Lysspredning. Lars Øgendal

Lysspredning Lars Øgendal Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet, 7. januar 2011

ii

Indhold 1 Indledning 3 1.1 Hvad er lysspredning?.............................. 3 2 Simpel teori for statisk lysspredning 7 2.1 Rayleigh forholdet................................ 9 2.2 Dipoler...................................... 10 2.3 Spredning af lys fra én lille usammensat partikel................. 11 2.4 Spredning fra et lille, sammensat molekyle.................... 15 2.4.1 Uden brug af komplexe tal........................ 15 2.4.2 Med brug af komplexe tal........................ 20 2.5 Spredning fra flere ens molekyler......................... 23 2.6 Resumé...................................... 25 3 Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse 27 3.1 Koncentrationseffekter for små molekyler.................... 27 3.2 Formfaktoren................................... 29 3.3 Størrelsesbestemmelse.............................. 31 3.3.1 Guinierapproximationen......................... 31 3.4 Molekylvægt og størrelse i blandinger...................... 33 3.4.1 Gennemsnitsbestemmelser........................ 33 3.4.2 Detaljerede bestemmelser........................ 35 3.5 Resumé...................................... 37 iii

iv Indhold 4 Simpel teori for dynamisk lysspredning 41 4.1 Intensitetsfluktuationer.............................. 43 4.2 Autokorrelationsfunktionen............................ 44 4.3 Data-analyse................................... 48 4.3.1 Monodisperse opløsninger........................ 48 4.3.2 Polydisperse opløsninger......................... 49 5 Lysspredning i praksis 55 5.1 Apparatur..................................... 55 5.1.1 Koncentrationsmåling.......................... 56 5.1.2 Inline måling af koncentration i forbindelse med SEC.......... 58 5.1.3 Inline måling af lysspredning i forbindelse med SEC.......... 61 5.1.4 Bestemmelse af molekylvægt...................... 63 A Komplekse tal 65 B Data fitning 69

0 Indhold

Forord Dette notesæt handler om lysspredning forstået som en måleteknik. Selve det fysiske fænomen lysspredning bliver gennemgået i det omfang, det er relevant for forståelsen af måleteknikken og dermed for fortolkningen af data. Der er tilstræbt en blid indføring i emnet, så flere fænomener bliver berørt gentagne gange men udfra forskellige anskuelser. Selve lyset bliver beskrevet som elektromagnetisk stråling eller som fotoner afhængigt af, hvad der i den aktuelle sammenhæng giver den simpleste beskrivelse. 1

2 Indhold

1Indledning 1.1 Hvad er lysspredning? Det fænomen, at lys, der rammer en partikel (molekyle eller lign.), derved ændrer retning, kaldes lysspredning. Lidt forenklet kan man sige, at lys ligesom anden elektromagnetisk stråling vekselvirker med stof på to måder: 1. Absorption (fotonerne forsvinder) 2. Spredning (fotonerne ændrer retning) Hvis spredningen foregår på en tilpas ordnet måde, kan det på makroskopisk niveau give sig udtryk i refleksion eller i brydning (refraktion). I disse noter forudsætter vi at spredningen foregår på en (men vil det vise sig ikke fuldstændig) uordnet måde. Begge vekselvirkningsfænomener giver anledning til at lysstråler svækkes på deres vej gennem opløsninger 1 (se figur 1.1). Lyset svækkes p.g.a. enten absorption eller spredning. I begge tilfælde er den transmitterede intensitet eksponentielt aftagende med tykkelsen x af stoflaget. I 1 Dette gælder også gasser og faste stoer. 3

4 Kapitel 1. Indledning forbindelse med absorption skrives I = I 0 10 αx medens svækkelse ved spredning beskrives som I = I 0 e τx. Størrelserne α og τ kaldes hhv. absorptionskoefficienten og turbiditeten. Forskellen i grundtal for eksponentialfunktionen beror udelukkende på en konvention. Når x I = I 0 10 -α x x I = I 0 e -τ x Figur 1.1: Det transmitterede lys svækkes p.g.a. absorption (øverst) eller spredning (nederst). man indenfor fysik eller i kemi taler om lysspredning eller lyssprednings-målinger, underforstås næsten altid at systemet, man måler på, er en opløsning af det stof, der er genstand for ens undersøgelser. Principperne for lysspredningsmåling diskuteres lettest ud fra en principskitse af en typisk måleopstilling for statisk lysspredning (dynamisk lysspredning kræver visse modifikationer). En sådan ses i figur 1.2. Prøven befinder sig i en kuvette, der normalt har form som en cylinder. Prøven belyses med en monokromatisk lyskilde (dvs. en lyskilde, hvor lyset udsendes ved kun én bølgelængde), hvis intensitet (eller effekt) monitoreres kontinuerligt. Intensiteten (eller effekten) af det spredte lys registreres af en detektor, der kan være en fotodiode eller et fotomultiplikatorrør (PMT), der betragter prøven under en kendt vinkel, θ. Medens absorption af lys (og dermed detektoren) bedst forstås ud fra fotonbegrebet, forstås

1.1. Hvad er lysspredning? 5 A/D converter PC Reference detektor Detektor Laser Halvgennemsigtigt spejl θ Prøve-kuvette Figur 1.2: Principskitse af opstilling til måling af statisk lysspredning. Intensiteten af det spredte lys måles som funktion af spredningsvinklen (detektorens betragtningsvinkel), θ. Den målte intensitet divideres med intensiteten af den indkommende laserstråling, der derfor også måles vha. en reference detektor. spredning af lys lettest ud fra en bølgebeskrivelse, jvf. elektromagnetisk strålingsteori (EMS). Spredning af lys kan forklare en række dagligdags fænomener såsom, hvorfor himlen er blå, hvorfor skyer er synlige når den vanddamp skyerne er dannet af ikke er det, hvorfor mælk er hvidt, etc..... Men spredning af lys kan som nævnt også anvendes som en eksperimentel metode til at opnå information om makromolekyler og partikler i opløsning, nemlig om molekylvægt, diffusionskoefficient, størrelse, form (i et vist omfang) og endelig vekselvirkningskræfter. Disse noter behandler to lyssprednings-teknikker, nemlig statisk lysspredning (SLS) og dynamisk lysspredning (DLS), som vil blive omtalt i nævnte rækkefølge. Allerede nu kan det afsløres at statisk lysspredning benytter måling af den spredte middel lysintensitet som funktion af spredningsvinklen (betragtnings-vinklen) θ, medens dynamisk lysspredning udnytter måling af tidslige korrelationer i fluktuationerne (på µs skala) i intensiteten af det spredte lys, der til gengæld normalt kun måles i en enkelt spredningsvinkel. Figur 1.3 illustrerer hvilke egenskaber ved det spredte lys, der benyttes i de to teknikker. Sammenfattende kan siges om forskellen mellem statisk og dynamisk lysspredning:

6 Kapitel 1. Indledning 10 8 Dynamisk lysspredning Intensitet 6 4 2 < I > Statisk lysspredning 0 0 1 2 3 4 5 tid (µ s) Figur 1.3: Lys, der spredes fra en opløsning af makromolekyler, har en middelintensitet, der afspejler molekylvægten, medes intensitets-uktuationerne har en karakteristisk uktuationstid, der afspejler molekylernes diusionskoecient. Statisk lysspredning benytter måling af det spredte lys intensitet ved mange vinkler (typisk 10 100). Intensiteten, der benyttes er normalt en middelintensitet opnået ved at midle i mindst 1 sekund. Den molekylære størrelsesinformation ligger i selve intensiteterne ved de forskellige vinkler. Dynamisk lysspredning benytter måling af lange serier af lysets middelintensitet, hvor midlingen foregår over så kort tid (ned til 200 ns) at der er store fluktuationer i intensiteten indenfor serien. Den molekylære størrelsesinformation ligger i de karakteristiske fluktuationstider for intensiteten.

2Simpel teori for statisk lysspredning Siden slutnigen af det 19. århundrede har lys været anvendt til bestemmelse af partikelstørrelser (Tyndall 1869, Rayleigh 1871 og 1881) og senere til bestemmelse af makromolekylers molekylvægt (Debye 1944 og 47). Måleteknikken, der benyttes kaldes statisk lysspredning eller SLS. Den bygger på det faktum, at når lys går igennem en opløsning af molekyler (partikler), vil en del af lyset spredes ud i alle mulige retninger. Den del af lyset, der spredes kan være så stor, at opløsningen virker helt ugennemsigtig. Dette gælder f. eks. mælk, der er hvidt fordi lyset spredes af mikroskopiske fedtpartikler og proteinpartikler (caseinmiceller) i væsken. I andre situationer er den brøkdel af lyset, der spredes så lille, at opløsningen virker fuldstændig gennemsigtig for det blotte øje. Denne situation ville man have, hvis man så på en opløsning af f. eks. 1 mg/ml BSA (bovin serum albumin, et protein med en molekylvægt på ca 66000 g/mol). For at se det spredte lys med øjnene kræves der en meget intens lyskilde (en laser), men så ses det spredte lys også som et lysende spor, der trækkes gennem opløsnigen af laserstrålen (se figur 2.1). Det er den sidstnævnte situation man er i, når lysspredning benyttes i praksis til bestemmelse af molekylvægte. Der er to betingelser, som lyset skal opfylde for at kunne anvendes til kvantitativ lysspredning. Den ene er, at det benyttede lys skal være monokromatisk, dvs. have en veldefineret bølgelængde. Den anden betingelse er, at lyset skal være kollimeret, dvs. det skal bevæge sig som et bundt 7

8 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning Figur 2.1: Laseren til højre i billedet udsender en intens lysstråle, der i princippet er usynlig set fra siden med mindre der er støvpartikler til stede i luften. Når laserstrålen går igennem en opløsning af store molekyler, f. eks. BSA, spredes noget af lyset af de opløste molekyler, således at strålen trækker et synligt lysende spor gennem opløsningen. af parallelle lysstråler. Almindelig hvidt lys består af bølgelængder mellem 300 og 700 nm og er således ikke monokromatisk. Man kan så ved brug af passende farvefiltre, der kun tillader en snæver gruppe af bølgelængder at passere (eller et prisme der skiller lyset i de forskellige farvekomponenter, for derefter at udvælge en bestemnt farve (bølgelængde) ved at blokere for de uønskede bølgelængder med en blænde). Jo mere præcis bølgelængden skal være, desto mere af det oprindelige lys skal fjernes, dvs. lyset bliver svagt. Betingelsen om at lyset skal være kollimeret opnår man ved at sætte en lille blænde foran lyskilden, så det udsendte lys kommer fra et lille område. Dernæst gøres de udsendte lysstråler parallelle ved at blive sendt gennem et system af linser. Jo mindre hul der er i blænden jo mere parallelle kan linsen gøre strålerne. Da målingens præcision afhænger af hvor godt lyset er monokromatiseret og hvor godt det er kollimeret, ses det, at det benyttede lys nødvendigvis må blive ret svagt, hvis udgangspunktet er hvidt lys. Og svagt lys sænker alt andet lige målingernes præcision. Dette dilemma har i dag kun historisk interesse, da man nu benytter lasere som lyskilde. Statisk lysspredning er i de senere år blevet genstand for fornyet interesse efter fremkomsten af kommercielle laserbaserede instrumenter. Fordelen ved at benytte en laæser som lyskilde er, at den udsender meget intenst lys, som samtidig er praktisk taget monokromatisk og som uden brug

2.1. Rayleigh forholdet 9 af blændere er kollimeret så godt som det er teoretisk muligt. Desuden er laserens lys som regel polariseret (dvs. at lysets elektriske felt kun svinger i én retning), i modsætning til lys, der er frembragt ved farvefiltrering af lyset fra f. eks. en glødelampe eller wn udladningslampe. At lyset er polariseret er spredningsteknisk en fordel, men har den praktiske ulempe, at de formler der benyttes til tolkning af måleresultaterne er forskellige for polariseret og for upolariseret lys. Dette indebærer, at formler taget fra litteratur før 1960 (laserens opfindelsesår) skal benyttes med stor varsomhed. 2.1 Rayleigh forholdet Når man foretager en lysspredningsmåling på en opløsning af partikler, er det jo som regel med det formål at opnå viden om opløsningen og ikke om apparaturet. Det er klart, at hvis man erstatter lyskilden i spredningsapparaturet med en dobbelt så kraftig lyskilde, så vil den spredte intensitet også fordobles ligesom en fordobling af afstanden mellem detektoren og prøven vil resultere i en reduktion i den registrerede intensitet med en faktor 4, da denne jo er omvendt proportional med anden potens af afstanden mellem spredende objekt og modtager. For at få en størrelse, der er uafhængig af apparaturet, men kun afhænger af det studerede system, definerer man Rayleigh forholdet R θ for opløsningen, man studerer som R θ = I s(θ) r 2 I 0 V s (θ) (2.1) hvor I s (θ) er intensiteten af den spredte stråling målt i betragtningsvinklen θ jvf. figur 1.2, I 0 er intensiteten af den anvendte laser, V s (θ) er spredningsvolumenet (dvs. det volumen som både er belyst af laseren og som samtidig kan ses af detektoren se figur 2.2), og r er afstanden fra spredningsvolumenet til detektoren. Når vi i afsnit 2.4 går bort fra at beskrive spredningsprocesser ved hjælp af spredningsvinklen θ, men i stedet benytter længden q af spredningsvektoren (se senere i kapitlet samt figur 2.8), defineret ved q = (4πn/λ) sin(θ/2), er det dermed naturligt at opfatte Rayleighforholdet som en funktion af q: R(q) = I s(q) r 2 I 0 V s (q) (2.2)

10 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning sigteområde d 2 Laserstråle d 1 θ Figur 2.2: På grund af de blændere, der normalt anvendes i en detektor, ser den kun, hvad der ligger indenfor et vist sigteområde (en cylinder) af diameter d 2, medens det belyste område tilnærmelsesvis er en cylinder med diameter d 1. Skæringen mellem disse to områder kaldes spredningsvolumenet, V s, og har den minimale værdi V 0 når θ = 90. Der gælder tilnærmelsesvis, at V s (θ) = V 0 / sin(θ) V s Det vil fremgå af de følgende afsnit, at R(q) er en funktion, der i første tilnærmelse afhænger af Molmassen af de opløste molekyler Koncentrationen af de opløste molekyler Brydningsindex af opløsningsmidlet Brydningsindex af de opløste molekyler Størrelsen af de opløste molekyler men som derudover også afhænger af vekselvirkningskræfter mellem partiklerne. 2.2 Dipoler For at forstå hvordan lys kan spredes af partikler eller molekyler, er det nødvendigt at vide hvad en elektrisk dipol er. En elektrisk dipol er et objekt, der har en asymmetrisk ladningsfordeling, normalt således at der er en netto positiv ladning i den ene ende og en netto negativ ladning i den anden ende (se figur 2.3). Dipolmomentet µ defineres for det simple tilfælde vist til venstre på figuren som µ = d Q, altså som produktet af separationen mellem den positive ladning Q og den negative ladning Q. Dipolmomentet kan være permanent eller induceret, dvs. fremkaldt af et udefra kommende elektrisk felt. I forbindelse med spredning af lys er det kun inducerede

2.3. Spredning af lys fra én lille usammensat partikel 11 dipolmomenter, der er af betydning. I det mere generelle tilfælde, til højre på figuren, må man definere dipolmomentet ved et integral 1. Det interessante ved det inducerede dipolmoment er, at dets størrelse afhænger af styrken af det ydre elektriske felt, E, ved relationen µ = α ϵ 0 E, (hvor ϵ 0 = 8.85 10 12 F m 1 er vacuumpermittiviteten) ialtfald så længe det ydre felt ikke er for stærkt. Størrelsen α kaldes polarisabiliteten for partiklen og udtrykker ladningernes villighed til at lade sig flytte af et ydre elektrisk felt (en slags elektrisk "fjederkonstant"). d - Q + Q E - - - - + 300 V - 300 V µ = d Q Figur 2.3: Til vestre er vist en elektrisk dipol. Dipolmomentet µ deneres som produktet af den halve ladningsforskel (mellem de to ender) og deres afstand. Til højre er vist hvordan en partikel bliver til en dipol når den udsættes for et ydre elektrisk felt. 2.3 Spredning af lys fra én lille usammensat partikel Når spredning af lys skal diskuteres, er det formålstjenligt at beskrive lys som elektromagnetisk stråling: Et elektrisk og et magnetisk felt svinger vinkelret på hinanden og på udbredelses- retningen med frekvensen ν (og dermed med den cykliske frekvens ω = 2πν). Kun det elektriske felt er af betydning for lysspredning, idet det påvirker ladningerne i molekylet, så det polariseres (figur 2.4). Ladningerne i molekylet flytter sig i takt med det indkommende felt, og molekylet bliver derved til en oscillerende dipol, der svinger med samme frekvens, ν, som det lys, der rammer det. Herved udsender molekylet ifølge elektromagnetisk strålingsteori (EMS) som enhver an- 1 Dipolmomentet er egentlig en vektor, µ. Det kan beregnes som µ = 1 2 r (ρ( r) ρ)dv, hvor ρ( r) er ladningstætheden og ρ er middelladningstætheden, og integralet udstrækkes over legemet, der indeholder ladningen.

12 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning t = 0 t = λ/(2c) Figur 2.4: Det udefra kommende, svingende elektriske felt E forskyder ladningerne i molekylet, så det bliver positivt i den ene ende og negativt i den anden. Herved bliver molekylet til en svingende dipol med et dipolmoment µ = µ(t) = αe = E 0 cos(ωt kx) = µ 0 cos(ωt kx). den oscillerende dipol elektromagnetisk stråling i alle retninger, men med en intensitet, der afhænger af retningen. Vi vil her betragte den situation, at det indkommende lys er polariseret 2, dvs. at det elektriske felt hele tiden svinger i samme plan (se figur 2.5) Endvidere vil vi se på spredning af lyset fra én partikel, der antages at være meget mindre i udstrækning end lysets bølgelængde λ. Partiklen er for nemheds skyld anbragt i koordinatsystemets begyndelsespunkt. Det elektriske felt i lyset, der rammer den viste partikel (molekyle), kan beskrives som en bølge, der udbreder langs x-aksen: E(x, t) = E y (x, t) = E 0 cos(2πν(t x/c)) (2.3) hvor ν er lysets frekvens, c er dets hastighed og E 0 er amplituden af lysets elektriske feltkomponent. Hvis man definerer bølgetallet k = 2π/λ, hvor λ er lysets bølgelængde i det pågældende medium 3 og benytter at ν/c = 1/λ kan 2.3 omskrives til: hvor ω som nævnt er lysets (feltets) cykliske frekvens. E(x, t) = E y (x, t) = E 0 cos(ωt kx) (2.4) Ifølge EMS er intensiteten I 0 af det indkommende lys givet ved tids-middelværdien af anden 2 Grunden hertil er, at det indkommende lys i vore dage normalt er udsendt af en (polariseret) laser. I ældre litteratur (før 1960) er alle udregninger i den sidste ende henført til upolariseret lys, da dette var, hvad der blev benyttet som standard i lysspredningsudstyr før laserens fremkomst. Dette gør at formler for lysspredning i ældre litteratur skal benyttes med stor varsomhed hvis de skal anvendes til tolkning af resultater opnået ved anvendelse af polariseret lys. 3 Hvis lysets bølgelængde i vacuum benævnes λ 0 og brydningsindex for mediet er n, skrives bølgetallet også k = 2πn/λ 0

2.3. Spredning af lys fra én lille usammensat partikel 13 z E 0 φ r E s,1 (r) Molekyle θ y x Figur 2.5: Lys, der er polariseret i xz-planen, rammer et lille (meget mindre end lysets bølgelængde) molekyle, der derved selv kommer til at udsende lys i alle retninger. Intensiteten af det spredte lys afhænger af dets udbredelsesretning givet ved de to vinkler θ og ϕ. potens af det elektriske felt: I 0 (x) = ϵ 0 c E 2 (x, t) = ϵ 0 c E 2 0 cos 2 (ωt kx) = ϵ 0 ce 2 0 cos 2 (ωt kx) (2.5) hvor ϵ 0 er vacuumpermittiviteten og c er lysets hastighed. Konstanten ϵ 0 c har værdien 2.656 10 3 F/s. Da middelværdien af cos 2 (ωt kx) beregnet over selv meget kort tid er 1 2, fås I 0 (x) = 1 2 ϵ 0cE 2 0 (2.6) Det elektriske felt E s,1 (r) af den spredte stråling (fra én partikel; deraf 1-tallet i subskriptet) i afstanden r fra molekylet (jvf. figur 2.5) er iflg. EMS givet ved ( ) πα sin ϕ E s,1 (r) = E 0 cos(ωt kr) rλ 2 (2.7) hvor λ er lysets bølgelængde (i det pågældende medium), α er molekylets polarisabilitet og r er afstanden fra molekylet til detektoren. Bemærk, at E s,1 (r) ikke afhænger af vinklen θ i forhold til x-aksen.

14 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning Ved anvendelse af ligning 2.6 fås at intensiteten af det spredte lys er givet ved eller, ved anvendelse af ligning 2.6 I s,1 (r) = ϵ 0 ce 2 s,1(r) = 1 2 ϵ 0cE 2 0 π2 α 2 sin 2 ϕ r 2 λ 4 (2.8) I s,1 (r) = I 0 π2 α 2 sin 2 ϕ r 2 λ 4 (2.9) Da lysspredningsapparatur normalt har detektoren anbragt i x-y-planen vil vi fra nu af forudsætte, at ϕ = 90, og vi får derfor at der for et lille molekyle gælder, at den spredte lysintensitet er I s,1 (r) = I 0 π2 α 2 r 2 λ 4 (2.10) Heraf fremgår, ikke overraskende, at intensiteten af det spredte lys er proportional med intensititen af det indkommende lys og omvendt proportional med kvadratet på afstanden fra det spredende molekyle og detektoren. Hvad der derimod ikke umiddelbart var at forvente er, at den spredte intensitet er omvendt proportional med λ 4, dvs. at (når de spredende partikler er små), blåt lys (λ 480 nm) spredes ca. 4.5 gange så effektivt som rødt lys (λ 700 nm). Dette er som bekendt forklaringen på, hvorfor himlen er blå. Denne form for spredning, der gælder når de spredende partikler er meget mindre end lysets bølgelængde 4, kaldes Rayleigh spredning, og er karakteriseret ved at være isotrop, dvs. lige kraftig i alle retninger i forhold til det indkommende lys, og ved at det spredte lys har samme bølgelængde som det indkommende lys. Hvis man måler I s,1 (r), kan polarisabiliteten α bestemmes af ligning 2.10, idet de øvrige størrelser er kendt. Ved at betragte figur 2.6 er det ikke vanskeligt at indse intuitivt, at α er proportional med molekylets "størrelse"(volumen eller molekylvægt), idet sidestilling af to småpartikler, hver med den molekylære polarisabilitet α 1 i et givet felt giver dipolmomentet µ = (2Q) d, og endestilling af partiklerne giver dipolmomentet µ = Q (2d). I begge tilfælde bliver dipolmomentet det dobbelte af, hvad det er for en enkelt partikel. På lignende måde indser man, at n partikler har dipolmomentet µ = nµ 1, hvormed den sammensatte partikel får polarisabiliteten α = nα 1. Da n = M/M 1, hvor M er den sammensatte partikels molekylvægt og M 1 er den lille partikels molekylvægt, fås, at α = (α 1 /M 1 ) M. Det fremgår herved af ligning 2.10, at den spredte lysintensitet for et enkelt molekyle er proportional med molekylvægten i anden potens. For molekyler, der er store i forhold til lysets 4 der kræves i virkeligheden også at α er lille; herom senere

2.4. Spredning fra et lille, sammensat molekyle 15 - Q - Q d E d + Q + Q d - Q + Q - Q + Q + 300 V - 300 V Figur 2.6: To små partikler har hver dipolmomentet µ 0 = Q d. Sidestilling af to partikler giver dipolmomentet µ = (2Q) d medens endestilling giver µ = Q (2d), idet +Q og -Q i midten ophæver hinanden. Resultatet er i begge tilfælde at µ = 2µ 1. Argumentet kan let generaliseres til n partikler. bølgelængde, kan argumentet ikke anvendes, da molekylet ikke har en veldefineret polarisationstilstand. Denne situation vil vi nu begynde at se på, men gør det først grundigt i afsnit 3.2. 2.4 Spredning fra et lille, sammensat molekyle Vi skal her se, hvordan den måde lysets måde at spredes på, er bestemt af interferens mellem de forskellige bidrag til den samlede spredte stråling, der stammer fra forskellige punkter i den sammensatte partikel. Hvis man er fortrolig med anvendelsen af komplexe tal, kan denne beskrivelses mellemregninger laves simpelt. Men vi starter med at gennemgå teorien uden brug af komplexe tal og viser så bagefter, i afsnit 2.4.2, hvordan mellemregningerne bliver simplere med brug af komplexe tal. 2.4.1 Uden brug af komplexe tal Dette afsnit kan som sagt springes over, hvis man foretrækker beskrivelsen baseret på komplexe tal. Som sædvanlig kunne vi ligeså godt tale om "partikler"som om molekyler, det afgørende for udledningerne i dette og i det følgende afsnit er, at partiklerne kan tænkes opdelt i mindre partikler, der alle har samme polarisabilitet, α. For at beskrive spredning af lys er det hensigtsmæssigt at gå bort fra at anvende sprednings-

16 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning vinklen, θ, men i stedet benytte den såkaldte spredningsvektor, q. Denne er defineret ud fra bølgevektoren, k, der er en vektor, der peger i lysets (fotonernes) udbredelsesretning, og som har længden k = 2π/λ, dvs det i afsnit 2.3 definerede bølgetal. Når en foton med bølgevektoren kind rammer et molekyle og derved ændrer retning (spredes), får den bølgevektoren k ud (se k- vektorerne i figur 2.7) Ændringen i bølgevektoren kaldes spredningsvektoren q = k ud k ind. k ind r k ud R E 1 E 2 Figur 2.7: Monokromatisk lys med bølgelængden λ, og bølgevektoren k ind, rammer to små partikler adskilt ved vektoren r. Detektoren tænkes anbragt i afstanden R fra koordinatsystemets begyndelsespunkt. De to partikler spreder lyset, der detekteres langt fra partiklerne, hvor feltbidragene er hhv. E 1 og E 2, der har samme amplitude. Længden q af spredningsvektoren beregnes let ved at betragte figur 2.8. Man ser, at q = 2a, hvor a = k sin θ og længden af bølgevektoren k = 2π. Heraf fås, at længden af spredningsvektoren 2 λ kan skrives q = 4π sin θ. Her står λ for lysets bølgelængde i udbredelsesmediet. Det er imidlertid praksis, at benytte lysets bølgelængde λ 0 i vacuum (i praksis det samme som i luft) i λ 2 stedet for. Hertil benyttes, at λ = λ 0 /n, hvor n er mediets brydningsindex. Brydningsindexet for et stof angiver med hvilken faktor lysets hastighded i stoffet er reduceret i forhold til hastigheden

2.4. Spredning fra et lille, sammensat molekyle 17 i vacuum. Altså: Herefter kan vi så skrive længden af spredningsvektoren n = c vacuum c medium (2.11) q = 4πn λ 0 sin θ 2 (2.12) k ind k /2 /2 a k ud q k a q Figur 2.8: Til venstre ses, at spredningsvektoren q = k ud k ind. Til højre ses, at q = 2a, hvor a = k sin θ 2. Da det spredte lys har samme bølgelængde som det indkommende lys er k ud = k ind k, hvor længden af bølgevektoren k = 2π λ. Heraf fås længden af spredningsvektoren q = 4π λ sin θ 2. Det bemærkes, at λ er bølgelængden af lyset i det pågældende medium. Indføres vacuumbølgelængden λ 0 og mediets brydningsindex n, kan men også skrive q = 4πn λ 0 sin θ 2 De spredte elektriske felter stammende fra de to partikler i figur 2.7 kan beskrives som plane bølger med samme amplitude, når man befinder sig i stor afstand fra de spredende partikler. Egentlig er det spredte felt fra hver partikel jo en kuglebølge, men betragtet i stor afstand og indenfor et begrænset område kan de betragtes som værende plane: E 1 = E 0 cos(ωt R k ud ) (2.13) E 2 = E 0 cos(ωt R k ud + ϕ) hvor faseforskellen ϕ (ikke at forveksle med den tidligere benyttede vinkel ϕ mellem det spredte lys udbredelsesretning og koordinatsystemets z-akse) skyldes at der er en vejlængdeforskel, s, for lys der når detektoren fra de to molekyler. Vejlængdeforskellen kan udregnes at

18 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning have værdien s = r q/ k ud, hvor r er en vektor, der går fra den ene partikel til den anden, og giver anledning til faseforskellen ϕ = r q (2.14) Intensiteten I total af det totale felt E = E 1 + E 2 beregnes vha. ligning 2.13: I total = ϵ 0 c E 2 = (E 0 cos(ωt R k ud ) + E 0 cos(ωt R k ud + ϕ)) 2 = ϵ 0 ce 2 0 cos 2 (ωt R k ud ) + cos 2 (ωt R k ud + ϕ) + 2 cos(ωt R k ud ) cos(ωt R k ud + ϕ) (2.15) De to første led i 2.15 (dem med cos 2 ) har begge middelværdien 1. Det sidste led i 2.15 2 beregnes ved brug af en af de utallige trigonometriske formler: hvormed: cos x cos y = 1 [cos(x + y) + cos(x y)] 2 2 cos(ωt R k ud ) cos(ωt R k ud + ϕ) = cos(2ωt 2 R k ud + ϕ) + cos( ϕ) (2.16) Middelværdien af det første led på højre side i 2.16 er 0, det sidste led er konstant og har derfor middelværdien cos( ϕ) Ialt fås så: I total = ϵ 0 ce 2 0 (1 + cos ϕ) = 2 I s, 1 (1 + cos( ϕ)) (2.17) Dvs at lyset, der er spredt fra to partikler, kan være fra 0 til 4 gange så intenst som lyset spredt fra en enkelt partikel. Dette resultat skal nu generaliseres: I stedet for at tillægge feltbidraget E 2 den ekstra fase ϕ kunne man naturligvis ligeså godt have tillagt E 1 fasen ϕ 1 og E 2 fasen ϕ 2, så ϕ 2 ϕ 1 = ϕ. Vi skal nu generalisere ligning 2.17, så hvis vi i stedet for to små partikler betragter et molekyle sammensat af n underenheder (f. eks. aminosyrer), der tænkes nummereret i = 1, 2,..., n, (se figur 2.9) bliver det totale, spredte elektriske felt (fra de n underenheder; deraf n i subskriptet) på detektorens plads, E s, n, tilsvarende: n E s, n = E 0 cos(ωt + ϕ j ) (2.18) j=1

2.4. Spredning fra et lille, sammensat molekyle 19 i r ij j z r i y r j x Figur 2.9: Molekylet består af n ens underenheder ("sub units"), og belyses på samme måde som vist i gur 2.7. I detektorens afstand fra molekylet giver de feltbidrag med samme amplitude E 0 men med forskellige faser ϕ 1, ϕ 2, ϕ n. Positionerne af de enkelte underenheder er beskrevet ved stedvektorerne r 1, r 2..., r n hvormed den totale spredte intensitet I s, n er givet ved I s, n = ϵ 0 c Es, 2 n ( n n ) = ϵ 0 c E 0 cos(ωt + ϕ j ) E 0 cos(ωt + ϕ i ) j=1 i=1 n n = ϵ 0 ce0 2 cos(ωt + ϕ i ) cos(ωt + ϕ j ) = ϵ 0 ce 2 0 j=1 k=1 n n j=1 k=1 1 2 [cos(2ωt + ϕ i + ϕ j ) + cos(ϕ i ϕ j )] (2.19) Her ser man, at leddene cos(2ωt + ϕ i + ϕ j ) har middelværdi 0 og at de øvrige led er konstante. Hermed fås så: n n I s, n = I s, 1 cos(ϕ j ϕ k ) (2.20) j=1 k=1 hvor I s, 1 som sædvanlig betegner intensiteten af lyset spredt fra én underenhed af molekylet. Hvis molekylets udstrækning, d, er meget mindre end lysets bølgelængde, så d k = d 2π/λ 0, er faseforskellene ϕ j ϕ k = r j q r k q = r jk q d 2k 0. Herved fås, at for samtlige led i ligning 2.20 er cos(ϕ j ϕ k ) cos(0) = 1. Da dobbeltsummen indeholder ialt n 2 led

20 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning fås: I s, n I s, 1 n 2 (2.21) og da n = M/M 1, hvor M er molekylvægten og M 1 er massen af en molekylær underenhed, er I s, n (I s, 1 /M1 2 ) M 2 (2.22) altså det samme resultat som blev udledt i afsnit 2.3, at spredningsevnen for et enkelt, lille molekyle er proportionalt med molekylvægten i anden potens. Bemærk, at resultatet er gyldigt når molekylet er så lille, at lysets faseforskelle indenfor molekylet er nær 0. Hvordan denne indskrænkning undgås, behandles i afsnit 3.2 2.4.2 Med brug af komplexe tal Dette afsnit er et alternativ til afsnit 2.4.1. Beskrivelsen er baseret på kompleks notation af sinusformede bølger. Dette fører til en stærk simplifikation af de efterfølgende beregninger. Appendix A beskriver kort, hvordan komplexe tal anvendes. Ordlyden er i det store hele en gentagelse af ordlyden i afsnit 2.4.1, så dette afsnit kan læses uafhængigt af det foregående afsnit. For at beskrive spredning af lys er det hensigtsmæssigt at gå bort fra at anvende spredningsvinklen, θ, men i stedet benytte den såkaldte spredningsvektor, q. Denne er defineret ud fra bølgevektoren, k, der er en vektor, der peger i lysets (fotonernes) udbredelsesretning, og som har længden k = 2π/λ, dvs det i afsnit 2.3 definerede bølgetal. Når en foton med bølgevektoren k ind rammer et molekyle og derved ændrer retning (spredes), får den bølgevektoren k ud (se k vektorerne i figur 2.7). Ændringen i bølgevektoren kaldes spredningsvektoren q = k ud k ind. Længden q af spredningsvektoren beregnes let ved at betragte figur 2.8. Man ser, at q = 2a, hvor a = k sin θ og længden af bølgevektoren k = 2π. Heraf fås, at længden 2 λ af spredningsvektoren kan skrives q = 4π sin θ. Her står λ for lysets bølgelængde i udbredelsesmediet. Det er imidlertid praksis, at benytte lysets bølgelængde λ 0 i vacuum (i praksis λ 2 det samme som i luft) i stedet for. Hertil benyttes, at λ = λ 0 /n, hvor n er mediets brydningsindex. Brydningsindexet for et stof angiver med hvilken faktor lysets hastighded i stoffet er reduceret i forhold til hastigheden i vacuum. Altså: n = c vacuum c medium (2.23)

2.4. Spredning fra et lille, sammensat molekyle 21 Herefter kan vi så skrive længden af spredningsvektoren q = 4πn λ 0 sin θ 2 (2.24) De spredte elektriske felter stammende fra de to partikler er begge beskrevet som bølger, der har samme amplitude: E 1 = E 0 e i(ωt R k ud ) E 2 = E 0 e i(ωt R k ud + ϕ) (2.25) hvor faseforskellen ϕ (ikke at forveksle med den tidligere benyttede vinkel ϕ mellem det spredte lys udbredelsesretning og koordinatsystemets z-akse) skyldes, at der er en vejlængdeforskel, s, for lys der når detektoren fra de to molekyler. Vejlængdeforskellen kan udregnes at have værdien s = r q/ k ud, hvor r er en vektor, der går fra den ene spredende partikel til den anden, og giver anledning til faseforskellen ϕ = r q (2.26) Intensiteten I total af det totale felt E = E 1 + E 2 beregnes vha. ligning 2.25: I total = 1 2 ϵ 0c E 2 = 1 2 ϵ 0cE E = (E 0 e i(ωt R k ud ) + E 0 e i(ωt R k ud + ϕ) ) (E 0 e i(ωt R k ud ) + E 0 e i(ωt R k ud + ϕ) ) = 1 2 ϵ 0cE0(1 2 + 1 + e i ϕ + e i ϕ ) = 1 2 ϵ 0cE0(2 2 + 2 cos(ϕ)) (2.27) hvor E betegner komplekskonjugering af E. Ligning 2.27 kan også skrives I total = ϵ 0 ce0 2 (1 + cos ϕ) = 2 I s, 1 (1 + cos( ϕ)) (2.28) dvs. samme resultat som fundet i foregående afsnit i ligning 2.17 I stedet for at tillægge feltbidraget E 2 den ekstra fase ϕ kunne man naturligvis ligeså godt have tillagt E 1 fasen ϕ 1 og E 2 fasen ϕ 2, så ϕ 2 ϕ 1 = ϕ.

22 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning Hvis vi i stedet for to små partikler betragter et molekyle sammensat af n underenheder (f. eks. aminosyrer), der tænkes nummereret i = 1, 2,..., n, (se figur 2.9), bliver det totale, spredte elektriske felt på detektorens plads, E s, n, tilsvarende: n E s, n = E 0 e i(ωt+ϕ j) (2.29) j=1 hvormed den totale spredte intensitet I s, n er givet ved I s, n = 1 2 ϵ 0cE s, n Es, n = 1 ( n n ) 2 ϵ 0c E 0 e i(ωt+ϕ j) E 0 e i(ωt+ϕ k) j=1 k=1 = 1 n n 2 ϵ 0cE0 2 e i(ϕ j ϕ k ) = I s, 1 n = I s, 1 n = I s, 1 n j=1 k=1 n e i(ϕ j ϕ k ) j=1 k=1 n j=1 k=1 n j=1 k=1 (cos(ϕ j ϕ k ) + i sin(ϕ j ϕ k )) cos(ϕ j ϕ k ) (2.30) hvor I s, 1 betegner (middel)intensiteten af lyset spredt fra én underenhed af molekylet, og hvor der ved overgangen til den sidste linie er benyttet, at sin(ϕ j ϕ k ) = sin(ϕ k ϕ j ), så sinusleddene parvis går ud mod hinanden. Hvis molekylets udstrækning, d, er meget mindre end lysets bølgelængde, så d k = d 2π/λ 0, er faseforskellene ϕ j ϕ k = r j q r k q = r jk q d 2k 0. Herved fås, at for samtlige led i ligning 2.30 er cos(ϕ j ϕ k ) cos(0) = 1. Da dobbeltsummen indeholder ialt n 2 led fås: I s, n I s, 1 n 2 (2.31) og da n = M/M 1, hvor M er molmassen og M 1 er massen af en molekylær underenhed, er altså det samme resultat som blev udledt i afsnit I s, n (I s, 1 /M 2 1 ) M 2 (2.32) 2.3, at spredningsevnen for et enkelt, lille molekyle er proportionalt med molvægten i anden potens. Bemærk, at resultatet er gyldigt når molekylet er så lille, at lysets faseforskelle indenfor molekylet er nær 0. Hvordan denne indskrænkning undgås behandles i afsnit 3.2

2.5. Spredning fra ere ens molekyler 23 2.5 Spredning fra flere ens molekyler Vi vil nu se på den situation, at lyset spredes fra N molekyler, der befinder sig i et volumen, V, som er jævnt belyst af den indkommende stråling og som samtidig kan ses af detektoren. Molekylerne antages alle at være af samme art som diskuteret ovenfor (se figur 2.10) Man i r ij j r i z r j y x Figur 2.10: N ens molekyler bender sig i et jævnt belyst volumen af en størrelse, så lyset spredt fra samtlige molekyler kan nå detektoren. kan nu genbruge ligning 2.20, men hvor de individuelle spredere nu er hele molekyler, hvis spredningsintensitet er givet ved ligning 2.22 N N I s, total = I s, n cos(ϕ j ϕ k ) (2.33) j=1 k=1

24 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning Da man i statisk lysspredning interesserer sig for middelintensiteten af det spredte lys skal denne beregnes: N N I s, total = I s, n cos(ϕ j ϕ k ) (2.34) j=1 k=1 Da molekylerne bevæger sig uafhængigt af hinanden, ændrer faserne ϕ j og ϕ k sig hele tiden uafhængigt af hinanden, hvorfor ϕ j ϕ k kan antage alle værdier, hvis j k. Derfor er cos(ϕ j ϕ k ) = 0 hvis j k medens de N led, hvor j = k har cos(ϕ j ϕ k ) = cos(0) = 1. Derfor kan ligning 2.34 skrives I s, total = I s, n N (2.35) Da antallet, N, af partikler i volumenet V er givet ved den molære koncentration c ved udtrykket N = V c kan ligning 2.35 omskrives ved hjælp af ligning 2.22: I s, total = I s, n N A cv = (I s, 1 /M1 2 ) N A cv M 2 = (I s, 1 N A V/M1 2 ) c M 2 = (I s, 1 N A V/M1 2 ) C M (2.36) hvor N A er Avogadros tal og C er vægtkoncentrationen. Idet spredningsintensiteten for én molekylær underenhed, I s, 1, er proportional med laserens intensitet og omvendt proportional med detektorens afstand, r kvadreret, dvs. I s, 1 N A /M1 2 = K I 0 /r 2, kan ligning 2.36 også skrives I s, total = KI 0 V CM/r 2 (2.37) eller med definitionen 2.2 på Rayleighforholdet, R(q): R(q) = KCM (2.38) Konstanten K kan ret nemt vises 5 at være relateret til opløsningens og de opløste partiklers brydningsindex ved udtrykket: K = 4π2 n 2 0(dn/dC) 2 N A λ 4 0 (2.39) 5 Se f.eks. udledningen i Physical Biochemistry, second edition, K. E. van Holde, Prentice Hall 1985

2.6. Resumé 25 hvor n 0 er brydningsindex for opløsningsmidlet, λ 0 er laserens bølgelængde i vakuum og dn/dc er opløsningens brydningsindex differentieret mht. vægtkoncentrationen af opløst stof. Størrelsen dn/dc kaldes det differentielle brydningsindex increment, og har for de fleste proteiner i vand værdier i området 0.18 0.20 ml g 1 og for de fleste polysakkarider værdier på omkring 0.15 ml g 1. I ligning 2.38 er Rayleighforholdet R(q) en målt størrelse. Koncentrationen C kan som regel også let bestemmes. Derved kan molekylvægten M øjensynlig let bestemmes, idet K kan beregnes på forhånd ud fra 2.39 ved at man i en separat måling bestemmer dn, benytter en tabelværdi dc eller benytter er "sandsynlig"værdi herfor. for dn dc 2.6 Resumé Her følger de vigtigste formler fra kapitlet: Brydningsindex: n = c vacuum c medium Den optiske kontrastkonstant: K = 4π2 n 2 0(dn/dC) 2 N A λ 4 0 Spredningsvektoren: q = k ud k ind Spredningsvektorens længde: q = q = 4πn λ 0 sin ( ) θ 2 Rayleighforholdet: R(q) = I s(q) r 2 I 0 V s (q)

26 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning

3Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse En væsentlig grund til at foretage lysspredningsmålinger er, som ligning 2.38 viser, muligheden for at bestemme molekylvægte. Dette kompliceres imidlertid af en række forhold, der vil blive gjort rede for i det følgende. Hvis de undersøgte molekyler imidlertid er små (i praksis mindre end λ/20), og deres koncentration er lav (her er et kriterium vanskeligt at stille op), er det imidlertid uproblematisk, ialtfald i princippet. Denne situation vil vi nu se på: 3.1 Koncentrationseffekter for små molekyler Den simple sammenhæng (ligning 2.35 eller 2.38), at den spredte lysintensitet er proportional med vægtkoncentrationen af de opløste molekyler, holder normalt ikke for vilkårligt høje koncentrationer. Årsagen hertil er indlysende, idet ligning 2.35 jo var baseret på, at de enkelte opløste molekyler bevæger sig uafhængigt af hinanden. At dette ikke i praksis kan være tilfældet ligger bl.a. i at, dér hvor der ligger ét molekyle, kan der jo ikke ligge et andet, så i den forstand er molekylernes positioner trivielt afhængige af hinanden. Det er vel også intuitivt klart at denne effekt af pladsmangel vil blive mere og mere udtalt jo højere koncentrationen af de opløste molekyler er. Mere generelt skyldes den indbyrdes afhængighed mellem molekylernes positioner at der virker kræfter imellem dem, som bevirker at nogle afstande vil være mere 27

28 Kapitel 3. Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse sandsynlige end andre. Den førnævnte effekt benævnes "excluded volume"effekten, og kan ses som et udtryk for at der på kort afstand virker stærke frastødningskræfter mellem molekylerne, som forhindrer at de trænger ind i hinanden. Dobbeltsummen i ligning 2.34 divideret med antallet N af molekyler i spredningsvolumenet kaldes for den statiske strukturfaktor, og betegnes S(q): N N S(q) = N 1 cos(ϕ j ϕ k ) (3.1) j=1 k=1 Antagelsen om, at molekylerne bevæger sig uafhængigt af hinanden leder som vist til at dobbeltsummen i ligning 2.34 antager værdien N, eller med andre ord, at S(q) = 1. Herved kan udtrykket 2.38 for Rayleighforholdet generaliseres: R(q) = KCM S(q) (3.2) Problemet er naturligvis, at beregne S(q). For små (isotropt spredende) partikler, kan det vises (se f.eks. Physical Chemistry of Macromolecules, C. Tanford, OUT-OF-PRINT-BOOKS-ON- DEMAND 1992) at Rayleighforholdet er relateret til de opløste molekylers osmotiske tryk, Π ved udtrykket: KC R(q) = 1 RT ( ) Π C T,P (3.3) hvor R er gaskonstanten. Da det osmotiske tryks koncentrationsafhængighed normalt beskrives ved rækkeudviklingen: Π RT = 1 M C + A 2C 2 + A 3 C 3 + (3.4) hvor konstanterne A 2, A 3,... betegnes den 2., 3. virialkoefficient osv., kan ligning 3.3 skrives: KC R(q) = 1 M + 2A 2C + 3A 3 C 2 + (3.5) I praksis bryder man normalt af efter den 2. virialkoefficient. Denne er en størrelse som under visse omstændigheder kan beregnes teoretisk, men som normalt bestemmes eksperimentelt. Så vidt koncentrationseffekter. Men vi mangler at se på effekten af at molekylerne ikke nødvendigvis er så små, at de spreder isotropt, før vi kan anvise en metode til bestemmelse af molekylvægte:

3.2. Formfaktoren 29 3.2 Formfaktoren At lyset fra et molekyle spredes isotropt hænger som før nævnt på, at de forskellige spredningsbidrag fra molekylets enkelte dele er i fase, og dette hænger igen på, at molekylets udstrækning er lille i forhold til lysets bølgelængde. Hvis ikke molekylerne er meget mindre end lysets bølgelængde spredes lyset normalt med en effektivitet,der aftager med stigende spredningsvinkel og dermed med stigende q-værdi. Dette gælder for partikler uden markant symmetri (som f.eks. ens kugler eller ens cylindre) medens spredningsintensiteten som funktion af q for eksempelvis kugler udviser maxima og minima. Hvis man for en opløsning af partikler af en bestemt størrelse og form måler intensiteten af det spredte lys, I s (q), som funktion af q definerer man formfaktoren for disse partikler, P (q) som den normaliserede spredningsintensitet: P (q) = I s (q)/i s (0) (3.6) hvor I s (0) normalt må findes ved ekstrapolation af I s (q) til q = 0, da denne værdi ikke er tilgængelig for direkte måling. En anden måde at opfatte formfaktoren på er, at den udrykker forholdet mellem spredningsintensiteten for de aktuelle partikler divideret med spredningsintensiteten for uendeligt små partikler med samme partikelmasse. For meget små partikler er P (q) 1 for selv de største værdier af q (der for λ = 633 nm og en spredningsvinkel på 180 i vand med brydningsindex n = 1.333 giver q max = 0.026 nm 1 ). For større partikler fås formfaktor-kurver der kvalitativt ser ud som vist på figur 3.1 Det skal bemærkes at funktionen P (q) undertiden kaldes spredningsfunktionen. Formfaktoren kan beregnes ved at benytte ligning 2.20 og 2.21 idet man husker, at ϕ j ϕ k = r j q r k q = r jk q. Idet ligning 2.20 gælder generelt og ligning 2.21 gælder for uendeligt små partikler med samme masse, fås formfaktoren ved at dividere den første ligning med den sidste og dernæst midle over alle mulige orienteringer af molekylet 1 : P (q) = 1 n 2 n n j=1 k=1 cos(ϕ j ϕ k ) = 1 n n cos( r n 2 jk q) (3.7) j=1 k=1 Middelværdien kan let beregnes ved at indføre et koordinatsystem med z-aksen i q s retning og dernæst udføre beregningen i polære koordinater (med de to vinkler θ i forhold til z-aksen og ϕ i xy-planen). Man bemærker, at r jk q = q r jk cos(θ) i dette koordinatsystem, så middelværdien 1 Da formfaktoren gælder spredning fra en opløsning af molekyler med tilfældige orienteringer, skal der naturligvis blot midles over alle orienteringer for ét molekyle

30 Kapitel 3. Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse 1 r = 25 nm r = 100 nm r = 400 nm P(q) 0.5 0 0 0.01 0.02 0.03 q (1/nm) Figur 3.1: Formfaktoren bliver mere og mere stejlt aftagende jo større partikler den repræsenterer. Bemærk at formfaktoren altid har værdien 1 for q = 0 af ét led i ligning 3.7 er givet ved 1 2π π cos(q r jk cos(θ)) sin(θ) dθ dϕ = sin(q r jk) (3.8) 4π 0 0 q r jk der er udregnet ved anvendelse af substitution (sæt x = q r jk gyldige udtryk for formfaktoren for et vilkårligt molekyle: cos(θ) ). Herved fås det generelt P (q) = 1 n 2 n n j=1 k=1 sin(q r jk ) q r jk (3.9) Dette generelle udtryk for formfaktoren kan naturligvis beregnes (på computer) hvis man kender molekylernes struktur, eller man kan approximere molekylerne med simple geometriske former, som kugler, ellipsoider, cylindre etc. og dernæst foretage en analytisk beregning ved integration (hvis det er muligt). Eksemler herpå er vist i afsnit 3.5. Men ofte er man interesseret i at foretage en approximativ beregning af P (q) ud fra ligning 3.9 ( se næste afsnit). Ved brug af formfaktoren kan Rayleighforholdet i ligning 2.38 (hvis koncentrationen er så lav, at partiklerne ikke vekselvirker) altså skrives R(q) = KCP (q)m, hvormed KC/R(q) = 1/(MP (q)). Det er derfor ikke overraskende at vi kan generalisere ligning 3.5 ved det endelige udtryk: KC R(q) = 1 MP (q) + 2A 2C + 3A 3 C 2 + (3.10)

3.3. Størrelsesbestemmelse 31 Princippet i molekylvægtsbestemmelse er nu oplagt: Man skal bare for et antal koncentrationer, C 1, C 2, C 3,..., hvor C n 0, måle Rayleighforholdet R(q) ved et antal q-værdier, q 1, q 2, q 3,..., hvor q n 0. Herefter foretager man en ekstrapolation af KC til C = 0 for hver R(q) q værdi, hvorved man finder 1/(M P (q)), svarende til den såkaldte tilsyneladende molekylvægt M app ved den pågældende spredningsvinkel (eller q-værdi). Den tilsyneladende molekylvægt for en bestemt q-værdi er altså defineret som M app = MP (q) (3.11) Når de tilsyneladende molekylvægte ved de forskellige q-værdier er bestemt, ekstrapoleres de til q = 0. Herved får man så den sande molekylvægt M, idet jo P (0) = 1. I praksis fortages denne ekstrapolation til q = 0 ved at man laver et Guinier-plot som beskrevet i afsnit 3.3.1. 3.3 Størrelsesbestemmelse Som lige vist afspejler molekylernes (partiklernes) størrelse og form sig i formfaktoren. Hvis ikke partiklerne er meget små, så formfaktoren kan anses for at være konstant lig med 1, er det nødvendigt at måle intensitetens af det spredte lys ved flere vinkler, så man kan foretage ekstrapolationen af den spredte intensitet til en spredningsvinkel på 0 (q = 0). Dette kan naturligvis virke som en besværlig fremgangsmåde, hvad det også er, hvis man kun er intersseret i molekylvægten. På den anden side, hvis formfaktoren ikke er konstant lig med 1, så indholder den oplysninger om molekylernes form og størrelse. I mange tilfælde er man tilfreds med et forholdvis groft mål for størrelsen af molekylerne, og vi skal her se hvordan dette kan opnås. Det størrelsesmål man er i stand til at bestemme kaldes for molekylernes gyrationsradius og betegnes R g. Vejen til at finde gyrationsradius går gennem beregning af nyttige approximationer til formfaktorudtrykket3.9. 3.3.1 Guinierapproximationen Hvis q r jk < 1, kan funktionerne i ligning 3.9 approximeres ved deres rækkeudvikling til 1. orden. Da sin(x) = x 1 3 x3 + fås så, at P (q) 1 n n (1 1 n 2 j=1 k=1 6 (q r jk) 2 ) (3.12)

32 Kapitel 3. Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse Da 1 n 2 nj=1 nk=1 (1) = 1 n 2 n 2 = 1, kan ligning 3.12 skrives som P (q) 1 1 3 q2 R 2 G (3.13) hvor R G kaldes for partiklernes gyrationsradius og er defineret ved R 2 G = 1 2 n 2 n n rjk 2 (3.14) j=1 k=1 Bemærk at enhver partikel har en gyrationsradius; approximationen til formfaktoren ligger i at se bort fra partiklens detaljerede struktur og erstatte denne med en enkelt parameter: Gyrationsradius. Approximationen 3.13, der kaldes for Debye approximationen benyttes undertiden som en er, men lider af den skavank, at falde meget hurtigt til 0 (approximationen er en parabel, der skærer q-aksen) i strid med, hvad man hyppigst ser ved spredningsmålinger, hvor der sker et ret blødt henfald mod 0. Dette kan man (simpelt, men arbitrært) reparere på ved at sige, at ligning 3.13 blot er de to første led i rækkeudviklingen for e 1 3 q2 RG 2. Formfaktoren er herved approximeret med en Gauss-funktion: P (q) e 1 3 q2 RG 2 (3.15) Dette kaldes for Guinier approximationen, og den antages normalt at være gyldig i q-området hvor q R g < 1. Hvor god approximationen faktisk er, afhænger af partiklernes form. Guinier approximationen anvendes til at størrelsesbestemme partikler: Man måler den spredte intensitet ved mange q-værdier (mange spredningsvinkler) og antager så, at I s (q) = I s (0) e 1 3 q2 RG 2 (3.16) Heraf fås, at ln I s (q) = ln I s (0) 1 3 q2 R 2 G (3.17) så hvis ln I s (q) plottes mod q 2 fås en ret linie med hældningskoefficient 1 3 R2 G. Dette kaldes et Guinier-plot. I praksis bestemmes hældningen ved lineær regression og, heraf fås R G. Man skal så bagefter kontrollere om betingelsen q R g < 1 er opfyldt for den fundne gyrationsradius og samtlige de benyttede q-værdier. Hvis ikke, må nogle mindre q-værdier anvendes. Da der i praksis er grænser for hvor små spredningsvinkler der kan måles ved, er der herved også en øvre grænse for, hvor store partikler, man kan bestemme gyrationsradius for ved denne metode.

3.4. Molekylvægt og størrelse i blandinger 33 Ligeledes er der en grænse for, hvor små partikler man kan bestemme gyrationsradius for, idet meget små partikler vil give en hældningskoefficient i Guinier-plottet, der er så lille, at den lineære regression kun kan bestemme den med meget stor usikkerhed (eventuelt kan den blive negativ ved regressionen). Grænsen ligger i praksis ved R g λ/20, hvor λ er den benyttede lasers bølgelængde. 3.4 Molekylvægt og størrelse i blandinger Hvis man i opløsningen har flere forskellige subpopulationer af partikler (molekyler) med vægtkoncentrationerne C 1, C 2,..., C n, molekylvægtene M 1, M 2,..., M n og gyrationsradierne R 1G, R 2G,..., R ng vil vi gå ud fra, at den totale lysspredning fra opløsningen er summen af de enkelte subpopulationers lysspredning, altså at 3.4.1 Gennemsnitsbestemmelser n n R total (q) = R i (q) = K C i M i P i (q) (3.18) i=1 i=1 Hvis man måler lysspredningen af en sådan opløsning på samme måde som hvis det var en opløsning af ens molekyler (dvs. måler ved flere spredningsvinkler og ved forskellige fortyndinger af opløsningen), kan man bagefter underkaste data den samme analyse som hvis der var tale om en opløsning af ens molekyler. Herved vil man selvfølgelig finde en værdi for molekylvægten som er en gennemsnitsværdi for de molekylvægte, der er til stede i opløsningen. Hvis en gyrationsradius kan bestemmes (ved et Guinier-plot) bliver denne selvfølgelig også en gennensnitsværdi for de gyrationsradier molekylerne i opløsningen har. For at kunne forstå/bruge de fundne gennemsnitsværdier er det vigtigt at vide, hvordan de enkelte molekylvægte og gyrationsradier er vægtet i forhold til hinanden. Dette vi vi nu se på: Hvis vi vil beregne en gennemsnitsmolekylvægt M, må den tilhørende vægtkoncentration af dette "gennemsntsmolekyle"være summen af vægtkoncentrationerne for de indgående stoffer. Dvs. at den totale lysspredning også kan skrives: ( n ) R total (q) = K C i M P (q) (3.19) i=1 Hvis vi sætter de to udtryk for R total i ligning 3.18 og 3.19 lig hinanden og sætter q = 0, hvorved