklusive prøver. Da der generelt ses lave reaktionsstyrker, dag 1, (figur 7 og figur 8) kan det være vanskeligt at vurdere om den reducering af reaktionsstyrkerne over de 14 dage, har reel betydning for antallet af reanalyseringer og den kliniske relevans, da højere reaktionsstyrker i udgangspunktet, formentlig ville udskyde hvornår prøverne blev inkonklusive og negative. Ud fra figur 9 ses ved Lu a bestemmelsen, stærkere reaktionsstyrker ved 4 o C, dag 7 og 10, dog aftager denne forskel dag 14, men det ses stadig at flere prøver har en stærkere reaktionsstyrke ved 4 o C. Resultaterne for temperatursammenligningen peger på, at den forskel der ses ikke er tilfældig, da den forekommer over flere dage. Dette stemmer også overens med at producenten anbefaler at prøver til analysering i Capture- R SELECT opbevares ved C, samt studiet af Seghatchian et al., der fandt forskel mellem celleskade i prøver opbevaret ved 4 o C og stuetemperatur allerede dag 7.(Bilag 1)(21). Enzymatiske processer foregår hurtigere i blod opbevaret ved stuetemperatur, fremfor blod opbevaret ved 4 p C, men det har ikke kun betydning hvornår der ses en forskel i celleskaden mellem de to temperaturer, men også hvor stor celleskade, og frigivelse af proteaser der skal til, førend Lu a antigenernes ekspression, og dermed Lu a bestemmelsen påvirkes. Her må igen medtages det forhold at der ses en stor variation i ekspressionen af Lu a antigener erytrocytterne imellem, hvilket også kan gøre Lu a bestemmelsen mere følsom overfor opbevaringstemperatur. Den signifikante forskel mellem reaktionsstyrkerne har betydning, men for afdelingen har det større betydning hvornår det ses at antallet af prøver der skal reanalyseres er betydeligt, samt den klinisk relevante forskel, hvor en prøve bestemmes falsk positiv eller falsk negativ. Ved anvendelse af NEO s (Immucor) cut- off, nedsættes antallet af inkonklusive prøver, men ændrer ikke på hvornår den kliniske relevante ændring af reaktionsstyrkerne indtræder ved 4 o C. På trods af usikkerheden på resultaterne og et stort antal inkonklusive prøver allerede dag 1, kan det dog udledes at stærkeste reaktionsstyrker ved Lu a bestemmelse opnås af prøver opbevaret ved 4 o C, og at antallet af 49

51 inkonklusive resultater ved denne opbevaringstemperatur stiger markant dag 7, hvilket vil betyde større arbejdsbyrde hvis prøverne opbevares i 7 dage. Diskussion af de udledte sammenhænge for Lu b bestemmelserne Resultaterne for opbevaring af Lu b ved 4 o C viser ingen signifikant eller klinisk relevant forskel mellem dagene, hvilket stemmer godt overens med studiet af Sparrow et al., og producentens anbefalinger. Dette viser desuden at Lu b bestemmelsen ikke synes så følsom som Lu a bestemmelsen (22). Ved stuetemperatur ses en statistisk signifikant forskel mellem dagene, men sammenholdt med studiet af Sparrow et. al, producentens angivne holdbarhed, og det tidligere nævnte forløb prøver der er inkonklusive dag 7 og 10 og positive igen dag 14, synes det muligt at reduceringen af reaktionsstyrkerne skyldes anden påvirkning(1)(22). Usikkerheden af disse resultater vanskeliggør vurdering af om den fundne statistiske signifikans er reel, og om opbevaring af prøver til Lu b bestemmelse ved stuetemperatur har betydning for antallet af inkonklusive resultater. Af figur 8 ses ingen entydig tendens til at opbevaringstemperaturerne påvirker Lu b bestemmelsen, hvilket stemmer overens med studiet af Sehatchian et al., og viser at Lu b bestemmelsen ikke påvirkes af mindre erytrocytcelleskade (21). Den nævnte usikkerhed taget i betragtning, kan det ud fra resultaterne af holdbarhedsforsøget med Lu b udledes at Lu b bestemmelsen ikke påvirkes betydeligt af opbevaringstemperaturen og at prøverne til Lu b bestemmelse kan opbevares ved 4 o C i 14 dage. Dertil kan det ikke med sikkerhed udledes om opbevaring af prøver til Lu b bestemmelse ved stuetemperatur har betydning for antallet af inkonklusive resultater. Yderligere undersøgelser bør foretages for at bekræfte dette. Konklusion og Perspektivering Af Resultater fra nærværende metodesammenligning for A 1 og Lu b fremgår det, at ingen eller færre inkonklusive resultater opnås ved bestemmelse på NEO (Immucor) sammenholdt med manuel teknik, og at det derfor fremover er muligt at anvende NEO (Immucor) til bestemmelse af A 1 og Lu b. Desuden fremgår det, af resultaterne for Lu a bestemmelsen, at der ved anvendelse af NEO (Immucor), opnås signifikant flere inkonklusive resultater sammenholdt med manuel teknik. Metoden til Lu a bestemmelse på NEO (Immucor) bør derfor justeres og yderligere validering må foretages før denne kan anvendes. Af holdbarhedsforsøget fremgår det, at resultatet af A 1 bestemmelsen ikke påvirkes af hverken opbevaringstid eller -temperatur, og at prøver til A 1 bestemmelsen derfor kan opbevares ved stuetemperatur i 14 dage. Da det i udgangspunktet er problematisk at bestemme Lu a på NEO (Immucor), er det ud fra nærværende studie ikke muligt at 50

52 konkludere, om der ses en reel klinisk relevant af ændring i reaktionsstyrkerne ved opbevaring over 14 dage. Dog ses der en signifikant forskel ved dag 14 for begge temperaturer, og stærkere reaktionsstyrker ved 4 o, hvilket indikerer at prøverne bør opbevares ved 4 o C, i op til 4 dage. For at bekræfte dette bør foretages yderligere undersøgelser. Resultaterne af Lu b bestemmelsen viser, at reaktionsstyrkerne ikke påvirkes af opbevaringstid over 14 dage ved 4 o C. Ud fra usikkerheden af Lu b resultaterne, kan det ikke entydigt konkluseres hvorvidt det er muligt at opbevare prøver til Lu b bestemmelse ved stuetemperatur i 14 dage, hvilket bør bekræftes af yderligere undersøgelser. I et videre perspektiv kunne det ud fra resultater fra nærværende undersøgelse, være interessant at undersøge, om det er muligt at nedsætte antallet af inkonklusive resultater i Lu a og Lu b bestemmelsen ved at nedsætte cut- off værdien tilsvarende NEO s (Immucor) eller den anvendte ved N- og Kell bestemmelsen på KIA, hvor ++ antages som positivt. Dette kunne gøres ved at bestemme et større antal prøver for Lu a og Lu b på NEO (Immucor), og derefter sammenholde disse med den manuelle metode eller genomisk blodtypebestemmelse. Idet serologiske metoder til fænotypebestemmelse af donorer, stadig rummer udfordringer, der medfører omkostninger og øget arbejdsbyrde, kunne det være interessant at undersøge om andre metoder, så som genotypisk blodtypebestemmelse, fremover kunne anvendes til fænotypebestemmelse af donorer. Dette kunne undersøges ved metodesammenligning af fast fase teknologi på NEO (Immucor) og eks. genotypisk blodtypebestemmelse med Microarray Beads, hvor omkostninger og produktivitet sammenholdes. Litteratur (1) Anstee DJ. Red cell genotyping and the future of pretransfusion testing. Blood 2009 Jul 9;114(2): (2) Daniels G. Lutheran. Immunohematology 2009;25(4): (3) Daniels G. Human Blood Groups. 3rd ed. USA: Blackwell publishing Ltd.; (4) Daniels G, Bromilow I. Essential Guide to Blood Groups, 2nd edition. 2nd ed. USA: Wiley-Blackwell; (5) Georgsen J. Klinisk Immunologisk Afdeling, Odene Universitetshospital, Kvalitetshåndbog (Kvalitetshåndbog). (6) Georgsen J, Hansen MB, Hinnerfeldt F, Sørensen B, Taaning E. Transfusionsmedicinske Standarder. Dansk selskab for Klinisk Immunologi 2014 Februar;3.4( ):

53 (7) Hess JR. Red cell changes during storage. Transfus Apher Sci 2010 Aug;43(1): (8) Jungbauer C, Hobel CM, Schwartz DW, Mayr WR. High-throughput multiplex PCR genotyping for 35 red blood cell antigens in blood donors. Vox Sang 2012 Apr;102(3): (9) Karpasitou K, Drago F, Crespiatico L, Paccapelo C, Truglio F, Frison S, et al. Blood group genotyping for Jk(a)/Jk(b), Fy(a)/Fy(b), S/s, K/k, Kp(a)/Kp(b), Js(a)/Js(b), Co(a)/Co(b), and Lu(a)/Lu(b) with microarray beads. Transfusion 2008 Mar;48(3): (10) Klein HG, Anstee DJ. Mollison s Blood Transfusion in clinical medicine. 12th ed. USA: Wiley Blackwell; (11) Knight RC, de Silva M. New technologies for red-cell serology. Blood Rev 1996 Jun;10(2): (12) Lund ME. Transfusionskomplikationer. 2010; Available at: f5be3d1283da.htm. Accessed 07/05, (13) McCullough J. 9 Blood groups. In: Blackwell KL, editor. Transfusion medicine; p (14) Pedersen MG, Sprogøe U. Valideringsrapport, resultater og konklusion Fænotypebestemmelse, svag RhD screening, svag RhD supplering og donorkontroltype bestemmelse på NEO (15) Pedersen MG. NEO forskrift og oplysninger. Qualiware,Erytrocytlaboratoriet,NEO (16) Plapp FV, Sinor LT, Rachel JM, Beck ML, Coenen WM, Bayer WL. A solid phase antibody screen. Am J Clin Pathol 1984 Dec;82(6): (17) Poole J, Daniels G. Blood Group Antibodies and Thier Significance ind Transfusion Medicine. Transfusion medicine Reviews 2007;21(1):58. (18) Reid ME, Lomas-Francis C, Olsson ML. The Blood Group Factsbook. 3rd ed. USA: Elsvier Ltd.; (19) Rumsey DH, Ciesielski DJ. New protocols in serologic testing: a review of techniques to meet today's challenges. Immunohematology 2000;16(4): (20) Sandler SG, Langeberg A, Avery N, Mintz PD. A fully automated blood typing system for hospital transfusion services. ABS2000 Study Group. Transfusion 2000 Feb;40(2):

54 (21) Seghatchian J, Krailadsiri P. Red cell storage lesion assessed by the levels of potassium, haemoglobin and Annexin V in supernatants. Transfus Apher Sci 2002 Apr;26(2): (22) Sparrow RL, Healey G, Patton KA, Veale MF. Red blood cell age determines the impact of storage and leukocyte burden on cell adhesion molecules, glycophorin A and the release of annexin V. Transfus Apher Sci 2006 Feb;34(1): (23) St-Louis M. Molecular blood grouping of donors. Transfus Apher Sci 2014 Apr;50(2): (24) Yamada C, Serrano-Rahman L, Vasovic LV, Mohandas K, Uehlinger J. Antibody identification using both automated solid-phase red cell adherence assay and a tube polyethylene glycol antiglobulin method. Transfusion 2008 Aug;48(8):

55 Bilag 1- Indlægsseddel Capture- R SELECT 54

56 55

57 56

58 57

59 Bilag 2- Indlægsseddel Anti- A1 Lectin 58

60 59

61 Bilag 3- Indlægsseddel Capture LISS 60

62 61

63 Bilag 4- Priser for analyser på NEO (Immucor) Indberetning af udførte analyser pr. måned til Triolab AS Klinisk Immunologisk afdeling Odense Universitetshospital Att: Marianne G. Pedersen Dato: Initialer: Afregningsmåned og -år: EANnr: Faktura modtager: 4446 Kr. pr valideret analyse inkl. samlerabat 7 % Varenummer Antal Kontrolblodtypebestemmelse incl. PBS 10,85 OUH/0001 Fænotypeprofil IgG+IgM 227,85 OUH/0002 Fænotype k (cellano) min 6 stk. pr. strip 42,75 OUH/0003 Fænotype Kpb min. 6 stk. pr. strip 28,83 OUH/0004 Titrering IgM 8 brønde* 10,00 OUH/0005 Titrering IgG 8 brønde* 50,00 OUH/0006 Fænotype Wra min 6 stk. pr. strip* (Immucor testsera) 33,50 OUH/0007 Fænotype Lua og /eller Lub Fænotype A1 *2014 priser Alle priser er ex moms. Lægges til BAN/MPE sammen med udskrifter fra Neo. til Diannie Boysen Triolab AS: diannie@triolab.dk til administrativt sekretariat: Mads.christensen@rsyd.dk Gitte.voelund@rsyd.dk 62

64 Bilag 5- Indlægsseddel, immuclone Rh Hr- Control 63

65 64

66 Bilag 6- Konklusion ud fra graduering, Manuelle teknikker 65

67 Bilag 7- Konklusion på NEO (Immucor) ud fra gradueringer og omsætning af rådata 66

68 Omsætning af Rådata på NEO (Immucor) A 1 67

69 - Omsætning af rådata på NEO (Immucor) Lu a 68

70 Omsætning af Rådata på NEO (Immucor) Lu b 69

71 Bilag 8- Fremgangsmåde glasteknik bestemmelse af A1 (Øverst) 70

72 Bilag 9- Aflæsningsskema Glasteknik 71

73 Bilag 10- Fremgangsmåde søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, Lu a og Lu b (grøn) 72

74 Bilag 11- Aflæsningsskema Søjleagglutinationsteknik 73

75 Bilag 12- Flowskema Fænotypebestemmelse af A1 på NEO (Immucor) 1 2 Aflæsning af mikrotiterpladen med CCD kamera Afpipettering af 320 µl Galileo Diluent + 3 µl pakkede erytrocytter som blandes. Ved sidste blanding opsuges 270 µl og overfører 53 µl fortynding til Rh-kontrol brønd. 3 Afpipettering af 10 µl Rh- kontrol reagens Afpipettering af 10 µl Anti- A1 Lectin testsera 4 Inkubation af mikrotiterpladen i 300 sek (5 min) ved 20 o C 5 Centrifugering af mikrotiterpladen i 60 sek. ved 80 g + kraftig rystning i 60 sek sek. ved 15 g 6 Resultatet aflæses vha. CCD kamera 74

76 Bilag 13 Flowskema fænotypebestemmelse af Lu a på NEO (Immucor) 75

77 Bilag 14- Flowskema over fænotypebestemmelsen af Lu b på NEO (Immucor) 1 Aflæsning af mikrotiterpladen med CCD kamera 2 Afpipettering af 70 µl system liquid + 3 µl pakkede erytrocytter som blandes. 3 Mikrotiterpladen centrifugeres 60 sek. ved 150 g + 50 sek. ved 500 g 4 Vask af mikrotiterpladen 5 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera (monolayer) 6 Afpipettering 25 µl anti-lu(b) testsera Afpipettering 50 µl LISS 7 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera (LISS farveskift) 8 Inkubationved 39 C i 900 sek (15 min.) 9 Vask 10 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera 11 Afpipettering af 55µl Capture- R indikatorceller 12 Mikrotiterpladen centrifugeres 90 sek. ved 600 g 13 Aflæsning af resultater vha. CCD kamera 76

78 Bilag 15 Databehandling af rådata Fishers Eksakte test- Metodesammenligning Lu a Ud fra afdelingens cut-off værdier Ud fra NEO s (Immucor) cut-off værdier 77

79 N(0,1)-Fraktil Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Lu b Ud fra afdelingens cut-off værdier Eksempler fra undersøgelse af Normalfordeling vha. Probit plot - Holdbarhedsforsøget Rang Dag 1 4 C Sandsynlighed N(0,1)- Fraktil , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,5 1 0,5 Probit plot dag 1 ved 4 C for Lu a R² = 0, , Serie1 Lineær (Serie1) -1,5 Målinger 78

80 N(0,1)- fraktil Professionsbachelorprojekt, 2014 Sandra Gaedt Schmidt Dag 4 rang sandsynlighed fraktil ,1-1, ,2-0, ,5 0,35-0, ,5 0,35-0, ,5 0,55 0, ,5 0,55 0, ,8 0, ,8 0, ,8 0, I følgende undersøgelse er prøve nr taget ud da denne prøve har langt lavere reaktionsstyrker gennem hele forløbet. 1,5 1 0,5 Probit plot dag 4 ved 4 C for Lu b R² = 0, ,5-1 -1, Målinger Serie1 Lineær (Serie1) 79

81 Friedmantest på Lu a prøver opbevaret ved 4 o C, hvor dag 1,2,4,7,10 og 14 sammenholdes Anvendt program: XLSTAT version (Addinsoft ) 80

82 Friedmantest på Lu a prøver opbevaret ved 4 o C, hvor dag 1,2,4,7 og 10 sammenholdes Anvendt program: XLSTAT version (Addinsoft ) 81

83 Friedmantest på Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7,10 og 14 sammenholdes Anvendt Program: XLSTAT version (Addinsoft ) 82

84 Friedmantest på Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7 og 10 sammenholdes Anvendt program: XLSTAT version (Addinsoft ) 83

85 Friedmantest på Lu b prøver opbevaret ved 4 o C, hvor dag 1,2,4,7, 10 og 14 sammenholdes Anvendt program: XLSTAT version (Addinsoft ) 84

86 Friedmantest på Lu b prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7, 10 og 14 sammenholdes Anvendt Program: XLSTAT version (Addinsoft ) 85