(19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT. 24'w. Patent- og Varemærkestyrelsen

Transkript

1 (19) DANMARK (11) DK B1 24'w (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.CI. 8 : C 12 N 7/01 ( ) A 61 K 39/275 ( ) C 07 K 14/01 ( ) C 12 N 15/38 ( ) A 61 K 39/285 ( ) (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (86) International ansøgning nr: PCT/US90/02094 (86) International indleveringsdag: (85) Videreførelsesdag: (30) Prioritet: US US US (73) Patenthaver: Health Research, Inc., Empire State Plaza Tower, Albany, NY 12209, USA (72) Opfinder: Enzo Paoletti, 31 Putland Street, Albany, NY 12209, USA (74) Fuldmægtig: Zacco Denmark A/S, Hans Bekkevolds Alle 7, 2900 Hellerup, Danmark (54) Benævnelse: Rekombinant poxvirus og vaccine mod herpesvirus indeholdende dette (56) Fremdragne publikationer: Ingen (57) Sammendrag: Der beskrives et rekombinant poxvirus, såsom vacciniavirus, fjerkrævirus eller kanariepoxvirus, indeholdende fremmed DNA fra herpesvirus. I en udførelsesform udtrykkes det fremmede DNA i en vært ved dannelsen af et herpesvirus-glycoprotein. I en anden udførelsesform udtrykkes det fremmede DNA i en vært ved dannelsen af mindst to, især to eller tre, herpesvirus-glycoproteiner. Desuden beskrives en vaccine indeholdende det rekombinante poxvirus til inducering af et immunologisk respons i et værtsdyr inokuleret med vaccinen. Ved opfindelsen overvindes eller undgås den maternelle immunitetsbarriere i nyfødt afkom. fortsættes

2 Hind ED A Hind LEI VACCINIA JRE TERMINUS puc8 Sall Hind =I Rsa I EagI Sall psd4 I 9VC Hi nd na Ecor I HindLEI Smal BamHI Sal I LIGER Sal' Rsa I EagI BglII Hind ra Rsa I Smal MPSYN59-62 [2s:3 pst' SYNTETISK EagI DN EcoR I Smal BamHI Sal' Rsa I Rsa I PARTIEL. KINASE EagI LIGER ANNELER Bglil BamHI BamHI EcoRI Bgl EI Sma I BamHI Sall Hind= HG. I EcoRI Smal BamHI Sall Rsa I B glii BamHI Hindlp EagI PstI Smal Rsa I EagI PstI Smal BglEI IN VIVO vp425 vp4 I 0 VC-2 REKOMBINATION

3 i Opfindelsen angår et modificeret poxvirus og metoder til fremstilling og anvendelse deraf. Navnlig angår opfindelsen rekombinant poxvirus, der udtrykker genprodukter af et herpesvirusgen, og vacciner, der giver beskyttende 5 immunitet overfor infektioner med herpesvirus. I beskrivelsen henvises der ved arabiske tal i parentes til adskillige publikationer. I slutningen af beskrivelsen, umiddelbart før kravene, er der en fuldstændig over- 10 sigt over disse henvisninger, der beskriver det stade af teknikken, som den nærværende opfindelse forholder sig til. Opfindelsens baggrund 15 Vacciniavirus, og for nylig andre poxviruser, er blevet anvendt til indsættelse og udtrykkelse af fremmede gener. Den grundlæggende teknik til indsættelse af fremmede gener i levende infektiøse poxviruser indebærer rekombi- 20 nation mellem pox-dna--sekvenser, der flankerer et fremmed genetisk element i et donorplasmid, og homologe sekvenser til stede i hjælperpoxviruset (28). Nærmere betegnet konstrueres de rekombinante poxviruser i 25 to trin, der er kendte inden for teknikken og er analoge med de metoder, der anvendes til dannelse af syntetiske rekombinanter af vacciniavirus, der er beskrevet i US patentskrift nr , hvis indhold er inkorporeret heri ved henvisning. 30 Først placeres den DNA-gensekvens, der skal indsættes i viruset, især en åben læseramme fra en ikke-pox-kilde, i en E. coli plasmidkonstruktion, hvori er indsat DNA homolog med en DNA-sektion fra poxviruset. Den DNA- 35 sekvens, der skal indsættes, ligeres separat til en promoter. Promoter-gen--koblingen anbringes i plasmidkonstruktionen således, at promoter-gen-koblingen i begge

4 2 ender er flankeret af DNA, der er homolog med en DNAsekvens, der flankerer et pox-dna-område indeholdende et ikke-essentielt locus. Den herved fremkomne plasmidkonstruktion amplificeres ved vækst i E. coli-bakterier 5 (11) og isoleres (12,20). Dernæst transficeres det isolerede plasmid indeholdene den DNA-gensekvens, der skal indsættes, ind i en cellekultur, f.eks. kyllingefoster-fibroblaster, sammen med 10 poxviruset. Rekombination mellem homolog pox-dna i henholdsvis plasmidet og det virale genom giver et poxvirus, der i et ikke-essentielt område af sit genom er modificeret ved tilstedeværelsen af fremmede DNA-sekvenser. Udtrykket "fremmed" DNA angiver exogen DNA, især DNA fra en 15 ikke-pox-kilde, der koder for genprodukter, der ikke normalt dannes af det genom, hvori den exogene DNA anbringes. Genetisk rekombination er generelt udveksling af homologe 20 DNA-stykker mellem to DNA-strenge. I visse viruser kan RNA erstatte DNA. Homologe nukleinsyrestykker er stykker af nukleinsyre (DNA eller RNA), der har samme nukleotidbasesekvens. 25 Genetisk rekombination kan forekomme naturligt under replikationen eller ved dannelsen af nye virale genomer inde i den inficerede værtcelle. Således kan der forekomme genetisk rekombination mellem virale gener under den virale replikationscyklus, der foregår i en 30 værtcelle, der er co-inficeret med to eller flere forskellige viruser eller andre genetiske konstruktioner. Et DNA-stykke fra et første genom anvendes konvertibelt til konstruktionen af det område af genomet i et andet coinficerende virus, i hvilket DNAen er homolog med det 35 første virale genoms DNA.

5 3 Imidlertid kan rekombination også finde sted mellem DNAstykker i forskellige genomer, der ikke er helt homologe. Hvis et sådant stykke er fra et første genom, der er homologt med et stykke af et andet genom bortset 5 fra, at der i det første stykke er indsat f.eks. en genetisk markør eller et gen kodende for en antigen determinant, i en del af den homologe DNA, kan der stadig ske rekombination, og produkterne af en sådan rekombination kan da påvises ved tilstedeværelsen af den 10 genetiske markør eller genet i det rekombinante virale genom. For vellykket udtrykkelse i det modificerede infektiøse virus af den indsatte DNA-gensekvens kræves to betingel- 15 ser opfyldt. For det første skal indsættelsen være i et ikke-essentielt område af viruset, således at det modificerede virus forbliver levedygtigt. Den anden betingelse for udtrykkelse af indsat DNA er tilstedeværelsen af en promoter med korrekt forbindelse med den indsatte DNA. 20 Promoteren skal være placeret således, at den befinder sig opstrøms fra den DNA-sekvens, der skal udtrykkes. Der er to undertyper af herpesvirus equi, der, skønt de indeholder krydsneutraliserende epitoper, kan skelnes ved 25 deres antigene profiler, restriktionsendonukleasesærpræg og deres patogenicitet for heste (1). Herpesvirus equi 1 (EHV-1) er forbundet med luftvejslidelser, lidelser i centralnervesystemet og klassiske herpesaborter, hvorimod herpesvirus equi 4 (EHV-4) overvejende 30 er forbundet med luftvejslidelser (1,48). Herpesvirus equi tilhører a-herpesvirus-underfamilien og udviser mange af de typiske biologiske og biokemiske karakteristika af humane herpesviruser, såsom genomisk isomerisation, regulering af genudtrykkelse, etablering af 35 latente infektioner, dannelse af defekte interfererende viruspartikler, inducering af neurologiske lidelser og in vitro oncogen transformation (1,4,23). EHV kan således

6 4 med fordel anvendes til at undersøge de forskellige biologiske konsekvenser af infektion med herpesviruser. Herpesvirus-glycoproteiner formidler essentielle virale 5 funktioner, såsom cellulær fasthæftning og penetrering, spredning af virusen fra celle til celle og, hvad der er vigtigt, bestemmer infektionens patogenicitetsprofil. Herpesvirus-glycoproteiner er kritiske komponenter i samspillet med værtsimmmunsystemet (36,37). 10 De velkarakteriserede glycoproteiner af herpes simplex virus omfatter gb, gc, gd, ge, gg, gh og gi (36,37,49-55). Et antal undersøgelser har indikeret vigtigheden af herpes simplex virus glycoproteiner til fremkaldelse af 15 immunresponser. Det er således rapporteret, at gb og gd kan fremkalde vigtige immunresponser (6,8,13,18,21,22, 26,27,30,44,46,47). gc kan stimulere klasse I restriktionsbundne cytotoxiske lymfocyter (15,32), hvorimod gd kan stimulere klasse II cytotoxiske T-celleresponser 20 (21,22,44,46,47). gg vistes at være et mål for virusneutralisering ved komplementafhængigt antistof (38,39). Et antal glycoproteiner fra andre herpesviruser er også vist at fremkalde vigtige immunresponser (5,10,36,56). 25 Begge undertyper af EHV udtrykker seks glycoproteiner (1,3,43), der forekommer i stor mængde. De genomiske dele af de DNA-sekvenser, der koder for gp2, gp10, gp13, gp14, gp17/18 og gp21/22a, er blevet bestemt ved brug af Ågt11- udtrykkelsesvektorer og monoklonale antistoffer (3). 30 Glycoproteinerne gp13 og gp14 var beliggende i de samme steder indenfor genomets L-komponent, hvor henholdsvis gc- og gb-homologerne af herpes simplex virus er beliggende (3). EHV-1 lader til at være unik blandt de a- herpesviruser, hvis glycoproteingener er blevet kortlagt, 35 derved, at fem af dets seks i størst mængde forekommende glycoproteiner kodes fra sekvenser indenfor genomets L- komponent, mens kun 'e'n (gp17/18) befinder sig i U s -

7 5 området. Ved analyse af disse data er det forudsagt, at nogle af de i lav mængde forekommende glycoproteiner, der er identificeret i EHV-1 virioner, såvel som endnu ikke identificerede EHV-1-glycoproteiner, kan kortlægges til 5 genomets S-komponent (3). Kappe-glycoproteinerne er de vigtigste immunogener hos herpesviruser og er forbundet med fremkaldelse af både humorale og cellulære immunresponser hos værten (5,8,73-75) og er således af stor interesse for udformning af vacciner. 10 For nylig er nukleotidsekvensen for Kentucky T431- stammens EHV-1 transkriptionsenhed, der koder for gpl3, blevet rapporteret (2). En åben læseramme koder for et 468 aminosyrer stort primært translationsprodukt på kda. Proteinet har de karakteristiske egenskaber for et protein, der spænder over membranen, med ni potentielle N-bundne glycosyleringssteder (Asn-X-Ser/Thr) til stede i overfladedomænet mellem de formodede signaldele og transmembranelt forankrende dele af proteinet (2). Glyco- 20 proteinet vistes at være homologt med herpes simplex virus (HSV) gc-1 og gc-2, med pseudorabies virus (PRV) giii og varicella-zoster virus (VZV gpv (2). EHV-1 gp13 er således den strukturelle homolog af herpesvirus gclignende glycoproteiner. 25 Nukleotidsekvensen for EHV-1 gp14 (71,72) er for nylig blevet rapporteret. Analyse af den beregnede aminosyresekvens for gp14-glycoprotein viste signifikant homologi med det tilsvarende glycoprotein af HSV, gb. 30 Monoklonale antistoffer rettet mod nogle EHV-1 glycoproteiner er vist at være neutraliserende (76). Passive immuniseringsforsøg viste, at monoklonale antistoffer rettet mod gp13 eller gp14 (77) eller mod gpl3, gp14 35 eller gpl7/18 (78) kunne beskytte hamstere mod en dødelig udsættelse for antigen påvirkning. Andre gb og gc glycoproteinanaloge er også involveret i beskyttelse mod syg-

8 6 domme forårsaget af a-herpesviruser (8,10,73). EHV-1 gp17/18 glycoproteinet, skønt karakteriseret som et andet potentielt beskyttende immunogen, havde indtil nu ikke noget kendt strukturelt modstykke blandt de adskillige 5 glycoproteiner, der kodes fra S-komponenten i de andre a- herpesviruser (66,79,80). Baseret på dets genomiske position, har det været overvejet, om gp17/18 kunne være den analoge til HSV ge (2). 10 Pseudorabies virus (PRV), en a-herpesvirus, er årsag til Aujeszky's sygdom. Sygdommen er meget smitsom og medfører alvorlige økonomiske tab inden for svineindustrien. Sygdommen er forbundet med høj sygelighed og dødelighed blandt smågrise og er karakteriseret ved alvorlig respi- 15 ratorisk sygdom, aborter, reduceret kuldstørrelse og nedsat vækstrate hos de overlevende dyr. En hyppig konsekvens af infektion er dødelig encephalitis. Latente virale infektioner, der er karakteristisk for herpes viruser, kan etableres, hvorved helbredte voksne svin 20 fungerer som kroniske bærere af viruset. For et nyere omfattende review, se Wittmann og Rziha (81). PRV-genomet består af en 90 x 10 6 dalton dobbeltstrenget DNA (82) adskilt ved inverterede repeterende sekvenser i 25 unikke lange (U L ) eller unikke korte (Us ) segmenter (83,84). PRV-genomet koder for ca. 100 polypeptider, hvis udtrykkelse reguleres på kaskadelignende vis i lighed med andre herpesviruser (85,86). Indtil nu er fem glycoproteiner, gpl, gpii, gpiii, gp63 og gp50, vist at være for- 30 bundet med den virale kappe og forbundet med de forskellige membranstrukturer i PRV-inficerede celler (80,86-91). Et sjette PRV-kodet glycoprotein (gx) frigives i kulturmediet (92). Disse glycoproteiners fysiske beliggenhed på PRV-genomet og deres DNA-sekvens er almin- 35 deligt kendt (62,80,91-98). Som det er tilfældet for glycoproteinerne fra andre herpesviruser, formidler PRVglycoproteinerne essentielle virale funktioner, såsom

9 7 cellulær fasthæftning og penetrering ind i eller frigørelse fra celler. PRVglycoproteinerne er kritiske i patogenicitetsprofilen ved PRV-infektion og er kritiske komponenter ved sygdomshelbredelse og immunstatus. 5 PRV gpl er ikke-essentiel for virusreplikation in vitro og in vivo og er fraværende i de fleste attenuerede PRV-stammer (99). Den attenuerede natur af disse gpl-deleterede stammer indikerer også en mulig rolle for gpl ved virulens (99,100). Andre PRV-proteiner lader imidlertid til at være involveret i denne funktion, da udtrykkelse af gpl alene ikke er tilstrækkeligt til at frem- 10 bringe høje virulensniveauer (100). Det er uklart, hvilken rolle gpl spiller ved udløsning af et immunrespons mod PRV. Monoklonale antistoffer mod gpl kan neutralisere virus in vitro (101) og passivt beskytte immuniserede mus mod en dødelig udsættelse for antigen 15 påvirkning med PRV (81). Kost et al. (98) har for nylig beskrevet udtrykkelsen af PRV gpl i vacciniavirus-rekombinanter enten alene eller i forbindelse med gp50 og gp63. Intracranial inokulering af mus med vaccinia-rekombinanterne resulterede i øget virulens, især når PRV gpl var forbundet med koekspression af gp50 og gp I svin dannes der imidlertid ikke neutraliserende antistoffer mod gpl (5). Endvidere beskytter et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker PRV gpl-kodede polypeptider (98), ikke mus mod en dødelig udsættelse for antigen påvirkning med PRV (i forhold til den beskyttelse der gives af vildtype-vacciniavirus- 25 kontrollen). Tilsammen tyder disse data på, at PRV gpl er mere passende som en diagnostisk sonde end som en komponent i en underenhedsvaccine. PRV glycoprotein gp63 er beliggende ved siden af gp50 i U s - området af PRV-genomet (80). Kodningssekvensen for PRV

10 8 gp63 begynder med tre på hinanden følgende ATG-codoner beliggende ca. 20 nukleotider nedstrøms for gp5o's stopcodon. Der er ikke noget genkendeligt transkriptionssignal-tema, og translation sker formentlig fra det samme 5 transkript som gp50. PRV gp63 er ikke-essentiel in vitro (88). PRV gp63 i form af en med PRV gp5o kontinuerlig DNA-sekvens er blevet udtrykt i vacciniavirus som rapporteret af Kost et al. (98). Det er vanskeligt at fastlægge PRV gp63's bidrag til beskyttelse i mus mod udsættelse 10 for antigen påvirkning med PRV, da undersøgelserne ikke adskiller bidragene fra PRV gp50 og PRV gp63. PRV glycoprotein gx er et ikke-strukturelt glycoprotein, hvis slutprodukt udskilles i ekstracellulærvæsken 15 (85,92). Der opnåedes ingen in vitro neutralisering af PRV med hverken polyklonale eller monoklonale sera mod PRVgX (102,103), og gx-underenheds-vacciner beskyttede ikke mod udsættelse for antigen påvirkning (104). 20 PRV glycoprotein gp50 er analogen til Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) gd (97). Den åbne DNA-læseramme koder for 402 aminosyrer (95). Den modne glycosylerede form (50-60 kda) indeholder 0-koblet carbonhydrat uden N- koblet glycosylering (95). Svineserum reagerer kraftigt 25 med PRV gp50, hvilket tyder på, at det er et vigtigt immunogen. Monoklonale antistoffer mod gp50 neutraliserer PRV in vitro med eller uden komplement (97,105,106) og giver passiv beskyttelse til mus (102,105,106) og svin (102). Vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker PRV 30 gp5o, inducerede serumneutraliserende antistoffer og beskyttede både mus og svin mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med PRV (98,107,108). PRV gpiii-genet er beliggende i genomets U L-område. Den bp åbne læseramme koder for et protein på 479 aminosyrer. Det 50,9 kda deducerede primære translationsprodukt har otte potentielle N-koblede glycosylerings-

11 g steder (96). PRV gpill er analog til HSV-1 gc (96). Der observeredes ikke funktionel udskiftning af PRV gplll med HSVgC (109). Skønt PRV gpill ikke er essentielt for replikation in vitro (110,111), er den modne glycosylerede form (98 kda) en i rigelig mængde forekommende bestanddel af PRV- 5 kappen. Anti-gplll monoklonale antistoffer neutraliserer viruset in vitro med eller uden komplement (86,106,110) og kan passivt beskytte mus og svin (102). PRV-glycoprotein gplll kan beskytte mus og svin mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med PRV efter immunisering med et Cro/gp111- fusionsprotein udtrykt i E. coli (Robbins, A., R. Watson, L. Enquist, EP an- 10 søgning nr A1) eller ved udtrykkelse i en vaccinia-rekombinant (Panicali, D., L. Gritz, G. Mazzara, EP ansøgning nr A2). En af hovedbestanddelene af PRV-kappen er et disulfidkoblet kompleks af tre glycoproteiner (120 kda, 67 kda og 58 kda) betegnet PRV gpll ifølge 15 Hampl's nomenklatur (86). DNA-sekvensen, der koder for PRV gpll er beliggende i den venstre ende af UL. Den åbne læseramme på 2976 nukleotider koder for et primært translationsprodukt på 913 aminosyrer eller 110 kda. PRV gpll er homolog med HSV-1 gb (62). Monoklonale antistoffer rettet mod PRV gpll er vist at neutralisere viruset in vitro (5) med eller uden komplement 20 (81). Endvidere har undersøgelser af passiv immunisering vist, at neutraliserende monoklonale antistoffer delvis beskytttede svin, men ikke beskyttede mus mod udsættelse for antigen påvirkning med virulent virus (102). Til dato er der ikke rapporteret om aktiv immunisering af svin med PRV gpll glycoprotein. 25 I de sidste 20 år er hyppigheden af genitale infektioner forårsaget af herpes simplex virus type 2 (HSV2) tiltaget signifikant. Nyere beregninger tyder på, at i USA har 5-20 millioner mennesker genital herpes (112). Skønt det er vist, at peroral behandling med acyclovir kan reducere

12 10 sværhedsgraden af primære infektioner (113) og undertrykke tilbagevendende episoder (114), er kontrollen og behandlingen af disse infektioner langt fra ideel. Der er derfor behov for en vaccine til forebyggelse af primære 5 og tilbagevendende infektioner. Herpes simplex virus type 1 (HSV1) genomet koder for mindst otte antigent distinkte glycoproteiner: gb, gc, gd, ge, gg, gh, gi og gj (115). Det lader til, at der 10 findes homologe til disse gener i HSV2 ( ). Da disse glycoproteiner er til stede både i virionkappen og i den inficerede celleplasmamembran, kan de inducere humoral og celle-medieret beskyttende immunrespons (37). 15 Man har ikke fuldstændig belyst den relative vigtighed af humoral og cellulær immunitet ved beskyttelse mod infektioner med herpes simplex virus. Mus immuniseret med oprenset HSV1 gb, gc eller gd er beskyttet mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med HSV1 (120). Mus er 20 også blevet beskyttet mod dødelig udsættelse for antigen påvirkning med HSV1 eller HSV2 ved passiv immunisering med antistoffer mod total HSV1- (121) eller HSV2-virus (122) og med antistoffer mod de individuelle HSV2 gb-, gc-, gd- eller ge-glycoproteiner (123). Denne beskyttelse 25 synes imidlertid at være afhængig af et kompetent T- celle-respons, da dyr, der var immunsupprimeret ved bestråling, cyclophosphamid eller anti-thymocyt-serum, ikke var beskyttet (124). 30 Man forstår ikke helt, hvilken rolle de individuelle glycoproteiner spiller ved fremkaldelsen af et beskyttende immunrespons. Udtrykkelse af disse glycoproteiner et heterologt system, såsom vaccinia, har gjort det muligt at analysere nogle af disse parametre. For eksem- 35 pel er det vist, at vacciniavirus-vektorer, der udtrykker HSV1 gb (125) og HSV1 gc (32), inducerer cytotoxisk T- celle respons. Endvidere er det vist, at mus immuniseret

13 11 med rekombinant vacciniavirus, der udtrykker enten HSV1 gb (8), HSV1 gc (126) eller HSV1 gd (26) er beskyttet mod en udsættelse for dødelig antigen påvirkning med HSV1. Et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker HSV1 gd er 5 også vist at have en beskyttende virkning over for HSV2 i et marsvine-modelsystem (44). Det vides imidlertid ikke, om udtrykkelse af multiple HSV-antigener vil resultere i en forstærkning af dette beskyttende respons. 10 Bovin herpesvirus 1 (BHV1) er ansvarlig for forskellige sygdomme hos kvæg, herunder conjunctivitis, vulvovaginitis og abort (127). Det er også en af de vigtigste faktorer ved bovin respiratorisk sygdom, hvor det enten virker direkte eller som en prædisponerende faktor for 15 bakterieinfektion (128). BHV1 udtrykker over 30 strukturelle polypeptider, hvoraf 11 er glycosylerede (129). Man har karakteriseret fire af disse glycoproteiner, gi, gii, giii og giv, og de er 20 fundet at være homologe med herpes simplex virus (HSV) glycoproteinerne gb, gc, gd og ge (130,131). Underenheds-vacciner bestående af gi, giii og/eller giv er vist at beskytte kvæg mod sygdom (ved anvendelse af en 25 BHV1/Pasteurella haemolytica aerosol-udsættelsesmodel), men ikke mod infektion (132). Disse resultater antyder disse glycoproteiners betydning for frembringelse af et vellykket imunresponse mod BHV1. 30 gi og giii er også ved gensplejsning blevet indsat i vacciniavirus, og kvæg immuniseret med disse rekombinanter er vist at danne neutraliserende antistoffer mod BHV1 (56,133). 35 Rhinotracheitis felis er en almindelig sygdom hos katte med global udbredelse, der forårsages af en a--herpesvirus betegnet felin herpesvirus type i (FHV-i). I lighed med

14 12 andre herpesviruser etablerer FHV-1 en latent infektion, der resulterer i periodisk reaktivering (134). Infektioner med FHV-1 i ynglende kolonier er kendetegnet ved en høj dødelighed blandt killinger. Sekundære infektioner i 5 de Øvre luftveje medfører svækkelse hos voksne katte. Man forsøger for tiden at kontrollere denne sygdom ved anvendelse af modificerede levende vacciner eller inaktiverede vacciner, der kan undertrykke udviklingen af kliniske symptomer, men som ikke forhindrer infektion, der 10 medfører spredning af virus. Vaccinerede katte uden symptomer kan således sprede virulent virus, og latente infektioner kan ikke forebygges med de eksisterende vacciner (135) eller ved de mere sikre vacciner af oprensede underenheder, der er under udvikling (136,137). 15 Glycoproteiner af herpesvirus formidler fasthæftning af virionet til værtcellen og er yderst vigtige ved viral infektion (138,139). De bestemmer også virusets undertypespecificitet (140). Herpesvirus glycoprotein-anti- 20 gener genkendes af såvel det humurale som det cellulære immunsystem og er vist at vække beskyttende immunresponser i vaccinerede værter (44,107,141,142). FHV-1 er vist at indeholde mindst 23 forskellige proteiner (143,144). Ud af disse er mindst fem glycosylerede 25 (144,145) og har rapporterede molekylmasser spændende fra 120 kda til 60 kda. FHV-1 glycoproteinerne er vist at være immunogene (143,145). I lighed med flere andre a-herpesviruser lader det til, 30 at FHV-1 har en homolog til glycoprotein B (gb) fra HSV- 1, og den delvise sekvens af FHV-1 gb-genet er for nylig rapporteret (146). HSV-1 gb er nødvendig for indtrængen af virus og for cellefusion ( ). HBV-1 gb og de gbanaloge fra andre herpesviruser er vist at fremkalde 35 vigtigt cirkulerende antistof såvel som cellemedierede immunresponser (8,10,37,47,73,150). FHV-1 gb-glyco- proteinet er et 134 kda kompleks, der dissocieres med B-

15 13 mercaptoethanol til to glycoproteiner på 66 kda og 60 kda. FHV-1 DNA-genomet er ca. 134 kb stort (153). Epstein Barr Virus (EBV), et humant B-lymfotropt herpes- 5 virus, er et medlem af slægten lymphocryptovirus, der tilhører underfamilien r-herpesvirus (115). Det forårsager infektiøs mononucleosis (154) og B-celle lymfomer (156). EBV er forbundet med to maligne sygdomme hos mennesker: det endemiske Burkitt's lymfom og udifferen- 10 tieret nasopharyngealt carcinom (156). Siden EBV-genomet, ligesom det er tilfældet for genomerne af VZV (66) og HSV1 (158), blev fuldstændigt sekventeret (207), er der beskrevet talrige homologier mellem disse 15 forskellige herpesviruser (159). i nogle tilfælde er disse homologier blevet anvendt til at forudsige de potentielle funktioner af en åben læseramme (ORF) i EBV. De EBV-gener, der er homologe med HSV1-generne involveret i immunitet, er af særlig interesse. Således har EBV 20 BALF4-genet homologier med HSV1 gb (68) og EBV BXLF2- genet med HSV1 gh (161). Endelig indeholder EBV BBRF3- genet homologier med et CMV-membranprotein (162). Blandt EBV-proteinerne er de to vigtigste kappeglyco- 25 proteiner, gp340 og gp220, de best karakteriserede potentielle vaccine-antigener. De er afledt fra det samme gen ved splejsning uden ændring i læserammen (163,164). Monoklonale antistoffer og polyklonale sera rettet mod gp340 neutraliserer EBV in vitro (165). Cottontop 30 tamarin (en art egernabe), der er det eneste modtagelige dyr, kan beskyttes ved en immunisering med oprenset gp340-vacciniavirus (166) og med et rekombinant EBVgp340-vacciniavirus (167). z dette tilfælde blev beskyttelsen opnået med en rekombinant afledt fra WR-vaccinia- 35 stammen, men ikke med en rekombinant afledt fra Wyethvaccinla-stammen. Wyeth-stammen har været almindeligt anvendt som vaccinestamme.

16 14 Monoklonale antistoffer rettet mod gp85, der er EBV-homologen til HSV1 gh, er beskrevet som in vitro neutraliserende antistoffer (168,169). 5 Human cytomegalovirus (HCMV) er et medlem af 13-herpesvirinae-underfamilien (familie Herpesviridae). HCMV kan danne en hårdnakket produktiv infektion på trods af betydelig specifik immunitet. Selv om HCMV i almindelighed har en lav patogenicitet, forårsager intrauterin in- 10 fektion hjerneskade eller døvhed hos ca. 0,15% af alle nyfødte, og det er den mest almindelige infektiøse komplikation ved organtransplantation (170). Skønt man har vist effektiviteten af en eksperimentel levende attenueret (Towne-stamme) HCMV-vaccine (171), har betænkelig hed ved levende vaccinestammer ledt bestræbelserne i retning af identifikation af HCMV-proteiner, der kan bruges som underenhedsvaccine. I disse undersøgelser er et vigtigt skridt identifikationen af virion-glycoproteiner og evalueringen af dem som beskyttende midler. Der er beskrevet tre immunologisk distinkte glycoproteinfamilier forbundet med HCMV-kappen (172): gci (gp55 og gp93-130); gcii (gp47-52); og gciii (gp85-p145). 25 Genet, der koder for gci, er homologt med HSVI gb. gciii-glycoproteinerne kodes af en familie bestående af fem gener (HXLF) arrangeret i tandem og med 'e't eller to homologe områder. Det er sandlynligt, at gcii kodes af kun to af disse gener (172,173). Det gen, der koder for 30 gciii, er homologt med HSVI gh (174). Der er beskrevet in vitro neutraliserende antistoffer specielt rettet mod hver af disse familier ( ). 35 Passende modificeret poxvirus-mutanter, der bærer exogene herpesvirus equi-gener, der i en vært udtrykkes som en antigen determinant, der udløser værtens dannelse af

17 15 antistoffer mod herpesvirusantigener, repræsenterer hidtil ukendte vacciner, der undgår konventionelle vacciners ulemper ved at anvende dræbte eller attenuerede levende organismer. Således kræver fremstilling af vacciner ud 5 fra dræbte organismer for eksempel vækst af store mængder af organismerne efterfulgt af en behandling, der selektivt ødelægger deres infektionsevne uden at berøre deres antigenicitet. På den anden side frembyder vacciner indeholdende attenuerede levende organismer altid muligheden 10 for en reversion af den attenuerede organisme til en patogen tilstand. modsætning hertil undgås muligheden for reversion til en patogen organisme, når man som vaccine anvender et 15 rekombinant pox-virus, der på passende vis er modificeret med et herpesvirus equi gen kodende for en antigen determinant af et sygdomsfremkaldende herpesvirus, da poxviruset kun indeholder det gen, der koder for den antigene determinant af den sygdomsfremkaldende organisme 20 og ikke de genetiske dele af organismen, der er ansvarlig for replikationen af patogenet. PRV inficerer på dødelig vis mange pattedyrarter (kvæg, hunde, etc.). Voksne grise overlever imidlertid sædvan- 25 ligvis infektion, og udgør derfor et vigtigt virusreservoir. Fordi PRV medfører alvorlige økonomiske tab, foretager man i mange lande vaccination af grise med attenuerede eller dræbte vacciner. 30 Forsøg på at kontrollere PRV-infektion hos svin og reducere økonomiske tab er blevet gjort ved aktiv immunisering med modificeret levende eller inaktiverede vacciner. Attenuerede vacciner, der almindeligvis inducerer langvarig immunitet og er fordelagtige, hvad angår om- 35 kostninger, udgør en risiko for utilstrækkelig attenuering eller genetisk ustabilitet. Inaktiverede vacciner er mindre effektive, kræver flere immuniseringer og inde-

18 16 holder sædvanligvis potente adjuvanser. Disse sidstnævnte formuleringer kan inducere post-vaccinale allergiske reaktioner, såsom appetitløshed, feber eller abort hos drægtige søer. Disse vaccinetyper lider også af visse 5 ulemper med hensyn til forebyggelse af latente infektioner, overvindelsen af virkningerne af moderens antistoffer på vaccinationseffektivitet og elimineringen af potentiel anvendelse af et serologisk diagnostisk assay til at skelne vaccinerede dyr fra dyr, der tidligere er 10 inficeret med PRV. Alternative vaccinationsstrategier, såsom brugen af rekombinante poxviruser, der udtrykker immunologisk relevante PRV-genprodukter, ville have visse fordele: 15 (a) fjerne levende attenuerede PRV-vaccinestammer fra området og (b) tillade skelnen mellem vaccinerede og inficerede eller seropositive dyr. Det sidste kunne udføres ved brug af passende diagnostiske reagenser, der præcist ville skelne vaccinerede fra naturligt inficerede dyr. 20 Dette er et vigtigt hensyn på grund af gældende regler til styring af flytningen af seropositive dyr. Endvidere er vaccination mere økonomisk og at foretrække fremfor testning og eliminering af inficerede dyr fra områderne. Udviklingen af sådanne vacciner kræver et kendskab til de 25 bidrag der ydes af passende PRV-antigener til induktion af beskyttende immunitet. Når det drejer sig om PRV, ligesom det gælder for andre medlemmer af herpesvirusfamilien, er glycoproteiner vigtige kandidater for antigener der er til stede i en effektiv vaccine af rekom- 30 binante underenheder. Teknologien til frembringelse af vacciniavirus-rekombinanter er for nylig blevet udvidet til andre medlemmer af poxvirus-familien, der har et mere begrænset værtsområde. 35 Især er avipoxviruser, der replikerer i fuglearter, blevet konstrueret til at udtrykke immunologisk relevante genprodukter. Inokulering af fuglearter (42,177) og ikke-

19 17 fuglearter (41) med avipoxvirus-rekombinanter fremkaldte beskyttende immunresponser overfor det tilsvarende patogen. 5 Attenuerede levende vacciner og inaktiverede vacciner mod BHV1 har været tilgængeligt i mere end 30 år og har med held reduceret forekomsten af BHV1-relaterede sygdomme. Disse vacciner forebygger imidlertid ikke latent infektion eller reinfektion med vildtypevirus. De gør det også 10 kompliceret at skelne mellem inficerede og vaccinerede dyr. Begge vaccinetyper har andre væsentlige ulemper. Vaccinering af drægtige køer med attenuerede levende vacciner 15 kan forårsage fosterdød og efterfølgende abort (127). Endvidere er det vist, at vaccinerede dyr kan sprede virus (178). Derfor kan vaccinerede dyr, der går sammen med drægtige køer, sprede infektiøs virus til de drægtige dyr og forårsage abort af fosteret. 20 Inaktiverede vacciner inducerer ikke aborter eller provokerer viral ekskretion. Imidlertid nødvendiggør de brug af adjuvanser og kan forårsage dødelige hypersensitivitetsreaktioner (anafylaksi) og ikke-dødelig inflammation 25 og feber (179). Et de af vigtigere problemer i forbindelse med vaccination er at overvinde eller undgå maternel immunitet. Hvis en moder er immun over for et bestemt patogen, vil 30 "immuniteten" i moderen blive overført til den nyfødte via de antistoffer, der er til stede i kolostrum, og/eller ad andre overførselsveje. Alligevel kan den nyfødte ikke med held vaccineres, indtil niveauet af maternel immunitet er aftaget i tilstrækkelig grad. Der 35 er derfor et snævert tidsrum, inden for hvilket den nyfødte med held kan vaccineres i nærvær af aftagende maternel immunitet.

20 18 Det vil således forstås, at tilvejebringelse af et med herpesvirus rekombineret poxvirus og af vacciner, der giver beskyttende immunitet over for herpesvirusinfektioner, der tilfører teknikken fordelene ved inokulering med 5 levende virus, men som reducerer eller eliminerer de oven for diskuterede problemer, ville være en i høj grad Ønskelig fordel i forhold til den kendte teknik. Opfindelsens formål Det er derfor et formål med denne opfindelse at angive rekombinante poxviruser, der udtrykker herpesvirusgenprodukter, og at angive en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne rekombinante poxviruser. Det er endvidere et formål med opfindelsen at angive kloning og udtrykkelse af herpesvirus-kodende sekvenser i en poxvirusvektor, især en vacciniavirus-, fjerkræpoxviruseller kanariepoxvirusvektor. Et yderligere formål med opfindelsen er at angive en vaccine, der kan udløse herpesvirus-neutraliserende antistoffer og beskyttende immunitet mod udsættelse for en dødelig antigen påvirkning med herpesvirus. Disse og andre formål og fordele ved opfindelse vil fremgå af det efterfølgende. Opfindelsen angår et rekombinant poxvirus indeholdende en 30 DNA-sekvens fra herpesvirus i et ikke-essentielt område af poxvirusgenomet. Herpesviruset kan med fordel tilhøre a-herpesvirus-, a-herpesvirus- eller r-herpesvirusunderfamilien. DNA-sekvensen fra herpesvirus koder specielt for et herpesvirusglycoprotein. Nærmere bestemt er 35 herpesvirusglycoproteinet valgt blandt herpesvirus equi gp13, herpesvirus equi gpl4, herpesvirus equi gd, herpesvirus equi gp63, herpesvirus equi ge, pseudorabies virus

21 19 gp 50, pseudorabies virus gpii, pseudorabies virus gpiii, pseudorabies virus gpl, herpes simplex virus gb, herpes simplex virus gc, herpes simplex virus gd, bovint herpes virus gi, felint herpes virus gb, Epstein-Barr virus 5 gp220, Epstein-Barr virus gp340, Epstein-Barr virus gb, Epstein-Barr virus gh og humant cytomegalovirus gb. Ifølge opfindelsen udtrykker de rekombinante poxviruser genprodukter fra det fremmede herpesvirusgen. I særdeles- 10 hed koder den fremmede DNA-sekvens for et herpesvirusglycoprotein, og det fremmede DNA udtrykkes i en vært ved dannelsen af herpesvirusglycoproteinet. Med fordel udtrykker det rekombinante poxvirus flere herpesvirusglycoproteiner samtidigt i værten. Poxviruset er med fordel et 15 vacciniavirus eller et avipoxvirus, såsom fjerkræpoxvirus eller kanariepoxvirus. Desuden angår opfindelsen en vaccine til inducering af et immunologisk respons i et værtsdyr inokuleret med vacci- 20 nen, idet vaccinen indeholder en bærer og et rekombinant poxvirus indholdende, i et ikke-essentielt område, DNA fra herpesvirus. I særdeleshed koder DNAen for og udtrykker et herpesvirusglycoprotein. Med fordel udtrykker det rekombinante poxvirus flere herpesvirusglycoproteiner 25 samtidigt i værten. Det poxvirus, der anvendes i vaccinen ifølge opfindelsen, er med fordel et vacciniavirus eller et avipoxvirus, såsom fjerkræpoxvirus eller kanariepoxvirus. 30 Endvidere angår opfindelsen mekanismer til at omgå problemet med maternel immunitet. Hvis barrieren skyldes tilstedeværelsen af antistoffer mod et eller flere givne antigener, så kan barrieren af maternel immunitet overvindes eller undgås ved selektivt at anvende vektorer, 35 der udtrykker definerede antigen-delmængder. For eksempel kan det drægtige dyr vaccineres med et rekombinant vacciniavirus, der udtrykker pseudorabiesvirus-glycopro-

22 20 tein gp5o, og afkommet kan vaccineres ved fødslen eller kort derefter med vacciniarekombinanter, der udtrykker de andre pseudorabiesvirus-glycoproteiner gpii eller gpiii eller kombinationer deraf. Hvis på den anden side bar- 5 rieren, der frembydes af maternel immunitet, skyldes vektoren, så kan man vaccinere moderen med en vektor (vaccinia eller avipox) og vaccinere afkommet med en anden vektor. Ved denne procedure tages naturligvis i betragtning, ikke blot brugen af forskellige vektorer, men 10 også af vektorer, der udtrykker en forskellig sammensætning af glycoproteiner. Således angår opfindelsen en fremgangsmåde til at overvinde eller undgå maternel immunitet, der ellers ville forhindre vellykket immunisering af nyfødt afkom. Ved den foreliggende opfindelse 15 inokuleres det nyfødte afkom med et rekombinant poxvirus, der i et ikke-essentielt område af poxvirusgenomet indeholder DNA fra en ikke-poxkilde, idet denne DNA koder for et første antigen fra et patogen fra det nyfødte afkom, og dette antigen er forskelligt fra et andet antigen fra 20 det samme patogen, der anvendes til at inducere et immunologisk respons mod det samme patogen hos moderen til det nyfødte afkom. Ligeledes ved den foreliggende opfindelse inokuleres det nyfødte afkom med et rekombinant første poxvirus, der i et ikke-essentielt område af 25 det første poxvirusgenom indeholder DNA fra en ikke-poxkilde, idet denne DNA koder for et antigen fra et patogen fra det nyfødte afkom, og idet det første poxvirus er forskelligt fra et rekombinant andet poxvirus anvendt til at inducere et immunologisk respons mod det samme patogen 30 hos moderen til det nyfødte afkom. Beskrivelse af tegningen Opfindelsen forklares nærmere på tegningen, hvor: 35 Fig. 1 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante vacciniavirus vp425,

23 21 Fig. 2 viser DNA-sekvensen for et EHV-1 fragment på 1,88 kb indeholdende gp13-kodningssekvensen, 5 Fig. 3 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante vacciniavirus vp483 indeholdende EHV-1 gp13-genet, 10 Fig. 4 Fig. 5 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante vacciniavirus vp458, skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante vacciniavirus vp577 indeholdende EHV-1 gp14-genet, 15 Fig. 6 viser DNA-sekvensen for et EHV-1 fragment på 3,35 kb indeholdende gp14-kodningssekvensen, 20 Fig. 7 Fig. 8 er et diagram over relativ hydrofili for EHV-1 gp14-kodningssekvensen, skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante fjerkræpoxvirus vfp44 indeholdende EHV-1 gp13-genet, 25 Fig. 9 skematisk viser en metode til konstruktion af den rekombinante kanariepoxvirus vcp48 indeholdende EHV-1 gp13-genet, 30 Fig. 10 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmiderne phes-mp63, phes-mp1 og phes- MP34 indeholdende modificerede versioner af EHV-1 gp14-genet, 35 Fig. 11 er et kort over BamHI-skæringsstederne i EHV-1 Kentucky D-stammen, hvorpå er vist de inverterede gentagelser i genomet angivet ved boxe, beliggenheden af de seks vigtigste EHV-1-glyco-

24 22 proteingener samt en ekspansion af det område af genomet, der indeholder gd-, gp63- og ge-generne. 5 Fig. 12 viser nukleotidsekvenserne for et 6402 basepar EHV-1-fragment indeholdende gd-, gp63- og gekodningssekvenserne. 10 Fig. 13 er et hydropatidiagram over den sekvens på 402 aminosyrer, der udgør EHV-1 gd, Fig. 14 er et hydropatidiagram over den sekvens på 413 aminosyrer, der udgør EHV-1 gp63, 15 Fig. 15 er et hydropatidiagram over den sekvens på 552 aminosyrer, der udgør EHV-1 ge, 20 Fig. 16 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmiderne pjca006, pjca007 og pjca008 indeholdende henholdsvis EHV-1 gd-genet, EHV-1 ge-genet og ERV-1 gp63-genet og frembringelse af rekombinant vacciniavirus indeholdende disse gener, 25 Fig skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmiderne pjca009 (indeholdende EHV-1 gdog gp63-generne) og pjca010 (indeholdende EHV-1 gd-, gp63- og ge-generne) og frembringelse af rekombinant vacciniavirus indeholdende disse gener, 35 Fig. 18 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasrnid ppr18 indeholdende PRV gpii-genet og frembringelse af rekombinant vacciniavirus, der udtrykker PRV gpii-genet,

25 23 Fig. 19 viser DNA-sekvensen for den åbne læseramme af PRV gpii. 5 Fig. 20 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmid ppr24 indeholdende PRV gpiii-genet og frembringelse af rekombinant vacciniavirus, der udtrykker PRV gpiii-genet, 10 Fig. 21 viser DNA-sekvensen for den åbne læseramme af PRV gpiii. Fig. 22 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmid ppr26 indeholdende PRV gp50-genet 15 og frembringelse af rekombinant vacciniavirus, der udtrykker PRV gp50-genet, Fig. 23 viser DNA-sekvensen for den åbne læseramme af PRV gp Fig. 24 skematisk viser en metode til konstruktion af plasmid PSD478VC og psd479vcbg og indsættelse af b-galactosid i vacciniavirus, 25 Fig. 25 skematisk viser en metode til konstruktion af plasmid pmp13pp, 30 Fig. 26 skematisk viser en metode til konstruktion af plasmid pfpprvii indeholdende PRV gpii-genet, Fig. 27 skematisk viser en metode til konstruktion af det rekombinante kanariepoxvirus vcp55, der udtrykker PRV gpii-genet, 35 Fig. 28 skematisk viser en metode til konstruktion af det rekombinante vacciniavirus vp717, der udtrykker PRV gi-genet,

26 24 Fig. 29 skematisk viser en metode til konstruktion af de rekombinante vacciniaviruser vp569 og vp734, der udtrykker HSV-2 gb-genet, 5 Fig. 30 skematisk viser en metode til konstruktion af de rekombinante vacciniaviruser vp579, vp748 og vp776, der udtrykker HSV-2 gc-genet, Fig. 31 skematisk viser en metode til konstruktion af de 10 rekombinante vacciniaviruser vp570, vp761, vp775 og vp777, der udtrykker HSV-2 gd-genet, Fig. 32 skematisk viser en metode til konstruktion af de rekombinante vacciniaviruser vp637 og vp724, der 15 udtrykker BHV-1 gi-genet, 20 Fig. 33 skematisk viser en metode til konstruktion af donorplasmid pjca001 indeholdende FHV-1 gb-genet og til konstruktion af det rekombinante vacciniavirus vp713, der udtrykker FHV-1 gbgenet. Fig. 34 viser nukleotidsekvensen for 3400 bp segmentet af FHV-i DNA, der koder for glycorpotein gb, 25 Fig. 35 er et hydropatidiagram over den sekvens på 947 aminosyrer, der udgør FHV-1 ge, Fig. 36 skematisk viser en metode til konstruktion af 30 donorplasmiderne 409gp220 indeholdende EBV gp220-genet og 409gp340 indeholdende EBV gp340- genet, Fig. 37 skematisk viser en metode til konstruktion af 35 vaccinia-donorplasmid 409gB indeholdende EBV gbgenet,

27 25 Fig. 38 skematisk viser en metode til konstruktion af vaccinia-donorplasmid 486gH indeholdende EBV ghgenet, 5 Fig. 39 skematisk viser strukturen af vaccinia-donorplasmid 513gHgBgp340 indeholdende EBV-generne gp34o, gb og gh, Fig. 40 skematisk viser en metode til konstruktion af 10 vaccinia-donorplasmid 409CMVgB indeholdende CMV gb-genet, 15 Fig. 41 viser nukleotid- og aminosyresekvenserne for HCMV (Towne-stamme) HXLF1-genet, og Fig. 42 viser nukleotid- og aminosyresekvenserne for HCMV (Towne-stamme) HXLF2-genet. Detaljeret beskrivelse af opfindelsen 20 De efterfølgende eksempler tjener til at belyse opfindelsen og give en forståelse af de mange fordele, der kan opnås derved. 25 EKSEMPEL 1 - Konstruktion af vacciniavirus-rekombinanter, der udtrykker herpesvirus equi gp13-glycoproteinet Udskiftning af HA-genet i vaccinia med E. coli 8-30 galactosidase-genet. I dette eksempel blev anvendt Copenhagen-stammen af vacciniavirus opnået fra Rhone Merieux, Inc. (Athens, GA). Viruset blev opformeret fra et oprenset plak-isolat på enten VERO-celler (ATCC CCL81) eller MRC-5-celler (ATCC CCL171) i Eagle's 35 minimal-essentielt medie (MEM) plus 10% føtal bovint serum (FBS). Et derivat af vildtypeviruset, hvorfra den fulde kodningssekvens for thymidinkinasegenet var delete-

28 26 ret ved standardmetoder (25,28) blev isoleret og betegnet vp410. Denne thymidinkinase-deletionsmutant blev anvendt til yderligere manipulationer. Plasmider blev konstrueret, screenet og dyrket ved standardprocedurer 5 (20,27,28). Der henvises nu til fig. 1. SalI F-fragmentet på 13 kb fra vacciniavirus, der spænder over HindIII A/B-fragmentforbindelsen, blev ligeret ind i puc8 nedbrudt med Sall 10 til dannelse af psd419vc. Den højre arm af psd419vc, der svarer til HindIII B-delen af SalI F-fragmentet, blev fjernet ved skæring med HindIII og religering til dannelse af psd456vc. psd456vc indeholder således den højre ende af HindIII A-fragmentet, indenfor hvilket er det 15 fulde kodningsområde for hæmagglutinin (HA) genet (35) flankeret af ca. 0,4 kb yderligere vacciniasekvenser på hver side. For at frembringe en plasmidvektor, der praktisk taget er 20 fri for HA-kodningssekvenser, blev psd456vc skåret (partiel nedbrydning) i RsaI-stedet opstrøms for HA-genet og i EagI-stedet 80 bp fra 3'-enden af HA-genet. RsaI/EagIfragmentet på ca. 3,5 kb blev isoleret fra en agarosegel. 25 Syntetiske oligonukleotider MPSYN59-62 blev fremstillet til at erstatte området fra RsaI-stedet gennem position 2 opstrøms for HA-kodningssekvensen, umiddelbart efterfulgt af BglII-, Smal- og PstI-restriktionsstederne og en EagIkohæsiv ende. Sekvensen for MPSYN59-62 med de angivne 30 restriktionssteder er følgende: 5' -ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGT7TTATAGGTAGTTGATAGAACAA 3 ' -TOTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAACTATCTTGTT 35 AATACATAATTTTGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCTCCCGGGCTGCAGC-3' TTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTCTAGAGGGCCCGACGTCGCCGG-5 13g1II Smal PstI EagI

29 27 Den annelerede MPSYN59-62-blanding blev ligeret ind i 3,5 kb Rsal/EagI-fragmentet fra psd456vc til dannelse af psd466vc. I psd466vc er HA-genet således blevet erstattet med et polylinker-område. 5 Et 3,2 kb BglII/BamHI (partielt) fragment indeholdende E. coli 6-galactosidase-genet fra pmc1871 (34) under transkriptionel kontrol af vaccinia-promoteren på 11 kda (7) blev indføjet i psd466vc, der først var nedbrudt med 10 BglII. Et plasmid indeholdende 11 kda promoter/bgalactosidase-genkassetten i en retning fra venstre mod højre i forhold til flankerende vaccinia-arme blev betegnet psd466vcbga og rekombineret ind i en thymidinkinase-deletionsmutant, vp410, af Copenhagen-stammen af 15 vacciniavirus til dannelse af vaccinia-rekombinanten vp425; der udtrykker b-galactosidase. Der blev bibeholdt 80 bp i carboxyl-terminus af HA-genet for ikke at forstyrre en kort potentiel åben læseramme transkriberet fra højre mod venstre i forhold til vacciniagenomet. 20 Det rekombinante vacciniavirus, vp425 (184), blev identificeret på basis af blå plaquedannelse i nærvær af det chromogene substrat, X-gal, som beskrevet af andre (9,24). Substitution af b-galactosidasegenet med endnu et 25 andet fremmed gen i efterfølgende vaccinia-rekombinanter kunne nemt udtages ved at isolere farveløse plaques i stedet for blå plaques. For at lette fremtidige gensplejsningstrin blev Smal- 30 stedet afledt fra puc8-multikloning-området elimineret ved nedbrydning af psd466vc med BamHI/EcoRI, dannelse af stumpe ender med Klenow-fragmentet af E. coli polymerase og religering. Det enkelte Smal-sted, der er tilbage i det resulterende plasmid, psd467vc, er således i poly- 35 linkerområdet af HA-deletionen.

30 28 Identifikation af DNA-sekvenser, der koder for EHV-1 gp13-genet. DNA-sekvensen, der koder for glycoproteinet EHV-1 gp13, er beliggende i 7,3 kb BamHI-H fragmentet af EHV-1 (3). Nukleotidsekvens-data for begge strenge blev 5 opnået fra puc (BamHI-H) området ved brug af overlappende subkloner, idet der anvendtes det modificerede T7-enzym Sequenase (40) (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH). Der blev udført standard dideoxy kædetermineringsreaktioner (33) på dobbeltstrengede plasmid-skabeloner, der var de- 10 natureret i alkali. M13-forward- og revers-primere blev anvendt til opnåelse af den indledende sekvens af hver klon. Specialfremstillede mer-primere syntetiseret ved standard kemiske metoder (Biosearch 8700, San Rafael, CA; Applied Biosystems 380B, Foster City, CA) 15 blev anvendt til vandring langs resten af fragmentet. IBI Pustell-sekvensanalyseprogram blev anvendt ved alle sekvensdataanalyser (29). DNA-sekvensanalyse afslørede en åben læseramme på bp, der koder for 468 aminosyrer med et beregnet primært translationsprodukt på 50,9 kda. I carboxylhalvdelen af den formodede åbne læseramme for gp13 blev der observeret signifikant aminosyrehomologi med gc af herpes simplex virus type 1 og type 2, giii af pseudorabies virus og gpv 25 af varicella-zoster virus, hvilket tyder på, at gp13 er et medlem af de gc-lignende glycoproteiner af herpesviruser. Yderligere detaljeret analyse af den åbne læseramme for EHV-1 gp13 er fremlagt i en tidligere publikation (2). For at lette beskrivelsen af indsættelse og ud- 30 trykkelse af EHV-1 gp13 i vacciniavirus-vektorer er den åbne læseramme for EHV-1 gp13 samt yderligere 5'- og 3'- sekvenser vist i fig. 2. I fig. 2 er en formodet TATA-box og aminosyrer omfattende formodede signaler og membranfasthæftningselementer understreget. Det potentielle skæ- 35 ringssted i signalsekvensen er fremhævet med en pil efter skæringssignalet ASA (åbne cirkler). Potentielt forekommer der ni N-koblede glycosyleringssteder inden

31 29 for signal- og fasthæftningssekvenserne, som det er angivet ved Asn-X-Ser/Thr-mønsteret (stjerner). Indsættelse af EHV enet i et vacciniavirus-donor- 5 plasmid. En tidlig/sen vacciniavirus-promoter, H6, er blevet brugt til udtrykkelse af fremmede gener i fjerkræpoxvirus-vektorer (41,42). Dette promoterelement svarer til DNA-sekvensen beliggende umiddelbart opstrøms for den åbne H6 læseramme i vaccinia HindIII-H fragment (31). 10 Der henvises nu til fig. 3. For at mutere og indsætte H6-promoteren i psd467vc blev oligonukleotiderne H6SYN oligo A-D syntetiseret. Sekvensen af H6SYN oligo A-D, med modificeret base understreget og restriktionssteder som 15 angivet, er som følger: BglII 5T-GATCTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTT 3' -AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAA 20 GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA CACAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATT GTTTGTATCGTACCC-3' 25 CAAACATAGCATGGG-5' Smal De understregede baser angiver modifikation i forhold til den native H6-promotersekvens. 30 Den 130 bp dobbeltstrengede DNA af fuld længde, dannet ved annellering af H6SYN oligoerne A-D, blev oprenset ved elektroeluering fra en agarosegel og ligeret til 0,5 kb SmaI/HindIII- og 3,1 kb BglII/HindIII-fragmenter afledt 35 fra psd467vc. Det resulterende plasmid, ptp15 (184) har ATG-initieringscodonen modificeret til CCC som en del af Smal-stedet, der umiddelbart efterfølges af et PstI-sted.