SERUM FOLATPRØVERS HOLDBARHED OG

Bioanalytikeruddannelsen Aarhus SERUM FOLATPRØVERS HOLDBARHED OG HÆMOLYSEINTERFERENS AF SERUM FOLATKONCENTR ATION PROFESSIONSBACHELORPROJEKT 2012/2013 Christine Schubert Waldstrøm Christiansen Studienummer: 110591 I-vejleder: Karen Koed, e-mail: kako@viauc.dk K-vejleder: Ole Bernth Jensen, e-mail: obj@rn.dk Antal tegn (inklusive mellemrum): 69.346

Forord Nærværende professionsbachelorprojekt rapport Serum folatprøvers holdbarhed og er resultatet af projektarbejde gennemført i perioden fra den 8. oktober til den 19. december 2012, inklusive forsøgsarbejde på Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy-Mors i perioden fra den 9. oktober til den 22. oktober 2012. Først og fremmest tak til uddannelseskoordinatoren Chalotte Johansen for, at vi kunne udføre vores bachelorforsøg på Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy-Mors, eftersom Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy- Mors ikke oprindelig var udpeget til bachelorophold. Dernæst skal I- og K-vejlederne, Karen Koed og Ole Bernth Jensen have tak for deres hjælpsomhed og engagement. Der skal også rettes en stor tak til de ansatte på Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy- Mors som frivilligt afgav blodprøver til projektet. Til sidst tak til Ruth Bjørnskov Christensen for god støtte, da prøverne skulle analyseres. Tilknyttet denne professionsbachelorprojekt rapport er bilagene på USB: Bilag 1_Hæmoglobinværdier til hæmolyseforsøget Bilag 2_S-folatværdier til hæmolyseforsøget Bilag 3_Fra fryseren til Modular E170 Bilag 4_Rådata til forhold 1 (lys) Bilag 5_Rådata til forhold 2 (mørke) Bilag 6_Rådata til forhold 3 (køl) Bilag 7_Hæmolyseforsøget Bilag 8_Holdbarhedsforsøget (lys) Bilag 9_ Holdbarhedsforsøget (mørke) Bilag 10_ Holdbarhedsforsøget (køl) Bilag 11_ P-Folat; stofk. forskriften fra KBA Thy-Mors Bilag 12_ Folat III, Indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) Side 1 af 47

Resume Bagrund Folat er vandopløselig B vitamin, som er essentiel i biosynteserne af blandt andet nukleotider og er dermed aktiv i DNA-syntesen. Folatmangel fører til makrocytær anæmi (1,2). I litteraturen er der uenighed om holdheden og opbevaring af folatprøver (3-5). Derfor undersøges serum folatprøver (S-folatprøver) under tre forskellige opbevaringsforhold. Derudover er der ingen oplysninger om, hvor stor en kvantitativ mængde hæmolyse, der interfererer folatprøver. Derfor undersøges hæmolyseinterferens af S-folatprøver. Metode Til hæmolyseforsøget (hæmolyseinterferens af serum folatprøver) anvendes vejledning fra bogen Interferographs: users guide to interferenscens in clinical chemistry instuments (6) hvor en hæmolyse fortyndingsrækkefølge bestående af syv glas for to niveauer af S-folat, først bliver analyseret på Konelab Prime 30i for frit hæmoglobin og dernæst bliver analyseret på Roche Modular Analytics E 170 for S-folat. Til holdbarhedsforsøget indsamles otte prøver fra hver af de 15 frivillige. Serum fra de otte prøver fra hver af de 15 frivillige, bliver fordelt på 21 prøver. Disse 21 prøver bliver fordelt og opbevares derefter under følgende opbevaringsforhold: Forhold 1: lys og stuetemperatur (20-25⁰C), Forhold 2: mørke og stuetemperatur (20-25⁰C) Forhold 3: mørke og køl (2-8⁰C) til tiderne. Alle S-folatprøver (S-folatprøver) bliver analyseret på følgende tidspunkter: 0,2,4,8,24,48 og 72 timer. Resultater Hæmolysegraden for S-folatprøver må have en hæmoglobinkoncentration på 20 µmol/l ved S-folatprøver med en folatkoncentration på 7.07 nmol/l. Holdbarheden for S- folatprøver: 2 døgn ved stuetemperatur ubeskyttet mod lys, mere end 3 døgn ved stuetemperatur beskyttet mod lys (i mørke) og på køl beskyttet mod lys. Side 2 af 47

Konklusion Ud fra resultaterne i hæmolyse- og holdbarhedsforsøget ses det, at hæmolyse har størst indvirkning på S-folatkoncentrationen. Side 3 af 47

Indholdsfortegnelse Forord... 1 Resume... 2 Bagrund... 2 Metode... 2 Resultater... 2 Konklusion... 3 1 Introduktion... 6 1.1 Baggrund... 6 1.2 Formål... 7 1.3 Problemformulering... 8 1.4 Målformulering... 8 1.5 Hypotese... 9 2 Teori... 10 2.1 Vitaminer... 10 2.2 Folat... 11 2.2.1 P-folat-analysens anvendelse... 12 2.3 Analyseprincip bag kompetitiv ECL-assay... 12 2.4 Kvalitetssikring... 14 2.5 Interferens af folat-analysen... 16 2.6 Ny holdbarhedsmetode fra Norden... 17 2.7 Databehandling... 18 3 Materialer og metoder... 20 3.1 Materialer... 20 3.1.1 Hæmolyseforsøget... 20 3.1.2 Holdbarhedsforsøget... 20 Side 4 af 47

3.2 Metodedesign... 21 3.2.1 Hæmolyseforsøg... 21 3.2.2 Holdbarhedsforsøg... 25 4 Resultater... 29 4.1 Hæmolyseforsøget... 29 4.2 Holdbarhedsforsøget... 30 4.2.1 Forhold 1... 30 4.2.2 Forhold 2... 31 4.2.3 Forhold 3... 32 5 Diskussion... 33 5.1 Hæmolyseforsøget... 33 5.1.1 Resultatvurdering af hæmolyseforsøget... 33 5.1.2 Vurdering af metodedesign for hæmolyseforsøget... 36 5.2 Holdbarhedsforsøget... 37 5.2.1 Resultatvurdering af holdbarhedsforsøget... 37 5.2.2 Vurdering af metodedesign for holdbarhedsforsøget... 40 5.3 Sammenligning af hæmolyse-og holdbarhedsforsøgets resultater... 42 6 Konklusion... 44 7 Perspektivering... 44 8 Referenceliste... 46 Side 5 af 47

1 Introduktion 1.1 Baggrund Folat er vandopløselig B vitamin, som består af en cyklisk konjugering af pteridin, paraaminobenzoesyre (PABA) og glutaminsyrerester (1). Folat er en vigtig co-faktor i biosyntesen af methionin, aminosyrerne serin, glycin og histidin, cholin og purin- og thyminnukleotider og er dermed aktiv i DNA-syntesen (1,7). Folat er et essentielt B- vitamin og skal optages gennem føden og findes primært i gær, bladgrønsager og dyrelever, men findes også i sædvanlig kost såsom frugt, appelsinjuice, brød og mælkeprodukter. Mennesket er således afhængig af indtaget af folat. Dårlige kostvaner kan dermed føre til folatmangel (8). Ved folatmangel forringes DNA-syntesen. Den manglende evne til at syntetisere DNA fører til nedbrydelse af erytroblaster i knoglemarven og de erytroblaster, der overlever får en forlænget delingsperiode, som medfører, at de kan syntetisere mere hæmoglobin, så cellevolumen bliver større end normalt. Dette fænomen betegnes som makrocytær/magaloblastære anæmi(2). Indtagelsen af folat eller folinsyre bliver ofte associeret med svangerskab. Det er bevist, at folattilskud i det første trimester af graviditeten reducerer risikoen for neuralrørsdefekt og derfor er analysering af folat en vigtig kontrol under svangerskab (1,9). På Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) på Sygehus Thy-Mors anvendes serum folat (Sfolat) til koncentrationsbestemmelse af folat. Analysen udføres med et kompetitivt ECLassay (electrochemiluminescens) på apparaturet Roche Modular Analytics E 170 (Modular E170). Ved ønske om analytkoncentration skal to forudsætninger være tilstede for at prøveresultatet kan give et korrekt billede af patientens tilstand: Analysemetoden må have en god specificitet og sensitivitet, så der måles en korrekt koncentration af prøven Analytkoncentrationen i prøvematerialet må ikke ændre sig signifikant i tidrummet mellem blodprøvetagning og analyseringen af prøvematerialet (10) Dermed er det væsentligt at kende holdbarheden for folatprøver, og netop dette er der uenigheder om i litteraturen. Holdbarhed (Stabilitet) er blevet defineret af Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO) som prøvematerialets evne til at Side 6 af 47

opretholde den oprindelige måleværdi inden for definerede grænser, når måleværdien ligger under et givet forhold i et givet tidsrum (11). I e-doks laboratoriehåndbog for Hospitalsenheden Vest står der for folat: Holdbarhed efter afpipettering: Stuetemperatur: 2 d, køleskab (2-8 C): 7 d. (5). I reagensindlægssedlen for folat fra cobas (4) er oplyst, at serum og Li-heparinplasma prøver har en holdbarhed på 2 timer ved 20-25 ⁰C, to døgn ved 2-8 ⁰C og prøverne skal opbevares beskyttet mod lys. På KBA på Sygehus Thy-Mors står der i forskriften for folat, at holdbarheden for folatprøver er på et døgn, både ved stuetemperatur (20-25 ⁰C) og på køl (2-8 C), samt at prøverne ikke bør henstå i stærkt lys (3). KBA er i tvivl om, hvad der er mest hensigtsmæssig med hensyn til holdbarhed og opbevaring af folatprøver. Hvis det viser sig, at prøvematerialet kan holde i kortere tid end et døgn eller hvis prøvematerialet ikke kan tåle lys, vil det give problemer. Hvorimod det vil lette arbejdsbyrden, hvis prøvematerialet kan holde længere tid end de to timer, som anført af cobas (4). Derudover står der i indlægssedlen fra cobas Hæmolyse kan øge folatværdierne signifikant på grund af de høje koncentrationer af folat i røde blodceller. Hæmolyserede prøver er derfor ikke egnede til brug med denne analyse (4). Til tider oplever KBA på Sygehus Thy-Mors uenighed ved vurdering af, hvorvidt en prøve er hæmolyseret eller ikke, da der tages en visuel vurdering. Det kunne derfor være en stor hjælp, hvis man vidste, hvor lidt hæmolyse en prøve kan have for at påvirke folatkoncentrationen. 1.2 Formål Formålet med forsøget er at undersøge, hvordan man optimalt håndterer og opbevarer prøver til analysering for S-folat, og ligeledes afdække hvilke konsekvenser det evt. medføre for Klinisk Biokemisk Afdeling, Sygehus Thy-Mors. Derudover ønskes det undersøgt, hvor meget hæmolyse i µmol/l, der må være i S-folatprøver før det bliver af klinisk betydning. Side 7 af 47

1.3 Problemformulering Hvilken indvirkning har hæmolyse, lys, mørke, temperatur og opbevaringstid på S- folatkoncentrationen? 1.4 Målformulering Hæmolyseforsøget Vi vil undersøge hæmolyseinterferens af S-folatkoncentrationen ved at fremstille en pool med en kendt S-folatkoncentration, som bliver fordelt på seks glas med forskellige grad af hæmolysat. Hertil er der endvidere en 0-prøve kun bestående af pool og destilleret vand. Dette forsøg udføres i to niveauer af S-folat. Alle prøverne bliver analyseret på Konelab Prime 30i for hæmoglobin, som er et kvantitativt mål for hæmolyse. Dernæst foretages en S-folat-analyse på Modular E170. Til vurdering af hæmolyseinterferens af S-folatkoncentrationen fremstilles en graf, som viser måleværdierne i procent fra udgangsværdien (0 prøven) som er sat til 100 % for hvert af de to niveauer. S-folat analysens tilladte Bias % og tilladte total error (TE %) vil angives som horisontale linjer. Holdbarhedesforsøget Vi vil undersøge, hvordan opbevaring af S-folatprøver påvirker S- folatkoncentrationen ved at indsamle serumprøver fra 15 frivillige. Serum fra prøverne bliver fordelt og opbevares derefter under disse forhold, som vist i tabel 1: Tabel 1. De 3 opbevaringsforhold Forhold Lys/mørke Temperatur Tiderne (timer) nr. 1 Lys (ubeskyttet Stuetemperatur (20-25 ⁰C) 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 mod lys) 2 Mørke (beskyttet Stuetemperatur (20-25 ⁰C) 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 Side 8 af 47

mod lys) 3 Mørke (beskyttet mod lys) Køl (2-8⁰C) 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 Efterfølgende bliver prøverne frosset ned (-80 ⁰C), tøet op igen og analyseres for S- folat på Modular E170. Til vurdering af holdbarheden for S-folat under de forskellige opbevaringsforhold, fremstilles en graf til hvert af forholdene, som viser måleværdierne i procent fra udgangsværdien (0 timer) som er sat til 100 %. Gennemsnitsværdien af måleværdierne til hver tid med et 90 % konfidensinterval vil ses på grafen og S- folat analysens tilladte Bias % og TE % vil blive angivet som horisontale linjer. 1.5 Hypotese Hæmolyseforsøget Der kan godt udføres en S-folat analyse på S-folatprøver med lav grad af hæmolyse Holdbarhedsforsøget Det forventes, at S-folatprøvers holdbarhed er større end de oplyste 2 timer ved stuetemperatur (20-25⁰C) og beskyttet mod lys Side 9 af 47

2 Teori I dette teoriafsnit vil der blandt andet være en videre forklaring af folat, en beskrivelse af analysepricippet bag kompetitiv Electrochemiluminescens-assay (ECL-assay) som anvendes til analysering af S-folat på KBA på Sygehus Thy-Mors, en beskrivelse af interfererende stoffer for folat-analysen og en beskrivelse af den nye holdbarhedsmetode fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger, som anvendes i holdbarhedsforsøget i dette professionsbachelorprojekt. 2.1 Vitaminer Som beskrevet i overstående afsnit er folat et vitamin. Vitaminer er organiske molekyler, som har mange forskellige funktioner i kroppen. Eksempelvis fungerer vitaminer som cofaktorer (co-enzymer) for enzymatiske reaktioner i metabolismen af kulhydrater, fedt, proteiner, og knogler (7,12). Vitaminer kan generelt ikke syntetiseres af pattedyrceller, og dermed skal vitaminer optages gennem føden. Der findes to forskellige typer vitaminer, de vandopløselige og de fedtopløselige (7). Under betegnelsen de fedtopløselige vitaminer hører A-, D-, E- og K- vitaminer, og under de vandopløselige vitaminer hører B- og C- vitaminer til. B-vitaminer er en samlet betegnelse for en række vitaminer, hvor blandt andet folat indgår (se tabel 2) (7): Tabel 2. B- vitaminer Vitamin Navne B1 thiamin B2 riboflavin B3 niacin eller niacinamid B5 pantotensyre B6 pyridoxin, pyridoxal eller pyridoxamin B7 Biotin B9 folat eller folinsyre B12 cobalamin Side 10 af 47

2.2 Folat Efter indtagelsen af folat-rig kost, nedbrydes det fra polyglutaminer til monoglutaminer i tarm, hvorefter det absorbers af tarmepitel-cellerne i Jejunum og bliver ført ud i blodbanen (1,2). Hovedparten af folaterne bliver om dannet til 5-methyl- tetrahydrofolat (5-methyl- THF) under methylering og reducering i hovedsageligt leverceller, hvor folat også deponeres. 5-methyl-THF er den form for folat som cirkulerer i plasma, hvor størstedelen er løst bundet til transportproteinet albumin og en mindre del er bundet fast til specifikke proteiner, som dannes i leukocytterne. Før at 5-methyl-THF kan være medvirkende DNAsyntesen, skal det optages i cellerne. Denne optagelse af 5-methyl-THF sker ved hjælp af folattransportere, hvor cobalamin (B 12 vitamin) fungerer som er en co-faktor og katalyserer omdannelsen af homocystein til methionin ved, at hydroxycobalamin overbringer methylgruppen fra 5-methyl-THF til homocystein. Nu befinder folat sig i cellen i form af THF (tetrahydrofolat). Det er denne form for folat, som syntetiserer dannelsen af methionin, aminosyrerne serin, glycin og histidin, cholin og purin- og thyminnukleotider. Se figur 1 (1,7). Folat deponeres også i cellerne i form af THF og anvendes først ved behov. Folat findes fastbundet til hæmoglobin i erytrocytterne, selv om folat hverken optages eller afgives i de modne erytrocytter. Det er under erytropoiesen, at folat akkumuleres i de umodne erytrocytter (erytroblaster). (1). Figur 1. Reaktioner hvor THF fungerer som en co-faktor. Fra (13) Side 11 af 47

Folatkoncentration kan bestemmes på bagrund af plasma/serum eller erytrocytter (ERC). Det er blevet vist ud fra ernæringsundersøgelser, at S-folat/plasma-folat (P-folat) er den bedste indikator for folatbalancen ved nylig folat indtag. ERC-folat er en mere definitiv test for at undersøge folatdepoterne, eftersom erytrocytterne kun akkumulerer folat under erytropoiese. ERC-folatkoncentrationen ændres dermed langsommere med ændring af indtagelse af folat, eftersom erytrocytternes levetid er på 120 dag (14). Folatkoncentrationen bør analyseres på baggrund af serum eller plasma, eftersom ERCfolat-analysen er mere kompleks at udføre, da den kræver en særlig håndtering af prøver og har således en lavere impræcision (8,15). I Region Nordjylland er referenceintervallet for P-folat > 6 nmol/l (3), som er baseret på baggrund af folat-analysens metode, kompetitiv ECL-assay (14). Der er ikke krav om, at patienterne skal være fastende ved foretagelse at folat-analyse. Befinder folatstofkoncentration 6 nmol/l, kan dette betragtes som en folatmangel. 2.2.1 P-folat-analysens anvendelse Folatmangel ligner meget B12-vitaminmangel (cobalaminmangel), da de begge medfører makrocytær anæmi (7). Derved kan man anvende P-folat-analysen til udredning af makrocytær anæmi og kan ligeledes anvendes ved cobalaminmangel. Cobalaminmangel medfører øget folatkoncentration i blodet, eftersom folat ikke kan optages i cellerne, da cobalamin er fraværende (1). Folat optages i tarmen, og ved malabsorption nedsættes optagelsen af folat og dermed falder folatkoncentration i blodet (1). Ved fejlernæring kan der være nedsat folatkoncentration i blodet. Det samme gælder ved indtagelsen af antiepileptika og folatantagonister. Nedsat folatkoncentration i blodet ses også ved øget forbrug af folat i kroppen, som er tilfældet ved svangerskab, leukæmi og hæmolytisk anæmi (1). 2.3 Analyseprincip bag kompetitiv ECL-assay Som nævnt tidligere anvendes et kompetitivt ECL-assay (electrochemiluminescens assay) på apparaturet Modular E 170 til koncentrationsbestemmelse af folat på Sygehus Thy- Mors (4). Inkubation 1: Efter prøven bliver sat på Modular Analytics E 170, bliver 25 µl serum/plasma inkuberet ved 37 ⁰C med folatforbehandlingsreagenserne 1 og 2, som Side 12 af 47

indeholder Natrium 2-mercaptoethansulfonat og Natriumhydroxid. Folatforbehandlingsreagenser frigiver de bundne folater fra de endogene folatbindende proteiner som albumin. Inkubation 2: Dernæst bliver den forbehandlede prøve inkuberet med en overskydende mængde rutheniummærkede (ruthenium (II) tris-bipyridal (Ru (bpy) 3 2 + )) folatbindende protein (FBP), som er specifik for folat og der dannes et patient-folatkompleks, hvis mængde afhænger af analytkoncentrationen (folat) i prøven. Biotinyleret folat og streptavidin-coatede mikropartikler bliver dernæst tilsæt blandingen. Inkubaton 3: Det biotinylerede folat optager de ubundne bindingspladser på de rutheniummærkede folatbindende proteiner, hvorved der dannes et rutheniummærket folatbindende proteinfolatbiotinkompleks. Disse rutheniummærket folatbindende proteinfolatbiotinkompleks bindes til streptavidin-coatede mikropartikler via den stærke interaktion mellem biotin og streptavidin. Reaktionsblandingen opsuges i målecellen, hvor proteinfolatbiotinkompleks bliver indfanget magnetisk på elektrodens overflade via mikropartiklerne. Dernæst vaskes med ProCell/ProCell M for at fjerne ubundne stoffer såsom patient-folatkomplekser, eftersom disse ikke bliver opfanget på elektrodeoverfladen (4). ProCell/ProCell M indeholder tripropylamin (TPA) som er læse-buffer til den endelige ECL-reaktion (16). Ved at sætte spænding til elektroden induceres kemiluminiscensemission, hvor reportermolekylet, det bundne ruthenium og TPA, bliver oxideret. TPA mister en proton og TPA anvendes som en reduktant, der fører ruthenium til en exciteret tilstand, hvilket medfører lys som udsendes ved en bølgelængde på 620 nm (se figur 1) (16,17). Lyset bliver opfanget af fotomultiplikatoren og Ruthenium kommer tilbage til grundformen. Ruthenium bliver ikke brugt op i reaktionen, så denne cyklus kan fortsætte, så længe TPA er til stede. Flere excitation/emission cykler forstærker det udsendte lys og øger følsomheden (17). Mængden af produceret lys er omvendt proportionalt med mængden af folat i patientprøven. Det vil sige, at jo mere folat desto mindre lys bliver der udsendt, eftersom folat optager størstedelen af pladserne på FBP, som bliver vasket ud af målecellen af ProCell/Proll M (18). Kemiluminiscensemission bliver målt af fotomultiplikatoren over en bestemt periode, som anvendes til bestemmelse af folatkoncentrationen ved anvendes af en kalibreringskurve. Kalibreringskurven er fremstillet ud fra kendt folatkoncentration (2- punktskalibrering), og en masterkurve (16,17). Side 13 af 47

Figur 2. Den sidste reaktion i ECL-assay. Fra (17) ECL detektionsteknologi er en meget anvendelig teknologi, eftersom den giver tydelige fordele i forhold til andre detektionsmetoder. ECL har (18): Ikke-isotopisk markør Høj specificitet og sensitivitet Korte inkubationstider, høj kvalitet Giver hurtige resultater Stort måleområde Anvender små mængder af prøvemateriale Kontrolleret reaktion 2.4 Kvalitetssikring Man skal sikre sig, at et analyseresultat er sandfærdigt, dermed er der stor fokus på kvalitetssikring. Kvalitetssikring er alt det, der bidrager til at opretholde kvaliteten af resultatet af prøvematerialet (19). Derfor foretages kalibrering, som er baseret på kendt koncentration af en givet analyt. Kalibrering udføres: Når lotnumre på reagens til analysering ændres Når systemkomponenter udskiftes Når resultaterne af kvalitetskontrollen gentagne gange befinder sig uden for et givet område Side 14 af 47

Kvalitetskontroller udføres før analysering af patientprøver. Der opstilles krav til, hvor meget kvalitetskontroller må afvige fra deres vedtagne sande værdier (se afsnittet databehandling) og ud fra dette, kan vurderes om analysen fungerer tilfredsstillende. Til folat-analysen på Modular E170 anvendes disse tre kontroller (3,4): Tabel 3 Kontrol Navn Middelværdi Intern Lyphochek immunoassay Plus Control, Level 1, Cat No. 371- BIO-RAD Lyphochek immunoassay Plus Control, Level 2, Cat No. 372- BIO-RAD Ekstern Hormone- og immunkemi (Labquality) HK12 (DEKS) (nmol/l) SD CV % 7,67(n = 166) 0,70 (n= 166) 9,1(n = 166) 15(n = 164) 0,83(n = 164) 5,5(n = 164) 12,71(n= 119) 0,92(n = 119) 7,2(n = 119) CV %, som er folat-analysens usikkerhed sammenlignes med den tilladte CV %, som findes på Westgards hjemmeside. CV % for folat-analysen på Modular E170 skal være under den tilladte CV % på 12 % for, at man kan anvende denne analyse til kvantitativ bestemmelse af folatkoncentration. Det ses ud fra CV % erne fra tabel 3 og indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics)(4), at folat-analysen på Modular E170 er tilfredsstillede. De interne kvalitetskontroller anvendes daglig for at undersøge om S-folat-analysen er tilfredsstillende, de såkaldte kort tidskontroller. Den eksterne kvalitetskontrol fra DEKS (Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring for Laboratorier i Sundhedssektoren) HK12, er en langtidskontrol og anvendes til at sammenligne S-folat-analysen med andre laboratorier i landet, som anvender samme og forskellige apparatur for at se, hvordan analysen ligger i forhold til hinanden. Under kvalitetssikring er der også krav om holdbarhed til reagenset som anvendes til analysering og prøvematerialet. Holdbarhed eller stabilitet er ikke en egenskab som kan måles direkte. Holdbarhed kan forstås som evnen til at bevare sin oprindelige tilstand af et givet produkt. Derfor undersøges folatprøvers holdbarhed under tre opbevaringsforhold Side 15 af 47

som beskrevet i tabel 1. For hvert forhold udskiftes en faktor, eksempelvis lys til mørke. Årsag til, at det er disse tre forhold vi vil undersøge i dette professionsbachelorprojekt er, at de kan sammenlignes med oplysningerne i indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) (4). Andre muligheder er ikke medtaget på grund af ressourcepres (tid og økonomi). 2.5 Interferens af folat-analysen Under kvalitetssikring skal man også være opmærksom på interfererende stoffer, som kan være en betydelig fejlkilde i kliniske analyser. Sådanne fejl kan i visse tilfælde udgøre en fare for patienten. Mens impræcision (analytisk variation: afvigelsen mellem gentagne målinger på den samme prøve) rutinemæssigt overvåges ved intern kvalitetskontrol, og korrekthed kan verificeres ved sammenligning med referencematerialer eller procedurer, kan laboratorier ikke let opdage fejl forårsaget af interfererende stoffer (20). Dermed er det vigtigt at vide, hvilke stoffer der interferer folat-analysen på Modular E170. Til folatanalysen er der eksogen interferens i form af lægemidlerne methotrexat og leucovorin, da der opstår krydsreaktioner (1,20). Endogene interfererende stoffer for folat-analysen er blandt andet icterus, lipæmi og biotin. I indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) er der kvantitative acceptkriterier for de interfererende stoffer (4): Icterus: (bilirubin) < 564 µmol/l Lipæmi: (Intralipid) < 1500 mg/dl ~ 6,2 mol/l biotin < 86.1 nmol/ L Mængden af bilirubin og intralipid i folatprøven må være større end biotin, eftersom bilirubin og intralipider bliver skyllet ud af målecellen af ProCell/ProCell M, som beskrevet ved ovenstående afsnit. Biotin derimod interfererer mere med folatprøverne, da ECL-assayet indeholder biotinyleret folat og biotin fra prøver kan således optage Biotinyleret folaternes plads på streptavidin-coatede mikropartikler og dermed medføre et falsk forhøjet værdi af folatkoncentration. Hæmolyse er også nævnt i indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) som et interfererende stof (4). Hæmolyse betegner den situation, hvor erytrocytter afgiver hæmoglobin (giver den røde farve) og andet indhold til det omgivende medium, eftersom cellemembranen ødelægges. Hæmolyse kan være in vivo (inde i kroppen) og in vitro (uden for kroppen). Hæmolyse forekommer in vivo ved patologiske tilstande såsom HELLPsyndrom eller hæmolytisk uræmisk syndrom og in vitro forekommer hæmolyse oftest ved Side 16 af 47

forkert blodprøvetagning (21). Det er ikke den røde farve af hæmoglobin, som interfererer folat-analysen, men den høje folatkoncentration i erytrocytter og dermed får hæmolyseret folatprøver et falsk forhøjet folatkoncentration (4). Men mængden af hæmolyse, som interfererer folatprøverne er ikke oplyst i indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics), og derfor undersøges hæmolyseinterfererens af folatprøver i dette professionsbachelorprojekt. 2.6 Ny holdbarhedsmetode fra Norden I artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger fra Klinisk Biokemi i Norden (10) har Arne Åsberg, et al. fra afdeling for Medicinsk Biokemi, St. Olavs Hospital i Trondheim udviklet en ny metode til at vurdere holdbarhedsforsøg. De mener, at gennemsnitsværdien af analytkoncentrationen i prøver opbevaret med en bestemt kombination af opbevaringsbetingelser og opbevaringstidsrum må være inden for den gennemsnitlige udgangsværdi ± den tilladte Bias (ønskede). Det er den tilladte Bias af en givet analyt som avendes, da der findes pålidelige data vedrørende normal biologisk variation (10). Se definition og beregningen af den ønskede tilladte Bias i afsnittet Databehandling. Den målte gennemsnitsværdi har en tilknyttet usikkerhed, derfor anvendes et 90 % konfidensinterval for gennemsnitsværdien, så der er 95 % sandsynlighed for, at gennemsnitsværdien for hver tid ligger inden for konfidensintervallet. Det kræves, at 90 % konfidensintervallet skal ligge inden for acceptgrænserne for tilladte Bias % for at acceptere, at prøvematerialet er holdbart. De vurderer også den enkelte måleværdi, hvor acceptgrænsen er den enkelte prøves udgangsværdi ± den tilladte TE, som også defineres og beregnes i afsnittet Databehandling (22). Den tilladte TE anvendes som acceptgrænse for den enkelte måleværdi(10). Altså for en bestemt kombination af opbevaringsbetingelser og opbevaringstid skal begge krav, både kravet til gennemsnitsværdien og kravet til den enkelte måleværdi være opfyldt for, at prøvematerialet kan betragtes som holdbart (10). Side 17 af 47

2.7 Databehandling Bias- systematisk Bias afspejler den systematiske fejl og er defineret som forskellen mellem middelværdien af uendeligt mange målinger og prøvens referenceværdi (den sande værdi) (19). Bias er med et andet ord korrektheden og kan beregnes således: Bias= (19) Den sande værdi for et givet materiale er svær at definere, eftersom der skal uendelig mange målinger til at bestemme den sande værdi. Derfor anvendes den vedtaget sande værdi ofte som er middelværdien af mange målinger af et givet prøvemateriale. Den tilladte Bias er den største afvigelse som måleværdiernes gennemsnit må have før, at det bliver klinisk signifikant og patienter kan dermed få angivet en forkert diagnose. Den tilladte Bias kan være af optimum performance, desirable performance eller minimum performance. Den desirable performance Bias (den ønskede tilladte Bias) er den, som oftest anvendes og det er denne tilladte Bias i % for en givet analyt, som findes på Westgards hjemmeside (22) og den beregnes således (10,22): Den ønskede tilladte Bias % = (10,22) Hvor CVw er CV % for within-subject (intraindividuel variation) og CVg er CV% for between subject (interindividuel variation) Total allowable error range tilladte TE Den tilladte TE er den største afvigelse en enkelt måleværdi må have før, at det bliver klinisk signifikant (10) og denne tilladte TE i % findes på Westgards hjemmeside (22). Den tilladte TE % beregnes således(10): Den tilladte TE % = ± Hvor I % er den tilladte analytiske CV % for en givet analyt. Konfidensinterval Side 18 af 47

Et konfidensinterval er et tillidstro interval. Det er det interval, hvor man med en bestemt sikkerhed ved, at en givet parameter ligger indenfor. Ofte anvendes et 95 % konfidensinterval, som beregnes således (19): konfidensinterval = Hvor SEM (standard error of the mean) = CV - variationskoefficient CV er målingernes impræcision, altså graden af overensstemmelse mellem uafhængige målinger af en givet analyt. Ofte er variationskoefficient angivet i CV % og kan både beregnes som af analytisk eller biologisk variation. CV % beregnes således (19): CV % = Hvor SD er standardafvigelsen. CV % af den intra- og interindividuelle variation og den tilladte analytisk variation af en givet analyt, finds på Westgards hjemmeside (22). Side 19 af 47

3 Materialer og metoder 3.1 Materialer 3.1.1 Hæmolyseforsøget - Destilleret vand - Koldt fysiologisk saltvand (natriumklorid 9 mg/ml) - Centrifuge (Hettich: 10 min. ved 2500 g) - -80 grader fryser - Engangspipetter - Automatpipetter + pipettespidser - Afpipetterings plastglas med prop - kopper (til Konelab Prime 30i og Modular E170) Apparatur - ABL 800 Flex - Konelab Prime 30i - Modular E170 Reagenser - Natruimcarbonatopløsning 0,94mmol/L (fremstillet på KBA, Sygehus Thy-Mors, anvendes til Konelab Prime 30i) - Folat III fra Roche: pretreatment reagens 1, pretreatment reagens 2 og Streptavidincoatede mikropartikler (produkt nr.: 04476433 190) (anvendes til Modular E170) Prøvemateriale - Plasma fra 2x Geriner bio-one, Vacuette LH lithium heparin. Ref nr. 454029 (Liheparinglas) (til fremstilling af hæmolysat til hver af de to niveau) - Serum fra 2x8 Geriner bio-one, Vacuette Clot Activator with Gel Separator. Ref nr. 454067 (serum gelglas) (i forvejen analyserede prøver for folat dagen for inden) 3.1.2 Holdbarhedsforsøget - Utensilier til ca. 15 venepunktur der tages 8 gelglas pr. venepunktur. - Centrifuge (Ebbendorf og Hettich: 10 min. 2500 g) - -80 ⁰C fryser Side 20 af 47

- Køleskab (2-8 ⁰C) - Prøvestativer - Engangspipetter - Automatpipetter + pipettespidser - 315 Plast glas med prop - 315 kopper (til Modular E170) - Folie (til mørkebelægning af prøver) - Papkasser: (til mørkebelægning af prøver) - Lys (almindeligt loftpære + indfaldslys fra vinduerne til belysning af prøver) Apparatur - Modular E170 Reagenser - Folat III fra Roche: pretreatment reagens 1, pretreatment reagens 2 og Streptavidincoatede mikropartikler (produktnr.: 04476433 190) (anvendes til Modular E170) Prøvemateriale - Serum fra 8 Geriner bio-one, Vacuette Clot Activator with Gel Separator. Ref nr. 454067 (serum gelglas) fra hver 15 raske personer 3.2 Metodedesign Velvidende, at folat-analysen hedder P-folat; Stofk. (3) og serum ikke findes i kroppen, anvendes termen serum (S-folat) om folatprøverne, eftersom folatkoncentrationen bestemmes på serum både i hæmolyseforsøget og holdbarhedesforsøget i dette professionsbachelorprojekt. 3.2.1 Hæmolyseforsøg Til udførelsen af hæmolyseforsøget anvendes vejledning fra bogen Interferographs: users guide to interferenscens in clinical chemistry instuments (6). Hæmolyseforsøget blev udført i to niveauer: Niveau 1: lav S-folatkoncentration (ca. 8,15 nmol/l) Niveau 2: høj S-folatkoncentration (ca.26,9 nmol/l), Side 21 af 47

Man kan ikke vide sig sikker på om hæmolysesgradens interferens stemmer overens i alle niveauer af folatkoncentrationer, og derfor blev hæmolyseforsøget undersøgt på to niveauer. 3.2.1.1 Fremstillingen af stamopløsning for hæmolysat Til fremstillingen af hæmolysat-stamoplysning blev der anvendt erytrocytter fra Liheparinglas - et Li-heparinglas til hvert niveau. Der var her opmærksomhed på, at folatkoncentrationen i Li-heparinglassene var cirka den samme som i de to niveauer, eftersom folat frigives fra erytrocytterne ved hæmolyse. Hvis man anvendte et hæmolysatstamopløsning med høj folatkoncentration til det lave niveau, ville folatværdierne blive falsk forhøjede. Til hæmolysat-stamopløsningen for niveau 1 blev anvendt et Liheparinglas fra en patient, hvis serum indgår i poolen til niveau 1. Til det høje niveau (niveau 2) var der ingen Li-heparinglas fra en patient hvis serum indgik i poolen for niveau 2, som kunne anvende til hæmolyat for niveau 2. Dermed blev der analyser plasma folat (P-folat) på fem tilfældige Li-heparinglas. Det Li-heparinglas hvis P-folatkoncentration kom tættes på koncentration af folat i niveau 2 blev anvendt som niveau 2 s hæmolysat. Erytrocytterne i Li-heparinglassene blev vasket med koldt fysiologisk saltvand, centrifugeret og dernæst blev supernantanten aspireret, for at fjerne overskydende plasma og buffycoat. Denne vaskeprocedure blev i alt gentaget fem gange for at få den reneste pellet af erytrocytter. Erytrocytterne blev hæmolyseret ved tilsætningen af destilleret vand, dette skyldes det osmotiske tryk i erytrocytterne, som herved stiger og springes. Der blev tilsat så meget destilleret vand, så hæmoglobinkoncentrationen blev fortyndet til omkring de 3 mmol/l i stedet for de oprindelige 12 mmol/l, som oplyst i Interferographs: user s guide to interferencens in clinical chemistry instruments (6). Dette er grundet i, at indlægssedlen for folat fra cobas oplyser, at der ingen hæmolyse må være ved analysering af folatprøver (4). Derfor undersøgte vi folatkoncentration ved lave hæmolyse-koncentrationer. Med henblik på at opnå en hæmoglobinkoncentration på de omkring 3 mmol/l, blev ABL 8000 Flex anvendt, eftersom en analyse kun tager få minutter. For at sikre, at alle erytrocytterne blev hæmolyseret, blev de to hæmolysatglas placeret i -80 ⁰C fryser, optøet og sat på frys igen. Side 22 af 47

Efter anden optøning blev hæmoglobinkoncentrationen kontrolleret på ABL igen for, at vi var sikre på, at de to hæmolysater var omkring 3 mmol/l. Til sidst blev hæmolysatglassene centrifugeret så eventuelle cellerester blev bundfældet. 3.2.1.2 Fremstilling af hæmolyse-opløsningerne Der blev fremstillet en serum-pool til hvert af de to niveauer. Hver serum-pool bestod af serum fra otte forskellige serum-gelglas, som var analyseret for S-folat dagen forinden. Herved var folatkoncentrationerne kendte og ud fra dette blev de to niveauer fremstillet, henholdsvis: Niveau 1: lav S-folatkoncentration (ca. 8,15 nmol/l) Niveau 2: høj S-folatkoncentration (ca.26,9 nmol/l) En fortyndingsrækkefølg af hæmolyse beståede af 7 opløsninger for hvert af de to niveauer blev fremstillet (se tabel 4): Tabel 4. Fortyndingsrækkefølge af hæmolyse-opløsningerne Teoriske Fortynding Navn Hæmoglobinkoncentration (µmol/l) H150 150 H75 75 2x H150 H37,5 37,5 4x H150 H20 18,75 8x H150 H10 9,375 16x H150 H5 4,6875 32x H150 H0 0 Først blev 0-prøven (hæmoglobinkoncentration (H) = 0 µmol/l) for hver af de to niveauer fremstillet ved at blande 0,5 ml destilleret vand med 9,5 ml serum fra poolen til de to niveauer. 0-prøven blev anvendt som serum-stamopløsning til opløsningerne H75, H37,5, H20, H10, H5 og der blev afpipperet 1,0 ml fra serum-stamopløsningen (0-prøven) til hver af de 5 opløsninger. Side 23 af 47

Til fremstillingen af H150 i fortyndingsrækkefølgen til hvert af de to niveauer blev 0,1 ml fra hæmlysat-stamopløsningen afpippeteret og blandet godt med 1,9 ml fra serumpoolen. Dernæst blev 1,0 ml fra H150 afpippeteret til H75. 1,0 ml fra H75 blev afpippeteret til H37,5, og dette fortsætter således at 1,0 ml fra den forgående fortynding bliver afpippeteret over i det næste trin i fortyndingsrækken, ind til der blev afpippeteret 1,0 ml fra H10 til H5 (se figur 2). Figur 2. Hvordan hæmolysat overføres i fortyndingsrækkefølge. (Selvfremstillet i Paint) Side 24 af 47

De færdige hæmolyse-opløsninger af de 2 niveauer, så således ud: Billede 1. Niveau 1 (eget billede) Billede 2. Niveau 2 (eget billede) Hæmoglobinkoncentration i de syv opløsninger blev målt på Konelab Prime 30i med fotometrisk metode (23) for at få de aktuelle hæmoglobinkoncentrationer (se bilag 1). Dernæst blev S-folat målt på de syv opløsninger på Modular E170 for at undersøge de forskellige hæmolysegraders interferens på de to niveauer (se bilag 2). Efterfølgende blev hæmolyseresultaterne plottet ind i en lignende graf som figur 2 fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). 3.2.2 Holdbarhedsforsøg Til dette holdbarhedsforsøg af S-folat tages der udgangspunkt i artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). Vi tog blodprøver fra 15 raske frivillige bioanalytikere, da vi ønskede flere forsøgspersoner i holdbarhedsforsøget end de 10 personer som var tilfældet i artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). Grunden til, at vi valgt 15 forsøgspersoner var, at der var 21 folatprøver tilkoblet hver person, da vi undersøgte hver person for tre forhold, herunder tilknyttet syv tider, i alt 315 prøver (15x21). Såfremt vi inddrog flere end de 15 forsøgspersoner ville antallet af analyser tilsvarende overstige 315 prøver, hvilket ville gøre analyseringen væsentlig dyrere at udføre og samtidig vanskeligere at håndtere, da tiden er en væsentlig faktor i relation til dette holdbarhedsforsøg, da det oplyses i folat indlægssedlen for cobas (Roche Diagnostics), at folatprøver har en max. holdbarhed på to timer (4). På grund af det korte disponible tidsrum på to timer, hvor folatprøverne først skal henstå i 30 minutter, dernæst centrifugeres i 10 minutter før analysering, udføres holdbarhedsforsøget på raske personer. Hvis man anvendte patienter i stedet for raske personer, ville tiden til 0-prøven Side 25 af 47

blive længere end 0-prøven på de raske personer, da blodprøvetagning skulle foregå på Sygehus Thy-Mors sengeafdelinger. De 15 personers folatværdier blev ikke kontrolleret inden holdbarhedsforsøget blev sat i gang på baggrund af følgende: Når folat referenceintervallet ligger på > 6 nmol/l, ville der være variation af folatkoncentrationen ved de 15 forsøgspersoner, eftersom man skal ligge over de 6 nmol/l og også da den interindividuelle variation er med en CV % på 73 (22). Dermed er der sandsynlighed for at opnå et interval med stor værdivariation inden for folat-normalområdet. Folatkoncentrationen i blodet er afhængig af indtagelsen af føde og S-folat har dermed en intraindividuel variation CV % på 24 (22). Blodprøvetagning af 15 forsøgspersoner blev udført over to dage for at få tiden på 0- prøverne så lille så mulig. Der blev taget otte serum gel-prøveglas fra hver forsøgsperson, da der cirka er 1,5 serum pr. serum gel- prøveglas og der skulle anvendes 500 µl serum (200 µl til analyse på modular E170 plus spild) til hver af de 21 prøver. Serum og ikke Lithium-heparinplasma blev anvendt til dette holdbarhedsforsøg for folat, da det også er serum som KBA på Sygehus Thy-Mors anvender til koncentrationsbestemmelse af folat og Lithium-heparinplasma må ikke fryses ned (4). Efter blodprøvetagning blev tre af de otte serum-gelprøveglas fra hver forsøgsperson mørkelagt med folie. Prøverne henstod i 30 minutter (så blodet blev ordenligt koaguleret), hvorefter de blev centrifugeret i 10 minutter på 2500 g. Serum fra serum gel-prøveglassene blev afpippeteret til plastglas med prop, markeret med forhold og tid. Serum fra de tre mørkebelagte serum gel-prøveglas blev anvendt til forhold 2 (mørke, stuetemperatur (20-25 ⁰C), til tiderne: 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer). 0-prøverne blev placeret i -80 ⁰C fryser efter, at prøvernes middelværdien var en time gammel. Her antog vi, at ingen ændring af S- folatkoncentration finder sted ved -80⁰C. De andre serumprøver stod under de tre forhold (se tabel 4), hvor de efterfølgende også blev placeres i -80 ⁰C fryser. Side 26 af 47

Tabel 4 Forhold 1 (lys, 20-25 ⁰C til 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer) 2( mørke, 20-25 ⁰C til 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer) 3(mørke, 2-8⁰C til 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer) Definition Prøverne stod i et rum ved stuetemperatur, med store vinduer og med alm. rumlys tændt under hele forsøget. Prøverne stod i samme rum som forhold 1 og var placeret i en tætlukket kasse. Prøverne stod i en kasse i køleskabe på 2-8 ⁰C Vi ønskede at udføre holdbarhedsforsøget så virkelighedstro så muligt, så prøverne i forhold 1 og 2 blev anbragt i en rum, der ligner rummet med Modular E 170. Vi anbragte alle prøverne i -80 ⁰C fryser, så alle prøverne blev analyseret på samme dag, under samme kalibrering og godkendte kontroller for at undgå dag til dag variation (interindividuel variation). Prøverne blev taget ud af fryseren og blev tøet op i batches - 15 i hver. Prøverne blev udtaget efter de tre forhold, men med tilfældige tider og prøvenumre. Efter prøverne fra forhold 2 blev taget ud, stod prøverne til optøning under en tæt lukket kasse. Inden prøverne blev sat på Modular E 170 blev prøverne blandet godt og overført til kopper til Modular E 170 og kontrolleret for at prøverne ikke indeholdte bobler. Tiden der gik fra prøverne blev udtaget af den -80 ⁰C fryser til prøverne var på Modular E 170, var middelværdien 28 minutter (Bilag 3). Prøverne havde prop/låg på under hele holdbarhedsundersøgelsen, bortset fra når prøverne blev afpippeteret og når prøverne var sat på Modual E170. Resultaterne for de 3 forhold (bilag 4-6) blev indsamlet og blev plottet ind i en lignende graf som figur 2 fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). Ud af x-aksen blev den sammenlagte tid anvendt, eksempelvis tiden 2 timer bliver til 2,47 timer, eftersom prøverne stod i de tre forhold i 2 timer og det tog 28 minutter fra prøverne Side 27 af 47

blev udtaget fra den -80 ⁰C fryser til prøverne var på Modular E 170 (se graferne 1-4 i resultatafsnittet). 3.2.2.1 Etiske overvejelser Ved anvendelsen af blod fra raske, frivillige bioanalytikere på KBA, Sygehus Thy-Mors, blev en forespørgsel af patienter til brug af deres blod undgået. De frivillige bioanalytikere havde givet samtykke til brug af deres blod, ved selv at skrive sig på en seddel, som var hængt op på afdeling. På sedlen var der information om projektetet, hvor mange blodtagningsglas vi skulle anvende fra hver person og hvornår blodprøvetagningen vil blive foretaget. Der blev taget otte serum gel-prøveglas (8 3 ml = 24 ml) fra hver person. Dette kunne vi tillade os, da der ved en almindelig bloddonortapning tappes ca. en halv liter blod uden, at dette ville påvirker personen. På informationssedlen var angivet, at forsøget krævede syv prøveglas fra hver person, så de frivillige blev informeret om, at vi tog et ekstra glas (otte i alt) for at være sikker på at have tilstrækkelig prøvemateriale inden de blev stukket. De frivillige personer forblev anonyme, da deres navn ikke blev tilknyttet prøverne, men blot markeret med tal. Side 28 af 47

4 Resultater 4.1 Hæmolyseforsøget På graf 1 ses resultaterne af hæmolyseforsøget, præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) (se bilag 1-2 og 7). Graf 1 Folatkoncentrationsændring ved stigende grad af hæmolyse 250,00 200,00 % 150,00 100,00 Niveau 1: lav Niveau 2: høj 50,00 0,00 0 25 50 75 100 125 150 Aktuel hæmoglobinkoncentration (µmol /L) De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien (0-prøven =100 %) for hvert af de to niveauer. De blå, horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside (22)). De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S- folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 29 af 47

4.2 Holdbarhedsforsøget 4.2.1 Forhold 1 På graf 4 er resultatet for holdbarhedsforsøget for S-folat koncentration ved forhold 1. præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) (se bilag 4 og 8). Graf 2 150 S-folat koncentrationsændring af forhold 1 lys, stuetemperatur (20-25⁰C) 140 130 120 110 % 100 90 80 70 60 50 0 10 20 30 40 50 60 70 Timer De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien, som er sat til 100 %. De blå horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Det midterste, lodrette, røde og korte linje er symbolet for middelværdien (i procent af udgangsværdien) hvor hvert tidspunkt, mens de to andre lodrette, røde og korte linjer, som omgiver middelværdien, afspejler den øvre og nedre grænse af 90 % konfidensintervallet. De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 30 af 47

4.2.2 Forhold 2 På graf 5 er resultatet for holdbarhedsforsøget for S-folat koncentration ved forhold 2, præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) (se bilag 5 og 9). Graf 3 150 140 130 120 110 S-folat koncentrationsændring af forhold 2 mørke, stuetemperatur (20-25⁰C) % 100 90 80 70 60 50 0 10 20 30 40 50 60 70 Timer De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien, som er sat til 100 %. De blå horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Det midterste, lodrette, røde og korte linje er symbolet for middelværdien (i procent af udgangsværdien) hvor hvert tidspunkt, mens de to andre lodrette, røde og korte linjer, som omgiver middelværdien, afspejler den øvre og nedre grænse af 90 % konfidensintervallet. De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 31 af 47

4.2.3 Forhold 3 På graf 4 er resultatet for holdbarhedsforsøget for S-folat koncentration ved forhold 3, præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). (se bilag 6 og 10). Graf 4 S-folat koncentrationsændring af forhold 3 150 140 130 120 110 mørke, køl (2-8⁰C) % 100 90 80 70 60 50 0 10 20 30 40 50 60 70 Timer De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien, som er sat til 100 %. De blå horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Det midterste, lodrette, røde og korte linje er symbolet for middelværdien (i procent af udgangsværdien) hvor hvert tidspunkt, mens de to andre lodrette, røde og korte linjer, som omgiver middelværdien, afspejler den øvre og nedre grænse af 90 % konfidensintervallet. De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 32 af 47

5 Diskussion 5.1 Hæmolyseforsøget De aktuelle S-folatværdier på H0 (0-prøve) er: Niveau 1: 7,07 nmol/l Niveau 2: 26,11 nmol/l 5.1.1 Resultatvurdering af hæmolyseforsøget Ud fra graf 1 ses det, at folat-analysen på Modular E 170 med et ECL-assay er følsom over for hæmolyse, da folatkoncentrationen stiger i takt med mængden af hæmolyse ved begge niveauer. Det ses også, at ved en hæmolysegrad (hæmoglobinkoncentration) på 10 µmol/l er der ingen forskel på de to niveauers værdier og deres 0-prøve. Dermed er min opstillede hypotese til hæmolyseforsøget bekræftet. Ved en hæmoglobinkoncentration på 39 µmol/l overskrider niveau 1 den tilladte TE % s (39 %) øvre grænse, mens niveau 2 ligger inden for den tilladte Bias %, som er 19,2 %. Niveau 2 overskrider den øvre tilladte Bias %-grænse ved en hæmoglobinkoncentration på 74 µmol/l og den øvre tilladte TE % s-grænse ved 148 µmol/l. Det vil sige, at hæmolyseinterferensen er størst ved de lavere værdier af S-folatkoncentration. Det ses ud fra grafen, at niveau 2 fra en hæmoglobinkoncentration på 17 µmol/l til hæmoglobinkoncentration på 36 µmol/l ikke stiger som det ellers var forventet, men der imod falder lidt. Dette kan skyldes analysens usikkerhed (CV %). Spørgsmålet er, hvilket acceptkriterium (acceptgrænse) skal hæmolyseinterferens af S-folat have, før det bliver af klinisk betydning? I litteraturen findes der intet standardiseret acceptkriterium/grænse for hæmolyseinterferens generelt. Der findes mange måder at gribe dette an på ifølge Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (20). I interferogaphs: User s guide to interferences in clinical chemistry instruments (6) anvender de 10 % som acceptgrænse. At anvende 10 % som grænse til en vilkårlig analyse er ikke det bedste udgangspunkt, eftersom alle analyser har forskellige intra og interindividuelle variationer og dermed også forskellig tilladt Bias %. Hvis acceptgrænsen af interferens for S- thyroxin bindende globulin (TBG) er 10 %, er denne acceptgrænse større end den tilladte Bias % for TBG, som er på 0,0 % (22). Den tilladte Bias % for S-folat er på 19,2 %, som dermed Side 33 af 47

næsten er 20 gange så stor som TBG s tilladte Bias %. Derfor anvendes de 10 % ikke som acceptgrænse for hæmolyseinterferens for S-folat. Acceptgrænsen til hæmolyseinterferens skal være større end folat-analysens intermediær impræcision (analytiske variation, CV %) på Modular E170, eftersom det er analyseusikkerheden og har dermed intet at gøre med hæmolyseinterferencen. Hertil anvendes folat-analysens største CV %, som ligger på 9,1 % ved den laveste interne kontrolværdi. Dermed skal acceptgrænsen til hæmolyseinterferens ligge over 9,1 %, eftersom de 9,1 % ikke er et udryk for hæmolyseinterfererens i S-folatprøverne. Både den tilladte Bias % og den tilladte TE % for S-folat, som er angivet på graf 1, kan anvendes som acceptgrænse for hæmolyseinterferens af S-folat prøverne ifølge CLSI (20). Den tilladte TE % på 39 % kan anvendes som acceptgrænsen for S-folatprøver på baggrund af termens definition (se afsnittet databehandling), da vi kun har målt de to niveauers fortyndingsrækker en gang. Her er den analytiske variation medtaget i og med den tilladte CV% for S-folat indgår i den tilladte TE % s beregning for S-folat. Man kan også anvende den tilladte Bias % til acceptgrænse for hæmolyseinterferens af S- folat prøverne, eftersom det er oplyst i indlægssedlen for cobas (Roche Diagnostics), at der ingen hæmolyse må være i folatprøverne, og dermed kræver det en mere snæver acceptgrænse såsom den tilladte Bias %. Den tilladte TE % på 39 % er meget stor i forhold til, at der ingen hæmolyse må være. Jo mindre grænse jo større sikkerhed har man for, at måleværdierne er rigtige. Ud fra graf 1 ses det, at det er lige meget hvilken acceptgrænse man anvender (den tilladte Bias % eller tilladte TE %) for hæmoglobinkoncentrationen vil være på 20 µmol/l for begge niveauer, eftersom niveau 1 overskrider den tilladte Bias %-grænse og den tilladte TE %-grænse ved hæmoglobinkoncentrationen på 39 µmol/l. For niveau 2 er det anderledes, eftersom det overskrider den tilladte Bias %-grænse ved en hæmoglobinkoncentrationen på 74 mmol/l og den tilladte TE %-grænse ved en hæmoglobinkoncentrationen på 148 µmol/l. Den tilladte TE % bliver anvendt ved dette hæmolyseforsøg på bagrund af den tilladte TE% definition. Så man kan acceptere hæmolyseinterferens i S-folatprøver ved: Side 34 af 47