Sammenligning af kort og lang vævspræpareringsmetode

Bachelorprojekt Patologiafdelingen Rigshospitalet Sammenligning af kort og lang vævspræpareringsmetode Udarbejdet af: Mette Bang Nyholm (14.12.1974) I perioden: 3. november 28 24. marts 29 Vejledere: Merete Ringsholt Bioanalytikeruddannelsen København Marianne Rasmussen Patologiafdelingen Rigshospitalet

INTRODUKTION... 3 PROBLEMBAGGRUND... 3 PROBLEMFORMULERING... 4 BEGREBSDEFINITIONER... 4 BAGGRUNDSTEORI... 4 Fiksering... 4 Konventionel vævspræparering... VIP... 7 PATHOS... 7 Peloris... 9 Hæmatoxylin-Eosin farvning... 9 Immunhistokemisk teknik... 11 MATERIALER OG METODE... 12 MATERIALER... 12 Prøvemateriale... 12 Reagenser og apparatur... 12 Antistoffer... 13 METODE... 14 Modtagelse og klargøring af prøver... 1 Fiksering/vævspræparering... 1 Indstøbning... 16 Skæring og spørgeskema... 16 Farvning... 16 Gradering af snit... 16 Mikroskopering af snit... 18 RESULTATER... 18 HE-FARVNING... 18 IHC... 21 SPØRGESKEMAUNDERSØGELSE... 21 DISKUSSION... 22 HE-FARVEDE SNIT... 22 IHC SNIT... 24 SPØRGESKEMAUNDERSØGELSE... 2 PRØVESTØRRELSE... 26 KONKLUSION... 26 PERSPEKTIVERING... 27 REFERENCER... 28 BILAGSFORTEGNELSE... 3 BILAG 1... 31 BILAG 2... 32 BILAG 3... 33 BILAG 4... 3 2

Introduktion Den praktiske del af dette projekt er udført i samarbejde med bioanalytikerstuderende Maria G Nielsen på Rigshospitalets Patologiske afdeling (PA). Vurdering af resultater, samt den skriftlige del af projektet, er udført hver for sig. Problembaggrund På PA anvender man Tissue-Tek Vacuum Infiltration Processor TH (VIP) til vævspræparering. På PA sættes vævet som standard over til vævspræparering om eftermiddagen og er færdig næste morgen. VIP en er programmeret, så den med det samme går i gang med vævspræpareringen, som varer hele natten. Det er derfor vigtigt, at vævet er godt fikseret, inden det tages med. Som det ser ud i dag, må væv der modtages sidst på dagen, vente til dagen efter med at blive præpareret. Mammavæv, der er meget fedtholdigt, har især brug for lang fiksering, og kan derfor først medtages i VIP en dagen efter, det er modtaget. VIP maskinerne på PA er over 2 år gamle og skal i den nærmeste fremtid udskiftes. PA har tidligere testet vævspræparering ved brug af PATHOS fra Milestone på nålebiopsier fra mamma. Resultaterne herfra så lovende ud. Derfor vil vi gå videre med vævspræpareringen, ved at teste på flere forskellige vævstyper og vævsstørrelser på PATHOS. Ved de tidligere forsøg blev der anvendt et program på 4 timer. Derfor har vi valgt også at anvende dette. Umiddelbart før vores projektperiodes start, gik en af VIP erne i stykker og blev erstattet med en Peloris fra Leica. Da Peloris har et 4 timers program, der minder meget om PATHOS 4 timers program, så vi muligheden i, at udvide projektet til også at omfatte Peloris. Både PATHOS og Peloris er vævspræpareringsmaskiner, der har kortere præpareringstid end den konventionelle metode. Dermed vil de, ved natlig præparering, give mulighed for en længere fiksering, inden præpareringen går i gang. Herved vil prøver, der ankommer til PA sidst på eftermiddagen også kunne medtages i samme dags vævspræparering. I 27 indgik Regeringen og Danske Regioner en aftale omkring behandling af kræft, de såkaldte kræftpakker. Pakkerne tilknytter sig de enkelte kræftformer, og patienten skal sikres optimal udredning og behandling for at forkorte forløbet. [] 3

Hvis det er muligt at anvende præpareringsmaskiner, der kan være medvirkende til at forkorte svar tiden, ville det være en fordel. Problemformulering Kan vævspræpareringstiden forkortes, ved at anvende PATHOS fra Milestone eller Peloris fra Leica i stedet for den nuværende Tissue- Tek Vacuum Infiltration Processor TH, uden at den gyldne standard forringes? Begrebsdefinitioner Gylden standard: Prøvemateriale hvor vævspræpareringen er foretaget på VIP Reaktionsmønster: Et billede på, om et antistof reagerer med det antigen, det er rettet imod. Baggrundsteori Fiksering Når væv afskæres fra ilt og næring, begynder cellerne i vævet med det samme at autolysere. For at minimere dette, er det vigtigt, at der hurtigt påbegyndes fiksering af vævet. Der findes to typer af fiksativer: Gelerende Koagulerende Gelerende fiksativer er oftest aldehyder. Vævets frie aminogrupper, thiolgrupper og aromatiske ringsystemer reagerer med aldehydet. Primært reagerer det med aminogrupperne. Det sker ved, at et aldehyd binder sig til aminogrupper mellem proteinmolekyler og i samme proteinmolekyle. Virkningen heraf bliver, at cellerne låses fast og at vævet stabiliseres. 4

Det mest anvendte aldehyd er 1 % neutral buffet formalin (v/v) (formalin). Det har den fordel, at det trænger meget hurtigt ind i vævet, hvorved autolyse minimeres. Figur 1 Figuren viser princippet bag gelerende (nederst) og koagulerende(øverst) fiksering www.bio.cvuoeresund.dk/index.php?module=pagesetter&type=file&func=get&tid=3&fid=fil&pid=973 &download=1 slide 14 Koagulerende fiksativer f.eks. ethanol udfælder og åbner proteinerne. Det betyder, at hydrofobe sidegrupper, der normalt er gemt i proteinmolekylets indre, nu er blotlagte og dermed kan reagere indbyrdes. Proteinets tertiære og sekundære strukturer ødelægges. Derfor virker koagulerende fiksativer denaturerende.[2] Konventionel vævspræparering Den konventionelle vævspræparering består af fire trin, der er nødvendige for at vævet senere kan indstøbes i paraffin. Første trin er fiksering i formalin. Andet trin er dehydrering. Her udsættes vævet for flere hold af stigende koncentrationer af ethanol, der virker ved at trække vandet ud af vævet. Paraffin er hydrofobt og derfor er dette trin nødvendigt, da paraffinen ellers ikke vil kunne trænge ind i vævet.

Foruden at være en dehydrant, virker ethanol også som et koagulerende fiksativ. Det bevirker at vævet, hvis det ikke er fuldt formalinfikseret, også vil udsættes for en koagulerende fiksering. Derfor er det vigtigt at vævet er fuldt fikseret inden vævspræpareringen. Ved dehydreringen er der risiko for en større eller mindre skrumpning af vævet. Derfor er det fordelagtigt, at dehydreringstrinet er så kort som muligt. Tredje trin er klaring. Ethanol er ikke blandbart med paraffin. Derfor er det nødvendigt at anvende et klaringsmiddel, der er blandbart med både ethanol og paraffin. På PA anvendes xylen som klaringsmiddel ved den konventionelle væpspræparering på VIP. Xylen er et organisk opløsningsmiddel, der som vist på figur 2 indeholder en benzenring og to methylgrupper. Figur 2 Kemisk opbyggelse af xylen http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e9/p-xylene.png Fjerde og sidste trin er paraffininfiltrationen. Vævet føres igennem flere hold af 8 C varmt flydende paraffin, hvorved klaringsmidlet, xylenen udskiftes med paraffin. Efter disse fire trin er vævet parat til paraffinindstøbning. På både PATHOS og Peloris er klaringsmidlet, der anvendes isopropanol (IPA). IPA er en alkohol og dermed også et organisk opløsningsmiddel. Figur 3 Kemisk opbyggelse af isopropanol http://www.dbooth.net/mhs/chem/isopropanol.png 6

VIP VIP en er en automatisk vævspræpareringsmaskine, hvor tider og reagenser kan programmeres efter det behov, den enkelte patologiafdeling har. VIP anvender den konventionelle vævspræpareringsmetode, som beskrevet i forrige afsnit. Fiksering, dehydrering og klaring sker ved en temperatur på 4 C og paraffininfiltrationen ved 8 C. VIP en består af et lukket system, hvor reagenserne via slanger og ventiler pumpes ind i det kammer, hvor selve vævspræpareringen foregår. Når et reagens skal anvendes, åbnes der for ventilen til den slange der fører reagenset fra reagensdunken til kammeret. Der dannes et vakuum i kammeret, hvorved reagenserne trækkes ind i kammeret. Tilsvarende dannes der tryk i kammeret når reagenserne skal tilbage til reagensdunkene. Dette er en tidskrævende proces, der er med til at forlænge præpareringstiden. Under selve præpareringen i kammeret sker der en vekslen mellem tryk og vakuum, hvilket fremmer indtrængningen af reagenserne i vævet.[9] Program for VIP kan ses i tabel 1 på side 9. PATHOS PATHOS er en automatisk vævspræpareringsmaskine, hvor princippet bygger på mikrobølger. Apparatet har et arbejdsrum, hvori der er to kamre. Det ene er et mikrobølgekammer, hvor vævet præpareres med diverse reagenser. Det andet er et kammer til paraffin, her foregår paraffininfiltrationen. Fordelen ved separate kamre er, at der herved ikke kan ske paraffin forurening af slanger og reagenser. [7] Første trin er fiksering i formalin, ved hjælp af mikrobølger. Efterfulgt af to hurtige skylninger med ethanol. Andet trin er dehydrering med ethanol, ved hjælp af mikrobølger. Tredje trin er klaring med IPA, ved hjælp af mikrobølger. Fjerde trin er en kort tørring, der har det formål at fjerne IPA. Dette sker ved hjælp af mikrobølger og vakuum. Femte og sidste trin er parffininfiltrering, som sker ved 7 C og under indflydelse af vakuum. Processen er illustreret på figur 4 på næste side.[7] Program for PATHOS kan ses i tabel 1. 7

Figur 4 Figuren viser princippet i PATHOS vævspræparering. Først ses hvordan dehydrering og klaring foregår, dernæst tørring hvor IPA fjernes og til sidst paraffininfiltrationen. http://www.milestonemedsrl.com/histopathology/products/pathos/how_works.html Mikrobølger Mikrobølger er elektromagnetiske bølger, med en frekvens mellem 3 MHz og 3 GHz og bølgelængder mellem 1 mm og 1 m.[1] Generelt er mikrobølger ikke ioniserende, men i mikroovne findes en magnetron, der gør bølgerne meget energirige og derved ioniserende. Mikrobølgerne virker på materialer, der indeholder vand eller fedt. Dvs. de virker godt på væske og proteinerne væv. Molekylerne i vævet er dipolære og vil virke magnetiske. Mikrobølgerne skifter retning mange gange pr. sekund, og molekylerne vil derfor også skifte retning. Dette gør, at vævet og reagens varmes op. Figur Figuren viser hvordan mikrobølgerne bevæger sig. http://www.bmskorea.co.kr/bms_product/makerimage/notice/milestone/microwave_heating.pdf s. 23 8

Peloris Peloris er en automatisk vævspræpareringsmaskine, der har to individuelle kamre. Dette gør det muligt, at bruge to forskellige programmer på samme tid. Det er endvidere muligt at programmere maskinen med de tider, man ønsker. I bunden af hvert kammer, er der en magnetomrører, som sørger for en hurtig og jævn opvarmning af reagenserne. Dette gør at, tiden vævet skal opholde sig i de forskellige reagenser, forkortes væsentligt i forhold til den konventionelle vævspræparering.[6] Processen består først af et kort trin i formalin, dernæst dehydrering i ethanol og klaring i IPA. Mellem dehydreringstrinet og klaringstrinet, er et trin, hvor reagenset er en blanding af ethanol og IPA i forholdet 8/2. I dette trin fortsætter dehydreringen, samtidig med en indledende klaring påbegyndes. Sidste trin er infiltrering med 8 C varm paraffin. [4] Programoversigt for Peloris kan ses i tabel 1 herunder. Tabel 1 Programoversigt for henholdsvis VIP, PATHOS og Peloris VIP PATHOS Peloris Trin Reagens Tid/min Temp/ C Reagens tid/min temp/ C Mikrobølger Reagens tid/min temp/ C 1 Formalin 6 4 Formalin 4 + Formalin 1 2 Ethanol 7 % 6 4 Ethanol 99 % 2 Ethanol 8 % 3 3 Ethanol 96 % 6 4 Ethanol 99 % 2 Ethanol 8 % 22 4 Ethanol 96 % 6 4 Ethanol 99 % 2 62 + Ethanol+IPA 1 Ethanol 99 % 6 4 IPA 11 68 + Ethanol+IPA 4 6 Ethanol 99 % 7 4 Tørring 1, 7 + IPA 3 7 Ethanol 99 % 9 4 Paraffin 68 7 IPA 1 8 Xylen 6 4 IPA 4 9 Xylen 6 4 Paraffin 4 8 1 Xylen 9 4 Paraffin 2 8 11 Paraffin 12 8 Paraffin 1 6 12 Paraffin 12 8 13 Paraffin 12 8 14 Paraffin 12 8 Hæmatoxylin-Eosin farvning Hæmatoxylin-Eosin farvningen (HE) er en oversigtsfarvning. Den består af to farveopløsninger: Mayers Hæmalun (Mayer), der farver kernerne og Eosin, der farver cytoplasma. 9

Mayer fremstilles af farvestoffet hæmatoxylin, natriumiodat (Na-iodat) og kaliumaluminiumsulfat i en vandig opløsning. Hæmatoxylin oxideres af Na-iodat til hæmatein. Sammen med aluminiumsionerne (Al 3+ ) danner hæmateinet det letopløselige røde metalkompleksfarvestof Al-hæmatein. Komplekset er positivt ladet, og kan derfor ved iontiltrækning binde sig til negative phosphatgrupper i kernens DNA. Der sker desuden også hydrofob stabilisering. Det foregår ved at hæmatein og de upolære grupper i vævet indbyrdes danner upolære bindinger og fortrænger derved vandet.[2] Figur 6 Figuren viser, hvordan hæmatoxylin oxideres til hæmatein, og hvordan Al 3+ bindes til hæmatein. Hallager, K. (2), Histokemi og Histologisk teknologi, Hospitalslaborantskolen i Århus s. 3.7 Efter farvning med Al-hæmatein foretages altid skylning i rindende vand, hvorved der sker en blåning. Når der skylles i vand stiger ph-værdien, og hæmatein fraspalter et H +. Dette gør, at Al-hæmatein skifter farve fra rød til blå.[2] Figur 7 Figuren viser den kemiske opbygning af Eosin. Hallager, K. (2), Histokemi og Histologisk teknologi, Hospitalslaborantskolen i Århus s. 2.31 Eosin er et anionfarvestof. Det er negativt ladet og kan derfor binde sig til proteinerne i vævet. Som det ses på figur 7, har det to negative ladninger, hvor den ene er delokaliseret 1

og den anden en ioniseret carboxylgruppe. De negative ladninger øger farvestoffets opløselighed i vand og nedsætter opløseligheden i ethanol. På grund af carboxylgruppen, der har en pks værdi på omkring 4 [2], er det nødvendigt at ph værdien i farvevæsken ikke kommer under 4, da Eosin ellers vil udfælde. På PA farves der ved ph 4,6. Immunhistokemisk teknik Detektionssystemet, der anvendes til immunhistokemisk farvning (IHC), er EnVision+ systemet fra DAKO, som er en indirekte polymerforstærkningsteknik. Vævet inkuberes med et primært umærket antistof efterfulgt af en inkubering med EnVision+. EnVision+ består af fleksibel polymer (dextran), hvorpå der er koblet enzymet Horse Radish Peroxidase (HRP) og sekundært antistof, der er rettet mod det primære antistof.[3] Bindingen mellem antigen og primært antistof, kan nu detekteres ved at visualisere HRP. Figur 8 Figuren viser princippet bag EnVision+ teknikken http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/wentges-marek-24-12-13/html/wentges_html_m39f9f68.png HRP i sig selv er usynligt, men kan visualiseres ved hjælp af en histokemisk teknik, hvor der anvendes hydrogenperoxid som substrat og et kromogen, i vores tilfælde 3.3 diaminobenzidin (DAB) DAB fungerer som donor af H-atomer, den oxideres af hydrogenperoxiden, og udfældes som et brunt rektionsprodukt.[3] Ved at inkubere med kobbersulfat, kan DAB reaktionen forstærkes, dvs. at den får en mørkere og mere intens brun farve. Der afsluttes med en kernefarvning med Mayer. 11

Materialer og metode Materialer Prøvemateriale Prøvematerialet er væv fra ufikserede præparater, modtaget på PA på hverdage i tidsrummet 9.-1. i en periode på tre uger. Der blev indsamlet 43 vævsprøver fra i alt 1 patienter. Fordelt på følgende væv: Blære, uterus, mesoteliom, hud fra mamma, sarkom, metastase i lymfeknude, tumorvæv fra mamma, fedtvæv fra mamma, prostata, oment med metastaser, rectum og tarmkrøs. Reagenser og apparatur Til HE-farvning Eosin, fremstillet på PA. For regensfremstilling samt sikkerhed, se bilag 3 Mayers Hæmalun, fra RH s apotek Linear Stainer II fra Sakura Til IHC Mayers Sure Hæmalun 2, %, fra RH s apotek EnVision+ fra DAKO DAB fra DAKO TechMate + Autostainer Link Plus Hvad der herudover anvendes, af reagenser og apparatur til udførelse af projektet, er de normalt anvendte på PA. 12

Antistoffer Antistofferne er valgt med hensigt på at få et bredest muligt udvalg af antistoffer. Enkelte antistoffer er derfor brugt, selvom de normalt ikke ville anvendes til vævet. Vi konfererede med patologerne og rutinerede bioanalytikere, for at finde ud af dette. Tabel 2 Tabellen er en oversigt over, hvilke antistoffer blev anvendt i projektet, deres anvendelse og producent Antistof Anvendelse Producent Kodenr/klon CA12 Anvendes til diagnosticering af ovariecarcinomer. Påviser cytoplasmisk reaktion i overfladen af cylinderepithelceller. Valgt fordi patienten også havde en ovariecancer. Novo Castra Laboratories ldt NCL-CA12 /Ov18:1 Calretinin Anvendes til at identificere malignt mesotheliom DAKO M7246 CD3 Anvendes som T-lymfocytmarkør. Novo ldt CD2 Anvendes som B-lymfocytmarkør DAKO M7 CK7 Påvises i kirtelepithelceller og vil normalt være positivt i mammaepithel. Valgt fordi metastasen i lymfeknuden stammer fra en brystcancer. DAKO PS1 M718 EMA Påviser mesotheliomer DAKO M613 ER HER-2 Castra Laboratories NCL-CD3- Progesteron (PgR) Ses i kerner i kirtelepithel i normal mamma. Anvendes til at påvise mammacarcinomer. Er derfor valgt til mammatumorvæv Ses i epithelvæv i mamma. Anvendes til bestemmelse af HER-2 protein i mammacarcinomer. Er derfor valgt til Mammatumorvæv. Ses i kerner i kirtelepithel i normal mamma. Anvendes til at påvise mammacarcinomer. Er derfor valgt til mammatumorvæv Labvision DAKO DAKO SP1 SK 1 (kit) M369 PSA Ses i kirtelepithel i normal prostata DAKO M7 Vimentin WT1 Ses i fx mesothel, endothel og lymfocytter. Anvendes til sarkomer, melanomer og mesotheliomer. Er valgt fordi den kan påvises i det meste væv. Ses i cytoplasma og i kerner. Anvendes bl.a. til serøse adenocarcinomer fra ovariet. Valgt fordi patienten også DAKO DAKO M72 M361 13

havde en ovariecancer. Metode Nedenunder ses et flowdiagram over prøvernes gang fra modtagelse til mikroskopering. De enkelte trin er nærmere beskrevet på de følgende sider. Ufikseret præparat modtages Patologen udleverer vævet til os Vævet skæres i tre lige store stykker og målene noteres. Vævsstykkerne placeres i tre kapsler med etiketter A: VIP, B: PATHOS og C: PELORIS VIP kapsler i formalin. Tidspunkt noteres PATHOS kapsler i formalin Tidspunkt noteres PELORIS kapsler i formalin Tidspunkt noteres Medtages i VIP en dagen efter kl. 12 Medtages i PATHOS samme eftermiddag kl. 1 Medtages i PE- LORIS samme eftermiddag kl. 1 Indstøbning Skæring samt udfyldning af spørgeskema HE-farvning IHC på udvalgte snit Mikroskopering og gradering Figur 9 14

Flowdiagram over prøvens gang fra modtagelse til mikroskopering Modtagelse og klargøring af prøver Når PA modtog et ufikseret præparat, blev vi tilkaldt og patologen fratog væv til os. Herefter blev det delt i tre lige store stykker, et til hver vævspræpraringsmetode. Det var vigtigt at stykkerne blev af samme størrelse, for at skabe ens grundlag for den senere sammenligning af de tre vævspræpareringsmetoder. Vi fremstillede prøver af flere størrelser Prøver med tykkelse på 3 mm Prøver med tykkelse på 1 mm (efterligning af biopsier) Længde, bredde og højde blev målt, for at holde styr på hvilke størrelser vi havde indsamlet. Desuden også for at kunne se, om størrelsen skulle have nogen indflydelse på præpareringens kvalitet. Tidspunkt for fiksering blev noteret, for at kunne beregne prøvematerialets nøjagtige fikseringstid. Dette var vigtigt i forbindelse med at vurdere, om fikseringstiden fik nogen indflydelse på resultaterne. Afhængigt af hvornår på dagen vævet blev modtaget, ville tiden, hvor vævsprøven opholdt sig i formalin, variere. Fiksering/vævspræparering Efter udskæring kom kapslerne i formalin, indtil de kunne medtages i vævspræpareringsmaskinerne. PATHOS og Peloris blev startet samme eftermiddag kl. 1. VIP en blev først startet næste dag kl. 12. VIP ens program var PA s lange fedt program. PATHOS programmet, var det, fra producenten anbefalede, til vævsstykker på optil 3mm tykkelse. Peloris var et forudindstillet 4 timers program, som vi vurderede svarede til PATHOSprogrammet. Programmerne for VIP, PATHOS og Peloris kan ses i tabel 1 1

Indstøbning For at skabe ens betingelser mellem de tre metoder, blev alle tre vævsprøver indstøbt i indstøbningsforme af samme størrelse. Skæring og spørgeskema Blokkene blev samlet i sæt, så de tre vævspræpareringmetoders blokke fulgtes ad. Sammen med hvert sæt blokke, blev udleveret et spørgeskema, hvor der skulle afkrydses, hvordan hver blok var at skære i forhold de vanlige blokke. Fordi en sådan vurdering kræver erfaring, valgte vi, at alle blokke skulle skæres af rutinerede bioanalytikere. Der blev skåret et snit fra hver blok til HE farvning, samt et snit for hvert antistof til IHC. Farvning Alle HE snit blev farvet på farvemaskinen Linear Stainer II fra Sakura. Farveforskrift samt reagensfremstilling se bilag 2 Immunsnit blev farvet på TechMate + eller Autostainer Link Plus Immunkontroller blev medtaget, hvor der ikke automatisk var en intern kontrol i snittet. Gradering af snit Kriterierne for gradering opstillede vi i fællesskab, med henblik på at kunne konferere vores resultater med hinanden. Gradering af HE-snit med henblik på morfologi og farveintensitet HE-snittenes morfologi vurderes i forhold til den gyldne standard, på baggrund af kromatinstruktur, skrumpning og autolyse. HE-snittenes farveintensitet vurderes i forhold til den gyldne standard, på baggrund af intensiteten af Mayer og Eosin. Ved en god morfologi, ses der: Tydelig kromatinstruktur i kernerne Minimal skrumpning af vævet 16

Ingen autolyse af cellerne Farveresultater Kerner: Kontrast mellem blå nuancer Cytoplasma: Forskellige nuancer af lyserød Tabel 3 Gradering af HE snit 3 God morfologi/farveintensitet. 2 Acceptabel morfologi/farveintensitet 1 Forringet morfologi/farveintensitet. Ringe morfologi/farveintensitet. Succeskriteriet for HE-farvningen er en gradering på mindst 2. Gradering af IHC Ved IHC graderes farveintensiteten, samtidig med, at reaktionsmønstret for antistoffet også vurderes. Er der medtaget kontrol ved IHC, vurderes disse inden gradering. Kun hvis kontrolsnittene er godkendte, graderes snittene. Tabel 4 Gradering af IHC snit 3 Kraftig farve intensitet 2 Moderat farveintensitet. 1 Svag farveintensitet. Ingen farveintensitet. Succeskriteriet for immunfarvningen er en gradering på mindst 2. 17

Mikroskopering af snit Undervejs i forsøgsperioden mikroskoperede og graderede vi snittene. Vi valgte at gøre det hver for sig, for ikke at lade os påvirke af hinanden og på den måde få en individuel vurdering af snittene. Bagefter konfererede vi hinanden. Der blev mikroskoperet ved en forstørrelse på 4. Desuden mikroskoperede flere patologer og erfarne bioanalytikere også et udvalg af snittene, med henblik på, at bestemme om der var forskel på snittene fra de tre metoder. De graderede dog ikke snittene. Resultater I dette afsnit vises resultaterne for HE-farvningerne, IHC farvninger samt spørgeskemaerne. HE-farvning Resultater for blok 13C mangler, da vævsstykket forsvandt under vævspræpareringen, Resultater fra blok 13 vil derfor ikke indgå i den samlede vurdering. Tabel Samlet skema over vævets størrelse, fikseringstid og gradering af HE-snit. A, B og C står for henholdsvis VIP, PATHOS og Peloris. Tabellen fortsætter på næste side. Blo k nr. Væv Størrelse (mm) LxBxH 1 Blære 24x3x3 2x4x3 24x4x3 2 Blære 24x3x3 2x4x3 24x4x3 3 Blære 24x1x1 24x1x1 24x1x1 4 Uterus benign tumor Fikseringstid (timer,min.) Gradering af HEsnit Morfologi Intensitet A B C A B C A B C A B C 2x1x 1 22x1x 2 23x9x2 Uterus benign tumor 22x8x3 21x7x3 2x6x3 6 Uterus benign tumor 2x14x 3 21x9x3 22x1x 3 7 Mesoteliom 7xx3 6xx3 7xx3 8 Mesoteliom 9x6x1 7xx2 8xx2 26,1 26,1 26,1 2,4 2,4 2,4 2, 2, 16,4 16,4 16,4 16,1 16,1 16,1 1,3 1,3 16,4 16,4 16,4 16,1 16,1 16,1 1,3 1,3 3 3 3 3 2 2 18

Blo k nr. Væv Størrelse (mm) LxBxH 9 Hud fra mamma 29x4x3 29xx3 3xx3 1 Hud fra mamma 1x1x1 1x1x1 2x1x1 11 Hud fra mamma 6x6x3 7x6x3 4x4x3 12 Sarkom 6x6x3 6x6x3 xx3 13 Sarkom 4x4x2 4x4x2 14 Uterus 2x6x3 19x7x3 18x7x3 1 Uterus 23x4x3 18x4x3 18x8x3 16 Uterus 13x4x2 12xx2 9x4x2 17 Metastase i lymfe (mam) Fikseringstid (timer,min.) Gradering af HEsnit Morfologi Intensitet A B C A B C A B C A B C 12x4x2 1xx2 1x4x2 18 Hud fra mamma x7x4 x4x4 x6x4 19 Hud fra mamma x3x4 x7x4 xx4 2 Tumorvæv fra mamma 9xx2 6xx2 4x3x2 21 Fedt fra mamma 1x4x2 14x4x2 12x4x2 22 Fedt fra mamma 19x12x 2 2x11x 2 21x1x 2 23 Tumorvæv fra mamma 17x2x2 17x2x2 17x2x2 24 Tumorvæv fra mamma 6xx1 7xx1 7xx1 2 Tumorvæv fra mamma 2x2x2 2x2x2 2x2x2 26 Fedt fra mamma 1x2x2 19x2x2 21x2x1 27 Prostata 13x4x4 1x4x4 14x4x4 28 Prostata 6x4x4 7x4x4 6x4x4 29 Fedt fra mamma 1x1x1 14x1x1 14x1x1 3 Fedt fra mamma 17x9x3 21x9x3 31 Fedt fra mamma 2x1x 3 2x8x3 11x1x 3 18x9x3 32 Fedt fra mamma 17x3x3 1x4x3 12x3x3 33 Oment med metastase 21x11x 2 19x11x 2 17x12x 2 34 Oment med metastase 24x8x4 2x7x4 23x9x4 3 Oment med metastase 23x9x3 36 Rectum 37 Tarmkrøs 1x1x 3 22x17x 2 21x11x 3 1x1x 3 21x14x 2 19x12x 3 1x1x 3 2x1x 2 24, 24, 24, 23, 23, 22, 22, 22, 26,1 73, 73, 72, 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 2,3 27,2 8 27,2 8 73,3 73,3 73,3 73,3 73, 73, 73, 72, 72, 1,2 1,2 1,2 14,2 14,2 12,3 12,3 12,3 16,4 1,3 1,3 1,2 16, 16, 16, 16, 16, 16, 1, 8 1, 8 16, 16, 16, 16, 1,3 1,3 1,3 14,3 14,3 1,2 1,2 1,2 14,2 12,3 12,3 12,3 16,4 1,3 1,3 1,2 16, 16, 16, 16, 16, 16, 1, 8 1, 8 16, 16, 16, 16, 1,3 1,3 1,3 14,3 14,3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 2 2 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 2 2 3 3 3 3 3 19

Blo k nr. Væv Størrelse (mm) LxBxH 38 Hud fra mamma + fedt 19x4x3 17x3x3 16xx3 39 Fedt fra mamma xx2 6xx2 7x6x2 4 Fedt fra mamma 9x6x3 8x6x3 9x6x3 41 Fedt fra mamma 12xx1 7x4x1 11x4x1 42 Fibrom fra ovarie 1x4x1 1x4x1 1x4x1 43 Fibrom fra ovarie 14x3x1 12x2x1 12x2x1 Fikseringstid (timer,min.) Gradering af HEsnit Morfologi Intensitet A B C A B C A B C A B C 26,2 26,2 26,2 2,4 2,4 2,4 16, 16, 16, 16,1 16,1 16,1 16, 16, 16, 16,1 16,1 16,1 3 2 3 3 3 3 2

IHC Tabel 6 Gradering af IHC. Blok nr. Væv Gradering af IHC 7 Mesoteliom 2 2 3 3 3 3 8 Mesoteliom 3 3 2 3 3 3 Calretinin EMA ER HER-2 PgR PSA A B C A B C A B C A B C A B C A B C 17 Metastase i lymfeknude 2 3 3 2 3 2 3 3 2 2 Tumorvæv fra mamma 2 3 3 3 3 3 23 Tumorvæv fra mamma 2 3 3 2 3 2 3 3 3 24 Tumorvæv fra mamma 3 3 2 2 3 2 2 3 2 2 Tumorvæv fra mamma 2 2 2 2 2 2 2 27 Prostata 3 3 3 28 Prostata 3 3 3 Blok nr. Væv Gradering IHC 14 Uterus 2 3 3 CA12 Vimentin WT1 CD3 CD2 CK7 A B C A B C A B C A B C A B C A B C 17 Metastase i lymfeknude 3 3 3 18 Hud fra mamma 3 3 3 19 Hud fra mamma 3 3 3 2 Tumorvæv fra mamma 2 3 2 34 Oment med metastase 3 3 3 3 2 3 3 1 2 36 Rectum 3 3 3 Spørgeskemaundersøgelse Spørgeskemaernes resultater er grafisk afbilledet i figur 1 på næste side. Der blev i alt skåret og vurderet 129 blokke. Desuden var der tilknyttet følgende kommentarer: VIP: I to tilfælde, blev vævet beskrevet som hårdt. PATHOS: I to tilfælde blev vævet beskrevet som hårdt og i et andet, at vævet havde en tendens til at blive trykket sammen ved skæringen. 21

Peloris: I to fælde blev vævet blevet beskrevet som hårdt og i to andre, at vævet var lettere at skære end vævet i de to andre blokke. VIP PATHOS PELORIS 33% 2% 33% 2% 3% 3% 6% 6% 67% Nem at skære Ingen forskel Mere besværlig Nem at skære Ingen forskel Mere besværlig Nem at skære Ingen forskel Mere besværlig Figur 1 Grafisk afbildning af spørgeskema resultater Diskussion HE-farvede snit Vi har i vores forsøg lavet en række HE farvninger. Det viser sig, at der generelt ikke er nogen forskel på resultaterne fra de tre metoder. I resultaterne fra tabel ses det at 242 snit ud af 22 er graderet til 3 og kun 1 er graderet til 2. Dette ligger stadig inden for vores succeskriterium, som var på mindst 2. Ved graderingen af snittenes morfologi har 3 snit ud af 126, opnået graderingstallet 2 og de resterende snit har opnået 3. Ved intensiteten har 7 snit ud af 126 opnået graderingstallet 2 og de resterende snit har opnået 3. Hverken for morfologien eller ved farveintensiteten mener jeg, at der kan påvises noget egentligt mønster, med hensyn til, hvilken metode der er anvendt ved graderingen af de snit, der har opnået 2. VIP har opnået flere graderinger til 3 i forhold til både PATHOS og Peloris. Men ser man på snit blokkene 1, 2 og 3, der alle stammer fra samme væv og patient, og har haft samme betingelser med hensyn til størrelse og fikseringstid, er det kun snit fra blok 2B og 2C, der 22

er graderet til 2. Hvis der skulle have været påvist et mønster, skulle de to andre blokke have haft samme gradering. I en artikel af Rohr et al. [12] sammenlignes konventionel vævspræparering med vævspræparering, hvor der anvendes mikrobølger. Forsøget er udført med 18 tilfældigt udvalgt og parret prøvematerialer. Den konventionelle metode varede 12 timer og mikrobølge metoden 1 time. Man fandt frem til, at der ikke var nogen forskel på kvaliteten af de mikroskoperede snit. Ud af det samlede antal prøver var der for den konventionelle metode og mikrobølge metoden kun henholdsvis 8 og 7 prøver, der ikke levede op til deres fastlagte standard. Dette svarer stort set til resultatet af vores forsøg, hvor der heller ikke er ikke er nogen forskel på vævspræpareringen for henholdsvis VIP og PATHOS. Smidt [4] omtaler xylenfri vævspræparering på Peloris. Artiklen sammenligner vævspræparering på Peloris med konventionel vævspræparering. Præpareringstiden var på henholdsvis 9 og 16 timer. Ud fra HE-farvningerne i forsøget, konkluderer han, at der ingen forskel er på de to metoder. Det passer godt sammen med vores forsøg. Selvom præpareringstiderne afviger fra hinanden, viser resultaterne af vores HE-farvninger viser det samme, at der ingen forskel er på Peloris og den konventionelle metode. Ifølge Bingnold [13] kan fiksering med formalin og især ethanol føre til skrumpning og sammenklumpning af kromatinet i kernerne. Ethanol anvendes til dehydreringen i alle tre vævspræpareringer. Derfor er der risiko for, at der kan ske en blandingsfiksering, hvis ikke vævet er fuldt fikseret inden dehydreringen påbegyndes. Ethanol er et koagulerende fiksativ, der vil udfælde og åbne vævets native proteinstruktur. Fikseringstiderne for PATHOS og Peloris varierer fra 12 timer og 3 min til 16 timer og min. For VIP varierer fikseringen fra 22 timer og min til 73 timer og 3 min. Alt væv har været igennem en forholdsvis lang fiksering, inden dehydreringen er startet og der sås ingen forringede morfologiske ændringer i nogle af snittene. 23

IHC snit Der blev lavet IHC på i alt 96 snit, fordelt på 12 antistoffer. Ud fra resultaterne i tabel 6 viser der sig en klar tendens til, at snit fra blokke, der er præpareret på PATHOS, opnår en kraftigere farveintensitet. I 84 % af tilfældene har snit fra PATHOS opnået en gradering på 3. Hvor i mod VIP og Peloris har opnået henholdsvis 63 % og 66 % med graderingen 3. Det betyder dog ikke, at VIP og Peloris ikke har vist gode resultater, for stort set alle snit har opnået succeskriteriet på en gradering på mindst 2. Resultaterne fra PATHOS stemmer godt overens med, hvad både Morales et al. [9] og Leong [11] beskriver. Begge artikler sammenligner konventionel vævspræparering med vævspræparering, hvor der anvendes mikrobølger. Det fremgår at resultaterne for IHC, i begge tilfælde er bedre for mikrobølge vævspræparering end for den konventionelle vævspræparering. Lyon og Prentø [2] skriver at temperaturen for paraffin ikke bør overskride 6 C, da dette ellers vil påvirke vævets antigener og have en ødelæggende virkning på epitoperne. Både PATHOS og Peloris anvender paraffinbade hvor temperaturen er væsentlig højere end hvad der anbefales, henholdsvis 7 C og 8 C. Det kan forklare, hvorfor farveintensiteten for Peloris viser sig ikke at være så kraftig, men ikke hvorfor PATHOS opnår en kraftigere farveintensitet. På grund af PATHOS og Peloris høje paraffintemperatur, kan vævets ophold i paraffin forkortes væsentligt i forhold til VIP en. I stedet for 8 timer ved 8 C, får vævet godt en time ved høj temperatur. Det kunne tyde på at det ikke er temperaturen, men tiden vævet opholder sig i paraffinen, der har betydning for om epitoperne ødelægges. En årsag til at VIP ikke viser så kraftig farveintensitet som Peloris, kan være den længere fikseringstid. Werner et al. [11] diskuterer, hvordan fikseringstiden påvirker antigenerne. Lang fikseringstid medfører øget maskering af antigenerne, og det kan have indvirkning på den efterfølgende demaskering. Fikseringstiden for væv, der er præpareret på VIP, er minimum 1 timer længere end væv, der er præpareret på PATHOS eller Peloris. I enkelte tilfælde er tidsforskellen helt op til 7 timer længere. En så lang fiksering kan have forårsaget at den demaskering der normalt udføres på PA, ikke har været tilstrækkelig. Det er muligt, at der ved en ændring af eks. kogetiden i demaskeringen ville kunne ske en forbedring af farveintensiteten for VIP. 24

På figuren nedenunder ses et eksempel på de tre vævspræpareringsmetoders forskelle i farveintensiteterne. Vævet stammer uterus (blok 14A, B og C), det er farvet med antistoffet Vimentin og er graderet til 2, 3 og 3 for henholdsvis VIP, PATHOS og Peloris. A B C Figur 11 Figuren viser et eksempel på IHC med antistoffet Vimentin på blok 14 A, B og C ved forstørrelse 2. De tre snit fra blok 2 (PgR) er graderet -2-. Umiddelbart ser resultatet mystisk ud, idet der slet ingen reaktion fremkommer. Ser man på resultaterne fra HE-farvningerne fra samme blokke, ses det, at der er tumorceller i. Derfor burde der være sket en reaktion. En mulig forklaring er, at der ikke er blevet tilsat primært antistof til de to glas. Farvningen er foretaget på autostaineren. Der kan være sket en fejl i aflæsningen af stregkoden på glassene. Under alle omstændigheder burde vi have skåret nye snit og lavet IHC på dem igen, for på den måde at kunne udelukke, at det den manglende reaktion ikke skyldes, at der ingen tumorceller var i snittene. Spørgeskemaundersøgelse Formålet med spørgeskemaet var at give et billede af, hvordan blokkene fra de tre vævspræpareringsmetoder var at skære, i forhold til de blokke der skæres til dagligt på PA. Derfor var blokkene blindede, og kun benævnt med A, B og C. Designet af spørgeskemaet var dog ikke optimalt udformet, idet vi efterfølgende opdagede, at der hos enkelte af bioanalytikerne havde været tvivl angående, hvad det var, de skulle vurdere blokkene op i mod. Det er vigtigt, når et spørgeskema udleveres, at der ikke hersker tvivl omkring hvordan det skal udfyldes. I dette tilfælde har jeg vurderet, at denne usikkerhed ikke har haft indflydelse på den samlede bedømmelse af blokkene. Alle bioanalytikere, der deltog i spørgeskemaundersøgelsen, har god rutine i at skære blokke, og dermed erfaring med, hvordan blok- 2

ke generelt er at skære. Derfor mener jeg, at undersøgelsen giver et realistisk billede af, at der ikke var nogen forskel på, hvordan de tre metoders blokke var at skære. Ud fra diagrammerne på figur 1 ses det, at der ikke er den store forskel på fordelingen af spørgeskemaernes svar. VIP og PAHTHOS har samme procentsatser, og Peloris afviger kun med nogle få procenter. Fælles for alle tre metoder er at kun en meget lille del af blokkene er bedømt som værende mere besværlige at skære i forhold til de almindelige blokke fra VIP. (2 % for VIP, 2 % for PATHOS og 3 % for Peloris). Selvom Peloris har en højere %-del, der er mere besværlig at skære, mener jeg dog ikke, det betyder at Peloris blokkene er dårligere, end de andre blokke, dertil er det for lille en forskel. Derimod mener jeg, det tydeligt fremgår, at der ikke har været mere besværligt at skære nogen af blokkene, i forhold til de VIP-blokke der normalt bliver skåret. Prøvestørrelse En svaghed ved vores forsøg var, at flere af prøverne ikke havde samme størrelse. Vi delte selv prøverne i tre stykker, men hos enkelte af de delte prøver afveg størrelsen med op til flere mm. En anden svaghed var at når et vævsstykke deles i tre stykker, kan det ikke med sikkerhed vides, om der er de samme celler i alle tre stykker. Vi kunne have valgt, at anvende en udstanse til at dele vævsstykkerne med. På den måde ville vævstykkerne få præcis den samme størrelse. Samtidig ville det være muligt at udtage stykker tæt på hinanden, og dermed øge chancen for at få det samme cellebillede. Konklusion Succeskriteriet for både HE-farvning og IHC var at der skulle opnås en gradering på mindst to. Da det med undtagelse af nogle ganske få tilfælde, var gældende for alle snit, kan jeg på baggrund af mine resultater konkludere at vævspræpareringstiden kan forkortes, ved at anvende PATHOS og Peloris, uden at den gyldne standard forringes. Dette er dog kun gældende for vævstyper og antistoffer præpareret ved i 4 timer. 26

Perspektivering I vores forsøg har vi haft den begrænsning, at vi i løbet af indsamlingsperioden kun fik mulighed for at afprøve et mindre antal forskellige vævstyper. Hvis vævspræpareringen på PA fremover skal foregå på enten PATHOS eller Peloris, vil det derfor være nødvendigt at udføre forsøg med flere forskellige vævstyper. Heriblandt også mere sarte væv som f.eks. lymfe og testis. Det kunne være en mulighed at afprøve andre program tider. Ved 4 timer er der ingen forskel på vævspræpareringen, muligvis kan man gå længere ned i tid. Man kunne afprøve om det var muligt at udføre vævspræpareringen ved 2 eller 3 timer. Vi valgte ikke at medtage specialfarvninger og FISH i vores forsøg på grund af tidsmangel, men det er en nødvendighed også at lave forsøg med disse to, for at kunne godkende PATHOS og Peloris som vævspræpareringsmetoder. Vi anvendte 12 antistoffer i forsøget, men da det kun er en brøkdel af de antistoffer der anvendes på PA, vil det være nødvendigt at lave forsøg med mange flere antistoffer. Mette Bang Nyholm 27

Referencer [1] Boon, M. E., Kok, L.P. (1989) Microwave Cookbook of Pathology, (second revised edition). Leiden: Coulomb Press Leyden. s. 18. [2] Lyon H., Prentø P. (22) Kompendium i kemiske og biokemiske analyseprincipper København: Bioanalytikeruddannelsen i København. Afsnit A s. 1-29 og Afsnit B s. 3, 3, 6-7. [3] Vyberg M. (2) Anvendt Immunhistokemi, (6.udgave). København: Bionanalytikeruddannelsen i København. s. 37, 41-42. [4] Leica Microsystems, Smith, J. (28) Xylene-free Tissue Processing An Evaluation of Routine Use. Lokaliseret d. 19. marts 29 på http://www.leica-microsystems.com [] Statens serum institut. (28) Beskrivelse af pakkeforløb. Lokaliseret d. 2. februar 29 på http://www.sst.dk/planlaegning_og_behandling/planer_indsatser/kraeft/task_force_ for_kraeftomraadet/beskrivelse_af_pakkeforloeb.aspx?lang=da [6] Brugerhåndbog Peloris TM Vævsprocessor, Leica Microsystems, Leica Biosystems Melbourne Pty Ltd 27 s.19-21. [7] Milestone. (28) Welcome to PATHOS: The future is here. Automatic, rapid microwave enhanced histoprocessor. Lokaliseret d. 1. oktober 28 på http://www.milestonemedsrl.com/histopathology/products/pathos/how_works.html [8] Miles inc. (1993) Tissue-Tek V.I.P. TH Vacuum Infiltration Processor E1/3 series. Operating Manuel, (first edition). section 1 og A. [9] Morales, A. R. et al. (24). Experience With an Automated Microwave-Assisted Rapid Tissue Processing Method: Validation of Histologic Quality and Impact on the 28

Timelines of Diagnostic Surgical Pathology. American Journal of Clinical Patholgy, (121), 28-36. [1] Leong, A. S. Y. (24). Microwaves and Turnaround Times in Histoprocessing: Is This a New a Era in Histotechnology. American Journal Clinical Pathology, (121), 46-462. [11] Werner M. et al. (2) Effect of Formalin Tissue Fixation and Processing on immunohistochemistry, 24(7), 116-119. [12] Rohr, L. R. et al. (21). A Comparison of Routine and Rapid Microwave Tissue Processing in a Surgical Pathology Laboratory: Quality of Histologic Sections and Advantages of Microwave Processing. American Journal of Clinical Patholgy, (11), 73-78. [13] Bingnold, L. P. (22) Hypothesis for the influense of fixatives on the chromatin pat terns of interphase nuclei, base don shrinkage and retraction of nuclear and peri nuclear structures. British Journal of Biomedical Science, (9) 2, 1-113. 29

Bilagsfortegnelse Bilag 1: Spørgeskema Bilag 2: Forskrift for HE-farvning Bilag 3: HE opskrift Bilag 4: Forskrift Immun-farvning 3

Bilag 1 Spørgeskema Blok nr.(1,2,3 osv.): Hvordan er blokken at skære, i forhold til de almindelige blokke? A B C Nem at skære Nem at skære Nem at skære Ingen forskel Ingen forskel Ingen forskel Mere besværlig Mere besværlig Mere besværlig Evt. kommentarer: TAK! Hilsen Mette og Maria, 7. Semester 31

Bilag 2 32

Bilag 3 33

34

Bilag 4 3