Metodevalidering af højsensitiv C-reaktive Protein

Metodevalidering af højsensitiv C-reaktive Protein Afsluttende eksamensprojekt Udarbejdet af Shagufta Amin Projektperiode på Bioanalytikeruddannelsen København Klinisk Biokemi Københavns Praktiserende Lægers Laboratorium (KPLL) Hovedvejleder: Ulla Tüschow Mol Bivejleder: Mariann Jensen

Forord Dette bachelorprojekt er udført i perioden 2. november 2009 til 23. november 2009 ved Bioanalytikeruddannelsen København i samarbejde med Almenkemisk Afdeling på Københavns Praktiserende Lægers Laboratorium (KPLL). En stor tak til mine to vejledere Ulla Tüschow Mol og Mariann Jensen for god vejledning gennem hele projektforløbet. Jeg vil ligeledes takke afdelingsleder Vibeke Olsen, personalet på almen-kemisk afdeling og til ledelsen på KPLL laboratorium for hjælp og information til forsøget endvidere tak for den økonomiske frihed til brug af diverse reagenser og forsøgsmateriale. 8. Januar 2010 Shagufta Amin (26-10-1976) Side 1

Resumé Der udføres en metodevalidering af analysen hscrp på apparatet ADVIA 2400 som KPLL ønsker at tage i brug. Resultater sammenholdes fra producenten Siemens og videnskabelige artikler. Projektet er udført som et praktisk laboratorieforsøg og litteratstudie. Analysens metrologiske sporbarhed, korrekthed og metodesammenligning, analytisk måleområde, detektionsgrænse, analytisk specificitet, linearitet, intermediær præcision, robusthed, afsmitning og præanalytiske forhold blev undersøgt. Oplysninger om metrologisk sporbarhed, analytisk måleområde og analytisk specificitet er oplyst fra producenten. Korrekthed og metodesammenligning viste korrelationskofficienten på 0,99. t-testen viste en signifikant forskel på den konventionelle CRP og hscrp analyse. Detektionsgrænsen blev undersøgt og beregnet til 0,12 mg/l. Linerariteten var acceptabel og impræcision for intermediær præcision var indenfor den acceptable grænse. Robustheden viste, at der er signifikant forskel på varianserne både i det lave niveau og høje niveau, mens CV % var acceptable. Afsmitningen viste en forskel på 2,5 % i prøven med lav koncentration og 0,26 % i prøve med høj koncentration. Ved præanalytiske forhold under holdbarhed og opbevaring viste det sig at prøver som var opbevaret i køleskab var stabile mens koncentrationen steg over tid for prøver opbevaret ved stuetemperatur. Forsøg med alternativt materiale viste at alle EDTA-prøver havde lavere koncentration end prøver i serum. Med baggrund i den praktiske udførelse, statistiske beregninger og vurdering af resultaterne kan det konkluderes at analysemetoden hscrp kan opsættes på apparatet ADVIA 2400. Side 2

Indholdsfortegnelse Forord... 1 Resumé... 2 Introduktion og Problembaggrund... 5 Formål... 6 Problemformulering... 6 Begrebsdefinitioner... 6 Teori... 6 CRP s struktur og funktion... 6 hscrp og Aterosklerose... 8 ADVIA 2400... 10 Analyseprincip for hscrp... 10 Måleprincip for hscrp analyse... 11 Metodevalg og afgrænsning... 12 Etiske overvejelser... 14 Materialer og metoder... 15 Materialer... 15 Metoder... 16 Forsøgsopsætning... 16 Resultater... 21 Metrologisk sporbarhed for hscrp... 21 Korrekthed og metodesammenligning for hscrp... 21 Parret t-test... 21 Analytisk måleområde for hscrp... 22 Detektionsgrænse for hscrp... 23 Analytisk specificitet for hscrp... 23 Linearitet for hscrp... 23 Side 3

Intermediær præcision for hscrp... 24 Interseriel impræcision... 24 Intraseriel impræcison... 25 Afsmitning for hscrp... 26 Robusthed for hscrp... 26 Præanalytiske forhold for hscrp... 27 Alternativ prøve materiale for hscrp... 28 Diskussion... 29 Metrologisk sporbarhed for hscrp... 29 Korrekthed og Metodesammenligning for hscrp... 29 Analytisk måleområde for hscrp... 30 Detektionsgrænse for hscrp... 30 Analytisk specificitet for hscrp... 31 Linearitet for hscrp... 31 Intermediær præcision for hscrp... 32 Robusthed for hscrp... 32 Afsmitning for hscrp... 33 Præanalytiske forhold for hscrp... 33 Holdbarhed og opbevaring... 33 Alternativt prøvemateriale... 34 Konklusion... 35 Perspektivering... 37 Litteraturliste... 38 Side 4

Introduktion og Problembaggrund I videnskabsverdenen bliver der hele tiden forsket i sygdomme og behandling af disse. Der bliver udviklet nye og bedre metoder til at analysere sygdomme. Enhver metode bliver nøje undersøgt mht. pålidelighed og nøjagtighed inden den tages i brug i laboratoriet. Hjertekarsygdomme er et af de største, alvorligste og mest ressourcekrævende sygdomsområder i Danmark. Omkring 32.000 danskere lider af en hjertekarsygdom. Behandlingen omfatter både medicinsk såvel som kirurgisk behandling 1. Ifølge Ridkers artikel 2 spiller inflammation en rolle i opstart og progression af aterosklerose. Aterosklerose er en af årsagerne til iskæmisk hjertelidelse og hjerteinfarkt. Laboratorieundersøgelser viser, at der ved aterosklerose sker en stigning af CRP i patientens blod 3. Normalt forbindes C-reaktiv Protein (CRP) med inflammation når koncentrationen af denne stiger markant i blodet i løbet af få timer. Små stigninger af CRP kan ikke detekteres af en standard CRP-analyse, som har et måleområde på 4-[304-336] mg/l 4. Der er derfor udviklet en ny analysemetode, højsensitiv CRP (hscrp), som detekterer CRP ved lave koncentrationer og har et måleområde fra 0,16 til 10,0 mg/l 5. Patienter med hjertelidelser bliver undersøgt for forskellige parametre såsom low-density lipoprotein (LDL-kolesterol), high-density lipoprotein (HDL-kolesterol) og triglycerider. Herudover foretages fysiologiske undersøgelser f.eks. elektrokardiogram. Hos nogle patienter med hjertekarsygdomme vises LDL-kolesterol koncentrationen indenfor normalområdet mens hscrp bliver forhøjet. Derfor bliver flere analyser foretaget i forhold til screening af hjertekarsygdomme. Forsøg i forbindelse med hjertelidelser viser, at hscrp er den mest egnede metode til at supplere andre analyser for hjertekarsygdomme da den opfylder alle krav indenfor hjertescreening 2. Siemens Healthcare Diagnostics, som er producent af det biokemiske apparat ADVIA 2400, har udviklet den immunkemiske analyse (hscrp). Denne analyse har, som nævnt ovenover, et lavere detektionsområde end den normale CRP i humant serum og plasma (litiumheparin eller kalium EDTA stabiliseret) 4. Ved efterspørgsel fra lægerne eller hvis analysen kommer til at indgå i et forebyggelses-/udredningsprogram for hjertekarsygdomme skal denne benyttes som risikomarkør på KPLL. Det er derfor interessant at udføre en metodevalidering af hscrp på ADVIA 2400. Side 5

Formål Formålet med projektet er, at metodevalidere analysen hscrp ved, at undersøge kvaliteten af denne på en ADVIA 2400 apparater. Analysen kan anvendes som risikomarkør til identifikation af tilsyneladende raske personer, der har risiko for at udvikle hjertekarsygdomme. Analysen kan også anvendes til at monitorere patienter med disse lidelser 2. Problemformulering Kan analysen P-Høj Sensitiv C-Reaktive-Protein; massek. (hscrp) i serum godkendes på KPLL som metodevalidering for analysekvaliteten af metrologisk sporbarhed, korrekthed og metode-sammenligning, analytisk måleområde, detektionsgrænse, analytisk specificitet, linearitet, intermediær præcision, robusthed, afsmitning og præanalytiske forhold som udføres på apparatet ADVIA 2400? Begrebsdefinitioner Serie: Defineret som kontrolmateriale med niveauerne: Lav, Middel og Høj. Analyseres en gang om dagen. Børværdi: Acceptværdier som er fastsat af interseriel impræcision til godkendelse af kontrolresultater og patientresultater. Teori CRP s struktur og funktion CRP er et af de akutfaseproteiner, der optræder med den største koncentrationsstigning i blodet. Det forøges op mod 1000 gange ved en inflammatorisk reaktion. Det er ligeledes en uspecifik markør for inflammation. CRP blev opdaget i 1930 erne og er navngivet på grund af dens evne til at binde sig til phosphocholine (PCh). PCh er rester af C-polysaccharid (PnC) og en af bestanddelene i Streptococcus Pneumoniae og mange andre bakterier. CRP molekylet er en cyklisk pentameter opbygget af 5 identiske subenheder (se figur 2) hver med en vægt på 23,5 kda. Hver subenhed indeholder 206 aminosyrer foldet i to antiparallelle β-sheets. En Side 6

lang α-helix ligger foldet imod en af de to β-sheets. CRP molekylet har to sider. På hver subenheds ene side sidder to Ca 2+ ioner i kæder som indgår i ligandbinding. På anden side af subenheden har molekylet Fc bindingstedet sådan at det kan binde til Fc receptorer på granulocytter 6. CRP s struktur er illustreret på figur 1. Figur 1. Pentametrisk struktur CRP 8. Efter at en makrofag har fagocyteret og dræbt en mikroorganisme udsender den cytokinsignal stoffer såsom interleukin (Il-6). Signalstofferne deriblandt IL6 stimulerer produktionen af akutfase proteinet CRP. CRP syntetiseres af levercellerne (hepatocytterne). CRP aktiverer komplement-systemets proteiner men kan også selv klæbe til mikroorganismer, så de lettere opdages af f.eks. neutrofile granulocytter. Genet for CRP findes på kromosom 1 og er lokaliseret mellem bånd q21 og q23. Ligeså snart CRP-Phc komplekset bliver genkendt af C1q, aktiveres det klassiske kompletsystem (se figur 2). Forskellige sygdomstilstande vil fremkalde bestemte koncentrationer af CRP i blodet. Ved bakteriel infektion stiger CRP fra 50-200 mg/l I og ved viral infektion ligger værdien under 30 mg/l 7. CRP har en halveringstid på ca. 19 timer og efter 7-8 dage er koncentrationen normaliseret 8. CRP kan også binde til andre nukleare bestanddele som ikke indeholder PCh. CRP kan ligeledes fungere som opsonin og er dermed med til at gendanne vævsstrukturer 6. I Reference interval: CRP < 6 mg/l. Se note 7 i litteraturlisten. Side 7

Figur 2. CRP bliver synteseret af leveren ved respons af cytokiner 9 hscrp og Aterosklerose For at undersøge om der er risiko for hjertekarsygdomme hos raske personer kan hscrp analysen bruges til screening. Denne analyse kan også bruges til monitere patienter med hjertekarsygdomme. Risikointervallerne er defineret som følgende: Lav risiko < 1.0 mg/l 1.0 mg/l <= Middel risiko <= 3.0 mg/l 3.0 mg/l < Høj risiko II hscrp niveauer blev studeret i patienter med hjertekarsygdomme. Kronisk lav inflammation fører til aterosklerose. Undersøgelser har vist at tromber indeholder bakterien Chlamydia pneumoniae som er årsag til inflammation 10. Aterosklerose er en af hovedårsagerne til hjertekarsygdomme. Aterosklerose er fællesbetegnelse for en række patologiske tilstande i perifere arterier. Før i tiden var aterosklerose defineret som lipid-lager inde i den arterielle II Reference interval: hscrp < 3 mg/l. Se note 8 i litteraturlisten. Side 8

væg, efterfulgt af fibrose og åreforkalkning. Nyere undersøgelser viser at årsagen til aterosklerose er inflammation i endotellaget i arterievæggen. Aterosklerose rammer ofte aorta, hjernearteriene og konararteriene. Ved aterosklerose bliver arterievæggen fortykket pga. forekomst af plaques som dannes ved abnorm vækst, deling af glatte muskelceller og ophobning af makrofager udviklet fra monocytter i blodet. LDL-kolesterol oxideres og optages i makrofagerne og abnorme muskelceller. De fedtholdige makrofager og muskelceller omdannes til fedtceller. Lidt efter invaderer bindevævsceller dette område og fører til læsioner og vægfortykkelse. Aterosklerotiske aflejringer bryder igennem det svækkede endotellag og kommer i kontakt med trombocytter i blodet (se figur 3). Der bliver dannet blodkoageler, som bliver til tromber, hvilket fører til forsnævring af arterievæggen med nedsat blodstrømning som følge. Den dannede trombe kan løsne sig og danne blodprop i små arterier og kar. F.eks. kan tromben i conararterien lukke helt til og blodforsyning til hjertet bliver mindre og der vil forekomme hjerteinfarkt. 10 Figur 3. a) Ved en infektion vandrer leukocytter til endotelaget i arterien. b) Kolesterol og marokrofager aflejres i abnormale muskelceller og arterien bliver fortykket. c) Fedt aflejringer byder igennem det svækkede endotellag og kommer i kontakt med blodet 11. Kvinder får typisk sygdommen 10 år senere end mænd. Årsagen til dette er ukendt, men yngre kvinder synes at være beskyttede af de kvindelige kønshormoner som østrogener, men nærmer sig den samme risiko som hos mænd for at få aterosklerose efter menopausen 11. Rygning, højt blodtryk, overvægt og diabetes mellitus er vigtige risikofaktorer for hjertekarsygdomme. Nogle mennesker har genetisk i øget risiko for at udvikle hjertekarsygdomme 10. Side 9

ADVIA 2400 ADVIA 2400 er et biokemisk apparat som laver mange analyser af enzymer og proteiner. Apparatet har en prøvekarrusel, én fortyndningskarrusel og en reaktionskarrusel. Herudover er der to reagenskarruseller som bruges til reagens 1 og 2. Apparatet bruger to måleprincipper: ionselektivelektrode (ISE) til analysering af Na +, K + og Cl - og immunturbidimetry til protein og enzym analyser. Apparatet bruger 30µl prøvemateriale og fortynder dette med 120µl 0,9 % Natriumchlorid. Prøven inkuberes ved 37 grader og der aflæses kvantitativt ved hjælp af fotometri. Lyskilden til fotometri er en halogenlampe som afkøles vha. kølervæske. Apparatet analyserer ved 41 punkter hver 14. sekund og fortynder automatisk en prøve som har højre koncentration end måleområdet. Analyseprincip for hscrp Analysen er baseret på en latex forstærket immuntrubidimetrisk metode. I en kuvette afpiptteres reagens, R1, som indeholder buffer for at stabilisere ph værdien. I kuvetten afpipetteres patientprøver som indeholder CRP antigener. Efter 5 min bliver der tilsat reagens R2 til opløsningen. R2 indeholder ploystyrenlatexpartikler, som er coatet med anti-crp antistof. Opløsningen inkubers i 5 minutter ved 37 grader. I denne opløsning bliver der dannet præcipitat, som er en udfældning af antigen-antistof komplekset. Opløsningen bliver uklar og dette kaldes for turbid. Når reaktionen er nået til endepunktet er antigen-antistof ækvivalente, dvs. at der er hverken frie antistoffer og antigener tilstede. Para-top og epi-top er bundet sammen 12 (se figur 4). Side 10

Figur 4. Viser præcipitation af antistof-antigen kompleks 13. Måleprincip for hscrp analyse Måleprincippet er end-point-assay, dvs. koncentration af opløsning bliver målt i et specifikt tidsrum når det er nået endepunktet.. Kuvetten med turbidet bliver belyst af en halogenlampe ved 571 nm. En del af lyset fra halogenlampen bliver spredt og resten passere igennem kuvetten og bliver detekteret af et fotometer. Dette er illustreret i figur 5. Koncentration af opløsningen bestemmes udfra absorptionsværdi på kalibreringskurven ved hjælp af formlen, logit log 3 14. Figur 5 Princippet i turbidimetri 15 Side 11

Metodevalg og afgrænsning Projektet er udført som et praktisk laboratorieforsøg og litteraturstudie. KPLL er et akkrediteret laboratorium, derfor bliver der benyttet KPLL s metodevalidering (dok.nr.30 016-05) 16. Metodevalidering er udarbejdet udfra DANAK s retningslinjer RL 6 17 og vil blive fulgt i dette projekt. I projektet beskæftigede har jeg med blodprøver fra patienter, der allerede havde fået analyseret/valideret CRP analyse. På KPLL analyseres CRP i serum. Derfor analyseres på serum under projektet. Metodevalidering af hscrp udføres på apparatet ADVIA 2400. Metrologisk sporbarhed En metodes metrologisk sporbarhed er at en given analyses opnåede måleresultater og kalibratorer kan spores tilbage til nationale og internationale SI enheder. En sådan metrologisk sporbarhed er opgivet for ADVIA 2400 fra producenternes side 16,17. Korrekthed og metodesammenligning Ved korrekthed og metodesammenligning forstås en sammenligning af den hidtidige og den nye metode. Ved metodesammenligning benyttes 50 patientprøver på forskellige relevante niveauer. Disse analyseres med den rutinemæssige CRP og på den nye hscrp analyse. Der bliver fremstillet et x/y plot hvor analyseresultaterne vises. Disse bliver indtegnet som en lineær regression v.h.a. en regressionsligning med formlen y = a*x + b. Korrelationskofficienten beregnes for at vise om der er sammenhæng mellem de to analyseresultater. Der udføres også en parret t-test, for at vise om der er signifikant forskel på resultaterne. Herudover laves et differenceplot for at se hvordan resultaterne ligger i forhold til hinanden 16,17. Analytisk måleområde En metodes måleområde er det koncentrationsområde, hvor man kan forvente at udføre kvantitativ analyse med tilstrækkelig god nøjagtighed. Analytisk måleområde for denne analyse er opgivet af producenten 16,17. Side 12

Detektionsgrænse En metodes detektionsgrænse er den laveste grænse komponent eller prøvemængde en analyse kan måle. Dette kan findes ved at analysere blindprøve 10-20 gange i samme serie. Derefter beregnes middelværdien og Standard Deviation (SD) af signalet. Detektionsgrænsen findes ved formlen: middelværdi + 5*SD af signalet 16,17. Analytisk specificitet En metodes analytiske specificitet er dens evne til at måle komponenten så specifikt som muligt uden påvirkning af interferens. I dette tilfælde fravælges interferensundersøgelse af hensyn til projektets afgrænsning 16,17. Linearitet En metodes evne til at måle lineært over et måleområde kaldes linearitet. Metoden viser om der er direkte proportionel sammenhæng mellem beregnede og målte koncentrationer. En analyses linearitet undersøges ved at lave en række fortyndinger over måleområdet med prøver af høj og lav koncentration (se tabel 1). Derefter laves en linearitetskurve, hvor de beregnede koncentrationer plottes på x-aksen og de målte koncentrationer på y-aksen for at se om analysen er lineær 16,17. Intermediær præcision En metodes præcision udtrykker, hvor tæt en række resultater ligger på hinanden opnået ved gentagen analyse af samme prøve. Præcisionen kan derfor udtrykkes ved standarddeviationen, variansen eller variationskoefficienten (CV). Ved at undersøge den interserielle og den intraserielle impræcision får man et mål på hvor præcis analysen er. Jeg vil benytte kontroller i tre forskellige niveauer, lav, middel og høj. Den interseriel impræcision er en dag-til-dag impræcision, hvor det samme analysemateriale analyseres en gang pr. analysedag i 20 dage. Ved den intraserielle impræcision, forstås at det samme analysemateriale analyseres 20 gange i samme serie under identiske forhold. Med Side 13

udgangspunkt i resultaterne beregnes middelværdien, SD og CV %, da disse er relevante for analysens kvalitet og impræcision 16,17. Robusthed En metodes robusthed er et udtryk for i hvor høj grad analyseresultater påvirkes af ændringer i fremgangsmåden. Jeg vil undersøge analysens robusthed med to forskellige reagens lotnr. for at vise hvorvidt forskellige reagens lotnr. har påvirkning på analyseresultaterne. Her vil det vise sig, om der er forskel på analyseresultaterne 16,17. Afsmitning Afsmitning viser hvorvidt analyseresultatet påvirkes af seriens forrige prøve. Afsmitning vurderes ved at anvende en prøve med højt analyseresultat og en prøve med lavt analyseresultat i en serie hvor de analyseres efter hinanden gentagne gange. Derefter vil jeg beregne akkuratessen for at se om der er skred i analyseresultatet 16,17. Præanalytiske forhold Er de forhold som har betydning for analyseresultatet, prøvetagning, prøvebehandling og opbevaring inden analysering. Da jeg ikke selv tager prøverne har jeg ikke indflydelse på hvordan prøven tages. Jeg vil undersøge opbevaring og holdbarhed ved at stille noget af patientmaterialet i køleskab og noget af det i stuetemperatur for at se om det giver forskellige analyseresultater 16,17. Litteratur brugt til dette projekt er videnskabelige artikler fundet på Google, Google Scholar og Pubmed. Jeg brugte søgeordene: hscrp, hscrp and methods, korrelation between methods. Etiske overvejelser En betingelse for at vi kan lave forsøget er at patientprøverne er færdiganalyseret og svaret er afgivet til rekvirenten til behandling. I vores forsøg bliver der ikke lavet andre analyser end Side 14

dem lægerne har rekvireret. Derfor er det etisk korrekt at benytte patientprøver til vores forsøg. Vi er dog opmærksomme på, at hvis der er noget patologisk, så skal disse resultater behandles forsvarligt af en læge. Materialer og metoder Materialer Apparat og utensilier: Advia 2400 Siemens Medical Solutions Diagnostics SN CA 12410051h Finnpipette Digital 20 200 µl, labsystem. Serie nr. J03814 4500 Finnpipette Digital 200-1000 µl, labsystem. Serie nr.u83039 4500 Centrifuge Rontana 460 Køleskab 2-8 o C Reagenser til analysering: Incubation bath oil ISE Buffer lotnr:ds918a NaCl 0,9 % mmol/l Cuvette wash, lotnr: 0905082 Cuvette conditioner lotnr: 0907133 Reagens 1: som indeholder Glycin, Natriumklorid, EDTA dinatriumsalt dihydrat og Natriumazid, lotnr: 290CP og lotnr: 274CP Reagens 2: indeholder CRP-antistof (kanin)-syntetisk latex og Natriumazid, lotnr: 291CP og lotnr.275cp 6 kalibratorer: ADVIA Chemistry CardioPhaseTMkalibrator til høj sensitivt C-reaktivt Protein: REF. 05006455 lotnr: 1668 82 Level 1 : 0,00 mg/l lotnr: 278CP o Level 2: 0,55 mg/l lotnr: 279CP o Level 3: 1,09 mg/l lotnr: 280CP o Level 4: 1,67mg/L lotnr: 281CP Side 15

o Level 5: 5,55mg/L lotnr: 282CP o Level 6: 11,16mg/L lotnr: 283CP Kontrol: lav niveau, lotnr: 29 731 og 29 741 udløbsdato: 2011-01-31 middel niveau, lotnr: 29 732 og 29 742 udløbsdato: 2011-01-31 højt niveau, lotnr: 29 733 og 29 743 udløbsdato: 2011-01-31 Prøvemateriale: Udvalgte patientprøver i serum, udtaget i gelrør. Prøverne er valgt med henblik på at være fordelt over hele måleområdet. Herudover er der også valgt prøver udenfor dette måleområde. Fem EDTA-stabiliseret patientprøver. Metoder Forsøgsopsætning Nogle af de gennemgåede punkter har vi ikke haft mulighed for at lave. Til metrologisk sporbarhed, analytisk måleområde, og analytisk specificitet har jeg brugt oplysninger opgivet af producenterne. Indsamling af prøvemateriale Til metodesammenligning af 50 patientprøver med CRP findes på KPLL s EDB system netlink med følgende koncentrationer: o 20 prøver mindre end 4 mg/l o 25 prøver i intervallet 4-10 mg/l o 5 prøver større end 10 mg/l Til linearitet findes en CRP prøve med en høj koncentration på 20 mg/l, A samt en prøve med lav koncentration på 1 mg/l, B. Side 16

Til afsmitning findes en CRP prøve med høj(h) koncentration på 100 mg/l samt en prøve med lav (L) koncentration på 1 mg/l. Til opbevaring findes ti CRP patientprøver med koncentrationer i intervallet 0-10 mg/l. Til alternativt prøvemateriale findes fem CRP patientprøver på net-link og på tilsvarende patienter findes fem EDTA stabiliseret fuldblod. General fremgangsmåde og opsætning af analysen på ADVIA 2400 Apparatet opstartes ifl. Apparatvejledning. Dokument nr. 20 055-03 (se punkt 3.1.1). Forsøget startes med at opsætte analysen hscrp på apparatet vha. parameter oplysninger fra Siemens. Reagenser og kalibratorer for hscrp sættes på apparatet (se punkt 3.1.3). Kalibreringskurven ses i bilag 1. Der benyttes 6 kalibratorer, da analysen er multipoint. Analysen kalibreres 28. dag og hvis der anvendes nyt reagens lotnr. Der afpipetteres 250 µl i de små samples cup. Kalibratorene sættes i positionerne 70-75 i sample turntable tray(stt) krans. Resultat printes ud. Der benyttes 3 kontroller i henholdsvis lav, mellem og høj niveauer. Før kontrollerne bruges, vendes de i 15 min. Kontrollerne afpipetteres 200µl i bayer cup. De sættes i positionerne 24-26 i calibrator /controls turntable tray(ctt) krans. Resultat printes ud. Inden patientprøver analyseres, skal kontrollerne accepteres udfra et acceptinterval, som er opgivet af producenten (se tabel 2). Analysering af prøvemateriale uden barkode (se punkt 3.4.3). Kontrollerne analyseres og accepteres ifølge acceptgrænser. Ved godkendte kontroller, accepterer vi prøveresultaterne. Apparatet lukkes ned iflg. apparatvejledning (se punkt 3.7). Side 17

Metodesammenligning De 50 prøver som er beskrevet under punktet opsamling af prøvemateriale bruges til at lave metodesammenligning. Patient prøverne fordeles over 5 dage, således at der bliver analyseret 10 patientprøver hver dag. Resultaterne fra hscrp sammenlignes med resultater for KPLL s CRP. Der udføres parret t-test, XY- og differensplot. Detektionsgrænse I en bayer cup afpipettres der 800 µl Natriumchlorid. Apparatet indstilles og prøven analyseres 20 gange efter hinanden. Linearitet Ud fra prøverne laves der en fortyndingsrække, hvor prøve A og prøve B blandes. Som vist i tabel 1. Fortyndingerne blev udregnet ved hjælp af formlen C 1 * V 1 = C 2 * V 2 (se bilag 5 for beregninger). Der beregnes teoretiske koncentrationer for hver af disse opløsninger. Opløsningerne analyseres på ADVIA 2400 (se punkt 3.4.3). Resultaterne printes ud og der laves lineær regression. Fortyndingsrække Prøve A µl Prøve B µl 1 450 0 2 400 50 3 350 100 4 300 150 Side 18

5 250 200 6 200 250 7 150 300 8 100 350 9 50 400 10 0 450 Tabel 1. Viser hvordan prøverne med høj og lav koncentration blandes sammen til undersøgelsen af lineariteten. Intermediær præcision Interseriel impræcision: En gang om dagen i 20 dage analyseres kontrolmaterialet i niveauerne lav, middel og høj. Resultaterne bruges til at beregne børværdien. X (Lav) Lav mg/l X (Mellem) Mellem X (Høj) Høj mg /l Kontrol 1 0,50 0,40-0,60 2,18 mg/l 1,75-2,62 6,27 5,02-7,53 Kontrol 2 0,48 0,38-0,58 1,88 1,50-2,26 5,71 4,57-6,86 Tabel 2. Acceptintervaller fra producenten. Intraseriel impræcision: I den sammenhæng vil vi også analysere kontrolmaterialet i niveauerne lav, middel og høj, men 20 gange efter hinanden. Resultaterne bliver brugt til at beregne impræcision. Middelværdien, SD og CV beregnes. Robusthed Analysens robusthed undersøges ved skifte reagens lot. nr. efter 10 dage for at se om der er variation i kontrol resultaterne. Derefter laves F-test over resultaterne. Side 19

Afsmitning To patientprøver med høj og lav koncentration fordeles i bayer cups følgende rækkefølge: H-H-H-L-L-L-H-H-H-L-L-L-H-H-H og analyseres. Resultaterne bruges til beregning af middelværdien for prøve H og L, og herefter beregnes inakkuratesen. Præanalytiske forhold. Holdbarhed og opbevaring: Prøverne findes på netlink og analyseres. Prøverne deles i 2 portioner, den ene del opbevares i køleskab og den anden ved stuetemperatur ved ca. 20 grader. Disse prøver analyseres den 3. dag og den 7. dag, for at se om der er forskel på analyseresultater. Resultaterne sættes ind i et koordinat system, hvor dagene plottes på x-aksen og analyse resultat plottes ind på y-aksen. Alternativt prøvemateriale: Fem CRP patientprøver findes på netlink. Fem EDTA-rør med patientprøver findes på netlab. EDTA centrifugeres ved 3000 omdrejninger, g:1800 Side 20

Resultater Metrologisk sporbarhed for hscrp Metrologisk sporbarhed er opgivet af producenten, Siemens Diagnostik brugsvejledning: ADVIA Chemistry CardioPhase hscrp-metoden er baseret på IRMM-referencemateriale CRM 470 5. Korrekthed og metodesammenligning for hscrp Parret t-test H 0 : Der er ikke signifikant forskel på metoderne H 1 : Der er signifikant forskel på metoderne α: 0,05 Beskrivende Statistik T-test Kurtoisis -0,70 t Stat -3,52 Skævhed 0,57 t Critical two-tail 2,01 Tabel 3. Det ses at kurtoisis og skævhed er normalt fordelt og derfor kan der udføres en parret T-test. Rådata ses i bilag 3. Side 21

Difference (mg/l) hs CRP (mg/l) Metodesammenligning 14 12 10 8 6 4 2 0 y = 0,8865x + 0,8665 R 2 = 0,9905 0 5 10 15 CRP (mg/l) Figur 6. Viser korrelation over to metoder samt regressionsligning over CRP og hscrp. 1,5 Differenceplot for hscrp 1 0,5-0,5 0 0,00 5,00 10,00 15,00-1 -1,5 Middelværdi (mg/l) Figur 7. Viser difference plot over to metoder. Middelværdi af metoderne CRP og hscrp på x-aksen og differensen for begge metoder på y-aksen. Analytisk måleområde for hscrp Analytisk måleområde var opgivet af producenten til at være 0,16-10,0 mg/l 5. Side 22

Detektionsgrænse for hscrp Antal Resultat (mg/l) Antal Resultat (mg/l) 1 0,08 11 0,07 2 0,06 12 0,08 3 0,07 13 0,02 4 0,08 14 0,08 5 0,08 15 0,07 6 0,08 16 0,07 7 0,08 17 0,07 8 0,08 18 0,07 9 0,08 19 0,07 10 0,07 20 0,08 Middelværdi (mg/l) = 0,07 SD = 0,01 Detektionsgrænse 0,07 + 5*SD = 0,12 Tabel 4. Viser koncentrationer på referenceopløsning, 0,9 % Natriumchlorid samt beregnet detektionsgrænse. Analytisk specificitet for hscrp Ifølge producenten vil en procenteffekt på 10 % anses for at udgøre en signifikant inteferens. Linearitet for hscrp Fortyndningsrække Beregnet koncentration i (mg/l) Målt koncentration i (mg/l) A % (Vo- V 1 /Vo)*100 1 20 23,94-19,7 2 17,8 21,49-20,7 3 15,7 17,67-12,5 4 13,6 14,50-6,6 5 11,4 11,70-2,6 Side 23

Målt koncentrationer i mg/l 6 9,4 9,94-5,7 7 7,3 7,97-9,2 8 5,2 6,06-16,5 9 3,1 4,03-30,0 10 1 2,08-108,0 Tabel 5. Viser beregnede og målte koncentrationer over hscrp og inakkratesse i mellem disse. A% værdierne er negative da de beregnede koncentrationer er lavere end de målte. 30,00 25,00 Linearitet for hscrp y = 1,1581x - 1,1172 R 2 = 0,9331 (Rød linie: Y=X; gennem 0,0; hæld. 1) 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0 5 10 15 20 25 30 Beregnet koncentrationer i mg/l Figur 8. Linearitetskurve over målte og beregnet koncentrationer. Intermediær præcision for hscrp I det følgende vises beregninger for interseriel og intraseriel impræcision. Interseriel impræcision Lav niveau (mg/l) Mellem niveau (mg/l) Høj niveau (mg/l) Middelværdi 0,52 2,20 6,24 SD 0,12 0,28 0,31 CV% 23,97 13,14 5,06 Tabel 6. Beskrivende statistik for interseriel imprecision før outliner er fjernet. Side 24

Lav niveau (mg/l) Mellem niveau (mg/l) Høj niveau (mg/l) Middelværdi+/-3*SD 0,16-0,88 1,36-3,04 5,31-7,71 Tabel 7. Viser beregning af middelværdi +/- 3*SD er interval for outleir. Lav niveau (mg/l) Mellem niveau (mg/l) Høj niveau (mg/l) Middelværdi 0,56 2,26 6,26 SD 0,02 0,06 0,32 CV % 4,43 2,79 5,10 Tabel 8. Beskrivende statistik for interseriel impræcision efter outleir er fjernet. Lav niveau (mg/l) Mellem niveau (mg/l) Høj niveau (mg/l) Middelværdi-/+2*SD 0,56-0,60 2,14-2,38 5,62-6,90 Tabel 9. Beregnede acceptintervaller fra interseriel impræcision (KPLL s børværdi) Intraseriel impræcison Lav niveau (mg/l) Mellem niveau (mg/l) Høj niveau (mg/l) Middelværdi 0,56 2,32 6,61 SD 0,01 0,14 0,11 CV % 1,77 5,94 1,71 Tabel 10. Beregnede resultater for intraseriel impræcision. Rå data i bilag 5. Side 25

Afsmitning for hscrp Prøve Afsmitning (mg/l) P1-P3 A % (mg/l) 1 H 68,98 2 H 66,53 3 H 68,12 1 L 1,57 2 L 1,55 3 L 1,55 0,02 1,29 1 H 69,25 2 H 69,56 3 H 69,51-0,26 0,27 1 L 1,59 2 L 1,53 3 L 1,55 0,04 2,5 1 H 68,98 2 H 69,12 3 H 69,16-0,18 0,26 Tabel 11. Resultater fra afsmitning. Der er beregnet diffrense imellem prøve 1 og prøve 3. A % er beregnet ved hjælp af formel, se bilag 5. Robusthed for hscrp For at se hvor stor variation der er imellem to lot. numre har jeg lavet F-test over resultatet: H 0 : Der er ikke signifikant forskel på varianserne H 1 : Der er signifikant forskel på varianserne α: 0,05 Lav niveau: F (beregnet) = 0,44 F (tabel) = 0,29 Mellemniveau: F (beregnet) = 2,40 F (tabel) = 3,22 Højniveau: F (beregnet) = 10,37 F (tabel) = 3,22 Side 26

Resultat i mg/l Dag 1-10 Lav niveau Mellemniveau Høj niveau (mg/l) (mg/l) (mg/l) Middelværdi 0,58 2,30 6,44 SD 0,01 0,06 0,37 CV % 1,92 2,98 5,86 Tabel 12. Resultater fra beregning dag 1-10 af robusthed fra data interseriel impræcision. Dag 11-20 Lav niveau Mellemniveau Høj niveau (mg/l) (mg/l) (mg/l) Middelværdi 0,54 2,24 6,09 SD 0,01 0,04 0,01 CV % 2,84 1,97 0,22 Tabel 13. Beregnede værdier fra dag 10-20. Præanalytiske forhold for hscrp Dette afsnit beskriver holdbarhed og opbevaring af hscrp prøverne. Holdbarhed for hscrp (Køleskab 4-8 C) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Dag 1 Dag 3 Dag7 Serie 1 Serie 2 Serie 3 Serie 4 Serie 5 Serie 6 Serie 7 Serie 8 Serie 9 Serie 10 Figur 9. Viser resultater af målinger over hscrp-prøver opbevaret i køleskab flere dage. Farverne repræsenterer de ti forskellige prøver. Se rå data i bilag 7. Side 27

Resultat mg/l Holdbarhed for hscrp (Stuetemperatur) 14 12 10 8 6 4 2 0 Dag 1 Dag 3 Dag 7 Serie 1 Serie 2 Serie 3 Serie 4 Serie 5 Serie 6 Serie 7 Serie 8 Serie 9 Serie 10 Figur 10. Viser resultater af målinger over hscrp-prøver i stuetemperatur i flere dag. Farverne repræsenterer de ti forskellige prøver. Se rå data i bilag 7. Alternativ prøve materiale for hscrp Prøve Gel rør mg/l EDTA-rør Differenser A% 1 1,40 mg/l 1,30 0,10 7,14 2 0,28 0,26 0,02 7,14 3 1,27 1,21 0,06 4,72 4 2,80 2,60 0,20 7,14 5 3,59 3,52 0,07 1,94 Tabel 14. Viser resultater over to forskellige prøverør fra samme patienter. Det ses at resultatet for EDTA-rør er lavere end gelrør. Side 28

Diskussion En hscrp analyse kan spille en vigtig rolle som indikation for hjertekarsygdomme. Det er derfor vigtigt at måle hscrp værdier så nøjagtigt som muligt. Producenterne for ADVIA 2400 opgiver informationer om analysens kvalitet. Inden man kan tage analysen i brug, skal denne metodevalideres 16. I en metodevalidering er der en del procedurer, der skal sikre, at analysen er klinisk stabil og acceptabel med en kendt variation. Inden analysering af patientprøverne, skal kontrollerne være i overensstemmelse med kontrollernes acceptintervaller. Kontrolmateriale er fra Bio-rad liquidchek Cardiac Markeres Plus Control Levels 1, 2 og 3. Acceptintervaller er opgivet (se i tabel 2). Ved en fejltagelse fik vi udleveret 2 forskellige kontrol lotnumre, dette har medført at vi har forskellige acceptintervaller ved hver kontrol niveau. Denne fejltagelse har dog ikke betydning for patientresultaterne. Metrologisk sporbarhed for hscrp I dette forsøg var metrologisk sporbarhed opgivet til at være CRM 470 men dette har ikke været muligt at verificere. Jeg er dog under min litteratursøgning stødt på andre leverandører f.eks. Dade Behring som bruger samme reference materialer i en artikel af Jovicic et al. 18. Korrekthed og Metodesammenligning for hscrp Formålet med metodesammenligning er at undersøge om der er forskel på den konventionelle CRP analyse og hscrp analyse, herunder sensitiviteten af denne. Resultatet af mit metodesammenligningsforsøg viser at differensen af analyserne hscrp og CRP er normaltfordelte, da kurtoisis er -0,70 hvilket som ligger indenfor det opgivne interval +/- 1,36. Skævheden er 0,57 som også ligger indenfor intervallet +/- 0,68. Derfor har jeg lavet en t-test hvor t-værdien (-3,40) er mindre end den valgte a værdi (0,05) dvs. 0-hypotesen kan forkastes (der er ikke signifikant forskel på metoderne). Dermed kan jeg konkludere at der er en signifikant forskel på de to metoder 19. Jeg har lavet et xy-plot for at se hvordan resultaterne ligger i forhold til hinanden. Dette xyplot viser den bedste rette linje igennem skæringspunkterne på begge metoder. Punkterne ser ud til at ligge pænt fordelt omkring den rette linje. Derefter har jeg i xy-plottet beregnet en Side 29

linjens ligning som følgende: y= 0,88*x+ 0,86. Korrelationskoefficienten R 2 er beregnet til 0,99, hvor R 2 = 1 angiver den bedste lineære sammenhæng og ved R 2 = 0 er der ingen sammenhæng. Da man udfra en korrelationskoefficient ikke altid kan afgøre hvorvidt der eksisterer om en mulig sammenhæng vil jeg lave et differenseplot 18. Ved et differensplot over metodesammenligning kan det grafisk ses i hvilke niveauer forskellen er størst. Det viser at forskellen er størst under koncentrationen 4 mg/l og over 10mg/L. Den normale CRP har et måleområde 4-[304-336] mg/l, men apparatet kan detektere koncentrationer helt ned til 0 mg/l. Derfor kunne jeg finde prøver i meget lave koncentrationer. Da hscrp er en mere sensitiv analyse kan den detektere mere præcise værdier f.eks. 0,51 mg/l hvor CRP analysen ville have vist en værdi på 0 mg/l. Lignende metodesammenligning bliver også lavet af P. Hedberg et al. hvor de sammenligner analyse resultater for hccrp Innotrec Aio og Cobas Inertgra fra Roche Diagnostic og koerrelationskofficietn til 0,97. Cobas Interga bruger samme måleprincip som i mit projekt. Analytisk måleområde for hscrp Analytiskmåleområde er også opgivet af producenten til 0.16-10mg/L. De forskellige producenter opgiver forskellige måleområder. I artikel P. Hedberg et al. 20 ses en sammenligning af analysen hscrp fra forskellige producenter. Cobas Interga fra Roche har et måleområde fra [0-200] mg/l. I artikel Snježana Rothkrantz-Kos et a.l, hvor de sammenligner to metoder bl.a. hscrp fra Dade Behering har et måleområde på [0.18 1150] mg/l, som er meget bredt. Dette kan være at Dade Behering s analyser er baseret på nephtolometri, som er et andet måleprincip, hvor man måler på spredt lys 21. Detektionsgrænse for hscrp Jeg undersøgte metodens detektionsgrænse, som producenterne havde opgivet til at være 0,05 mg/l. Ifølge Danak RL 6 er der to måder at undersøge detektionsgrænsen på, som KPLL s metodevalidering også er opbygget efter. Jeg valgte, at undersøge detektionsgrænsen ved hjælp af en referenceopløsning som er 0,9 % Natriumchlorid på grund manglende 0-kalibrator materiale. Detektionsgrænsen regnede jeg ud til at være 0,12 mg/l. I artiklen Roberto Dominicini et al. 22 opgiver de detektionsgrænsen på 0,03 mg/l som bruger Roche Diagnostics. Deres detektionsgrænse er beregnet ved hjælp af formlen: middelværdi + 3*SD. Side 30

Jeg valgte, at bruge en model med en middelværdi + 5*SD som også bliver brugt på KPLL. I artikel af Jovicic et al. har de fundet detektionsgrænsen på 0.11 mg/l fra producenten Dade Behring 17, som er fundet ved hjælp af middelværdi + 3*SD. Deres detektionsgrænse meget tæt på det jeg har fundet frem til. Den detektinsgrænse som producenten angiver for reagenskitet passer ikke altid med det man finder praktisk. Således passer den detektionsgrænse, som producenten opgiver ikke altid i virkeligheden. I stedet for bliver der fundet funktionel sensivitet (se bilag 8). Analytisk specificitet for hscrp Producenterne har opgivet at der ikke er nogen signifikant interferens fra hæmolyse eller tryglicider. Dvs. analysen kan måle specifikt på den gældende komponent uden forstyrrelser. Analysen er baseret på turbidimetry og intensiteten af uklarhed bliver målt. Derfor forventes det heller ikke at hæmolyse ville interferere da måleprincippet ikke er baseret på farveintensiteten. Ifølge producenten en procenteffekt på 10 % anses for at udgøre interferens. Linearitet for hscrp Linearitetsforsøget viser, at der er en lineærsammenhæng mellem den beregnede og de målte koncentrationer, da korrelationskoefficienten R 2 er på 0,93. Det ses at punkterne ligger i en lige linje i måleområdet op til 20,0 mg/l. Der kan ikke ses på grafen, hvornår der er knæk på linjen dvs. koncentrationen øvre grænse for linearitet. Trods dette er det bevist at analysen er retlinjeret. Da mit måleområde er i intervallet [0,16 10] mg/l så burde man kunne se knækket ved punktet 10 mg/l. For at tydeliggøre knækket kunne man have haft flere målepunkter i koncentrationer under 15 mg/l. I Roberto et al ses der i linearitet forsøg at de får bedre korrelationskofficienten R 2 til 0,99. 23 I tabel 5 ses at de målte værdier for lineariteten er højre end de beregnede værdier. Dette kan skyldes, at det er sket fejl i forbindelse med afpipttering. En anden udfordring jeg mødte ved linearitet da der ikke var patientmateriale nok til at lave de ønskede fortyndinger. Dette løste jeg, ved at undersøge om der var andre analyser, som var rekvireret på patienten. Jeg fandt frem til et D-vitamin analyse, som var lavet på patienten. D- Side 31

vitamin analyser laves også på serum og på den måde kunne jeg supplere prøvematerialet i mit forsøg. Intermediær præcision for hscrp Det er vigtigt at impræcisionen opfylder det krav, som er opstillet i forhold til hscrp analysen. Intermedier præcision kan undersøges vha. to metoder: interseriel og intraseriel. Disse er forklaret under afsnit vedr. metodevalg. I forsøg med interseriel impræcision (tabel 7) ses beregninger for, hvor CV er henholdsvis 23,97 %, 13,14 % og 5,06 %. Dvs. at CV % i niveauerne lav og mellem niveau er større end 10 % hvilket er uacceptabelt (se tabel 6). I forsøg med interseriel impræcision ses i bilag 5 at der et resultat fra dag 5 som ligger langt fra resten af resultaterne dvs. en outlier. Derfor beregnes der et interval middelværdi +/- *SD for at se om jeg kan tillade mig se bort fra denne værdi 16. Jeg valgte at udelukke dette resultat og fik en markant lavere CV på henholdsvis 4,43 %; 2,79 % og 5,15 %, som var acceptabelt og tæt på producentens CV%. Årsagen til den outlier kan være, at der var sket en fejl under analysering af kontrolmaterialet. I P. Hedeberg et al. artikel ses CV værdier på henholdsvis på 6,2 %, 8,2 % og 6,5 %, hvor op til 10 % af de opgivne CV % er acceptable. Det samme er opgivet af producenten for ADVIA 2400. Der ses i tabel 8 at beregninger for intraseriel impræcision er henholdsvis 1,77 %, 5,94 % og 1,71 % som ligger indenfor de opgivne 10 %. Dvs. metodens reproducerbarhed er god. Robusthed for hscrp Robusthed laves for en analyse for at få et bredere acceptinterval. I forsøg med robusthed laves to forskellige reagens lotnumre. For at se om der er forskel på varianser af reagens lotnumre har jeg lavet en F-test mellem de første 10 dage og resterende 10 dage for de relevante niveauer. Der ses i det lave niveau at F-værdien (0,44) er større end det aflæste (0,29) og dermed kan H 0 forkastes (der er ikke signifikant forskel på varianserne). I mellemniveauet ses det at F-værdien (2,40) er mindre end aflæste F værdi (3,22) og dermed H 0 accepteres. I det høje niveau ses der igen at F værdi (10,37) er større end den aflæste F værdi (3,22) og H 0 forkastes. Derefter har jeg beregnet CV % for de første 10 dage og CV % for de næste 10 dage. Det var henholdsvis 1,92, 2,98 og 5,86 % for første 10 dage og for næste 10 dage, 2,84, 1,97, og 0,22 %. Disse værdier var tæt producentens havde opgivet. Side 32

Udfra F-testen kan det konkluderes at der er forskel imellem varianserne i det lave og høje kontrol niveau for 2 forskellige lotnumre mens CV % er acceptable. Afsmitning for hscrp I forsøg med afsmitning i tabel 11, ses at der er afsmitning fra den høje prøve til den lave prøve. Den lave prøve nr. 1 bliver højre i forhold til de næste prøver dvs. der er afsmitning på 1,27 %, mens man ikke kan se den omvendte afsmitning dvs. fra lav til høj prøve. Afsmitning kan skyldes at apparatet bruger samme probe til analyserne. Selv om proben bliver vasket imellem hver prøve, er det måske ikke grundigt nok. En afsmitning på 1,27 % har ikke noget klinisk betydning for patientresultaterne. Præanalytiske forhold for hscrp Holdbarhed og opbevaring En række forhold har stor betydning for det afgivne patientresultat herunder de præanalytiske forhold f.eks., hvordan prøven er taget og opbevaret inden analysen foretages. Iflg. producenten er hscrp prøver holdbare i 3 dage ved 4-8 C i køleskab. Jeg undersøgte holdbarheden for hscrp analysen både i køleskab og ved stuetemperatur. Prøverne blev analyseret igen hhv. dag 3 og dag 7. I bilag 7 ses det at koncentrationen stiger en lille smule dag 3 og 7 i køleskabet. Det samme prøvemateriale som var stillet ved stuetemperatur ses større variation på koncentrationen. F.eks. for prøve 1 er differensen fra dag 1 til dag 3 er 0,8 mg/l. Alle patientprøver på KPLL bliver gemt i køleskabet i 7 dage. Hvis det er analyser som er holdbare i 7 dage kan lægerne rekvirere endnu en analyse. Derfor bliver det ikke nødvendig at indkalde patienterne igen da det kan være genererende for disse. Desværre kunne jeg ikke analysere prøverne den 7. dag da apparatet ikke ville afpipettere prøvematerialet selvom det var ligeligt fordelt. Det skete selvom apparatet bruger 30µl prøvemateriale plus noget dødvolume dog kunne en enkelt prøve fra stuetemperaturen analyseres. Det ses at den enkelte prøves koncentration er meget højre både i tabellen (se bilag 7) og grafisk i figur 10. Jeg mener, at der burde være nok materiale da der var afpipetteret 300µl prøvemateriale i små J-cup til holdbarhed ved stuetemperatur. Side 33

Alternativt prøvemateriale Det står i producenternes brugsvejledning at både serum og litium eller EDTA-stabiliseret plasma kan bruges til at analysere hscrp. Som udgangspunkt bruges serum i analyser på KPLL men i mit forsøg brugte jeg EDTA-stabilieret plasma som alternativ prøvemateriale til analysen for at se om det gav samme resultat som serum.. På KPLL s laboratorium er det ikke muligt at finde litium stabiliseret plasma derfor brugte jeg EDTA-stabiliseret plasma på samme patienter som forklaret under metodevalget. Det ses på differensen at resultater for EDTA-stabiliseret plasma ligger lavere for alle prøver. Dette har ingen klinisk betydning for patient resultater hvis patienterne ikke er under risiko intervallet. Side 34

Konklusion Formålet med projektet var at metodevalidere analysen P-Høj Sensitiv C-Reaktive-Protein; massek. (hscrp) i serum på KPLL ved hjælp af metodevalidering for analysekvaliteten for metrologisk sporbarhed, korrekthed og metode-sammenligning, analytisk måleområde, detektionsgrænse, analytisk specificitet, linearitet, intermediær præcision, robusthed, afsmitning og præanalytiske forhold. Således at analysen kan opsættes på Apparat ADVIA 2400. En t-test viste en signifikant forskel på resultaterne målt på forskellige relevante niveauer. Lineærregression viste en lige linje dvs. en overensstemmelse mellem metoderne og de valgte koncentrations niveauer. Detektionsgrænse blev udregnet til 0,12mg/L som stemmer over med funktionelt sensitivitet. Linearitet viste en god overstemmelse af de beregnede koncentrationer og målte koncentrationer. Både intraserielt og interserielt impræcisions forsøg viste CV % at være lave, dette betyder metoden har god impræcision. Robusthed viste at der var signifikant forskel i mellem det lave niveau og det høje niveau. Statistik kan det ikke accepteres men, klinisk har disse resultater ingen betydning. Dette kan bekræftes ved at CV % var lave. Ved forsøg med afsmitning viste der ikke noget betydelig afsmitning i mellem de høje og lave koncentrationer. I forsøg med præanalytiske forhold viste analysen hs CRP er god ved køleskab over flere dager, som passer med det producenten havde opgivet. Det viste sig at analysen har god holdbarhed i køleskab op til 7 dage De prøver som var opbevaret i stuetemperatur havde højre værdier allerede efter 3. dag. Derfor er det vigtig at hscrp prøverne bliver opbevaret i køleskab hvis de ikke kan analyseres det samme dag. Side 35

Ved alternativt materiale ses der resultater for EDTA-stabiliseret plasma ligger lavere for alle prøver men dette har ingen klinisk betydning for patientresultaterne. Ved nødstilfælde kan EDTA- stabiliseret plasma kan bruges til analysen hscrp. Dv.s. hscrp analysen er fleksibel at foretage da den kan analysere både på serum og plasma. Jeg kan hermed konkludere, at analysen kan opsættes på apparatet ADVIA 2400, da det opfylder alle krav der stilles til en metodevalidering. Side 36

Perspektivering I dette projekt er metrologisk sporbarhed, analytisk, specificitet og analytisk måleområde ikke blevet undersøgt praktisk. En anden gang, hvis man havde mere tid, kunne jeg godt tænke mig gennemgå alle punkterne praktisk i metodevalideringen. Det kunne tænkes at man kunne sammenligne analysen med andre laboratorieresultater, hvor man havde brugt andre metoder. CRP koncentrationen er en meget nyttig uspecifik biokemiske markør for inflammation. Det er vigtigt at diagnose ikke baseres udelukkende på hscrp da det er en uspecifik markør. Det kunne tænkes i fremtiden at analysen kunne bruges til udrede hjertekarsygdomme hvis sundhedsstyrelsen beslutter dette. Side 37

Litteraturliste 1 http://www.hjerteforeningen.dk/hjertekarsygdomme 2 Ridker, Paul M ;High-sensitivity C-reaktive Protein: Potential Adjunct for Global Risk Assesmant in the Primery Prevntion of Cardiovaskular Disease. Cikulation,103, 1813-1818; 2001 3 Scirica Benjamin M., Morrow David A., Cannon Christopher P. Lemos James A de, Murphy Sabina, Sabatine Marc S., Wiviott Stephen D, Rifai Nader, McCabe Carolyn H., and Braunwald Eugene; Clinical Application of C-Reactive Protein Across the Spectrum of Acute Coronary Syndromes. Clinic chemistry 188-1807; 2007 4 Olsen Vibeke, Analyse Forskrift for P-C-Reaktiv Protein ; massekonc. dokumentnr. 10 032-05 5 Siemens Healthceare Diagnostics Inc. Brugsvejledning 2008-08 6 Volanakis John E; Human C-reaktive protein: expression, structure and function, Molecular Immunologi 38; 2002 7 Lyngbye, Jørgen; Dansk laboratorie medicin - en håndbog; Nyt nordisk forlag Arnold Busck; København 2001 8 Pepys, Mark B. and Gideon M. Hirschfield; C-reactive protein: a critical update J. Clin. Invest. 111:1805 1812; 2003 9 Husebekk, Anne og Hanson Lars-Olof, C-reaktive in clinical practice Nycomed Pharma AS, Diagnostik Division, Oslo Norway, Second edition 1999 10 Mcphee, Stephen J. ; Ganong,William F.; Phathophysiologi of disease; Lange Medical Books 2006 fifth edition 11 Liby,MD Peter; Ridker,Paul M.MD; Maser, Attilio MD; Inflammation and Atherocslerosis, Cirkulation;105 ;1135-1143; 2002 12 A New CardioPhase High-Sensitivity C-Reactive Protein Assay on the ADVIA Chemistry Systems from Siemens Healthcare Diagnostics ; Voyagis M. Guo, Bartzeliotou A., Cherian S., Streva V., Papassotiriou I., Dai J. Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY, Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Athens, Greece, Aghia Sophia Children s Hospital, Athens, Greece 13 http://www.sep.alquds.edu/biology/scripts/biology_english/part_3_5_files/image002.gif kl1500 14.12.2009, Janeway, C.A. & Travers, P. (1994) 14 Søren Blirup-Jensen, Protein Standardization III :Method Optimization Basic Principles for Quantitative Determination of Human Serum Proteins on Automated Based on Turbidimetry or Nephelometry; Clinical Chem Lab Med; 39 (11): 1098-1109; 2001 15 http://www.gec.jp/ctt_data/wmon/chap_4/img/wmfig-102_2.gif kl.1300 16.11.2009 16 Procedure Metodevalidering Klinisk Biokemi. Dokument nr.30 016-05 17 Jesper Høy og Allan Munck; Danak s retningslinje RL6, Validering af målrprocedurer (metodevalidering ) i klinisk biokemisk laboratorier, 21.02.2005 18 Jovicic Snezana. Ignjatovic Svetlana, Dajak Marijana, Majkic-Singh Nada; Analytikel performance and clinical efficacy for cardiovascular risk estimation of an Olympus immunotubidimertic high- sensitive C-reaktive protein assay. Clinisk Chem Lab Med ; 2006 19 Lauritsen,Ove S. Statistik for bioanalytikere 2.udgave 15 oplag 7/2006 Bioanalytikeruddannelsen København 20 Hedberg P; Ylito K; Pukka M; Highly sensitive determination of C-reaktive protein on the Innotrac Aio! Immunoanalyzer, Scan.J. Clinic Invest 64: 677-686; 2004 21 Rothkrantz-Kos Snježana, Schmitz Maria P.J., Bekers Otto, Menheere Paul P.C.A., and Dieijen Marja P. van ;High-Sensitivity C-Reactive Protein Methods Examined, Clinical Chemistry 48, No. 2, 2002 22 Dominici Roberto; Luraschi Paola; Franzini Carlo; Measurement of C-reactive Protein: Two High SensitivityMethods Compared Journal of Clinical Laboratory Analysis 18:280 284 2004 Side 38

Bilag 1 Side 39

Bilag 2 Side 40

Side 41

Bilag 3 Beskrivende Statistik Mean -0,28108 Standard Deviation 0,563471704 Sample Variance 0,317500361 Kurtosis -0,709048844 Skewness 0,577882155 Minimum -1,07 Maximum 0,943 Sum -14,054 Count 50 Confidence 0,160136883 Level(95,0%) T-test Mean 5,16 5,44108 Variance 15,56571 12,351107 Observations 50 50 df 49 t Stat -3,5273 P(T<=t) one-tail 0,000461 t Critical one-tail 1,676551 P(T<=t) two-tail 0,000923 t Critical two-tail 2,009575 Formel for middelværdi og standarddeviation Bilag 4 - Metodesammenligning Dag Prøve Interval Resultater Resultater X1+X2/2 nr mg/l CRP hscrp Dag 1 1 patientprøver <= 4 0 0,51-0,51 0,25 Dag 1 2 patientprøver <= 4 0 0,2-0,2 0,10 Dag 1 3 patientprøver <= 4 0 0,49-0,49 0,24 Dag 1 4 patientprøver <= 4 3 3,78-0,78 3,39 Dag 1 5 patientprøver <= 4 1 1,84-0,84 1,42 Dag 1 6 patientprøver <= 4 1 2,03-1,03 1,51 Dag 1 7 patientprøver <= 4 1 1,96-0,96 1,48 Dag 1 8 patientprøver <= 4 3 3,71-0,71 3,35 Side 42

Dag 1 9 patientprøver <= 4 2 2,48-0,48 2,24 Dag 1 10 patientprøver <= 4 0 0,42-0,42 0,21 Dag 2 11 patientprøver <= 4 0 0,73-0,73 0,36 Dag 2 12 patientprøver <= 4 0 1,07-1,07 0,53 Dag 2 13 patientprøver <= 4 1 1,59-0,59 1,29 Dag 2 14 patientprøver <= 4 1 1,21-0,21 1,10 Dag 2 15 patientprøver <= 4 0 0,83-0,83 0,41 Dag 2 16 patientprøver <= 4 1 1,62-0,62 1,31 Dag 2 17 patientprøver <= 4 2 2,93-0,93 2,46 Dag 2 18 patientprøver <= 4 3 4,01-1,01 3,50 Dag 2 19 patientprøver <= 4 2 3,05-1,05 2,52 Dag 2 20 patientprøver <= 4 3 3,64-0,64 3,32 Dag 3 21 4 <= patientprøver <= 10 10 9,38 0,62 9,69 Dag 3 22 4 <= patientprøver <= 10 5 5,64-0,64 5,32 Dag 3 23 4 <= patientprøver <= 10 4 4,97-0,97 4,48 Dag 3 24 4 <= patientprøver <= 10 4 4,70-0,70 4,35 Dag 3 25 4 <= patientprøver <= 10 7 7,07-0,07 7,03 Dag 3 26 4 <= patientprøver <= 10 6 6,20-0,20 6,10 Dag 3 27 4 <= patientprøver <= 10 10 9,06 0,94 9,52 Dag 3 28 4 <= patientprøver <= 10 6 6,43-0,43 6,21 Dag 3 29 4 <= patientprøver <= 10 7 7,11-0,11 7,05 Dag 3 30 4 <= patientprøver <= 10 8 7,79 0,21 7,89 Dag 4 31 4 <= patientprøver <= 10 9 8,24 0,76 8,62 Dag 4 32 4 <= patientprøver <= 10 8 7,47 0,53 7,73 Dag 4 33 4 <= patientprøver <= 10 7 6,39 0,61 6,69 Dag 4 34 4 <= patientprøver <= 10 10 9,43 0,57 9,71 Dag 4 35 4 <= patientprøver <= 10 8 7,69 0,31 7,84 Dag 4 36 4 <= patientprøver <= 10 5 5,62-0,62 5,31 Dag 4 37 4 <= patientprøver <= 10 6 6,05-0,05 6,02 Dag 4 38 4 <= patientprøver <= 10 7 7,39-0,39 7,19 Dag 4 39 4 <= patientprøver <= 10 9 9,02-0,02 9,01 Dag 4 40 4 <= patientprøver <= 10 4 4,7-0,7 4,35 Dag 5 41 4 <= patientprøver <= 10 6 6,29-0,29 6,14 Dag 5 42 4 <= patientprøver <= 10 6 6,61-0,61 6,30 Dag 5 43 4 <= patientprøver <= 10 8 7,89 0,11 7,94 Dag 5 44 4 <= patientprøver <= 10 7 7,32-0,32 7,16 Dag 5 45 4 <= patientprøver <= 10 5 5,46-0,46 5,23 Dag 5 46 10 <= patientprøver <= 14 12 11,67 0,33 11,83 Dag 5 47 10 <= patientprøver <= 14 12 11,49 0,51 11,74 Dag 5 48 10 <= patientprøver <= 14 13 13,16-0,16 13,08 Dag 5 49 10 <= patientprøver <= 14 11 10,56 0,44 10,78 Dag 5 50 10 <= patientprøver <= 14 14 13,13 0,87 13,56 Bilag 5 Linearitet: Et eksempel på beregning af fortyndinger til linearitet: C * V 1 1 C 2 * V 2 C 3 * V 3 C 3 C * V 1 1 V 3 C 2 * V 2 Side 43

20mg / L*400 L 1mg / L*50 L C 3 17.8mg / L 450 L V0 V1 Beregning af akkuratesse : A % * 100 V Intraseriel imprecision: Lav niveau Mellem niveau Høj niveau 1 0,58 2,57 6,59 2 0,59 2,17 6,62 3 0,57 2,29 6,65 4 0,57 2,30 6,63 5 0,57 2,27 6,69 6 0,57 2,29 6,66 7 0,58 2,29 6,63 8 0,57 2,32 6,63 9 0,57 2,28 6,62 10 0,57 2,81 6,62 11 0,57 2,26 6,59 12 0,56 2,30 6,64 13 0,56 2,24 6,63 14 0,54 2,28 6,60 15 0,57 2,25 6,69 16 0,57 2,27 6,65 17 0,57 2,31 6,59 18 0,57 2,26 6,14 19 0,58 2,27 6,63 20 0,58 2,28 6,61 Interseriel imrpcæsion 0 Lav nivieau mellem niveau høj niveau Dag 1 0,58 2,30 6,24 Dag 2 0,58 2,30 6,44 Dag 3 0,58 2,33 7,14 Side 44

Dag 4 0,56 2,13 7,03 Dag 5 0 1 6 Dag 6 0,57 2,32 6,19 Dag 7 0,57 2,38 6,24 Dag 8 0,58 2,32 6,26 Dag 9 0,59 2,3 6,13 Dag 10 0,56 2,27 6,27 Dag 11 0,53 2,21 6,08 Dag 12 0,56 2,34 6,38 Dag 13 0,53 2,24 6,09 Dag 14 0,53 2,23 6,06 Dag 15 0,52 2,19 5,98 Dag 16 0,54 2,23 6,07 Dag 17 0,52 2,17 5,96 Dag 18 0,54 2,23 6,13 Dag 19 0,51 2,21 6,01 Dag 20 0,55 2,26 6,12 Bilag 6 Robusthed: Lav niveau: Variabel 1 Variabel 2 Side 45

Middelværdi Varians Observations df F P(F<=f) one-tail FCritical one-tail 0,574444 0,5359 0,000103 0,000232 9 10 8 9 0,442817 0,132631 0,295148 Mellem niveau: Mean Variance Observations df F P(F<=f) one-tail FCritical one-tail Variabel 1 Variabel 2 2,294444 2,2357 0,004703 0,001957 9 10 8 9 2,402904 0,106732 3,229583 Høj niveau: Middelværdi Varians Observations df F P(F<=f) onetail FCritical one-tail Variabel 1 Variabel 2 6,437778 6,0927 0,142244 0,013706 9 10 8 9 10,37825 0,000996 3,229583 Bilag 7 Rådata for holbarhed: Side 46

Prøve Holdbarhed køleskab mg/l Holdbarhed stue temperatur mg/l Dag 1 Dag 3 Dag7 Dag 1 Dag 3 Dag 7 1 0,96 1,04 1,08 0,96 1,76 2 4,47 4,57 4,68 4,47 5,27 3 2,10 2,17 2,22 2,10 2,68 4 2,73 2,81 2,86 2,73 3,30 5 5,11 5,11 5,20 5,11 6,20 6 3,57 3,75 3,77 3,57 4,64 7 6,94 6,68 6,85 6,94 8,45 8 8,93 9,23 9,20 8,93 10,96 9 5,64 5,78 5,90 5,64 6,70 11,85 10 7,53 7,71 7,86 7,53 9,70 Bilag 8 Side 47

Side 48

Side 49

Bilag 9 - Kontrol værdier Dag 1-02-11-2009 10 prøver til metodesammenligning 0,47 2,02 5,69 0,45 1,97 5,52 Dag 2 03-11-2009 10 prøver til metodesammenligning 0,48 2,03 5,74 0,48 2,06 5,76 Dag 3 05-11-2009 10 prøver til metodesammenligning/ linearitet 0,48 2,03 5,74 0,48 2,06 5,76 Dag 4 05-11-2009 10 prøver til metodesammenligning 0,48 2,04 5,70 0,46 2,06 5,91 Dag 4 06-11-2009 10 prøver til metodesammenligning 0,48 2,04 5,70 0,46 2,06 5,91 Dag 5 09-11-2009 10 prøver til metodesammenligning 0,46 1,94 5,58 0,47 2,06 5,91 Side 50

Dag 6 10-11-2009 10 prøver til holdbarhed og opbevaring 1. dag 0,51 2,15 6,13 0,45 1,96 5,33 Dag 7 11-11-2009 Præanalytikiske forhold 0,57 2,31 6,21 0,59 2,30 6,33 Dag 8 12-11-2009 10 prøver til holdbarhed og opbevaring 3. dag 0,58 2,32 6,30 0,59 2,29 6,28 Dag 9 16-11-2009 Detektionsgrænse og interseriel imprecision 0,56 2,27 6,28 0,58 2,82 6,63 Dag 9 17-11-2009 10 prøver til holdbarhed og opbevaring 3. dag 0,58 2,30 6,24 0,61 2,38 6,64 Side 51