VALIDERING OG IMPLEMENTERING AF APIXABAN - EN NY KOAGULATIONS ANALYSE

Transkript

1 VALIDERING OG IMPLEMENTERING AF APIABAN - EN NY KOAGULATIONS ANALYSE KELD ERASMUS SANDER JENSEN CHARLOTTE FACK GRØNKJÆR PERNILLE THORSGAARD RAFN LENA METTE NIELSEN

2 Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen University College Sjælland - Campus Næstved Validering og implementering af apixaban En ny koagulationsanalyse Validation and implementation of apixaban A novel coagulation analysis Udarbejdet af Keld Erasmus Sander Jensen bn12s08 Charlotte Fack Grønkjær bn13s104 Pernille Thorsgaard Rafn bn12s21 Lena Mette Nielsen bn12s15 Projektperiode: 5. oktober januar 2016 I-vejleder: Kathrine Balsløw Dester Adjunkt University College Sjælland - Campus Næstved K-vejleder: Marianne Birkekær Christensen Bioanalytikerunderviser Klinisk Biokemisk Afdeling Næstved Sygehus Antal anslag: Forsidebilledet er fundet [ ] på: Denne opgave eller dele heraf må kun offentliggøres med forfatternes tilladelse jf. Bekendtgørelse af lov om ophavsret nr. 587 af

3 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet af fire bioanalytikerstuderende i perioden 5. oktober 2015 til 4. januar 2016, som afsluttende eksamen på bioanalytikeruddannelsen på University College Sjælland - Campus Næstved. Projektet henvender sig til bioanalytikere, klinikere og andre faggrupper i sundhedsvæsenet og er en validering af analysen apixaban på STA- R Evolution. Den praktiske del blev udført på Klinisk Biokemisk Afdeling - Næstved Sygehus, som har stået for alle økonomiske omkostninger ved projektet og dermed har gjort det muligt at gennemføre valideringen. Tak til faglig specialist Bjarne Rasmussen, Klinisk Biokemisk Afdeling - Odense Universitetshospital for god mail korrespondance og deltagelse i analysering af vores prøver til metodesammenligning. Tak til Triolab A/S for kalibratorer, kontroller og reagenser med et nedslag i prisen. Tak til medstuderende for donering af 0-plasma til forsøg. En stor tak skal rettes til specialist Alice Anker, Klinisk Biokemisk Afdeling - Næstved Sygehus for undervisning og brug af udstyr samt faglig støtte ved gennemførelse af forsøgene. Tak til overlæge Lennart Friis-Hansen, Klinisk Biokemisk Afdeling - Næstved Sygehus og overlæge Maja Jørgensen, AK-centeret - Næstved Sygehus for ekspertviden om antikoagulansbehandling. Tak til ansvarlig afdelingskemiker Mikala Klok Jørgensen, Klinisk Biokemisk Afdeling - Slagelse Sygehus for ekspertviden om validering af analyser. En særlig tak til vores to vejledere, bioanalytikerunderviser Marianne Birkekær Christensen, Klinisk Biokemisk Afdeling - Næstved Sygehus og adjunkt Katrine Balsløw Dester, University College Sjælland Campus Næstved, som har været en stor støtte igennem hele projektet. 4. januar Projektet er udarbejdet af bioanalytikerstuderende: Charlotte Fack Grønkjær Pernille Thorsgaard Rafn Lena Mette Nielsen Keld Erasmus Sander Jensen

4 Indholdsfortegnelse Resumé... 6 Forkortelsesliste... 7 Introduktion... 8 Farmakodynamik Farmakokinetik Apixaban vs. warfarin Validering Analysen Problembaggrund Afgrænsning Problemformulering Metodiske overvejelser Materialer og metoder Materialer Metoder Patientprøver Spiking med Apixaban Fortyndingsrækker Intraseriel præcision Kalibratorer Technoclone Dataoverførsel Resultater Diskussion Resultater Metodeovervejelser Materialer og metoder Sundhedsvæsen Patienten... 36

5 Bioanalytikeren Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag Bilag 1 - Analyseskema over anvendte referencer Bilag 2 Flowskema & Westgard Bilag 3 Indlægssedler Stago Bilag 4 Vejledning til KBA OUH Bilag 5 Rådata - Arbejdsskema Bilag 6 OUH ECAT Bilag 7 Uddrag fra PAV Bilag 8 Labprotokol... 62

6 Resumé Baggrund Warfarin har gennem de sidste 60 år været anvendt til patienter med behov for antikoagulansbehandling, men det kræver rutinemæssig monitorering og stiller store krav til patienten pga. dets mange interaktioner med bl.a. lægemidler, naturlægemidler og kost. Der anvendes nu i stigende grad, den nye faktor a hæmmer apixaban, der tilhører gruppen af Non Vitamin K Orale Antikoagulantia i stedet. Formål Der valideres en metode til at måle aktiviteten af faktor a på STA-R Evolution på Klinisk Biokemisk Afdeling i Næstved. Denne analyse vil kunne rekvireres af klinikerne, hvis der skulle opstå akutte situationer, hvor patientens blødningsrisiko ønskes vurderet. Materialer & Metode Der blev analyseret i alt 30 prøver, hvori der indgik patientprøver og spikede prøver. Til analysen blev der anvendt STA Liquid Anti-a fra Stago samt de dertilhørende kalibratorer og kontroller. Der blev udført en metodesammenligning med Klinisk Biokemisk Afdeling på Odense Universitetshospital samt en undersøgelse af analysens korrekthed, præcision, acceptinterval, linearitet og dataoverførsel. Resultater Metodesammenligningen viser en signifikant forskel mellem resultaterne fra Odense og Næstved, hvorimod de eksterne kontroller fra ECAT fastslår, at analysen måler med en stor grad af korrekthed samt måling af de interne kontroller underbygger en høj præcision. Derudover har resultaterne af apixaban spikede prøver påvist, at vi kan genfinde vores resultater korrekt og der måles lineært i det fra producenten oplyste måleområde. Konklusion På trods af forskellen mellem resultaterne i metodesammenligningen vil analysen implementeres i rutinen på baggrund af den korrekthed og præcision, der er fremkommet. Side 6 af 62

7 Forkortelsesliste AFLI AK-behandling APTT ATE BCC CE CMA CMIN CV CYP3A4 DANAK DDD DMSO DSKB DVT ECAT ESC HPLC-MS INR ISO IVD KBA LE NOAK OUH PCC P-GP PNA PTB RADS SD TF TIA TTI VKA VTE Atrieflimmer Antikoagulansbehandling Aktiveret partiel tromboplastin tid Arteriel tromboemboli Laboratoriesystem Conformité Européenne Lægemiddelstoffets maksimale plasmakoncentration Lægemiddelstoffets minimale plasmakoncentration Coefficient of variation (Variationskoefficient) Enzym i leveren der nedbryder medicin Den Danske Akkrediteringsfond Defineret Døgn Dosis Dimethylsulfoxid Dansk Selskab for Klinisk Biokemi Dyb venetrombose External quality Control of diagnostic Assays and Tests European Soceity of Cardiology High Pressure Liquid Chromatography - Mass spectrometry International Normalized Ratio International Organization for Standardization In vitro diagnostic Klinisk Biokemisk Afdeling Lungeemboli Non vitamin-k orale antikoagulantia Odense Universitetshospital Protrombin complex concentrate P-glycoprotein Paranitroanalin Prøvetagningsblanket Rådet for anvendelse af dyr sygehusmedicin Standard Deviation Tissue Factor Transitorisk iskæmisk attak Tid i terapeutisk interval Vitamin K-antagonist Venøs tromboemboli Side 7 af 62

8 Introduktion I 2012 var mere end personer i Danmark diagnosticeret med en hjertekarsygdom. Der har været en tendens til en stigning i antallet de senere år. Det er dermed den næsthyppigste dødsårsag efter kræft og ca dør hvert år. Der er dog set et fald i antallet af dødsfald på omkring 48 % i perioden , det skyldes en bedre forebyggelsesindsats og en mere effektiv behandling (1). Når man har en hjertekarsygdom, kan der opstå en række komplikationer såsom arteriel tromboemboli (ATE) og venøs tromboemboli (VTE). I arterierne er det som oftest forårsaget af forandringer eller en skadelig belastning af karvæggen, hvorimod det i venerne er en øget aktivering af koagulationssystemet og/eller nedsat veneflow der er årsagen. Der kan være risiko for at tromben løsriver sig og sætter sig fast i andre blodkar i kroppen, som f.eks. i lungerne som lungeemboli (LE) eller ved apopleksi (2). En ofte underliggende årsag til trombofili er atrieflimren (AFLI). Ved AFLI vibrerer hjertets atrier fordi signalet fra sinusknuden forstyrres. Dette betyder at ventriklerne ikke fyldes optimalt og derved bliver hjertets pumpefunktion forringet (3). Behovet for antikoagulantia er støt stigende i Danmark som følge af en vækst i antallet af patienter med hjertekarsygdomme samt et stigende antal ældre i befolkningen >75 år med AFLI. I 2013 var der ca patienter fra primærsektoren, som var i antikoagulansbehandling. Af disse var der ca , som blev behandlet med Vitamin K-antagonister (VKA) og den største andel på ca fik ordineret warfarin. I forhold til antallet af patienter i VKA-behandling, var der kun en lille andel i behandling med nye antikoagulantia, Non Vitamin K Orale Antikoagulantia (NOAK). Gruppen af NOAK består i øjeblikket af præparaterne med indholdstofferne; dabigatran, rivaroxaban, apixaban og edoxaban, heraf er det kun de tre førstnævnte der er godkendt til anvendelse. Siden 2011 er der sket en eksplosiv vækst i ordineringen af NOAK og i 2013 var der ca der fik ordineret apixaban. NOAK er udviklet med henblik på at erstatte VKA, f.eks. warfarin (4), som har været det primære middel benyttet i antikoagulansbehandling i mere end 60 år. Warfarin stammer oprindeligt fra et rottegiftmiddel, coumadin (5). Ifølge statistisk materiale fra MEDSTAT (6) findes der imidlertid kun oplysninger fra primærsektoren og ikke et samlet tal for, hvor mange der i Danmark får ordineret antikoagulantia. Indikationer for anvendelsen af apixaban er indtil videre begrænset til forebyggelse af apopleksi og systemisk emboli hos patienter med nonvalvulær AFLI samt behandling af VTE. Desu- Side 8 af 62

9 den anvendes det til forebyggelse af VTE inden hofte- eller knæoperationer (6, 7, 8). Nyere studier for apixaban har vist at der er en nedsat risiko for systemisk emboli og apopleksi. Dette har især betydning for de ca patienter med nonvalvulær AFLI i Danmark (9). AFLI er som udgangspunkt en uskadelig rytmeforstyrrelse, men det kan medføre alvorlige komplikationer og en del af behandlingen er livslang antikoagulansbehandling (10). Når man er i antikoagulansbehandling kontrollerer man en af kroppens vigtigste mekanismer, koagulationen (11). Det første trin i koagulationen er den primære hæmostase, som opstår ved en skade på et blodkar, hvor trombocytter aktiveres og adhærerer. Samtidig sker en karkontraktion. Den sekundære hæmostase sker i tre faser. Den indledende fase er selve skaden på vævet hvor der bliver frigjort Tissue Factor, som aktiverer faktor VII til faktor VIIa, som igen aktiverer faktor til faktor a. Faktor a omdanner protrombin til trombin i mindre mængder. I den forstærkende fase kommer Ca 2+ ioner fra blodet og fosfolipider fra aktiverede trombocytter, som sammen med trombin aktiverer faktor V, VIII, I og I, samtidig aktiveres flere trombocytter. I den udbedrende fase dannes der meget faktor a, som kan omdanne protrombin til trombin i så store mængder, at omdannelsen af fibrinogen til fibrin aktiveres (12). Side 9 af 62

10 Farmakodynamik Ved VKA-behandling hæmmes funktionen af faktor II, VII og (figur 1), så protrombintiden (INR - International Normalized Ratio) forlænges, hvilket kan være risikofuldt. Aktiviteten af faktor II, VII og kaldes protrombinkomplekset. Alle tre faktorer er Vitamin-K afhængige og findes i inaktiv form i blodbanen. Området for det terapeutiske interval er snævert og kræver løbende monitorering med analysen INR (13). Figur 1 - Figur 1. Eksterne, interne og fælles koagulationssystem samt fibrinolysen. På figuren vises med pile, hvordan VKA hæmmer faktor VII i det eksterne koagulationssystem, faktor i det interne koagulationssystem og trombin, faktor II, i det fælles koagulationssystem. Apixaban hæmmer aktiviteten af faktor a direkte, og når patienten indtager en faktor ahæmmer binder det sig til protrombinasekomplekset og dermed stoppes omdannelsen af protrombin til trombin (14). Protrombinasekomplekset som sammen med aktivering af trombocytter består af de aktiverede faktorer Va og VIIIa og aktiveres af trombin, men ved behandling med apixaban vil dannelsen af trombin være hæmmet. Der dannes dermed ikke trombin som kan starte protrombinasekomplekset (figur 2). Side 10 af 62

11 Figur 2 - Koagulationskaskadens aktivitet som følger af vævsskade som med Tissue Factor aktiverer faktor VII til VIIa. Den direkte hæmning af faktor a stopper dannelsen af trombin, hvilket forhindrer aktivering af flere trombocytter samt aktivering af faktor V og VIII som ellers fungerer som protrombinasekomplekset der ved sin aktivitet er med til at forstærke protrombinkomplekset. Hele dette aktiveringssystem hæmmes ved behandling med apixaban. Farmakokinetik Warfarin bliver efter indtagelse absorberet 100 % og det meste omdannes i leveren til aktive (lavpotente) og inaktive metabolitter, som derefter udskilles gennem nyrerne (15). Det har en maksimal dosis effekt efter 4-5 dage og halveringstiden (T½) er 40 timer (4). Intervallet for INR når man er i behandling med f.eks. warfarin ligger på et terapeutisk interval på 2,0-3,0. Ved behandling med antikoagulantia for patienter med kunstig hjerteklap er det terapeutiske interval 2,5-3,5. Normalområdet for INR er 0,8-1,2 og lave værdier tillægges ingen betydning (16). Warfarin har interaktioner med mange lægemidler, som f.eks. trombocythæmmende midler, svampehæmmende midler og derudover interagerer det også med diverse naturlægemidler, kosttilskud og vitaminer (15). Når apixaban indtages har det en biologisk tilgængelighed på 60 % og en maksimal dosis effekt efter 1-2 timer, en halveringstid (T½) på 8-14 timer og 27 % udskilles uforandret gennem nyrerne. Sidstnævnte giver risiko for ophobning af aktivt stof i nyrerne hvis patienten har nyreinsuffiens, og det kan medføre en øget risiko for blødning (4). Side 11 af 62

12 Der er endnu ikke fastlagt et terapeutisk interval for apixaban. Ifølge et studie af Frost et al. (17), er der efter syv dage målt en maksimal observeret plasmakoncentration (Cmax) på 128,5 ng/ml og en minimum observeret plasmakoncentration (Cmin) på 49,6 ng/ml ved dosering med 5 mg to gange dagligt. Apixaban har ligesom de andre NOAK kun få interaktioner til sammenligning med warfarin. Der sker en øget virkning, hvis patienten samtidig benytter hæmmere af CYP3A4 og P-gp. Det kan f.eks. være midler mod svampeinfektioner og HIV-proteasehæmmere. Derimod er der en nedsat virkning når der samtidig anvendes antibiotika mod tuberkulose, og som forebyggende behandling mod meningokok meningitis samt ved anvendelse af epilepsi medicin (18). Apixaban vs. warfarin Som al anden medicin har apixaban og warfarin fordele og ulemper, som lægen er nødt til at tage stilling til inden medicinvalg. Overordnet skal der sammen med en lang række kliniske overvejelser og i samarbejde med patienten, vurderes hvordan medicinvalget vil påvirke patientens livskvalitet. Fordele Warfarin er billig i forhold til apixaban. Det er et gennemtestet og anerkendt lægemiddel, der kan anvendes til de fleste typer af patientgrupper og indikationer, hvori der indgår antikoagulansbehandling. Det har en lang halveringstid og medfører at virkningen er effektiv i længere tid (15). Det snævre terapeutiske vindue for warfarin øger risikoen for tilbagevendende tromber og blødningskomplikationer, hvis patienten ikke ligger på et stabilt niveau i mere end 70 % af tiden. Derimod har NOAK en mere forudsigelig virkning på koagulationssystemet. Det kan derfor gives i en fast dosis og anvendes uden rutinemæssig monitorering (4). Warfarin er et lav-clearence medikament og afhænger af hepatocytfunktionen og ikke af leverens blodgennemstrømning og dermed har warfarin ingen påvirkning af udskillelsen i leveren (19). Der findes flere antidoter, som kan anvendes til behandling mod en evt. overdosis. Ved akut forgiftning kan man behandle med aktivt kul for at reducere halveringstiden af VKA i plasma. Afhængig af INR kan der indgives forskellige koncentrationer af vitamin-k for at revertere virkningen af warfarin (15). Patienter der behandles med warfarin og som kan være selvmonitorerende, har en bedre effekt af behandlingen end patienter der kræver konventionel monitorering. Connock et al. (20) viser at selvmonitorering nedsætter risikoen signifikant for emboli og dødsfald. Modsat warfarin kræver apixaban ikke monitorering. Der er en opstartsfase, der varer det første år af behandlingen, heri indgår laboratorieanalyser hver tredje måned for at undersøge nyrefunktionen. For apixaban gælder det, at der opnås en hurtig effekt, dvs. at efter indtag er der Side 12 af 62

13 opnået Cmax efter 1-2 timer og som tidligere beskrevet er halveringstiden kort, hvilket betyder at stoffets virkning hurtigt aftager. Ved anvendelse af apixaban er der mindre blødningsrisiko, og det har modsat warfarin ingen indflydelse for behandlingen, hvad du indtager af fødevarer. Generelt er der få interaktioner med anden medicin, og man kan skifte fra warfarin til apixaban umiddelbart ved INR på <2,0 eller dagen efter ved INR <2,0-2,5 (8). Ulemper En ulempe ved behandling med warfarin er, at der er større risiko for blødning. Det terapeutiske interval er snævert og den lange halveringstid, kan betyde at man nemmere kan få overdoseret antikoagulantia og modsat kan der også gives for lav dosis med risiko for tromber. Ydermere skal patienten være i terapeutisk tidsinterval i >70 % af tiden. Monitoreringen kan enten ske hos egen læge eller via AK-centre på sygehusene. Udover hyppige målinger af INR (13) findes der en lang række forbehold for indtagelse af vitamin-k rige fødevarer såsom broccoli, avokado, spinat med mere. Andre ulemper i forbindelse med brug af antikoagulantia er den enkelte patients compliance. Ved compliance forstås f.eks. angst for bivirkninger ved brug af medicin, angst for venepunktur ved gentagende kontroller, patientens sociale status, kostvaner, økonomiske ressourcer og afstand til læge og sygehus. Den konstante monitorering ved VKA-behandling kan være en udfordring for patienter, som har et arbejdsliv med megen rejseaktivitet eller som generelt har mange arbejdstimer og derfor har svært ved at tage fri flere gange om måneden til monitorering (21). Apixaban er et forholdsvis nyt antikoagulantia og der findes ikke tilstrækkelig mængde data for anvendelsen. Det er ikke testet på patienter med mekanisk hjerteklap og det anvendes overvejende kun til patienter med nonvalvulær AFLI og til forebyggelse af emboli samt ved knæ- og hoftealloplastik. Apixaban har en kort halveringstid og det udskilles delvis gennem nyrerne, så det kan ikke anvendes til patienter med nedsat nyrefunktion (egfr <15 ml/kg) (22). Der findes endnu ikke en antidot, men en faktor a hæmmer-antidot med navnet Andexanet er under udvikling. Dette rekombinante modificerede faktor a molekyle indgår pt. i to fase III studier, der skal kvalitetssikre effektiviteten og sikkerheden ved anvendelse som antidot (23). En anden ulempe ved apixaban kan være, afhængig af den ordinerede dosis, at apixaban er 3-6 gange så dyrt som warfarin i defineret døgn dosis (DDD). Eksempelvis koster Marevan (warfarin) 4,38 kr. DDD og Eliquis (apixaban) koster 2,5 mg 24,60 kr. DDD og 5 mg 12,39kr. DDD (7, 15). Der er inden for de sidste år sket en eksplosiv vækst i medicinudgifter (24). De danske regioner har etableret Rådet for Anvendelse af Dyr Sygehusmedicin (RADS) og dette fagudvalg blev Side 13 af 62

14 stiftet i oktober 2009, som består af eksperter fra Regionerne, Sundhedsstyrelsen, Dansk Selskab for Klinisk Farmakologi, Danske Patienter og Amgros. RADS er med til at sikre, at der er lige adgang til behandling og at der etableres et ensrettet nationalt fagligt grundlag for anvendelse af dyr medicin. Derudover udarbejder de også regionale behandlingsvejledninger bl.a. for antitrombotisk behandling (25). De danske tilskudsregler i dag gør, at jo dyrere en medicin er, jo større tilskud får den enkelte til medicinudgifter og dette koster i den sidste ende det danske samfund flere penge. I behandlingsvejledningen udsendt af RADS er warfarin anført som første vurderingsvalg og derefter gruppen af NOAK præparater i prioriteret rækkefølge (25). Dette til trods for at vejledningen fra ESC (European Society of Cardiology) i 2012 har udtrykt at første valg bør være NOAK præparater (26). Validering Ledelsen på Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) i Næstved har besluttet at opsætte og validere analysen for apixaban. Der analyseres for apixaban på KBA Odense Universitetshospital (OUH) og på KBA Rigshospitalet. Valideringen udføres efter en regionalt vedtaget procedure, der bygger på retningslinjer fra Dansk Selskab for Klinisk Biokemi (DSKB) (27). Retningslinjerne er udarbejdet i samarbejde med Den Danske Akkrediteringsfond (DANAK) og efterleves disse, opfylder man kravene for akkrediteringsstandarderne ISO og ISO (28). Valideringen består af en protokoldel, datadel og konklusion. I udførslen af en validering er der flere forskellige personalegrupper involveret. Valideringsprotokollen skal godkendes af den ansvarlige kemiker inden man kan gå videre med udførsel af forsøgene. Det praktiske arbejde i laboratoriet bliver udført af bioanalytikere, evt. i samarbejde med en specialist inden for det relevante område. Undervejs indhentes specialistviden fra afdelingens kemiker og overlæge. Det endelige ansvar for godkendelse af valideringsrapporten og den efterfølgende implementering i rutinen ligger hos den ansvarlige kemiker (27). I en validering vil der indgå undersøgelse af følgende parametre; Baggrund, analyse og apparatur, henvisninger, miljø og sikkerhed, prøvemateriale, kontrolmateriale, kalibratorer, reagens, krav- og kvalitetsmål, referenceinterval, metrologisk sporbarhed, præanalytiske forhold, metodesammenligning, korrekthed, måleområde, detektionsgrænse, analytisk specificitet, linearitet, præcision, robusthed, afsmitning, måleusikkerhedsbudget, kontrol af dataoverførsel, økonomi og valideringsperiode. Et af de krav og kvalitetsmål der skal følges i forbindelse med en validering er, at alt medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik er IVD-mærket. Derfor er producenterne af reagens, kalibratorer Side 14 af 62

15 og kontroller forpligtet til at udføre en omfattende validering af disse i henhold til bekendtgørelse om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik (29). Ved at henvise til producentens oplysninger, der foreligger for den relevante valideringsparameter, kan man reducere i antallet af egne praktiske undersøgelser uden at det mindsker kvaliteten, sikkerheden og effektiviteten. For at sikre kvaliteten når analysen anvendes i rutinen er der udviklet Westgard-regler til at vurdere om kontroller overholder analysens præcision og korrekthed. I den forbindelse konstrueres et kontrolkort, der angiver kontrollens middelværdi samt hvor niveauet ligger for ± 1SD, ± 2SD og ± 3SD på hver side af middelværdien (30). På KBA anvendes en tilrettet udgave af Westgard-reglerne og nedenstående beskriver reglerne samt hvilke handlinger de udløser (bilag 2). For at analysen kan godkendes skal kontrolresultatet ligge indenfor ± 2SD. Selvom det er tilfældet, skal der efterfølgende kigges på den seneste måneds resultater, for at kontrollere om der kan observeres tegn på et analyseskred. Et tegn på dette kan være, når der ses fire på hinanden følgende kontrolresultater der overskrider ± 1SD på samme side af middelværdien, når der er syv kontrolresultater efter hinanden der stiger/falder eller ti kontrolresultater, der ligger på samme side af middelværdien (31). Når kontrolresultatet ligger udenfor ± 2SD kan analysen ikke godkendes, hvis den forrige kontrol også lå udenfor ± 2SD. Det udløser således en fejlfinding efter fastlagt procedure, eventuelle ændringer foretaget noteres i logbog og den ansvarlige specialist, afdelingsbioanalytiker eller kemiker informeres. Analysen kan ikke godkendes, hvis kontrolresultatet ligger uden for ± 3SD. Det samme gælder hvis der er to kontrolresultater efter hinanden, der afviger mere end ± 2SD fra middelværdien til samme side og hvis fire kontrolresultater tilsammen har en afvigelse på mere end fire gange ± 1SD. Disse overskridelser skal føre til fejlfinding med notering af eventuelle ændringer i logbog samt videreformidling af problematik til den ansvarlige specialist, afdelingsbioanalytiker eller kemiker. En af de metoder man kan anvende til at sikre kvaliteten af en analyse er en referencemetode (32), som har en høj specificitet og sensitivitet. Metoden anvendes som reference til verificering af kontroller og kalibratorer. Referencemetoden for Stagos kalibratorer, kontroller og reagenser er baseret på metoden, High Pressure Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (HPLC-MS) (33). Metoden er kostbar, men det er denne metode der refereres til i forbindelse med opsætning af analysen (bilag 3). Side 15 af 62

16 Analysen Apixaban skal analyseres i den daglige rutine på KBA Næstved når valideringen godkendes. Analysen udføres på STA-R Evolution og analyseprincippet er en kromogen katalytisk reaktion (figur 3). Faktor a spalter sit naturlige substrat, protrombin til trombin. Et specifikt kromogent substrat spaltes og stoffet paranitroanalin (pna) frigøres. pna afgiver en gul farve, som måles fotometrisk ved 405 nm og koncentrationen er omvendt proportional med aktiviteten af faktor a hæmmeren apixaban. Jo mere apixaban der findes i plasmaet, desto mindre bliver farveudviklingen i reaktionen. Aktiviteten af faktor a omregnes til en koncentration i ng/ml, Figur 3 - Analyseprincippet for apixaban. Substratet MAPA-Gly-Arg-pNA spaltes af faktor a og der frigøres paranitroanalin (pna). Det frigjorte pna afgiver en gul farve, som kan måles fotometrisk ved 405nm. Analyseudstyret på KBA Næstved er en STA-R Evolution fra Stago, som er sat op til analysen apixaban. Den benytter Stagos eget analysekit og er derfor sat anderledes op end STA-R Evolution på KBA OUH, hvor der benyttes et analysekit fra Technoclone (34). Den største variation i opsætningen på STA-R Evolution er den automatiske fortynding som i Næstved er 1:4 og i Odense 1:6 (34). Ved aflæsning af kuvetterne, som sker af to omgange, er det på KBA Næstved efter henholdsvis 10 sek. og 70 sek., hvorimod det for KBA OUH er efter 30 sek og 80 sek (34). Den reagensafhængige opsætning varierer også meget. Stagos reagens STA LIQUID ANTI-a har en inkuberingstid på 240 sek. til hver analyse, hvor KBA OUH s reagens kit er COAMATIC Heparin kit som har en inkuberingstid på kun 60 sek (34). Yderligere benytter KBA OUH Dextran sulfat som hindrer heparinantagonister f.eks PF4 (pladefaktor 4) på at have indflydelse på analysen (34). Stagos kalibratorer ligger på fire niveauer fra ng/ml, hvorimod Technoclones kalibratorer ligger i fem niveauer fra ng/ml (34). Stagos kontroller leveres i to niveauer; Kontrol 1 (54 92 ng/ml) og kontrol 2 ( ng/ml). Kontrollerne fra Technoclone er i niveauerne 104,2 173,6 ng/ml og 261,2 435,4 Side 16 af 62

17 ng/ml (34). I Næstved er acceptintervallet ±2 SD, hvor man på KBA OUH har et acceptinterval på ±3 SD. Fortyndingsreagens på begge afdelinger er STA Owren-koller fra Stago. Problembaggrund I 2030 vil der i Danmark være mere end borgere i aldersgruppen år (24). Heraf følger at der i denne gruppe allerede fra 2020 vil være en stigning på % af patienter med hjertekarsygdomme. I 2012 fik ca patienter diagnosticeret AFLI og siden er der sket en stigning på ca om året (1). Der har tidligere været tradition for at vælge VKA til behandling af patienter med AFLI og ifølge RADS retningslinjer er det i dag førstevalg. Trods manglende data er der meget der tyder på at NOAK er langt mere foretrukken og ved at tilbyde analysen vil det gøre det mere attraktivt for lægerne i regionen at vælge præparatet. Der ordineres i dag apixaban til flere og flere patienter og det medfører at der er et større behov for at lægerne i Region Sjælland kan rekvirere analysen. Formålet med projektet er at implementere en analyse der kan måle aktiviteten af faktor a, hos patienter der får ordineret apixaban. Afgrænsning Vi har valgt at ekskludere følgende parametre i valideringen; Detektionsgrænse, robusthed og måleusikkerhedsbudget. Detektionsgrænsen er på nuværende tidspunkt ikke mulig at udføre, idet måleområdet er meget usikkert i det lave og høje område. I det lave område er det sort set ikke muligt at måle en 0-plasma og få 0-værdi. Alle vores målinger på 0-plasma har givet værdier mellem 3-10 ng/ml. Robusthed er en valideringsparameter der som regel først kan undersøges når analysen har været i brug over en længere periode. Her handler det f.eks. om analysens kvalitet opretholdes som følger af lot.nr. skift mm. Der er bestemt en variationskoefficient (CV %) på 5 % og denne skal overholdes trods kalibrering af nyt lot.nr. Måleusikkerhedsbudgettet baseres på en lang række af informationer såsom usikkerhed på præanalytiske forhold, usikkerhed på kalibratorer, usikkerhed på BIAS, interseriel præcision samt reagenslot variation. En del af disse parametre kan kun vurderes når analysen har været i brug over en længere periode. Idet vi ikke havde mere end ti patientprøver med apixaban, var det nødvendigt at anvende heparin spikede prøver. Disse prøver (prøvenummer 1301 og 1401) er dog taget ud af metodesammenligningen med KBA OUH, da resultaterne afviger næsten 100 % fra den oprindelige værdi og vi fandt derfor ikke prøverne egnet til denne validering. Side 17 af 62

18 Problemformulering Hvilke valideringsresultater vil være relevante for at kunne validere og implementere analysen apixaban på STA-R Evolution på KBA Næstved? Hvilken betydning har det for patienterne og de rekvirerende læger at analysen implementeres i Region Sjælland? Metodiske overvejelser Dette projekt har fokus på opsætning, validering og kvalitetssikring af analysen apixaban. Analysen er en koagulationsanalyse som udføres på STA-R Evolution på KBA Næstved. Analysen måler aktiviteten af faktor a, som har betydning for patientsikkerheden f.eks. hvis patienten skal opereres (akut eller elektiv) eller får alvorlige blødningskomplikationer som følge af en overdosering. Til projektet anvendes STA-Liquid Anti-a analyse kit fra Stago, da de allerede er leverandør af reagenser, kalibratorer og kontroller til KBA i Næstved i forbindelse med de øvrige koagulationsanalyser. Projektets metodiske tilgang er af eksperimentel kvantitativ karakter og belyser hvorvidt forsøget overholder de valgte valideringsparametre, herunder en sammenligning af resultater med KBA OUH. Øvrige valgte parametre omfatter analysens korrekthed, linearitet, præcision og acceptinterval samt dataoverførsel. Prøvemateriale Der analyseres i alt 30 prøver, som består af patientprøver og spikede prøver. Fremstilling af de spikede prøver var nødvendig, da der endnu ikke er mange patienter i apixaban behandling. Der blev anvendt 0-plasma, fra en person der ikke får antikoagulantia, til fremstilling af spikede prøver og til måling af 0-værdi. Derudover udføres venepunktur på fem andre personer der ikke får antikoagulantia, med det formål at anvende plasmaet som 0-prøver. Det er sikret at prøverne er behandlet ens og der er fremstillet en vejledning til OUH, som de skal følge (bilag 4). Empiri Med udgangspunkt i problemformuleringen er der søgt litteratur i databaserne PubMed og UCSJ-biblioteket samt i søgemaskinen Google herunder Google Scholar. Undervejs har der været fokus på at finde frem til andre studier med sammenlignelige resultater, undersøgelse af analysens økonomiske aspekter og lægemidlets farmakologi. Side 18 af 62

19 Etiske overvejelser Da det er et kvalitetssikringsprojekt skal der ikke søges om tilladelse hos den Nationale Videnskabsetiske komité om anvendelse af patientprøver. Det var ikke nødvendigt at indhente samtykke fra patienterne til analysering af prøver, da de var bestilt til analysering for apixaban. Alle patientprøver er anonymiseret ved at tildele dem et fiktivt prøvenummer. I forbindelse med forsøget har vi udført venepunktur på ansatte fra KBA Næstved. Det har ikke haft en etisk betydning, da vi ikke undersøger en sygdom, men blot skal anvende det som 0- plasma. Statistiske overvejelser Et statistisk krav er, at analysens præcision (CV %) skal være 5 % på KBA i Næstved og 5 % på KBA i Odense. Den fastsatte CV % for KBA Næstved er bestemt af afdelingens ansvarlige kemiker. Der beregnes middelværdi, SD og CV % for relevante delforsøg. Derudover fremstilles en række diagrammer til grafisk præsentation af resultaterne. Metodesammenligning er opstillet i et Bland Altman plot og lineær regression. Der er udarbejdet en parret t-test til at belyse H0 hypotese, som påviser om der er en signifikant forskel på de to laboratorier. Interseriel præcision opstilles i punktdiagram. Apixaban spiket 0-plasma og kalibratorer fra Technoclone er opsat i Y-plot. Der er opstillet fortyndinger for 0-plasma og Owren-koller i et søjlediagram. Derudover beregnes et acceptinterval til fremstilling af kontrolkort for de interne kontroller. Alle statistiske beregninger er foretaget i Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft Corporation). Kvalitetssikring Der analyseres to interne kontroller hver dag, kontrol 1 (52-92 ng/ml) og kontrol 2 ( ng/ml). Der analyseres eksterne kontroller fra ECAT halvårligt for at sammenligne apparaturets korrekthed med andre biokemiske laboratorier. Til vurdering og godkendelse af kontroller følges Westgard-regler. Side 19 af 62

20 Materialer og metoder Materialer Apparatur StatSpin Express 2 højhastighedsbordcentrifuge modelnr. M fra Beckman Coulter (København K, Danmark) blev anvendt til centrifugering af blodprøver. Analyserne blev udført på STA-R Evolution serienr: CA fra Diagnostica Stago (Asnières sur Seine, Frankrig). Utensilier Der er anvendt mikrorør 2mL m/låg fra Sarstedt (D Nümbrecht, Tyskland) til udportionering og nedfrysning ved -80⁰C. Reagenser Til analysen er anvendt STA - Liquid Anti-a Reagens 1: Kromogent substrat MAPA-Gly-ArgpNA, HCl og Reagens 2: Bovint faktor a fra Diagnostica Stago (Asnières sur Seine, Frankrig). Til kalibreringen er STA - Apixaban Calibrator 1 (0 ng/ml), 2 (90 ng/ml), 3 (228 ng/ml), 4 (455 ng/ml) fra Diagnostica Stago (Asnières sur Seine, Frankrig) anvendt. Desuden blev interne kontroller STA - Apixaban Control 1 (54-92 ng/ml) og 2 ( ng/ml) fra Diagnostica Stago (Asnières sur Seine, Frankrig) anvendt. Til fortynding anvendes STA - Owren-Koller ph 7,35 begge fra Diagnostica Stago (Asnières sur Seine, Frankrig). Til opløsning af kalibratorer og kontroller samt fremstilling af stamopløsning nr. 2 er der anvendt Sterilt vand 20mL ampul fra Fresenius Kabi (Bad Homburg, Tyskland). Til fremstilling af stamopløsning nr. 1 er der anvendt CryoPur DMSO 10 ml fra OriGen Biomedical GmbH (Burladingen, Germany) og Eliquis (apixaban) 5 mg fra Bristol-Myers Squibb (Virum, Danmark). Derudover blev og eksterne kontroller fra ECAT Survey samt og fra ECAT survey anvendt (AC Voorschoten, Holland). Prøvemateriale Der er anvendt citrat-stabiliseret fuldblod 0,105-0,109 mol/l trinatriumcitrat: 3,2 W/V % Volumen 2,7 ml og 4,5 ml. I alt er der udført analyser på 12 stk. patientprøver, 12 stk. spikede prøver og 6 stk. prøver med 0-plasma, hvor sidstnævnte stammer fra seks forskellige personaler som ikke var i antikoagulansbehandling. Desuden blev der i alt udtaget 29 citratglas á 4,5 ml 0- plasma fra en af de seks personaler. Side 20 af 62

21 Metoder Udtaget 0-plasma Alle prøver blev centrifugeret i 180 sekunder på StatSpin ved 4440 g. Plasma blev afpipetteret i koagulationsrør og størstedelen blev efterfølgende udportioneret i mikrorør a 600 µl og frosset ned ved -80⁰C. Det resterende plasma blev anvendt direkte efter prøvetagning. Klargøring af interne kontroller STA - Apixaban Control 1 og/eller 2, blev hentet fra køl 5⁰C og henstod i min. 15 minutter, så de opnåede stuetemperatur (18-25⁰C). Der blev tilsat 1 ml sterilt vand og kontrollerne henstod ved stuetemperatur i 30 minutter. Flasken blev rullet mellem håndfladerne min. ti gange for at homogenisere opløsningen. Analyse uden barcode Prøver uden barcode blev afpipetteret i eppendorfrør u/låg og sat på STA-R Evolution i sanzrør. Prøverne blev automatisk kørt ud af apparaturet og nummeret i den pågældende rackposition blev slettet, hvorefter prøvens nummer blev indtastet. Der blev trykket på ikonet til indkøring af rack og analysen blev sat i gang ved at dobbeltklikke på hver prøve ved analysen apixaban. Håndtering af resultater Alle resultater angives som mængden af apixaban i forhold til volumen og enheden er ng/ml. Resultaterne printes ud og arkiveres i mappen Validering Apixaban i 5 år. Kalibrering STA - Apixaban Calibrator 1,2,3 og 4, blev hentet fra køl 5⁰C og henstod i min. 15 minutter, så de opnåede stuetemperatur (18-25⁰C). Der blev tilsat 1 ml sterilt vand til hver kalibrator og herefter henstod de ved stuetemperatur i 30 minutter. Flasken blev rullet mellem håndfladerne min. ti gange for at homogenisere opløsningen. Kalibratorerne blev analyseret i dobbeltbestemmelse og middelværdien blev beregnet. Kalibratorerne blev yderligere analyseret som patientprøver efter metoden analyse uden barcode. Interseriel præcision Kontrol 1 og 2 blev opløst efter ovenstående metode klargøring af interne kontroller. Begge kontroller blev analyseret hver morgen og eftermiddag ved dobbeltbestemmelse over fem dage. Der blev beregnet middelværdi, SD og CV% for hver kontrol. Eksterne kontroller Kontrollerne henstod ved stuetemperatur i min. 30 minutter, blev opløst med 1mL sterilt vand og henstod i 5 minutter. Derefter blev kontrollerne rullet min. ti gange mellem hænderne og Side 21 af 62

22 henstod i yderligere 20 minutter. Hver kontrol blev analyseret efter metoden analyse uden barcode ; x 1, x 10 og x 3. Der blev beregnet middelværdi, SD og CV%. Patientprøver Udportionering af patientprøver Patientprøver fra -80⁰C fryser blev optøet i vandbad i 7 minutter. ved 37⁰C. Prøverne blev analyseret efter fremgangsmåden analyse uden barcode. Mikrorør blev mærket med prøvenummer i henhold til arbejdsskema (bilag 5) og hertil blev der afpipetteret 600 µl patientprøve. Hver patientprøve blev fordelt i min. to mikrorør og blev frosset ved -80⁰C. Et mikrorør fra hver patientprøve blev sendt til KBA OUH på tøris. Analyse af patientprøver efter frys Patientprøver blev hentet fra -80⁰C frys og optøet, se udportionering af patientprøver. Prøverne blev analyseret efter fremgangsmåden analyse uden barcode. Spiking med apixaban Analyse før frys Der blev fremstillet en stamopløsning med en koncentration på 500 µg/ml. En tablet med 5 mg apixaban blev opløst i 10 ml DMSO. Fra DMSO-stamopløsning nr. 1 blev der fremstillet en stamopløsning nr. 2 med en koncentration på 5 µg/ml ved at fortynde med sterilt vand. Ud fra stamopløsning nr. 2 blev der fremstillet 10 koncentrationer fra ng/ml i henhold til arbejdsskema (bilag 5). Prøverne blev analyseret efter metoden analyse uden barcode. Følgende formler blev anvendt til beregning af prøvemængde til fremstilling af opløsninger: Analyse efter frys Vtotal = Vudt + Vfort Vudt = Vfort F F = Ckonc Cfort Spikede prøver blev hentet fra -80⁰C frys og optøet, se udportionering af patientprøver. Prøverne blev analyseret efter fremgangsmåden analyse uden barcode. Fortyndingsrækker Heparin Der blev udarbejdet en fortyndingsrække med ni fortyndinger i forholdet 1:1 ud fra en prøve spiket med heparin i henhold til bilag 5. Fortyndingerne blev analyseret efter metoden analyse uden barcode. Side 22 af 62

23 Apixaban Fra DMSO-stamopløsning nr. 1 blev der fremstillet en stamopløsning nr. 2 med en koncentration på 5 µg/ml, ved at fortynde med sterilt vand (bilag 5). Ud fra stamopløsning nr. 2, blev der fremstillet en fortyndingsrække i fem koncentrationer med 0-plasma og det samme med Owren-Koller. F1-F4 blev fortyndet 1:2. F1 blev fremstillet to gange, hvoraf en F1 blev anvendt til at fremstille en F5 som blev fortyndet 1:1 (bilag 5). Fortyndingerne blev analyseret efter fremgangsmåden analyse uden barcode. Følgende formler blev anvendt til beregning af prøvemængde til fremstilling af stamopløsning nr. 2: Vtotal = Vudt + Vfort Vudt = Vfort F F = Ckonc Cfort Intraseriel præcision Den eksterne kontrol blev opløst efter ovenstående metode eksterne kontroller. Ved påsætning af kontrollen blev apparaturet sat til at analysere samme kontrol ti gange. Den spikede prøve med koncentrationen 236,73 ng/ml blev analyseret efter metoden analyse uden barcode. Ved påsætning af prøven blev apparaturet sat til at analysere samme prøve ti gange. For begge intraserielle præcisioner blev der beregnet middelværdi, SD og CV%. Kalibratorer Technoclone Fem kalibratorer blev analyseret over tre dage. CAL 4+5 blev analyseret x 4 på første dag, CAL 2+3 blev analyseret x 3 på anden dag og CAL 1 blev analyseret x 3 på sidste dag. Kalibratorerne henstod ved stuetemperatur i 30 minutter., derefter blev de opløst i 1 ml sterilt vand, flaskerne blev vendt godt og henstod igen 30 minutter. ved stuetemperatur. De blev analyseret efter metoden analyse uden barcode og middelværdien blev beregnet. Dataoverførsel Dataoverførsel blev testet i BCC ved oprettelse af fire PTB er, med fire forskellige værdier. Der blev anvendt 0-plasma til test af 0 værdi, kalibrator Technoclone nr. 4 havde værdi inden for måleområdet, kalibrator Technoclone nr. 5 havde værdi lige over 500 ng/ml og til test af værdi langt over måleområde, blev der fremstillet en heparin spiket prøve. Prøverne blev analyseret efter metoden analyse uden barcode. Til sidst blev overførslen af måleresultaterne kontrolleret i BCC. Side 23 af 62

24 Resultater I denne validering er der inden analysering af patientprøver, foretaget kalibrering i fire niveauer og analyseret kontroller i to niveauer. Kontrollerne der er blevet analyseret hver dag og data fra 20 analyser af hver kontrol, er blevet anvendt til at beregne interseriel præcision. Kalibratorerne er ydermere analyseret i enkeltbestemmelse som patientprøve. For at få op til 30 prøver til valideringen, fremstillede vi prøver ved at spike 0-plasma med apixaban. Alle prøver blev analyseret i enkeltbestemmelse på KBA Næstved og på KBA OUH. Resultaterne er sammenlignet i Y-plot og differensplot. Som ekstra kvalitetssikringsforsøg af analysen, er der analyseret eksterne kontroller i to niveauer, hvoraf den ene blev analyseret ti gange i træk og data er blevet anvendt til at beregne intraseriel præcision. Der er ydermere blevet analyseret et eksternt sæt kalibratorer i fem niveauer og udført et fortyndingsforsøg med henholdsvis 0- plasma og Owren-Koller samt udført intraseriel præcision på en apixaban spiket 0-plasma. Der er analyseret kalibratorer fra Stago i fire niveauer. Kalibratorerne er analyseret i dobbeltbestemmelse og middelværdien af disse er beregnet og anvendt som sand værdi. Samme kalibratorer blev analyseret som patientprøver i enkeltbestemmelse. Resultaterne af enkeltbestemmelserne blev anvendt til at beregne analysens korrekthed ved at beregne BIAS % for hvert niveau; Cal1=68,62 %, Cal2=2,42 %, Cal3=0,09 % og Cal4=0,10 %. Figur 4 - Y-plot der viser en sammenligning af 28 resultater målt på KBA Næstved og KBA OUH. Skæring ved y-aksen er 4,9 hældningen er 0,83 og der er en lineær korrelation R 2 = 0,9985. På figur 4 ses en metodesammenligning mellem KBA Næstved (y-akse) og KBA Odense (x-akse) på 28 prøver. Begge akseværdier har enheden ng/ml og vises fra Resultaterne vises i et Y-plot med lineær regression og identitetslinje. Linjens ligning er 0,8356x + 4,9846, hvor Side 24 af 62

25 hældningen på 0,8356 afviger fra identitetslinjen med 0,17 og skæringen ved y-aksen er 4,98 Lineær korrelation (r 2 ) er 0,9985. Figur 5 - Differensplot som viser differensen af 28 prøver målt på KBA Næstved og KBA OUH. Differensen har en stigende tendens fra resultater der er >250 ng/ml. På figur 5 ses et differensplot for middelværdierne af de 28 prøver for henholdsvis KBA Næstved og KBA OUH. På y-aksen ses differensen fra -100 til 100 i ng/ml og på x-aksen ses koncentrationen ng/ml. Der ses en systematisk forskel mellem apparaterne på de to afdelinger, især i det høje måleområde fra ca. 250 ng/ml og opefter. For at få en præcis afklaring af ovenstående differensplot (figur 5), er der opstillet en hypotese hvor H0 hypotesen ikke afviger signifikant fra middelværdien af målingerne fra de to laboratorier og H1 hypotesen har en signifikant afvigelse. For at beregne hypotesen er der udført en parret t-test (bilag 5) med et signifikansniveau angivet til at være 5 % (α-værdi 0,05). Resultatet af testen har givet en p-værdi på 0,00009 som er mindre end signifikansniveauet (α-værdi 0,05), det betyder at H0 hypotesen forkastes og der ved at acceptere H1 hypotesen, kan påvises at der er en signifikant forskel mellem de to laboratorier. Side 25 af 62

26 Figur 6 - Kontrolkort for kontrol 1. Tyve kontroller er analyseret over fem dage og resultaterne er afspejlet i kontrolkortet med middelværdi, ±2SD og ±3SD På figur 6 ses et kontrolkort udarbejdet ud fra kontrol 1, der er analyseret 20 gange henover en periode på fem dage. Kontrolkortet viser middelværdi, ±2SD og ±3SD og her afspejler det at alle 20 resultater er inden for ±2SD. Y-aksen viser koncentrationen i ng/ml og x-aksen viser antallet af analyser. Der er analyseret fire kontroller pr. dag og ved punkt 1-4, som er helt friskt kontrolmateriale fra dag et, ligger resultaterne under middelværdi. Punkt 5-16, som er dag to, tre og fire, ligger resultaterne lige omkring middelværdien eller over. For punkt er der anvendt friskt kontrolmateriale og alle resultaterne for dag fem ligger under middelværdien. Figur 7 - Kontrolkort for kontrol 2. Tyve kontroller er analyseret over fem dage og resultaterne er afspejlet i kontrolkortet med middelværdi, ±2SD og ±3SD Side 26 af 62

27 På figur 7 ses et kontrolkort udarbejdet ud fra kontrol 2, der er analyseret 20 gange henover en periode på fem dage. Kontrolkortet viser middelværdi, ±2SD og ±3SD og her afspejler det at alle 20 resultater er inden for ±2SD. Y-aksen viser koncentrationen i ng/ml og x-aksen viser antallet af analyser. Der er analyseret fire kontroller pr. dag og ved punkt 1-4, som er helt friskt kontrolmateriale fra dag et, ligger resultaterne under middelværdi. Punkt 5-16, som er dag to, tre og fire, ligger alle over middelværdien. For punkt er der anvendt friskt kontrolmateriale og alle resultaterne for dag fem ligger under middelværdien. For at afprøve analysens evne til at genfinde resultater, er der analyseret en ekstern kontrol (15.85) fra ECAT, som patientprøve, ti gange i træk og resultaterne er blevet anvendt til at beregne intraseriel præcision. I beregningen indgår middelværdi og SD af de ti analyser og ud fra disse er der udregnet en CV % = 1,94. Til sammenligning med andre laboratorier og korrektheden for analysen af ECAT foretaget på KBA Næstved er der udregnet en BIAS på 3,68 % ud fra en konsensus værdi på 246 ng/ml. Som et ekstra forsøg blev der udvalgt en apixaban spiket prøve (nummer 1901) med en værdi på 236,73 ng/ml, denne prøve blev også analyseret ti gange for at undersøge analysens repeterbarhed og der blev beregnet middelværdi og SD til udregning af CV % = 2,10. For at undersøge analysens reproducerbarhed er kontrol 1 og 2 analyseret fire gange om dagen i en periode på fem dage. Resulaterne er indsat i et punktdiagram og der er beregnet middelværdi, SD og CV % for henholdvis 20 analyser af kontrol 1 og 20 analyser af kontrol 2. På nedenstående figur 8 ses et punktdiagram der viser resultater for 20 x analysering af kontroller 1 og 2. På y-aksen vises koncentrationen i ng/ml og på x-aksen vises antallet af analyser (analyse 1-20). De grønne punkter viser resultater fra kontrol 1 og en udregnet CV % = 3,94. De blå punkter viser resultater fra kontrol 2 og en udregnet CV % = 3,63. bilag 5. Figur 8 - Punktdiagram der afbilleder interseriel præcision af kontrol 1+2. Kontrollerne er analyseret tyve gange over fem dage. Kontrol 1 har en CV % = 3,94 og kontrol 2 har en CV % = 3,63. Side 27 af 62

28 På figur 9 ses et Y-plot der sammenligner beregning og resultat af apixaban spiket 0-plasma. På y-aksen vises koncentrationen i ng/ml og på x-aksen vises den beregnede koncentration, hvor værdien af koncentrationen er tallet. Prøverne er spiket i koncentrationerne ng/ml, fordelt på 11 prøver med et interval på 50. Resultaterne viser at den målte værdi ligger tæt på den beregnede værdi. Ved området for koncentrationerne ng/ml afviger de målte resultater lidt i forhold til den beregnede værdi. Figur 9 - Y-plot for apixaban spiket 0-plasma i 11 koncentrationer fra ng/ml. Der afbilledes den målte koncentration sat op i mod den beregnede koncentration. På Y-plottet (figur 10) på næste side vises der kalibratorer i fem niveauer fra Technoclone som er analyseret på henholdsvis KBA Næstved og KBA OUH. Y-aksen og x-aksen viser koncentrationen i ng/ml. Figuren afspejler at resultaterne fra KBA OUH ligger generelt højere end resultaterne fra KBA Næstved. Linjens ligning påviser forskellen med en hældning på 0,9238 for KBA OUH kontra en hældning på 0,8356 for KBA Næstved og en skæring på y-aksen ved 5,5 for KBA OUH og en skæring på 4,8267 for KBA Næstved. Den lineære regression ligger for begge laboratoriers vedkommende på 0,99. Side 28 af 62

29 Figur 10 - Y-plot over kalibratorer i fem niveauer fra Technoclone som er analyseret i henholdsvis KBA Næstved og KBA OUH. Y-plottet afspejler linjens ligning som for KBA Næstved er y = 0,8356x+4,8267 og for KBA OUH er y = 0,9238x+5,5, samt en lineær regression for KBA Næstved som er R 2 = 0,9981 og for KBA OUH R 2 = 0,9965. Figur 11 - Søjlediagram over fortyndingsforsøg med 0-plasma eller Owren-koller. Søjlerne afspejler beregnet værdi, 0-plasma værdi og Owren-koller værdi for fem fortyndinger (F1-F5). På figur 11 ses et søjlediagram over et fortyndingsforsøg med apixaban fortyndet med henholdsvis 0-plasma eller Owren-koller. Y-aksen viser apixaban koncentrationen i ng/ml og x-aksen viser fortyndingerne F1-F5, samt fortyndingsfaktor for hver fortynding. Søjlerne viser beregnet koncentration, koncentration i 0-plasma og koncentration i Owren-koller. Resultater for F1 har med en værdi på 877,68 ng/ml for 0-plasma fortynding og 956,27 ng/ml for Owren-koller fortynding, en stor varians fra den beregnede værdi på 1666 ng/ml. Resultaterne for F2 til F4, stemmer overens med den beregnede værdi, her ses kun en lille varians. For F5 er der Side 29 af 62

30 størst varians (-200) fra den beregnede værdi på 833 ng/ml til 0-plasma fortynding på 633,73 og en lavere varians (-110) til Owren-koller fortyndingen på 720,47 ng/ml. F1-F5 er vist i bilag 5. Side 30 af 62

31 Diskussion I det følgende afsnit ses en sammenfatning af rapportens tidligere afsnit med hovedvægt på en gennemgang af resultaterne. Der inddrages også materialer og metoder, kvalitetssikring af analysen samt samfundsmæssige perspektiver og aspekter med betydning for patienten. Resultater Med udgangspunkt i differensplot (figur 5) i metodesammenligningen mellem KBA Næstved og KBA OUH ses der en stigende differens i resultaterne fra ca. 250 ng/ml og opefter. Dette underbygges dels af den lineære regression (figur 4) som med en hældning på 0,83 viser en gennemsnitlig afvigelse på 17 % og dels den udførte parrede t-test der med en p-værdi på 0, viser, at der en signifikant forskel på resultater målt på de to laboratorier. Derudover viser den lineære regression at der ikke er tale om en systematisk fejl, da tendenslinjen ikke er parallel forskudt og underbygger dermed at der primært er tale om forskelle i det høje måleområde. Gouin-Thibault et al (35). har i ni laboratorier målt 6 forskellige spikede prøver (hvoraf den ene blev yderligere fortyndet 1:3) med Anti-a fra Stago. HPLC har været anvendt som referencemetode til måling af koncentrationen af apixaban i prøverne. En spiket prøve med en målt koncentration på 828 ng/ml viste et gennemsnitlig værdi på 603 ng/ml på de 9 laboratorier der anvendte Stagos assay, hvilket indikerer, at assayet har problemer med at måle i det høje område. Om det har nogen form for klinisk relevans at måle meget præcist i det høje niveau er endnu ikke kortlagt, da man endnu ikke har tilstrækkelig med data der gør, at man kan fastsætte et terapeutisk interval. Ligeledes kendes grænsen for øget blødningsrisiko heller ikke (7). I figur 5 er inkluderet 0-værdier målt på begge laboratorier, det skal bemærkes at de angivne værdier fra OUH er medtaget som værdien 0 såfremt den målte værdi har været under 11 ng/ml. Vores egne resultater er angivet som den eksakte målte værdi. 0-plasmaet er udtaget fra personer, som ikke er i behandling med antikoagulantia, men vi har observeret en målbar værdi i området 0-11 ng/ml. Gouin-Thibault et al. (35) bekræfter vores observationer og dette underbygger at 0-værdien kan måles op til 15 ng/ml og således ikke kan måles som 0 ng/ml. I samme studie har tre laboratorier målt de samme 0-prøver med et andet assay (Biophen heparin) på ACL TOP og har fundet værdier helt op til 42 ng/ml, årsagen til dette beskrives i studiet at kunne hænge sammen med kombinationen af reagens og apparat (35). Gouin-Thibault et al. (35)undersøgte som tidligere nævnt en prøve fortyndet 1:3. Prøven blev fortyndet ud fra en oprindelig prøve på 828 ng/ml og her viste resultatet fra samme ni laboratorier, som anvendte Stagos Anti a assay, at det her var muligt igen at måle den forventede koncentration. Vi udførte en fortynding af en spiket prøve, dels for at se om det var muligt at fortynde prøverne og dels hvilken påvirkning det ville have på det målte resultat at der blev Side 31 af 62

32 fortyndet med henholdsvis Owren Koller og 0-plasma (figur 11). Vores forsøg viste ligesom hos Gouin-Thibault et al. (35), at det er muligt fortynde prøver med en høj koncentration til et målbart niveau ( ng/ml). Som det også ses på figur 11 er der ikke den store forskel i anvendelsen af Owren Koller eller 0-plasma til fortynding. Man kan med fordel anvende Owren Koller for at undgå eventuelle biologiske faktorer, der kan influere på den målte koncentration. Derudover benyttes Owren Koller allerede som fortyndingsvæske på apparaturet. Til påvisning af analysens reproducerbarhed har vi udført en interseriel præcision for kontrol 1 (54-92 ng/ml) som viste en CV% på 3,94 og for kontrol 2 ( ng/ml) på 3,63. Dette stemmer overens med CV % for kontrollerne i førnævnte studie, som også er analyseret i to niveauer, henholdsvis 4,09 % for kontrol 1 (57-90 ng/ml) og 2,40 % for kontrol 2 ( ng/ml). Dette gør at det fastsatte acceptkriterie for en CV på 5 % på KBA Næstved er opfyldt. I samarbejde med afdelingens ansvarlige kemiker har vi valgt at indsnævre acceptintervallet ved at udarbejde kontrolkort. Fra producenten er der oplyst et bredt interval for hver kontrol, vi har valgt at indsnævre dette interval med et acceptinterval beregnet til ± 2SD, som skal anvendes til vurdering af kontrollerne i den daglige rutine. Til sammenligning anvender KBA OUH et pt. acceptinterval på ± 3SD. Dette er uhensigtsmæssigt da de i så fald vil være nødt til at tilbagekalde analysesvar, så snart de daglige kontroller ligger udenfor ± 3SD, dog skal det bemærkes at analysen endnu ikke er færdigvalideret på OUH. På KBA Næstved anvendes der modificerede Westgard-regler som indebærer at der i første omgang accepteres en kontrol udenfor ± 2SD, men skulle den efterfølgende kontrol igen ligge udenfor ± 2SD tilbageholdes analysesvar og der fejlfindes efter fastlagt procedure (31). En anden metode vi har anvendt for at påvise analysens præcision, er at undersøge repeterbarheden ved udføre intraseriel præcision. Forsøget er udført både med en ekstern kontrol der har en konsensusværdi på 246 ng/ml fra ECAT og en apixaban spiket prøvenummer 1901 med en værdi på 236,73 ng/ml. Prøverne fik beregnet CV % på henholdsvis 1,94 for ECAT og 2,10 for prøvenummer Det påviser således at analysen måler med stor præcision. Korrektheden påvises med en BIAS for ECAT på 3,68 % og for prøvenummer 1901 en BIAS på 5,52 %. De analyserede eksterne kontroller (15-84 og 15-85) fra ECAT gav hos KBA Næstved henholdsvis 134,33 ng/ml og 236,94 ng/ml. Samme kontroller blev analyseret på KBA OUH og gav henholdsvis 159 ng/ml og 284 ng/ml. Konsensusværdierne for kontrollerne er 139 ng/ml og 246 ng/ml, derved ses det at resultaterne fra KBA Næstved ligger tættere på konsensus end KBA OUH (bilag 6). I sammenligningen af den anvendte metode for henholdsvis KBA OUH og KBA Næstved giver det et tydeligt billede at det er på meget få parametre, at opsætningen af analysen på de to apparater er ens. I Næstved anvendes apparatur, kalibratorer, kontroller og reagens fra Stago Side 32 af 62

33 mens de i Odense anvender apparatur fra Stago, kalibratorer og kontroller fra Technoclone samt reagens fra Chromogenix. Ifølge Douxfils et al. (36) og Gouin-Thibault et al. (35) er analysen reagens afhængig og Odenses anvendelse af produkter fra forskellige producenter kan være en medvirkende årsag til at Odense generelt måler højere end vi gør i Næstved. I rapporten fra ECAT ses der en CV % på henholdsvis 11,3 og 11,9 for 13 laboratorier der anvender samme reagens som Odense, hvorimod CV % for de 42 laboratorier som anvender samme reagens som Næstved er på henholdsvis 7,0 og 5,7 (bilag 6). Som en del af korrektheden analyserede vi fem kalibratorer fra Techonoclone, da vi ved analyse af patientprøverne konstaterede at Odense generelt målte ca. 17 % højere (figur 4) og ydermere ønskede vi at måle endnu en referencemetode udover de eksterne kontroller fra ECAT. Vedlagt kalibratorerne var der en indlægsseddel med målte apixaban koncentrationer. Modsat indlægssedlerne fra Stago, som anfører at alle resultater er kontrolleret ved HPLC, var det ikke anført, hvilken metode der var anvendt til at kontrollere koncentrationerne på kalibratorerne. Koncentrationerne er lot nr. specifikke og vores resultater burde derfor have ligget meget tæt på de anførte koncentrationer. Vores resultater er fremkommet lavere end producentens oplyste koncentration og for de fem kalibratorer giver det en procentvis gennemsnitlig afvigelse på ca. 16 %, hvilket stemmer godt overens med den tidligere observation med at KBA OUH generelt måler 17 % højere end vi gør i Næstved. HPLC anses for at være referencemetode, da det er den mest sensitive og specifikke metode til at måle koncentrationen af stoffet apixaban (33). Udover at være en dyrere analyse, er den præanalytiske forberedelse tidskrævende og vil på de fleste laboratorier ikke være en analyse, der opsættes dagligt og ville kunne analyseres akut. Hvorimod analysen på STA-R Evolution ville kunne indgå i rutinen og rekvireres efter behov i akutte situationer. De spikede prøver blev, udover anvendelse til anskaffelse af nok prøvemateriale, benyttet til et genfindingsforsøg og til at sikre lineariteten i hele måleområdet. De spikede prøver viser (figur 9) at den målte værdi ligger tæt på den beregnede værdi, hvor den beregnede værdi skal forstås som den sande værdi. Gouin-Thibault et al. (35) har ligeledes fremstillet spikede prøver og har ligesom ved vores resultater haft succes med at genfinde de korrekte koncentrationer indenfor intervallet ng/ml. Metodeovervejelser En af de udfordringer der opstod allerede inden forsøgene skulle udføres, var indsamling af tilstrækkeligt prøvemateriale. Der blev indsamlet ti prøver fra patienter med tilknytning til AKcentret i Næstved. Det lave antal skyldtes dels, at andelen af patienter der fik ordineret Eliquis med det aktive stof apixaban, for nuværende ikke var særligt stort og dels at der ikke var tid Side 33 af 62

34 nok til at indsamle flere. Dette antal patientprøver var ikke nok til at forsøgene blev repræsentative, hvis regionale retningslinjer skulle efterleves. Når der udføres en verificering skal der analyseres 20 patientprøver og for en fuld validering skal der indgå 40 patientprøver. Det blev besluttet af afdelingens ansvarlige kemiker at 30 prøver ville være tilstrækkeligt. Det blev således besluttet at øge antallet af prøver ved at fremstille kunstige patientprøver i form af 0-plasma spiket med apixaban og ved at inddrage prøver fra personer med 0-plasma til bestemmelse af en 0-værdi. Under selve valideringen modtog vi to patientprøver, der indeholdt det aktive stof rivaroxaban, som også er en faktor a hæmmer og yderligere to prøver blev fremstillet ved at spike med heparin. Dermed kom det samlede antal prøver op på 30 og hele måleområdet blev afdækket. Denne metode med at fremstille spikede prøver er veletableret. Den bliver anvendt til undersøgelse af reagenser der kan måle faktor a aktiviteten hos både Gouin-Thibault et al. (35) og Douxfils et al. (36), men begge nævner også at det optimale ville være at benytte prøver indsamlet fra patienter i behandling med apixaban. Forskellen i virkemåden mellem warfarin og apixaban som tidligere beskrevet, gør at INR/PT eller APTT ikke kan anvendes til at måle på apixaban. Det skyldes at apixaban kun hæmmer et enkelt enzym, nemlig faktor a og tidligere undersøgelser har vist at analyserne ikke er specifikke og sensitive nok (35, 37). Det kræver således en mere specifik målemetode, hvor anti-a aktiviteten korrelerer lineært med plasmakoncentrationen. Der findes nu to forskellige kommercielt tilgængelige anti-a kit, der opfylder dette. Det ene er STA-Liquid anti-a fra Stago og den anden TecnoChrom fra Technoclone (37). Disse anti- assays er dog ikke specifikke for apixaban, da andre midler der påvirker faktor a aktiviteten, som f.eks. heparin vil kunne påvirke resultatet og dette skal tages i betragtning, hvis patienten anvender mere end en antikoagulant der influerer på faktor a (37). Materialer og metoder De indsamlede patientprøver blev stillet til rådighed af KBA i Næstved og var som tidligere beskrevet allerede håndteret og nedfrosset. Vi har derfor antaget, at de er blevet behandlet efter samme procedure, som ved de øvrige koagulationsanalyser. De er således centrifugeret inden en time efter prøvetagning. Enten ved 3000 g i 10 minutter eller på Stat-spin ved 4400 g i tre minutter. Hvor sidstnævnte fremgangsmåde også er anvendt til dette projekt i forbindelse med fremstilling af 0-plasma og spikede prøver. Plasma indtil ½ cm over erytrocytterne afpipetteres til et plastglas og fryses indenfor to timer ved -80 C (38). Stago angiver at patientprøver skal centrifugeres ved g i 15 minutter og det skal foregå ved 18 C. Denne procedure vurderes til at være tæt på den beskrevet i D4 og som nor- Side 34 af 62

35 malt anvendes til koagulationsanalyser. Desuden anbefaler producenten dobbeltcentrifugering, hvis opsamlet i konventionelt citratglas og at plasma kan holde i seks timer ved 20 ± 5 C (bilag 3). Vi har en formodning om, at de indsamlede patientprøver er centrifugeret to gange, men det er ikke blevet gjort i forbindelse med afpipetteringen af plasma til 0-prøver og fremstilling af 0-plasma til de spikede prøver. Det ser således ikke ud til at have den store betydning, da der ikke ses en påvirkning af resultaterne for prøverne med 0-værdi (figur 5) og apixaban spiket 0-plasma (figur 9). De seks timers holdbarhed af plasma bliver reduceret til fire timer hvis prøverne har været frosset ned (bilag 7), men i vores forsøg er holdbarheden overholdt, da alle prøver blev analyseret hurtigst muligt og inden en time efter optøning til stuetemperatur. Der ses imidlertid et mindre fald i aktiviteten af apixaban, når prøverne analyseres efter de har været genfrosset, så optøede prøver vurderes til ikke at kunne genfryses. Data der ligger til grund for ovenstående er ikke vist og derfor henvises til rådata (bilag 8). Det vides heller ikke hvor længe patientprøverne har været nedfrosset, da tidspunktet for indsamling af prøverne ikke er kendt. Hvis prøverne er frosset ved -80 C indenfor to timer kan de holde sig i seks måneder (bilag 7), hvilket prøverne med 0-værdi og de spikede prøver har overholdt. Producenten oplyser at analysens sensitivitet kan påvirkes af hæmoglobin op til 2g/L, ukonjugeret bilirubin op til 200 mg/l og triglycerid op til 10g/L (bilag 3). Der var en af prøverne med 0-værdi, som blev analyseret i OUH, hvor de angav, at prøven ikke kunne måles, da den var lipæmisk, den er dog inkluderet i metodesammenligningen som en 0-værdi. Alle kontroller blev fremstillet som anført i indlægssedlen og afpipetteret fra original beholder til et eppendorfrør placeret i messingholder og hver dag efter endt analysering blev der sat låg på eppendorfrøret, og de blev opbevaret som anført på indlægssedlen. Ifølge indlægssedlen skulle kontrollerne kunne holde sig i syv dage ved opbevaring ved 2-8 ⁰C. Under analyseringen af kontroller observerede vi henover et par dage, at der i overfladen af kontrollerne fremkom et fibrinlignende lag, som vi mente det var nødvendigt at fjerne for at apparaturet skulle kunne analysere kontrollerne. Umiddelbart undrede det os, eftersom at indlægssedlen beskrev, at kontrollerne skulle kunne holde sig i syv dage. Ved nærmere kontrol af indlægssedlen er der faktisk lagt vægt på, at den opløste kontrol opbevares i den originale beholder. Man kan diskutere om det så ikke ville være hensigtsmæssigt, at den originale beholder kunne sættes direkte på apparaturet og undgå at kontrollen flyttes fra beholder til beholder dag efter dag. Det ville i den sidste ende måske forlænge holdbarheden af kontrollerne, og det ville måske ikke være nødvendigt at opløse nye kontroller hver 5. dag. Dette ville spare afdelingen for en unødvendigt spild af kontrollerne. Side 35 af 62

36 Y-plottet (figur 9), viser at det er muligt at fremstille egne prøver ved at spike 0-plasma med apixaban. Ud fra vores beregninger (bilag 5) og laboratoriemæssige håndtering i forbindelse med opløsning af apixaban tablet og afpipettering er det lykkedes at måle koncentrationerne meget tæt på de beregnede koncentrationer. Det eneste område hvor der er en lille afvigelse er for koncentrationerne ng/ml. Denne lille afvigelse hvor vi måler lidt højere end beregnet koncentration, har dog ingen klinisk betydning. Eftersom det er bevist, at vi kan fremstille prøver selv og måle præcist, kunne det være muligt, at man fremstillede egne kalibratorer og kontroller, hvilket formodentligt vil være en besparelse for afdelingen. Sundhedsvæsen Pt. er analysen ikke en analyse som bliver rekvireret ofte, hvilket også afspejles i manglen af prøvemateriale til valideringen af analysen. Et af de spørgsmål man må stille sig er, om det på nuværende tidspunkt vil være relevant at implementere analysen. Som udgangspunkt skal alle ordinerende læger vælge warfarin som første valg (39) og kun ordinere apixaban (Eliquis) såfremt patienten skulle ønske det eller det terapeutiske interval ikke kan opretholdes på warfarin. På den anden side vil det faktum at analysen bliver implementeret kunne få lægerne til at ordinere medicinen. I takt med at flere og flere får ordineret apixaban vil medicinen også blive billigere. Rent økonomisk vil det måske i starten være en større udgift i form af forhøjede medicintilskud til apixaban, men i takt med at det vil blive mere og mere anvendt vil det give større besparelser i form af færre udgifter til indlæggelser, her tænkes specielt på indlæggelser ved blødningskomplikationer. Patienten I det lange løb vil det være en fordel for en stor del af de patienter der i dag får warfarin, at skifte medicintype til NOAK. Det vil give en bedre livskvalitet, specielt med tanke på de mange interaktioner der er med anden medicin, og de store livstilsændringer der er i patientens hverdag. En vigtig pointe er også den sygeliggørelse man som patient kan føle ved den konstante monitorering og de gentagne venepunkturer. På nuværende tidspunkt skal læger som udgangspunkt vælge den billigste medicin, hvilket ikke nødvendigvis kommer patienten til gode (39). Medicinen skal naturligvis vælges i samråd med patienten, men ofte ved patienten ikke noget om medicinen på forhånd og derfor er det næsten udelukkende lægen der bestemmer valget af medicinen. Bioanalytikeren Bioanalytikeren er den der validerer og implementerer nye analyser på afdelingen samt sørger for kvalitetssikringen. Det er bioanalytikerens brede viden der gør at de er mange steder i sundhedssektoren, som eksempel kan nævnes Klinisk Biokemisk Afdeling som denne rapport er udarbejdet på. Her er bioanalytikerens viden værdifuld i forbindelse med analyserne og Side 36 af 62

37 kendskabet til analyseudstyret på afdelingen. Derfor er det også bioanalytikere der i samarbejde med kemikere og andre specialister validerer og implementerer analyser som apixaban. Andre steder hvor bioanalytikerens viden benyttes, er AK-Centeret hvor de er ansat til at varetage forskellige opgaver med patienter i AK-behandling. Hvis det viser sig at NOAK efterhånden erstatter warfarin vil behovet for bioanalytikere i AK-centre måske ikke være så aktuelt mere, dog vil der stadig være en patientgruppe der ikke kan overgå til NOAK, og derfor stadig må monitoreres jævnligt, enten i et AK-center eller på en kardiologisk afdeling hvor bioanalytikerens profil også passer fint ind. Side 37 af 62

38 Konklusion Resultaterne af metodesammenligningen mellem KBA Næstved og KBA OUH viser at der er en signifikant forskel på middelværdierne af målingerne og KBA OUH generelt måler højere værdier. Konklusionen på t-testen har forkastet H0 hypotesen på baggrund af p-værdien på 0,00009 som er mindre end signifikansniveauet (α-værdi 0,05) og det kan påvise at der er en signifikant forskel mellem de to laboratorier. Ved gennemgang af metoderne for de to laboratorier kan det konkluderes at sammenligningen ikke vil være anvendelig som en del af denne validering, idet det formodes at være brugen af forskellige kalibratorer og reagenser der spiller en rolle i analysens måleområde, deraf den signifikante forskel på resultaterne. De andre resultater viser dog at analysen i Næstved er stabil og god til at genfinde resultater. Ved udførelse af interseriel præcision, intraseriel præcision og forsøget med apixaban spiket 0- plasma kan det påvises at analysen har en god evne til at genfinde resultater og måle præcist. Det er lykkedes at opnå en CV % der er lavere end det fastsatte acceptkriterie på 5 %. Det kan derfor konkluderes at analysen kan valideres og implementeres på trods af metodesammenligning. Ved implementering af analysen vil det være muligt for lægerne i Region Sjælland at rekvirere analysen ved behov for udredning af en blødningskomplikation. Den optimerede service for lægerne vil betyde at flere patienter vil komme i behandling med apixaban og for det vil give dem en langt bedre livskvalitet, idet de undgår de mange gentagende sygehus- og lægebesøg for at få monitoreret VKA-behandling. En overflytning af analysen kræver ikke en større udvidet oplæring af bioanalytikerne, idet vi allerede har erfaring med håndtering af apparaturet samt det faktum at analysen har en stor lighed med analysen for rivaroxaban som allerede er valideret og taget i brug. Side 38 af 62

39 Perspektivering Hvis der skulle bygges videre på denne validering og tilføjes noget vi ikke har kunnet udføre pga. af den begrænsede tid der var til rådighed, så ville det være at indsamle flere patientprøver. Især muligheden for at udføre venepunktur, hvor man kender indgiftstid for sidste dosis, kan være vigtig. Denne viden er af betydning, da apixaban har en hurtig indvirkning på koagulationen med en peak tid allerede efter 1-2 timer samt en kort halveringstid (37). Der er heller ikke fundet tilstrækkelige data til at fastsætte et terapeutisk interval eller grænse for hvornår der kan opstå en forhøjet blødningsrisiko (7). Der er i det hele taget mangel på data om apixaban og hvordan det fungerer i klinisk praksis på et bredt udvalg af patienter, da det ikke er længere siden end 2011 at det blev godkendt (4). En anden vigtig problematik er manglen på en antidot, som indtil videre har været med til at sætte en begrænsning for anvendelsen af apixaban. Der er imidlertid ved at blive udarbejdet en antidot kaldet Andexanet alfa, som allerede i skrivende stund indgår i fase III studiet AN- NEA-A (23). Når først denne mulighed for at revertere effekten af apixaban eksisterer, vil klinikerne med større tryghed kunne ordinere apixaban. Fremover vil der måske kunne anvendes apixaban til andre grupper af patienter med behov for antikoagulansbehandling end de relativt afgrænsede indikationer det er godkendt til i dag. Således beskriver Yeh et al. (4) en række studier, der er undervejs til afklaring af om apixaban kan ordineres til patienter med valvulær AFLI, hjertesvigt, koronar eller perifer arteriesygdom samt til behandling af venøs tromboemboli af cancer patienter. Dette vil måske kunne resultere i en omlægning af AK-klinikkerne som vi kender dem i dag. Man kunne forestille sig, at de med tiden ville kunne høre under de medicinske afdelinger, dels for at samle ekspertisen et sted og på samme tid gøre det lettere for patienterne at følge alle deres kontroller det samme sted. Det kunne derudover være en fordel at tilknytte bioanalytikere til den afdeling, dels som den part som varetager en evt. oplæring i selvmonitorering og måske vores kompetencer kunne udnyttes til andre tværfaglige projekter i afdelingen. Side 39 af 62

40 Litteraturliste 1. Dit hjerte Fakta om hjertekarsygdomme - Hjerteforeningen [Internet]. [citeret 2. december 2015]. Hentet fra: 2. Trombofili. Sundhed dk. [Internet]. [citeret 2. december 2015]. Hentet fra: 3. Atrieflimren og -flagren - Sundhed.dk [Internet]. [citeret 20. november 2015]. Hentet fra: 4. Yeh CH, Hogg K, Weitz JI. Overview of the New Oral Anticoagulants: Opportunities and Challenges. Arterioscler Thromb Vasc Biol [Internet]. 1. Maj 2015;35 (5 ): Hentet fra: 5. AM H, JA P, Labiris R, al et. SYstematic overview of warfarin and its drug and food interactions. Arch Intern Med [Internet]. 23. Maj 2005;165(10): Hentet fra: 6. Statens Serum Institut - Statistikker [Internet]. [citeret 7. december 2015]. Hentet fra: 014%22,%222013%22,%222012%22,%222011%22%5d,%22region%22:%5b%220%22%5 d,%22gender%22:%5b%22a%22%5d,%22agegroup%22:%5b%22a%22%5d,%22searchv ariable%22:%5b%22people_count%22%5d,%22errormessages%22:%5b%5d,%22treatm entgroup%22:%5b%22blodprop3%22%5d%7d 7. NBV Dansk Cardiologisk Selskab Atrieflimren og atrieflagren [Internet]. [citeret 20. november 2015]. Hentet fra: 8. Apixaban Pro Medicin [Internet]. [citeret 20. npvember 2015]. Hentet fra: 9. Institut for Rationel Farmakoterapi Information om oral antikoagulansbehandling [Internet]. [citeret 20. november 2015]. Hentet fra: Dit hjerte Atrieflimren - Hjerteforeningen [Internet]. [citeret 23. december 2015]. Hentet fra: Sand O. Menneskets anatomi og fysiologi. 2. udg. Kbh.: Gad; sider, illustreret i farver p. 12. Borup VD. Biokemi. 1. udg. Kbh.: FADL; sider, illustreret i farver p. 13. INR. Koagulation, vævsfaktor-induceret (KF II, VII, ) - sundhed.dk [Internet]. [citeret 3. Januar 2016]. Hentet fra: Side 40 af 62

41 14. Samama M-M, Amiral J, Guinet C, Le Flem L, Seghatchian J. Monitoring plasma levels of factor a inhibitors: how, why and when? Expert Rev Hematol [Internet]. 2013;6(2): Hentet fra: Warfarin «Orion» Pro. Medicin [Internet]. [citeret 27. december 2015]. Hentet fra: Region Sjælland - LMV - Koagulationsfaktor II+VII+ [INR];P [Internet]. [18. december 2015]. Hentet fra: Frost C, Nepal S, Wang J, Schuster A, Byon W, Boyd R a., et al. Safety, pharmacokinetics and pharmacodynamics of multiple oral doses of apixaban, a factor a inhibitor, in healthy subjects. Br J Clin Pharmacol [Internet]. 2013;76(5): Hentet fra: 1/bcp.12106/asset/bcp12106.pdf?v=1&t=hulnfz6b&s=aa4d28bc7cf68cbd25c4ab727f78 3bf2a9f95dd4 18. NBV Dansk Cardiologisk Selskab Peroral antikoagulansbehandling [Internet]. [citeret 20. december 2015]. Hentet fra: Nedsat leverfunktion - Promedicin [Internet]. [21. december 2015]. Hentet fra: Connock M, Stevens C, Fry-Smith A, Jowett S, Fitzmaurice D. Clinical effectiveness and cost-effectiveness of different models of managing long-term oral anticoagulation therapy: a systematic review and economic modelling. Health Technol Assess (Rockv) [Internet]. 2007;11(38):86. Hentet fra: IRF. Compliance- om afvigelser mellem lægers ordinationer og patienternes faktiske medicinering. Rapport om compliance. 2006;59.pdf Hentet fra: Antikoagulationsbehandling Sundhed.dk [Internet]. [20. december 2015]. Hentet fra: Clinical Trials - Portola Pharmaceuticals, Inc. [Internet]. [citeret 21. december 2015 ]. Hentet fra: Danske Regioner. Pres på sundhedsvæsenet. 2015; [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra dsv%c3%a6senet 25. RADS. Rådet for dyr Sygehus Medcin. 11. December 2014 [citeret 14. december 2015]; Hentet fra: Forum C. ESC Guidelines» 2012 focused update of the ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation «. 2013; 27. Validering af apparatur og analyser. Dokument id: Region Sjællands Dokumentportal [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: Side 41 af 62

42 28. DSKB - Dansk Selskab for Klinisk Bikemi. RL6 rapport [citeret ]; Hentet fra: Bekendtgørelse om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik - retsinformation.dk [Internet]. [citeret 6. oktober 2015]. Hentet fra: Bendsen T, Noter i statistik Westgard regler [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: Vurdering af kontrolmateriale og kontroladsvarsler. Dokumet id: Region Sjællands Dokumentportal [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: Bendsen T, Noter i statistik Ekstern kvalitetskontrol [Internet]. [citeret 4. Januar 2016]. Hentet fra: Landge SB, Jadhav SA, Dahale SB, Solanki P V. Development and Validation of Stability Indicating RP-HPLC Method on Core Shell Column for Determination of Degradation and Process Related Impurities of Apixaban An Anticoagulant Drug. 2015;(May): Klinisk Biokemi, OD - P-Apixaban, ver. 1 Odense Universitetshospital [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: Gouin-Thibault I, Flaujac C, Delavenne, Quenet S, Horellou M-H, Laporte S, et al. Assessment of apixaban plasma levels by laboratory tests: suitability of three anti-a assays. A multicentre French GEHT study. Thromb Haemost [Internet]. Schattauer Publishers; 2014;111(2): Hentet fra: Douxfils J, Chatelain C, Chatelain B, Dogné J-M, Mullier F. Impact of apixaban on routine and specific coagulation assays: a practical laboratory guide. Thromb Haemost [Internet]. 2013;110(2): Hentet fra: Garcia D, Barrett YC, Ramacciotti E, Weitz JI. Laboratory assessment of the anticoagulant effects of the next generation of oral anticoagulants. J Thromb Haemost. 2013;11(2): Centrifugering af forskellige glastyper. Dokument id: Region Sjællands Dokumentportal [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: RADS - Baggrundsnotat S, Det E, Normal A. Lægemiddelrekommandation for oral antikoagulation ved non-valvulær atrieflimmer. 2014;2 3 [Internet]. [Citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: Side 42 af 62

43 Bilag Side 43 af 62

44 Bilag 1 - Analyseskema over anvendte referencer Analyseskema til oversigt over brugen af referencer/ressourcer i et læringsforløb med et skriftligt produkt. Navn: Studienummer: Modul: 14 Produktionsår: 2015/2016 Titel: Problemformulering: Validering og implementering af apixaban En ny koagulationsanalyse Hvilke valideringsresultater vil være relevante for at kunne validere og implementere analysen apixaban på STA-R Evolution på KBA Næstved? Hvilken betydning har det for patienterne, AK-Center og rekvirerende læger at analysen implementeres i Region Sjælland? Reference Bemærkninger 1. Dit hjerte Fakta om hjertekarsygdomme - Hjerteforeningen [Internet]. [citeret 2. december 2015]. Hentet fra: 2. Trombofili. Sundhed dk. [Internet]. [citeret 2. december 2015]. Hentet fra: Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peer-reviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) Internet Internet 1 Reference-kategorier: Kategori 1: Videnskab og forskning (peer-reviewed), på dansk; Kategori 2: Videnskab og forskning (peer-reviewed), andre sprog end dansk; Kategori 3: Lærebog; Kategori 4: Faglig artikel (ikke peer-reviewed artikler fx fra fagblade); Kategori 5: Debat- og populærartikel (holdningsprægede artikler (uden referencer), indlæg, avisartikler, radio- og tv-interviews, samtaler mv.) Kategori 6: Andet (under andet skrives, hvad dette er, eksempelvis film fra YouTube (faglig, debat el. lign. angives), analysevejledning, datasheet osv.) Side 44 af 62

45 Reference Bemærkninger Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peer-reviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) 3. Atrieflimren og -flagren - Sundhed.dk [Internet]. [citeret 20. november 2015]. Hentet fra: Internet 4. Yeh CH, Hogg K, Weitz JI. Overview of the New Oral Anticoagulants: Opportunities and Challenges. Arterioscler Thromb Vasc Biol [Internet]. 1. Maj 2015;35 (5 ): Hentet fra: 5. AM H, JA P, Labiris R, al et. SYstematic overview of warfarin and its drug and food interactions. Arch Intern Med [Internet]. 23. Maj 2005;165(10): Hentet fra: Review 6. Statens Serum Institut - Statistikker [Internet]. [citeret 7. december 2015]. Hentet fra: %22,%222012%22,%222011%22%5d,%22region%22:%5b%220%22%5d,%22gender%22:%5b %22A%22%5d,%22ageGroup%22:%5b%22A%22%5d,%22searchVariable%22:%5b%22people_count %22%5d,%22errorMessages%22:%5b%5d,%22treatmentGroup%22:%5b%22blodprop3%22%5d%7 D Internet 7. NBV Dansk Cardiologisk Selskab Atrieflimren og atrieflagren [Internet]. [citeret 20. november 2015]. Hentet fra: Internet 8. Apixaban Pro Medicin [Internet]. [citeret 20. npvember 2015]. Hentet fra: Internet 9. Institut for Rationel Farmakoterapi Information om oral antikoagulansbehandling [Internet]. [citeret 20. november 2015]. Hentet fra: Internet Side 45 af 62

46 Reference Bemærkninger Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peer-reviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) 10. Dit hjerte Atrieflimren - Hjerteforeningen [Internet]. [citeret 23. december 2015]. Hentet fra: Internet 11. Sand O. Menneskets anatomi og fysiologi. 2. udg. Kbh.: Gad; sider, illustreret i farver 12. Borup VD. Biokemi. 1. udg. Kbh.: FADL; sider, illustreret i farver 13. INR. Koagulation, vævsfaktor-induceret (KF II, VII, ) - sundhed.dk [Internet]. [citeret 3. Januar 2016]. Hentet fra: Internet 14. Samama M-M, Amiral J, Guinet C, Le Flem L, Seghatchian J. Monitoring plasma levels of factor a inhibitors: how, why and when? Expert Rev Hematol [Internet]. 2013;6(2): Hentet fra: Review 15. Warfarin «Orion» Pro. Medicin [Internet]. [citeret 27. december 2015]. Hentet fra: Internet 16. Region Sjælland - LMV - Koagulationsfaktor II+VII+ [INR];P [Internet]. [18. december 2015]. Hentet fra: Vejledning 17. Frost C, Nepal S, Wang J, Schuster A, Byon W, Boyd R a., et al. Safety, pharmacokinetics and pharmacodynamics of multiple oral doses of apixaban, a factor a inhibitor, in healthy subjects. Br J Clin Pharmacol [Internet]. 2013;76(5): Hentet fra: 6/asset/bcp12106.pdf?v=1&t=hulnfz6b&s=aa4d28bc7cf68cbd25c4ab727f783bf2a9f95dd4 Tidsskirft 18. NBV Dansk Cardiologisk Selskab Peroral antikoagulansbehandling [Internet]. [citeret 20. december 2015]. Hentet fra: Internet 19. Nedsat leverfunktion Promedicin [Internet]. [21. december 2015]. Hentet fra: Internet Side 46 af 62

47 Reference Bemærkninger Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peer-reviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) 20. Connock M, Stevens C, Fry-Smith A, Jowett S, Fitzmaurice D. Clinical effectiveness and costeffectiveness of different models of managing long-term oral anticoagulation therapy: a systematic review and economic modelling. Health Technol Assess (Rockv) [Internet]. 2007;11(38):86. Hentet fra: Review 21. IRF. Compliance- om afvigelser mellem lægers ordinationer og patienternes faktiske medicinering. Rapport om compliance. 2006;59.pdf Hentet fra: Rapport 22. Antikoagulationsbehandling Sundhed.dk [Internet]. [20. december 2015]. Hentet fra: Internet 23. Clinical Trials - Portola Pharmaceuticals, Inc. [Internet]. [citeret 21. december 2015 ]. Hentet fra: Danske Regioner. Pres på sundhedsvæsenet. 2015; [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra senet Rapport 25. RADS. Rådet for dyr Sygehus Medcin. 11. December 2014 [citeret 14. december 2015]; Hentet fra: Internet 26. Forum C. ESC Guidelines» 2012 focused update of the ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation «. 2013; Rapport 27. Validering af apparatur og analyser. Dokument id: Region Sjællands Dokumentportal [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: D4 vejledning Side 47 af 62

48 Reference Bemærkninger Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peer-reviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) 28. DSKB - Dansk Selskab for Klinisk Bikemi. RL6 rapport [citeret ]; Hentet fra: Rapport 29. Bekendtgørelse om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik - retsinformation.dk [Internet]. [citeret 6. oktober 2015]. Hentet fra: Retsinfo 30. Bendsen T, Noter i statistik Westgard regler [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: Statnoter 31. Vurdering af kontrolmateriale og kontroladsvarsler. Dokumet id: Region Sjællands Dokumentportal [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: D4 vejledning 32. Bendsen T, Noter i statistik Ekstern kvalitetskontrol [Internet]. [citeret 4. Januar 2016]. Hentet fra: Statnoter 33. Landge SB, Jadhav SA, Dahale SB, Solanki P V. Development and Validation of Stability Indicating RP- HPLC Method on Core Shell Column for Determination of Degradation and Process Related Impurities of Apixaban An Anticoagulant Drug. 2015;(May): Klinisk Biokemi, OD - P-Apixaban, ver. 1 Odense Universitetshospital [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: D4 vejledning 35. Gouin-Thibault I, Flaujac C, Delavenne, Quenet S, Horellou M-H, Laporte S, et al. Assessment of apixaban plasma levels by laboratory tests: suitability of three anti-a assays. A multicentre French GEHT study. Thromb Haemost [Internet]. Schattauer Publishers; 2014;111(2): Hentet fra: Douxfils J, Chatelain C, Chatelain B, Dogné J-M, Mullier F. Impact of apixaban on routine and specific coagulation assays: a practical laboratory guide. Thromb Haemost [Internet]. 2013;110(2): Hentet fra: Side 48 af 62

49 Reference Bemærkninger Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peer-reviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) 37. Garcia D, Barrett YC, Ramacciotti E, Weitz JI. Laboratory assessment of the anticoagulant effects of the next generation of oral anticoagulants. J Thromb Haemost. 2013;11(2): Centrifugering af forskellige glastyper. Dokument id: Region Sjællands Dokumentportal [Internet]. [citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: D4 vejledning 39. RADS - Baggrundsnotat S, Det E, Normal A. Lægemiddelrekommandation for oral antikoagulation ved non-valvulær atrieflimmer. 2014;2 3 [Internet]. [Citeret 3. januar 2016]. Hentet fra: Internet Figurer: 1. Egen figur 2. Samama M-M, Amiral J, Guinet C, Le Flem L, Seghatchian J. Monitoring plasma levels of factor a inhibitors: how, why and when? Expert Rev Hematol [Internet]. 2013;6(2): Hentet fra: 3. Egen figur 4. Egne figurer 4-11 fra Excel Side 49 af 62

50 Bilag 2 Flowskema & Westgard Side 50 af 62

51 Bilag 3 Indlægssedler Stago Side 51 af 62

52 Side 52 af 62

53 Side 53 af 62

54 Side 54 af 62

55 Side 55 af 62

56 Bilag 4 Vejledning til KBA OUH Side 56 af 62

57 Bilag 5 Rådata - Arbejdsskema Side 57 af 62

58 Side 58 af 62

59 Bilag 6 OUH ECAT Side 59 af 62

60 Side 60 af 62

61 Bilag 7 Uddrag fra PAV Side 61 af 62

62 Bilag 8 Labprotokol Se separat medsendt fil i wiseflow Side 62 af 62