Professionsionsbachelorprojekt, modul 14. Udarbejdet af Asmaa Ismail Dallal University College Lillebælt Studienr.

Sammenligning af E-test og vancomycin antibiotikatabletten fra Rosco med en valgt opsætning af real-time PCR, som golden standard, ved detektion af vancomycinresistente Enterococcus med vana, vanb og vanc. Comparison of E-test and vancomycin antibiotic tablet from Rosco with a selected setup of real time PCR, as golden standard, for the detection of vancomycinresistant Enterococcus with vana vanb and vanc. Professionsionsbachelorprojekt, modul 14 Udarbejdet af Asmaa Ismail Dallal University College Lillebælt Studienr.: 32110516, SB5011 Vejledere: Klinisk vejleder: Sanne Malig, bioanalytikerunderviser,, Odense Universitetshospital Teoretisk vejleder: Charlotte Birk Olsen, bioanalytikerunderviser, University College Lillebælt Projekt udført i samarbejde med: Reem Kazem & Sara Ismail Dallal Projektperiode: 6. oktober 19. december 2014 Antal anslag: 56.197

Resumé Introduktion. Resistens overfor især vancomycin, er særlig bekymring hos Enterococcus, da efterlader få behandlingsmuligheder. Der er blevet påvist forskellige genotyper af vancomycinresistente Enterococcus (VRE), herunder VanA, VanB og VanC, hvoraf VanA og VanB er de mest kliniske relevante. Den mindst hæmmende koncentration (MIC) ved sensitive Enterococcus ligger på 4 mg/l. Derfor kan identifikationen af VanB Enterococcus-stammer med en MIC-værdi på 4 mg/l være vanskelige, hvorved VRE kan diagnosticeres værende sensitive i stedet for resistente, og patienten kan blive fejlbehandlet. Det kan derfor være interessant at undersøge en metode med høj sensitivitet og specificitet, hvorved fejldiagnosticering kan undgås. Til dette formål kan det være interessant at undersøge, den genotypiske analysemetode, real time PCR s anvendelighed. Formål. Et tidligere studie har vist uoverensstemmelse mellem de fænotypiske test, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, der anvendes i forbindelse med identifikation af VRE. Det kan derfor være interessant, at sammenligne disse fænotypiske test, ved hjælp af en valgt opsætning af Real time PCR, som efterfølgende anvendes som golden standard. Materialer og metoder. Der blev i nærværende studie anvendt 7 kontrolstammer, afprøvet på forskellige assays, i forbindelse med opsætning af real-time PCR. Efterfølgende blev 64 Enterococcus-stammer fra blod undersøgt vha. real-time PCR, som golden standard. Resultater. Ved sammenligning af E-test og ulden/ikke ulden fænomenet med real time PCR, er der opnået en sensitivitet og specificitet for E-test på 100 %. For ulden/ikke ulden fænomenet er sensitiviteten på 100 % og specificiteten på 80 %. Konklusion. Det anbefales, at der i forbindelse med detektion af VRE i rutinediagnostikken, udføres real time PCR sammen med den fænotypiske test, E-test fra Biomerieux, ved ampicillinresistens. Side 1 af 44

Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet i perioden 6. oktober 19. december 2014, på bioanalytikeruddannelsen, University College Lillebælt. Projektets praktiske del er udført på (KMA), Odense Universitetshospital (OUH). Følgende rapport henvender sig til studerende, undervisere, bioanalytikere og ikke mindst Kliniske Mikrobiologiske Afdelinger, samt andre interesserede. Jeg vil gerne komme med en speciel tak til medstuderende, Reem Kazem og Sara Dallal, for et godt teamarbejde under projektet. Desuden vil jeg gerne takke min klinisk vejleder Sanne Malig, bioanalytikerunderviser, KMA, OUH og min teoretisk vejleder, Charlotte Birk Olsen, bioanalytikerunderviser, University College Lillebælt, for råd og vejledning under hele projektforløbet. Jeg vil også takke bioanalytikeren, KMA, OUH, Louise Hjelmsted Pedersen og Elisa Knudsen samt molekylærbiologen på KMA, OUH, Silje Vermedal Høgh, for råd og vejledning under den praktiske del af projektet. Sidst men ikke mindst vil jeg gerne komme med en tak, til min mor, Samar Omayri samt min mand, Bassam Abdul-Latif, for stor støtte under hele uddannelsesforløbet og specielt under projektperioden. Asmaa Ismail Dallal December 2014 Side 2 af 44

Indholdsfortegnelse RESUMÉ... 1 FORORD... 2 INTRODUKTION... 5 Problemformulering... 8 Real time PCR... 8 Analyseprincip... 8 Resistensbestemmelse ved EUCAST agardiffusionsmetoder:... 9 Rosco... 9 E-test... 10 Metodiske overvejelser... 10 MATERIALER OG METODER... 12 Materialer... 12 Prøvematerialer... 12 Apparatur... 13 Utensilier... 13 Reagenser... 13 Metoder... 14 Del 1 Klargøring af stammer... 14 Del 2 Klargøring af DNA... 14 Del 3 Real time PCR... 14 Litteratursøgning... 15 RESULTATER... 15 DISKUSSION... 18 Opsætning af real-time PCR... 18 Vurdering af E-tests anvendelighed sammenlignet med real time PCR... 22 Vurdering af ulden/ ikke ulden fænomenet sammenlignet med real time PCR... 25 KONKLUSION... 27 PERSPEKTIVERING... 27 LITTERATUR... 28 BILAG... 32 Bilag 1 Svar fra elektronisk spørgeundersøgelse... 32 Side 3 af 44

Bilag 2 Liste over 65 Enterococcus-stammer... 34 Bilag 3 Eksempel på et PCR-pladelayout... 36 Bilag 4 Tabeller over ct-værdier, samt middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af forskellige assays... 36 Bilag 5 Rådata... 39 Bilag 6 Udregninger til tabel 3... 40 Bilag 7 ct-værdier i dobbeltbestemmelser opnået ved undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer vha. real time PCR... 42 Side 4 af 44

Introduktion Der ses efterhånden flere og flere modstandsdygtige bakterier der udvikler resistens overfor antibiotika. Denne resistensudvikling kan blandt andet forklares ved sundhedsvæsenets øgede forbrug af antibiotika, hvilket kan få fatale konsekvenser i form af udvikling af dødelige infektioner grundet begrænsede behandlingsmuligheder [1]. Ifølge Danish Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Program (DANMAP) er der sket en stigning i det totale forbrug af antibiotika, til mennesker i Danmark [1]. Det er derfor, ifølge DANMAP, vigtigt at følge udviklingen i antimikrobiel resistens og forbruget af antibiotika, med henblik på at identificere de risikofaktorer, der bidrager til udbredelsen af resistens og samspillet mellem risikofaktorerne [1]. Blandt modstandsdygtige bakterier kan der peges på Enterococcus. Enterococcus har vist sig som værende vigtige nosokomielle patogener med evne til at forårsage en række infektioner og deres bemærkelsesværdig resistensevne over for mange antibiotika, har gjort behandlingen af infektioner forårsaget af Enterococcus-arter vanskelig. Infektioner grundet Enterococcus skyldes oftest Enterococcus faecium og Enterococcus faecalis, som typisk er infektioner i urinveje, sepsis og endokarditis [2,3,4,5]. I 2013 er der i Danmark detekteret 3,4 % vancomycin resistente hos E. faecium og 0,2 % hos E. faecalis [1]. Resistens overfor især vancomycin, er særlig bekymring hos Enterococcus [2,3,6]. Enterococcus er grampositive, katalse negative, fakultative anerobe kokker, som lejres i kæder af forskellige længder. De er karakteriseret ved at vokse godt på blodagerplader og have en diameter på mindre end 1 µ. Mikroskopisk set, er Enterococcus ubevægelige og har en oval til en rund celleform [7,8]. Enterococcus er en del af normalfloraen i tarmen, men er opportunistiske bakterier. De er meget robuste og har derfor en særlig hårdfør overlevelsesevne i organismer og andre miljøer, herunder høje ph-værdier og en saltkoncentration på 6,9 %. Desuden er de i stand til at overleve ved en lang række temperaturer fra 10 o C til > 45 o C, med et temperaturoptimum på 35-37 o C [6,7,8,9,10]. Enterococcus overlevelsesevne skyldes deres medfødte resistens overfor mange almen anvendte antibiotikum. Denne øgede resistens skyldes bl.a. deres evne til at erhverve nye resistensgener, via mutation og plasmid overførsel. Disse resistensmønstre efterlader få behandlingsmuligheder, som forklarer det stigende globale problem med resistente Enterococcus [5,8]. Resistens mod antimikrobielle midler inddeles i to forskellige typer en medfødt eller erhvervet resistens [5,10]. Side 5 af 44

I forbindelse med den medfødte resistens, er der tale om en mikroorganisme, der mangler strukturer eller metaboliske processer som antimikrobielle midler ellers ville virke imod, derfor vil en mikroorganisme med disse mangler være upåvirkelig af midlet og dermed resistent. I modsætning hertil skyldes det erhvervede resistens, genetiske forandringer, såsom mutation i mikrobens eget kromosom eller ekstra ekstern DNA tilførsel, hos mikroorganismer som primært er følsomme [10]. Enterococcus er blandt andet karakteriseret ved, at bære et medfødt egenskab med relativ modstand til betalaktam-antibiotika, herunder penicillin og ampicillin, som synes at være på grund af lav affinitet for penicillinbindende proteiner (PBP) [7,10]. Dog er E. faecium mere resistent for vancomycin og ampicillin sammenlignet med E. faecalis [7]. Enterococcus-arterne E. faecium og E. faecalis, som er de to hyppigste arter forbundet med humane infektioner [2,3,5], har både medfødt og erhvervede resistens mod aminoglykosider, der forhindrer proteinsyntesen i ribosomerne [8]. Beta-laktamantibiotikas kemiske struktur består af en beta-laktamring, som typisk er bundet en anden ringstruktur, hvilket er forklaringen på den lange række undergrupper af betalaktamantibiotika. Beta-laktamantibiotika hæmmer enzymer i cellembranen som er involveret i dannelsen af peptidoglykan, som beta-laktamantibiotika binder sig kovalent til, deraf navnet pencillin-bindende proteiner (PBP). Fastgørelse af beta-laktam agenter til PBP resulterer i nedsat cellevægsyntese og i de fleste tilfælde, celledød [4,5,8]. Efter en stigende fremkomst af antibiotika resistente Enterococcus mod beta-laktam antibiotika og høje koncentrationer af aminoglykosider, blev vancomycin anvendt som et alternativ til ampicillin og som primær behandling hos patienter med alvorlig allergi over for beta-laktamer [7]. Det fortsatte indtil en væsentlig terapeutisk bekymring meldte sig i forbindelse med opdagelsen af vancomycin resistente Enterococcus (VRE) i 1980 erne, og endte med at blive et problem i flere lande, dog mest udbredt i USA[2,7]. VRE blev opdaget i Europa i 1987, og inden for 10 år blev de nogle af de mest frygtede opportunister på USA s hospitaler [2]. I 2007 blev der målt en stigning af vancomycinresistente E. faecium i USA på mere end 80 %, sammenlignet med starten af 1980 erne, hvor den var på 0 %. Vancomycinresistente E. faecalis udgjorde kun 5 % af stammerne [7]. I Europa blev der set en stor variation i antallet af VRE. I lande som Grækenland og Irland blev den eksempelvis målt til >30 %, mens de i Skandinavien blot var på omkring 1 %. Dog blev der i Sverige i perioden 2007-2009 sammenlignet med perioden 2000-2006, set en firedoblet stigning i infektioner grundet VRE [7]. Side 6 af 44

Vancomycin er et meget stærkt glykopeptidantibiotika, der anvendes mod patogene gram positive bakterieinfektioner [5,11]. Vancomycins resistensmekanisme ligger i hæmningen af cellevægsyntese, ved at danne tætte komplekser med D-alanyl-D-alanin (D-Ala-D-Ala) af peptidoglykan på celleoverfladen og har høj affinitet for vancomycin. Enterococcus resistens overfor vancomycin bygger på følgende forklaringen: udskiftning af D-Alanin (D-Ala) med D- lactat (D-lac), som resulterer i fjernelse af en af de fem hydrogenbindinger, der ellers ville blive etableret mellem vancomycin og D-Ala-D-Ala-komplekset. Det nydannede kompleks, D-Ala-D-lac, vil hermed binde med lavere affinitet til vancomycin[4,6,8]. Der er blevet påvist 6 forskellige genotyper af VRE kaldet, Van A, B, C, D, E og G. VanB inddeles i tre undertyper; vanb1, vanb2 og vanb3, hvor vanb2 er den hyppigst forekommende [13]. Ligeledes inddeles vanc i undertyperne vanc1 og vanc2/3 [11]. Van A og Van B er de mest kliniske relevante genotyper, der typisk er forbundet med E. faecium og E. faecalis [2,6,9,11]. Dog er E. faecium mere resistent for vancomycin og ampicillin sammenlignet med E. faecalis. VanA og vanb er koblet nogle transposoner og kan derfor nemt overføres fra en til anden bakterie, dermed kan voncomycinresistens erhverves af nye bakterier [12]. I modsætning hertil står VanC, som på grund af sin tilknytning til kromosomerne, ikke er i stand til at blive overført til andre bakterier. VanC ses ved enterokokartene E. gallinarum og E. casseliflavus, som er mindre problematiske i forhold til overførsel af resistensgener, sammenlignet med arterne E. faecalis og E. faecium [2]. De forskellige genotyper af VRE adskiller sig også fænotypisk, ved at have forskellige mindste hæmmende koncentrationer, kaldet, minimal inhibitory concentration, MIC, hvilket giver dem forskellige resistensevner. MIC angiver en bakteries følsomhed for et antibiotikum ved netop at angive midlets laveste koncentration der skal til, for at hæmme væksten af den aktuelle bakterie. MIC opgives i mg/l [4]. VanA har en high-level resistens for vancomycin, med en værdi på 16-512 mg/l sammenlignet med vanb, der har en MIC-værdi på 4-64 mg/l og har derfor en low-level resistens. Desuden er det kun vana blandt de to gener, der udviser resistens overfor glykopeptidet teicoplanin [12]. MIC-grænsen for sensitive Enterococcus ligger på 4 mg/l [14]. På (KMA), Odense Universitetshospital (OUH), identificeres Enterococcus, fænotypisk med Matrix-Assisted Laser Desorption Inization Time Of Flight (MALDI-TOF), efterfulgt af agardiffusionsmetoden, med antibiotikatabletter fra Rosco, baseret på EUCAST retningslinjer, til resistensbestemmelse. Vancomycintabletten medtages ikke i denne Side 7 af 44

forbindelse. I tilfælde af ampicillinresistente Enterococcus, laves MIC-bestemmelse vha. E-test fra Biomerieux for vancomycin [15], med henblik på påvisning af vancomycinresistens. Ved detektion af resistens for vancomycin, sendes VRE til Statens Serum Institut (SSI) til overvågning [15]. I det bioanalytiske arbejde er det vigtigt altid at have patienten i fokus, derfor er det ideelt, at overveje mulighederne for udvikling og effektivisering af anvendte analysemetoder til detektionen af VRE, således at patienten modtager bedst mulig diagnose og behandling. Et tidligere studie, udført på KMA, OUH, havde til formål, at sammenligne de fænotypiske test til påvisning af VRE hos Enterococcus-stammer fra blod, med E-test som golden standard [16]. Sidstnævnt studie har vist uoverensstemmelse mellem de fænotypiske test, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. E-test er en koncentrationsgradient af topisk antibiotikum, hvorved der opnås en MIC-værdi. I nærværende rapport er den benævnte E-test, betegnelse for, E-test for vancomycin fra Biomeriux. Ulden/ikke ulden fænomenet, vil i næreværende rapport være betegnelse for agardiffusionsmetoden med vancomycintabletten fra Rosco, til vurdering af zone kantens udseende, ulden/ ikke ulden. Det kan være interessant, at sammenligne E-test og ulden/ikke ulden fænomenet med en valgt opsætning af real time PCR, der efterfølgende anvendes som golden standard i projektet. Problemformulering Hvordan kan real time PCR, efter opsætning heraf, indgå i rutinediagnostikken af vancomycinresistente Enterococcus med vana, vanb og vanc, og hvordan er sensitiviteten og specificiteten for E-test og ulden/ikke ulden fænomenet ved detektion af vancomycinresistente Enterococcus overfor real time PCR som golden standard? Real time PCR Real time PCR er en kvantitativ molekylær biologisk analysemetode, der anvendes i forbindelse med undersøgelse af ekstraheret DNA eller RNA. Med denne analysemetode opnås en præcis mængdebestemmelse af DNA-target, altså kopiantal af DNA [17]. Analyseprincip Analyseprincippet ved real time PCR bygger på samme grundlag som i standard PCR, hvor prøvematerialet undergår tre temperaturafhængige trin; denaturering, annealing (hybridisering) og elongering (DNA-syntese), som udgør et PCR cyklus. Ved real time PCR bliver mængden af PCR produktet kvantificeret efter hver cyklus vha. en TaqMan probe [17]. Side 8 af 44

Ved denatureingsfasen, denatureres den dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenget. Denne fase foregår ved 95 C. Ved næste fase, annealings fasen, bliver det dobbeltstrengede DNA genskabt ved, at syntetisk fremstillede DNA stykker, kaldet forward- og reverse primer, binder til hver af de to enkeltstrengede DNA. Denne fase foregår ved en temperatur på 54 C. Ved den sidste fase, elongerings fasen, sker DNA-syntesen. Her sker opformeringen af DNA, ved at DNA polymerasen påsætter nukleotider på den komplementære DNA streng. Denne fase foregår ved 72 C [17]. Ved annealings fasen binder TaqMan proben sig til det komplementære DNA og fjernes ved mødet med DNA polymerasen, så den ikke længere forhindrer DNA syntesen. TaqMan proben består af en kæde på 20-30 nukleotider. I 5 enden af proben sidder en reporter (R), som er et fluorescerende farvestof, mens 3 enden af proben er bundet til farvestoffet quencheren (Q). Ved mødet med DNA polymerasen og TaqMan-proben, bliver R og Q adskilt fra hinanden, herved udsendes et fluorescerende signal. Mængden af fluorescerende signal er proportional med PCR produktet, og måles løbende ved hjælp af en detektor, som afspejler hvor meget PCR produkt, der er blevet replikeret under hver cyklus [17,18,19] Ved en real time PCR reaktion afbildes resultaterne som en amplifikationskurve med antal cyklusser på x-aksen og DNA mængden på y-aksen. Der fastsættes en tærskelværdi på kurven. Den cyklus hvor tærskelværdien nås, kaldes cycle treshold (ct-værdi). Resistensbestemmelse ved EUCAST agardiffusionsmetoder: Rosco Ved resistentsbestemmelse med antibiotikatablet fra Rosco, inkuberes pladen i 24 timer. Antibiotikatabletten, der er påsat en inokulumtilsåede agarplade vil begynde at diffundere ud i agaren, her kan der opstå en hæmningszone, i tilfælde af bakterien er sensitiv for det anvendte antibiotikum [20]. Aflæsningen af hæmningszonen sker ved måling af zonediameteren af den komplette hæmning omring tabletten [14]. Ifølge EUCAST vurderes en bakterie værende vancomycinsensitiv med en zonestørrelse på 12 mm, mens vancomycinresistente bakterier vurderes ved en zonestørrelse på 12 mm. [14]. Ved resistensbestemmelse af visse antibiotika, herunder vancomycin, kan det ifølge EUCAST, ikke nøjes med måling af zonestørrelsen. Her skal hæmningszonen også vurderes udefra zonens kant, ved undersøgelses af ulden/ikke ulden fænomenet. Zonekanten ved voncomycinresistens vurderes værende ulden, hvoraf der ses en uskarp afgrænsning af zonekanten og evt. kolonier inde i hæmningszonen. Dette betyder, på trods af en stor Side 9 af 44

måling af zonediameteren, vil bakterien stadig vurderes at være vancomycin-resistent. Ved en sensitiv bakterie for vancomycin, ses der derimod en skarp zonekant, kaldet ikke ulden [21]. E-test E-test er en metode der angiver en direkte kvantificering af antimikrobiel følsomhed af mikroorganismer [22]. E-test er en plastik strip på 50 mm, indeholdende 15 forskellige MICværdier i en dobbeltfortynding [22,23]. På den ene side af E-teststrippen er der imprægneret en stigende antibiotikagradient koncentration, mens der på den anden side er afmærket, en MIC-skala med stigende antibiotikakoncentrationer, der aflæses i ug/ml, herunder intervaller med dobbeltfortyndinger [24]. Der er i toppen af E-teststrippen angivet det pågældende antibiotikum som ønskes undersøgt, fx vancomycin. Resistensbestemmelsen ved E-test udføres ved at strippen lægges på en inokulumtilsået agarplade, hvorved antibiotika begynder at diffundere ud i pladen. Efter inkubation kan MIC-værdien aflæses ved skæringspunktet af den nedre del af den nu evt. opstået ellipseformet hæmningszone, med det tilsvarende tal på teststrimlen [22,23,24,25]. Til vurdering af MIC-værdierne tages der udgangspunkt i breakpoints SIR, hvilket er grænseværdier, der anvendes som et udtryk for, hvorvidt bakterien er sensitiv (S), intermediær (I) eller resistens (R) [14]. For vancomycin er bakterien sensitiv ved 4 mg/l og resistens ved > 4 mg/l[14]. Metodiske overvejelser Projektet er en retrospektiv kvantitativ undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer fra blod og 4 kendte VRE kontrolstammer. Nærværende projektforsøg basseres på en opsætning af real time PCR, der har til formål, at detektere tilstedeværelse af tre vancomycin resistensgener, vana, vanb og vanc, i en kollektion af 64 Enterococcus-stammer isoleret fra blod, samt 4 kendte VRE kontrolstammer, for de pågældende gener. De fremkommende resultater sammenlignes med resultater fra de fænotypiske test, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, som i det tidligere studie er udført på samme 64 Enterococcusstammer [16]. Opsætningen af real time PCR har til formål, at undersøge det bedste primerprobesæt (assay) og bedste kontrolstamme for generne vana, vanb, vanc og vanc2/3, med den hensigt at blive anvendt som den positive kontrol. Desuden har opsætningen af real time PCR være til hjælp, ved udvælgelse af den bedste interne kontrol til test af alle stammer, anvendt i projektforsøget. Real time PCR opsætningen tog udgangspunkt i to assays, begge indeholdende en forward- og en reverse primer og en probe for hver af vana, vanb og vanc og et assay for de to interne kontroller Side 10 af 44

23S og 16S, der har til opgave at kontrollere, at der er DNA tilstede, der kan opformeres. Desuden skal de 2 interne kontroller, kontrollere der ikke er for mange hæmmende stoffer til stede. Den interne kontrol 23S, er specifik for Enterococcus, mens den interne kontrol, 16S indeholder ribosomale RNA gener, som findes alle bakteriegenomer, og er derfor ikke speciesspecifikt. Det ene assay for vana, vanb, og assays for vanc1, vanc2/3 og for den interne kontrol, 16S, blev designet på KMA, OUH (inhouse-1) vha. et elektronisk blastings program (NCBI primer-blast). Det andet vana- og vanb assay blev udvalgt ud fra studiet, Fang H. et. al. [26], mens et studie af Ryu Hodon et. al [27], blev anvendt til udvælgelse af den interne kontrol 23S. De sidste to nævnte assays, der er udvalgt fra studier, vil følgende blive omtalt for inhouse-2. Samtlige assays kørte efter samme PCR proces og hver enkelt blev afprøvet på samme 7 kendte VRE kontrolstammer. De bedste assays for generne og de interne kontrolstammer blev vurderet og efterfølgende valgt, på baggrund af de udkommende amplifikationskurver og ct-værdier opnået efter kørsel af real time PCR. Desuden blev 4 af de 7 kontrolstammer, valgt som positive kontroller. I næreværende studie blev real time PCR valgt som analysemetode, grundet flere fordele i forhold til andre PCR analysemetoder. Først og fremmest er real time PCR yderst anvendelige, i forbindelse med bestemmelse af kendte gener [5,28]. Desuden er real time PCR mindre tidskrævende, da der ikke er noget postanalytisk arbejde forbundet med det, såsom kørsel af gel-elektroforese, som ved standard PCR, og derfor mindre kontaminering ved real time PCR. Desuden er real time PCR mere specifik og der opnås mere sensitive og reproducerbare resultater [5,28,29]. Til behandling af resultaterne i næreværende studie, er der anvendt deskriptive statisk ved beregning af sensitiviteten, der angiver en metodes evne til at angive antal sande positive resultater og specificiteten, som betegner metodens evne til at angive antal sande negative resultater, ved hjælp af følgende formler [30]: Sensitivitet = Antal sande positive Antal sande positive + antal falske negative 100 % Specificitet = Antal sande negative Antal sande neagtive + antal falske positive 100 % Ved beregningen af sensitiviteter og specificiteter er følgende begreber blevet defineret: Side 11 af 44

Sandt positiv (SP) angiver, at der ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet er enighed om resistens med real time PCR, Falsk positiv (FP) angiver, at den pågældende stamme er resistent ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet, men sensitiv ved real time PCR, Sandt negativ (SN) angiver, at der ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet er enighed om sensitivitet med real time PCR Falsk negativ (FN) angiver, at den pågældende stamme er sensitiv ved hhv. E-test og/eller ulden/ikke ulden fænomenet, men resistent ved real time PCR. Yderligere blev der i næreværende studie undersøgt, hvilke fænotypiske metoder andre Kliniske Mikrobiologiske Afdelinger i Danmark anvender til detektion af VRE, til sammenligning med projektets resultater. Følgende sygehuse er adspurgt; Slagelse- Nykøbing Falster sygehus, Regionshospitalet Viborg, Aalborg- og Skejby sygehus (bilag 1). Materialer og metoder Materialer Prøvematerialer Til opsætning af real time PCR er følgende assays og 7 VRE kontrolstammer blevet anvendt; De 7 kendte VRE kontrolstammer blev udleveret fra KMA, Skejby og Statens Serum Institut (SSI), og besår af: E. faecium vana (1) (A ATCCA 51559), E. faecium vana (2)(B 700221), E. faecium vanb (N-AST 4), E. faecalis vanb1 (N-AST 9), E. faecium vanb2 (N-AST 5), E. gallinarum vanc1 (G ATCC 49 573) og E. casseliflavus vanc2 (H ATCC 12 755). Følgende er in-house 1 assays (designet på KMA, OUH); vana_svh forward CAGGAAGTCGAGCCGGAAA, vana_svh reverse GGTCTGCGGGAACGGTTAT og vana_svh probe FAM-AGGCTCTGAAAACGCAGT-MBG, vanb_svf forward GGTAACGAGGATGATTTGATTG, vanb_svh reverse CGTGGCTCATCCGGATT og vanb-svh probe VIC-CGGCGAAGTGGATC-MBG, vanc1 forward GAAATTGGCTGCGGCATCT, vanc1 reverse TCGCATCACAAGCACCAATC og vanc1 probe FAM-AGGAAATGAGCAATTGA-MGB, vanc2/3 forward GATCGGTTGCGGTATTTTGG, vanc2/3 reverse TGAAATGGCGTCACAAGCA og vanc2/3 Side 12 af 44

probe VIA-CAACGACTCTTTGACTGTC-MGB, 16S forward CCAGAAAGCCACGGCTAACT, 16S reverse CGCTTGCCACCTACGTATTACC og 16S probe FAM-CGTGCCAGCAGCC-MGB. Følgende er in-house 2 assays (fra studier); vana forward AGTCAATACTCTGCCCGGTTTC, vana reverse GCAGCGGCCATCATACG og vana probe FAM-CGTCATCATACAGTCGTTATC-MGB, vanb forward TCCGGTCGAGGAACGAAA, vanb reverse GCCCTCTGCATCCAAGCA og vanb probe VIC- ACGGCAAAGAAAGTATATC-MGB, 23S forward AGAAATTCCAAACGAACTTG, 23S reverse CAGTGCTCTACCTCCATCATT og 23S probe FAM- TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA-BHQ1. Opsætningen af real time PCR blev anvendt til undersøgelse af følgende 64 Enterococcus-stammer: 19 E. faecium, 9 E. faealis, 6 Enterococcus durans, 5 Enterococcus avium, 5 E. gallinarum, 5 E. casseliflavus, 4 E. casseliflavus/gallinarum, 3 Enterococcus raffinosus, 2 E. avium/raffinosus, 2 Enterococcus hirae/faecium/durans, 1 Enterococcus hirae/durans/faecium, 1 Enterococcus dispar, 1 Enterococcus gilvus/maldoratus, 1 Enterococcus mundtii og 1 Enterococcus pseudoavium (Bilag 2). Apparatur 7500 Fast real time PCR system blev anvendt til analyse af prøvematerialerne, til inkubation af renkulturerne blev 35 C termostat KMA-4 anvendt, fra køleskab KMA-999 blev tubes med sterilt vand udtaget, mens køleskabet KMA-49 blev anvendt til opbevaring af tubes med bakterieafkog. Herudover blev anvendt mikrocentrifuge KMA-22, automatpipetter til fremstilling af Mastermix, Eppendorf Termostat Plus KMA-745 blev anvendt til kogning af Enterococcus og stopur i forbindelse med kogningen. Utensilier PCR-plade, pipetter, filterpipettespidser, 1½ ml mikrocentrifugerør, køleblokke, 5 % blodagarplader (SSI), 1μL øjepodenål, tubes og stanniol. Reagenser Sterilt H 2 O i form af RNase frit vand, TaqMan FAST mastermix 2x indholdene PCR buffer, dntp mix, TaqMan-polymerase (no AmpErase UNG, Applied Biosystems ), forward primer og Side 13 af 44

reverse primer (DNA Technology), TaqMan prober (DNA Technology og Applied Biosystems), positiv kontrol, negativ kontrol og intern kontrol Apparatur og utensilier er blevet stillet til rådighed af KMA, OUH, og reagenserne er blevet bestilt i samarbejde med KMA, OUH. Metoder Projektets praktiske del bestod i undersøgelse af samtlige 7 kontrolstammer og 64 Enterococcusstammer, efter følgende princip. Del 1 Klargøring af stammer Der laves renkultur af Enterococcus-stammer fra frysestik samt kontrolstammer der udsås på 5 % blodagarplader. Herefter inkuberes blodagarpladerne ved 35 C i termostaten. Efter 24 timer laves nye renkulturer fra de allerede inkuberede plader. Del 2 Klargøring af DNA 1-2 enkeltliggende kolonier fra renkulturerne opslemmes i en tube tilsat 250 μl sterilt vand, og de klargjorte tubes indsættes løbende i en blok. Kogningsapparatet, Eppendorf Termostat Plus er klar til anvendelse når temperaturen er op på 99 C, herved kan de klargjorte tubes indsættes til kogning. Efter 10 minutters kogning tages tubene ud af Eppendorf Termostat Plus og afkøles. Herefter er tubene klar til centrifugering ved 13.000 rpm i 1 minut. Tubene opbevares herved på køl. Del 3 Real time PCR 7500 FAST real time PCR apparatet tændes og får lov at stabilisere sig i 15 minutter. Herefter udfyldes et PCR-pladelayout for resistensgenerne vana, vanb og vanc, med notering af dato, initialer og angivelse af hvilke apparat ønskes anvendt (bilag 3). Layoutet indtastes efterfølgende i 7500 FAST real time PCR apparatet. PP-mix: Primere og prober opløses nu i 100 μm RNase frit vand, for derefter at fremstille PP-mix til hver af generne, vana, vanb og vanc. 250 μl PP-mix fremstilles af 25 μl forward primer, 25 μl reverse primer, 5 μl probe, 195 μl RNase frit vand. For at få reagenserne blandet, knipses forsigtigt på røret, og derefter centrifugeres røret kort vha. mikrocentrifugen, for herved at få reagenserne samlet i bunden af røret. Mastermix: Side 14 af 44

Mastermixet til hver af generne, vana, vanb og vanc fremstilles i 1½ ml mikrocentrifugerør. 20 μl Mastermix (pr. reaktion) fremstilles af 12,5 μl TaqMan FAST mastermix 2x, 2,5 μl PP-mix og 5,0 RNase frit vand. For at få reagenserne blandet, knipses forsigtigt på røret, som derefter centrifugeres kort vha. mikrocentrifugen. Den fremstillede mastermix opbevares på køl i mellem tiden, inden anvendelsen. En PCR-plade lægges over i en køleblok. Der tilsættes 20 μl Mastermix i bunden af hver brønd i PCR-pladen. Herefter tilsættes 5 μl prøve DNA-target med det genmateriale som ønskes undersøgt fra generne, vana, vanb eller vanc i hver brønd i PCR-pladen. Dog skal der i den negative kontrol, tilsættes 5 RNase frit vand i stedet for DNA-target. Herved sættes PCR-pladen over i en ny ikke afkølet blok og tildækkes med stanniol. PCR-pladen er klar til indsættelse i 7500 FAST real time PCR apparatet. PCR apparatet skal sikres at være indstillet til at forløbe efter følgende FAST PCRprogram, inden analysen sættes i gang; initial denaturering ved 95 C i 20 sekunder, 45 cykler ved denaturering ved 95 C i 3 sekunder efterfulgt af annealingstrinnet kombineret med elongeringstrinnet ved 60 C i 30 sekunder. Efter endt analyse oveføres resultaterne vha. USB-stik til en computer til efterbehandling. Herved fastsættes treshold, hvor ct-værdierne, som er et udtryk for DNA mængden, fremkommer. Litteratursøgning Litteratursøgningen i nærværende projekt er sket vha. databasen PubMed. Til begrænsning af litteratursøgningen blev følgende filtre anvendt; abstract, english, danish, full free text og humans. Desuden er det forsøgt, at anvende litteratur publiceret inden for de sidste 5 år. Af søgeord blev der brugt Enterococcus, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis Vancomycin, vana, vanb, vanc, VRE, PCR, Real time PCR, detection of vancomycinresistant Enterococcus. Andre artikler blev fundet ved hjælp af de allerede fundne artiklers referencelister. Desuden blev fagbøger anvendt til basisviden, mens der samtidig er blevet anvendt forskrifter fundet via afdelingens kvalitets- og dokumentstyringssystem, Qwalivare, til udførelse af projektforsøget, og ikke mindst til beskrivelse af metoder. Resultater I følgende afsnit ses resultater af real time PCR opsætningen med de to assays, in-house 1 og inhouse 2, angivet i tabel 1, samt tabel 2, der viser kontrolstammer, som tilsammen dannede grundlag Side 15 af 44

for valg af assay og kontroller, der analyserede de 64 stammer. Herudover ses en sammenligning af fænotypiske resistensmetoder over real time PCR som golden standard, angivet i tabel 3. In-house 1 Assays In-house 2 Assays Kontrolstamme vana vanb vanc vanc2/3 vana vanb 1 Middelværdi Middelværdi E. faecium vana (1) 16,4 - - - 18,6 - E. faecium vana (2) 15,4 - - - 17,1 - E. faecium vanb 37,8 22,1 20,7 - - - 21,5 20,4 21,4 20,9 E. faecalis vanb1-19,4 19,1 - - - 19,7 18,1 19,3 18,9 E. faecium vanb2-25,4 25,3 - - - 25,8 24,5 25,4 25,2 E. gallinarum vanc1 - - 21,3 - - - E. casseliflavus vanc2 - - - 21,3 - - Negativ kontrol (Rnase frit vand) - - - - - - Tabel 1 viser oversigt over beregnede middelværdier af ct-værdier i dobbeltbestemmelser opnåede ved positive reaktioner mellem 7 VRE kontrolstammer og hhv. in-house 1 assays, vana, vanb, vanc1 og vanc2/3, og in-house 2 assays, vana og vanb (bilag 4). De gråmarkerede felter ved vanb assayene, angiver ct-værdier. Negative reaktioner ved stammerne og den negative kontrol, hvorved ingen van-gen blev fundet, er angivet med -. Af tabel 1 ses, at der ved anvendelse af in-house 1 vana assays, er opnået følgende ct- middelværdier; 16,4 for vana (1), 15,4 for vana(2), 37,8 for vanb, mens der for vanb1, vanb2, vanc1 og vanc2, ikke er sket en reaktion og dermed ikke opnået en ct-værdi. Ved anvendelse af inhouse 2 vana assays, har hhv. vana (1) og vana (2) opnåede følgende ct-middelværdier; 18, 6 og 17,1, mens der ingen værdi blev opnået for vanb, vanb2, vanc1 og vanc2. Side 16 af 44

Desuden ses der i tabel 1, at der ved anvendelse af in-house 1 vanb assays, er opnået følgende ctmiddelværdier; 21,4 for vanb, 19,3 for vanb1, 25,4 for vanb2, mens der for vana (1), vana (2), vanc1 og vanc2, ikke er sket en reaktion og dermed ikke opnået en ct-værdi. Ved anvendelse af inhouse 2 vanb assays, ses følgende ct-middelværdier; 20,9 for vanb, 18,9 for vanb1 og 25,2 for vanb2, mens der ingen værdi blev opnået ved øvrige stammer. Som det også ses i tabel 1, er der ved anvendelse af in-house 1 vanc assays kun opnået en enkelt ctmiddelværdi på 21,3 for vanc1, mens der ved de resterende undersøgte VRE stammer, vana (1), vana (2), vanb, vanb1, vanb2 og vanc2, ikke er sket en reaktion. Ved anvendelse af in-house 1 vanc2/3 assays, har vanc2/3, som den eneste stamme, opnåede en ct-middelværdi på 21, 32. ct-værdier for interne kontroller Kontrolstamme In-house 1 16S In-house 2 23S E. faecium vana (1) 15,5 15,5 17,0 17,0 E. faecium vana (2) 13,8 13,9 15,4 15,5 Negativ kontrol 31,4 31,9-38,6 (Rnase frit vand) E. faecium vanb 16,1 17,5 E. faecalis vanb1 14,7 16,0 E. faecium vanb2 20,7 22,2 E. gallinarum vanc1 14,5 15,7 E. casseliflavus vanc2 15,2 16,3 Negativ kontrol 32,5 - (Rnase frit vand) Tabel 2 viser ct-værdier opnået ved reaktioner mellem 7 VRE kontrolstammer og assays for de interne kontroller 16S og 23S. VanA kontrol-stammer er kørt i dobbeltbestemmelser mens vanb- og vanc-kontrolstammer er kørt i enkeltbestemmelser. Negative reaktioner hvorved ingen van-gen blev fundet, er angivet med -. Som ses i tabel 2 er der ved den interne kontrol 16S, opnået ct-værdier ved samtlige Enterococcus stammer samt negative kontroller med en værdi på 31,4 og 31,9 for E. fæcium vana(1)- og E. fæcium vana (2)-stammerne, og en ct-værdi på 32,5 for samtlige vanb- og vanc stammer. Side 17 af 44

Herudover er der også opnået ct-værdier ved alle Enterococcus-stammer ved anvendelse af in-house 2 23S assay, dog kun en enkelt ct-værdi på 38,6 i dobbeltbestemmelsen for vana-stammerne, ved den negative kontrol. Den opsatte real-time PCR blev anvendt som golden standard, til sammenligning af de fænotypiske test, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. Udregninger af sensitiviteten og specificiteten ved de fænotypiske test blev basseret på samme 64 Enterococcus-stammer (bilag 5 og 6) og ses i nedenstående tabel. Metode Sensitivitet Specificitet + - + - E-test 41 % 100 % 100 % 100 % Ulden/ikke-ulden 24 % 100 % 80 % 80 % Tabel 3 viser beregnede sensitiviteter og specificiteter for hhv. E-test og ulden/ikke ulden fænomen. Medtagelsen af E. casseliflavus og E. gallinarum i beregningerne, er angivet som (+) og yderligere beregninger hvor disse to vanc stammer ikke blev medtaget, angivet som (-). Sensitiviteten for E-test og ulden/ ikke ulden fænomenet, hvor E. casseliflavus og E. gallinarum stammerne er medtaget i beregningerne, er på hhv. 41 %, og 24 %, mens der blev opnået 100 % sensitivitet ved begge fænotypiske test, hvor disse to vanc gener ikke er medtaget. Der ses ingen forskel på specificiteten ved medtagelsen af E. casseliflavus og E. gallinarum. Specificiteten for E- testen er beregnet til 100 %, mens den er på 80 % ved ulden/ ikke ulden fænomenet. Diskussion Opsætning af real-time PCR Til undersøgelse af de 64 anvendte Enterococcus-stammer for van-generne; vana, vanb og vanc, og for at kunne opnå pålidelige resultater i den forbindelse, er det nødvendigt at anvende en optimal real time PCR opsætning. Den valgte real time PCR opsætningen inkluderede følgende assays; Til påvisning af vana-genet i de 64 Enterococcus-stammer blev in-house 2 vana assayet, med ctværdier på hhv. 18,6 for vana(1) og 17,1 for vana(2) jf. tabel 1, valgt. Argumentet bag valget var, at in-house 1 vana assayet, reagerede uspecifikt med kontrol-stammen E. fæcium vanb med ctmiddelværdi på 37,8 %. Dette betyder, anvendelse af sidstnævnt kontrol-stamme, kan lede frem til falsk positive reaktioner, og dermed kan der i den forbindelse ikke stoles på evt. fremkommende positive resultater ved den videre undersøgelse af de 64 Enterococcus-stammer. Dog havde inhouse 1 vana assayet lavere ct-middelværdier på hhv. 16,4 for E. faecium vana (1) og 15,4 for E. Side 18 af 44

faecium vana (2) sammenlignet med samme kontrol-stammer ved in-house 2 vana assay, med ctmiddelværdier på 18,6 og 17,1. Dette betyder ved evt. anvendelse af in-house 1 vana assay kan opnås hurtigere svar, eftersom der gælder, jo lavere ct-værdier jo hurtigere er assayet til at detektere et gen, dermed vil opformeringen af et pågældende gen ske efter færre cyklusser. Ud fra det valgte vana assay blev kontrol-stammen E. faecium vana (2) udvalgt som positiv kontrol til efterfølgende undersøgelse af evt. vana Enterococcus-stammerne i de 64 undersøgte stammer. Udvælgelsen af E. faecium vana (2) som kontrol-stamme, er basseret på dens lavere ctmiddelværdi på 17,1, jf. tabel 1, sammenlignet med E. faecium vana (1) kontrol-stammen med en højere ct-middelværdi på 18,6. I forbindelse med detektionen af vanb-genet i de 64 Enterococcus-stammer, blev in-house 1 vanb assayet udvalgt til dette formål. In-house 1 vanb assayet havde dog en ct-middelværdi, der lå meget tæt på ct-middelværdien for in-house 2 vanb assayet jf. tabel 1, hvilket vil sige, at begge assays havde været ligeså anvendelige til detektionen af vanb-stammer. Eftersom det har været nødvendigt at udvælge en enkelt vanb assay til videreundersøgelse af de 64 test-stammer, blev udvælgelse af vanb assayet basseret på baggrund af differenserne mellem dobbeltbestemmelserne på ctværdierne. Differensen mellem dobbeltbestemmelserne for E. faecalis vanb1 med ct-værdier på 19,4 og 19,1 og E. faecium vanb2 med ct-værdier på 25,4 og 25,3, var mindre for in-house 1 vanb assayet end differenserne mellem dobbeltbestemmelserne på in-house 2 vanb assayet, med ctværdier på 19,7 og 18,1 for E. faecalis vanb1 og 25,8 og 24,5 for E. faecium vanb2. Så i betragtning af, at der ved in-house 1 vanb assayet, var mindre differens mellem dobbeltbestemmelserne på ct-værdierne ved vanb1- og vanb2 kontrolstammerne, sammenlignet med in-house 2 vanb assayet, kan det tænkes, at der har været mindre måleusikkerheder ved afprøvelse af in-house 1 vanb assayet, og dermed vurderes dette assay at være mere præcis ved anvendelse i studiet. Ud fra den valgte in-house 1 vanb assayet, blev kontrolstammen E. faecalis vanb1 valgt som den positive kontrol til undersøgelse af vanb Enterococcus-stammerne. Som ses i tabel 1, havde E. faecalis vanb1 en lavere ct-værdi sammenlignet med øvrige vanb kontrol-stammer. Dette betyder at der ved anvendelse af E. faecalis vanb1 som kontrol-stamme, vil en evt. detektion af et gen forekomme hurtigere, sammenlignet med anvendelse af de øvrige undersøgte vanb kontrolstammer, og dermed hurtigere svar. Til detektion af vanc-generne, blev begge in-house 1 vanc assays, E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus vanc2/3, valgt, som positive kontroller til detektionen af hhv. vanc1 og vanc2/3 Side 19 af 44

generne i Enterococcus-stammer. Af tabel 1 ses, at begge kontrol-stammer blev bundet specifikt til den tilsvarende kontrol-stamme. vanc1 assay reagerede udelukkende med kontrolstammen vanc1, mens vanc2/3 assayet reagerede specifikt til vanc2/3 kontrol-stammen. I forbindelse med real time PCR opsætningen blev 2 interne kontrollers (16S og 23S) anvendelighed også blevet undersøgt. Ud fra tabel 2 ses, at den interne kontrol, 16S reagerede positivt med den negative kontrol for vana kontrol-stammerne, resulterende i ct-værdierne på 31,4 og 31,9 i dobbeltbestemmelsen. Endvidere ses en positiv reaktion med den negative kontrol for vanb- og vanc-kontrolstammerne, med en ctværdi på 32,5. Den interne kontrol, 23S, viste kun en enkelt positiv reaktion med de negative kontroller, med en ct-værdi på 38,6 ved den negative kontrol for vana-kontrolstammerne i dobbeltbestemmelsens anden måling. Dermed havde begge de interne kontroller 16S og 23S, positive reaktioner ved negative kontrol-stammer. Eftersom den interne kontrol 16S reagerede positivt ved samtlige negative kontrol-stammer, i forhold til 23S, der kun reagerede positivt ved enkeltbestemmelsen af vana-stammen i den negative kontrol, blev 23S udvalgt, som den interne kontrol i det nærværende studie. I et studie af Ryu Hodon et al., som undersøger anvendelsen af 23S assayet overfor 153 Enterococcus-stammer, sås at 23S bandt specifikt til alle de medtagende Enterococcus-stammer [30], hvilket underbygger næreværende studiets valg, for at arbejde videre med 23S, som den interne kontrol. I betragtningen af en intern kontrol har til opgave, at undersøge om prøvematerialet indeholder DNA-target, der kan opformeres, er det ikke umiddelbart interessant at anvende denne til opsætning af real time PCR i næreværende studie. Studiet undersøger kendte Enterococcus-kontrol-stammer, hvilket betyder at det på forhånd har været kendt, at prøvematerialerne indeholder DNA-target. På trods heraf indgik 23S i opsætningen i næreværende studie, da den efterfølgende skulle anvendes til detektion af van-generne; vana, vanb og vanc. De positive reaktioner, der er fremkommet ved 16S s og 23S s reaktioner med de negative kontroller, gav en bekymring for, hvorvidt der kunne stoles på resultaterne ved projektets videre undersøgelse af Enterococcus- stammer, eftersom disse positive reaktioner kan give anledning til falsk positive resultater. På baggrund af de uforventede positive reaktioner mellem de interne kontroller, 16S og 23S, og de negative kontroller for vana, vanb og vanc assays, må det konstateres, der har været tale om nogle fejlkilder under kørslen af disse to interne kontroller. Side 20 af 44

Kontamineringen kan tænkes, at have været fejlkilden, der muligvis er sket enten i forbindelse med afpipettering af DNA-target, med PCR-produkter eller tidligere PCR-kørsler. I forbindelse med den interne kontrol, 16S, der viste positive reaktioner ved samtlige negative kontroller, kan kontamineringen muligvis være forbundet med firmaets fremstilling af reagenser til 16S assayet. Dette kan evt. opklares ved endnu en afprøvelse af 16S assayet. I tilfælde af, at der igen opnås positive reaktioner ved samtlige negative kontroller, er sandsynlighed for, at kontamineringen er forbundet med firmaets fremstilling af reagenserne til 16S assayet, stor, og der kan derfor evt. bestilles nye reagenser hjemme, til yderligere afprøvelse af den interne kontrol 16S. I forbindelse med opsætningen af real time PCR blev 7 kendte kontrol-stammer anvendt. I betragtningen af, jo større population der medtages i en bestemt undersøgelse, jo større er sandsynligheden for, at opdage forkerte resultater, som den pågældende undersøgelse kan afgive [30], og til sammenligning med antal stammer, andre studier anvender til en real time PCR opsætning, vurderes nærværende studiets real time PCR opsætningen med kun 7 kontrol-stammer, værende utilstrækkelige til beregning af sensitiviteter og specificiteter af de tidligere nævnte fænotypiske test. Dette bekræftes i andre studier, herunder et studie af Tripathi A, Shukla SK et al.[5], hvor det valgte prøveantal er væsentligt større. I sidstnævnte studie blev en opsætning af real-time PCR også undersøgt og blev bl.a. sat op imod E-test og standard PCR, i forbindelse med detektion af VRE[5]. I dette studie blev 80 VRE samt 65 vancomycin-sensitive Enterococcus (VSE) inkluderet til dette formål. I et andet studie af Kim TS et al.[28] er opsætning af real-time PCR overfor andre fænotypiske test, også blevet undersøgt. Her blev der i alt anvendt 100 VRE- og VSE-stammer [28]. Så på baggrund heraf, vurderes det igen, at nærværende studiets datasæt med kun 7 kontrolstammer, er en begrænsning for studiet. Ved medtagelse af kun 7 VRE kontrol-stammer, er der meget mindre sandsynlighed for at opdage en evt. uspecifik reaktion ved de valgte assays. På trods af få anvendte 7 VRE kontrol-stammer i næreværendes studiets opsætning af real-time PCR, der efterfølgende ønskes anvendt som golden standard, blev der arbejdet videre med opsætningen til detektionen af de 64 test-stammer. Dette blev gjort med det argument, at opsætningen blev udvalgt ud fra specifikke assays, som derfor forventes at binde specifikt ved en efterfølgende anvendelse af dem. Eftersom de 4 anvendte VRE kendte kontroller, E. faecium vana (2), E. faecalis vanb1, E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus vanc2, der blev anvendt som positive kontroller, reagerede Side 21 af 44

specifikt med de valgte assays, ved positive reaktioner, og negativt ved negative kontroller (bilag 7), blev kontrollerne bekræftet værende specifikke. På baggrund heri, kan nærværende studie anbefale KMA, OUH, denne opsætningen til anvendelse ved bl.a. VRE identifikationen fremfor at sende VRE-stammer videre til SSI. Herved kan der komme hurtigere svar på en VRE prøve, hvilket især vil være til gavn for patienten, som hermed kan komme hurtigere i behandling. Dog vil det være mest hensigtsmæssigt at undersøge nærværende studiets opsætning på ny med flere kendte VRE og vancomycinsensitive Enterococcus-stammer. De valgte assays; in-house 2 vana, in-house 1 vanb, in-house 1 vanc og vanc2/3 og in-house 2 23S, der blev udvalgt vha. den opsatte real time PCR, blev anvendt til videre sammenligning af de fænotypiske test hhv. E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, i forbindelse med undersøgelsen af de 64 Enterococcus-stammer. Vurdering af E-tests anvendelighed sammenlignet med real time PCR Der blev udregnet sensitiviteter og specificiteter for hhv. e-test og ulden/ikke ulden ved sammenligning med real time PCR som golden standard. Som ses i tabel 3, har medtagelsen af vanc stammerne, E. casseliflavus og E. gallinarum været af stor betydning i beregningerne af sensitiviteten. Sensitiviteten øges betydeligt med 59 % ved E-test, og ved ulden/ ikke ulden fænomenet øges sensitiviteten også markant med 76 %, når sidstnævnte vanc stammer ikke medtages i beregningerne jf. tabel 3. For både E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, er der opnået en sensitivitet på 100 %, ved undladelse af E. casseliflavus og E. gallinarum, hvilket vil sige, begge detektionsmetoder egner sig til at detektere vancomycinresistente Enterococcus. Ved medtagelse af sidstnævnte vanc stammer, er sensitiviteten for E-test beregnet til en betydelig lavere værdi, på 41 %, mens sensitiviteten for ulden/ ikke ulden er beregnet til endnu lavere procent på 24. Dog ses i tabel 3, at specificiteten for både E-test og ulden/ ikke ulden fænomenet, har været uændret ved inddragelse af E. casseliflavus og E. gallinarum med hhv. en værdi på 100 % for E-test og 80 % for ulden ikke ulden fænomenet. Som diskuteret i ovenstående, vil medtagelse af vanc stammerne forringe de fænotypiske tests sensitivitet markant, og ud fra denne udredning, bør vanc stammerne identificeres vha. andre analysemetoder. Ifølge EUCAST anbefales Malditof, som er en artsbestemmelsesmetode, til identifikationen af vanc stammerne E. gallinarum og E. casseliflavus [21]. Eftersom det vides at E. gallinarum og E. casseliflavus har et medfødt vancomycin resistens [21], vil artsbestemmelsen eksempelvis ved hjælp af Malditof, være tilstrækkelig, til efterfølgende valg af behandling [21]. Side 22 af 44

Et studie af Griffin M. Paul et al. [31], viser også, at Malditof er et godt alternativ som analysemetode til identifikation af VRE. Studiet konkluderer på, MALDI-TOF har en sensitivitet på 96,7 % og specificitet på 98,1 % ved undersøgelse af VRE. Sammenholdes næreværende studiets resultater med EUCAST s anbefalinger, tænkes det at være hensigtsmæssigt at identificere E. gallinarum og E. casseliflavus med eksempelvis MALDI-TOF, hvorved den opnåede sensitivitet ved E-test og ulden/ ikke ulden fænomenet således kan holdes på 100 %. På baggrund af ovennævnte problemstilling, ved medtagelse af E. gallinarum og E. casseliflavus til beregningen af sensitiviteten for E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, vil den videre diskussion af disse to fænotypiske test tage udgangspunkt i sensitiviteterne og specificiteterne uden disse vanc stammer. En sensitivitet og specificitet på 100 % for E-test, jf. tabel 3 betyder, at der har været 100 % overensstemmelse mellem resultaterne opnået ved undersøgelse af de 64 Enterococcus-stammer med E-test og real-time PCR. Dermed er E-test, ifølge næreværende studie, en god fænotypisk test til påvisning af VRE. Dog har E-testen ulemper i forbindelse med identifikation af vanb-stammer med lave MIC- værdier på 4 mg/l [12]. Denne lave MIC-værdi for nogle vanb stammer, antages at ligge i gråzonen, da grænsen er så tæt på MIC for vancomycinsensitive Enterococcus, der er defineret ved 4 mg/l [21]. Dette kan føre til fejlbehandling af patienten, eftersom VRE kan risikere at blive diagnosticeret værende sensitive i stedet for resistente. I et studie af Schulz og Sahm [24], hvor bl.a. 14 vancomycinresistente Enterococcus er undersøgt, der inkluderede stammerne; E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum og E. casseliflavus, bliver den ovennævnte ulempe ved E-test også understreget [24]. Dette studie konkluderer bl.a. at detektionen af low-level vancomycin resistente Enterococcus er netop problematisk ved anvendelse af E-test som detektionsmetode [24]. Det er dog vigtigt at have for øje, at sidstnævnte studie er baseret på et lille datasæt med kun 14 VRE undersøgte stammer, hvilket er en svaghed ved dette studie, da der som tidligere beskrevet gælder, at jo større population der medtages i en bestemt undersøgelse, jo bedre fremstår den pågældende undersøgelse [30]. Herudover kan der peges på endnu en svaghed forbundet med E-test som detektionsmetode, ved en evt. detektion af high-level vanb stammer. I forbindelse med vurderingen af high-level vanb stammer, vil der igen være tale om en gråzonevurdering. Dette skyldes vanb stammernes MICværdi, der er på 4-64 mg/l [14], mens vana stammer har MIC på 16-512 mg/l [13]. Herved kan der Side 23 af 44

ske et overlap ved bestemmelse af vana- og vanb stammernes MIC-værdier, i intervallet 16-64 mg/l, og dermed kan high-level vanb-gener risikeres blive fejldiagnosticeret værende vana. Dette kan have betydning for valg af behandling for patienten, da vanb Enterococcus er sensitiv for teicoplanin i modsætning til vana der er resistens for dette antibiotikum [12]. Eftersom der i nærværende studie kun er undersøgt for 2 vanb stammer, kan dette studie hverken bekræfte eller afkræfte E-testens evne til at detektere Enterococcus i gråzonen og er dermed heller ikke i stand til at biddrage med viden omkring de diskuterede svagheder ved E-testen. Det kan derfor være oplagt at undersøge et større datasæt med flere kendte van-gener med low- og highlevel vanb-stammer. Udefra de ovenstående problemstillinger omkring E-testens anvendelighed til detektion af VRE, er det oplagt, at anvende en genotypisk analysemetode, såsom real-time PCR, som anvendt i nærværende studie. Ved anvendelse af real time PCR opnås et præcis svar om hvilket gen der er til stede. Herved kan usikkerheden omkring detektionen af van-gener i gråzonen, i forbindelse med E- test undgås. Blandt andet studiet af Tripathi et al. viser, at real time PCR er en ideel påvisningsmetode til påvisning af VRE gener [5]. Der blev i sidstnævnt studie analyseret på VRE stammer, hvor samtlige stammer viste sig at være af vana type [5]. Real-time PCR analysemetoden viste sig at have en sensitivitet på 100 %. Desuden er real time PCR, ifølge studiet af Tripathi et al., en hurtigere detektionsmetode til van-gener i Enterococcus når MIC-værdier er foruddefineret vha. fx E-test. Herudover bliver der i sidstnævnte studie konkluderet, at real-time PCR analysemetoden er præcis og hurtigere end de fænotypiske analysemetoder til detektion af VRE. I et andet studie af Kim TS. et al bliver real time PCR s anvendelighed til detektion af VRE også undersøgt [28]. Studiet undersøger den kliniske anvendelighed af real-time PCR til detektion af vana gener overfor diskdiffusions metoden og E-test, og konkluderer, at real time PCR analysemetoden er en bedre detektionsmetode af VRE sammenlignet med de undersøgte fænotypiske test og kan derfor erstatte de sidstnævnte test. Herved er der i begge de diskuterede studier [5,28], principiel enighed om, at real time PCR er en god detektionsmetode af VRE. Dog er der uenighed om, hvorledes real time PCR skal indgå i rutinediagnostikken. Ifølge studie af Tripathi et al. vil real time PCR analysemetoden være bedst anvendelig i forlængelse af en foruddefinerede MIC-værdi, dermed i forlængelse af diskdiffusionsmetoden og E-test, mens studiet af Kim TS. et al mener, at real time PCR helt kan erstatte de fænotypiske test i forbindelse med detektionen af VRE. I betragtning af, at real-time Side 24 af 44

PCR er en dyrere analysemetode sammenlignet med den enkelte fænotypiske test og at E-test er udmærket til at detektere de vancomycin sensitive Enterococcus, vil den næreværende studie anbefale, at der i rutinediagnostikken anvendes real time PCR i forlængelse af diskdiffusionsmetoden og E-test. Med denne anbefaling, undgås en unødvendig analysering af Enterococcus med real time PCR, der ellers vil vise sig at være vancomycin sensitive, hvilket vil være en økonomisk gevinst for afdelingen. Vurdering af ulden/ ikke ulden fænomenet sammenlignet med real time PCR Udefra tabel 3 se at der ved sammenligning af ulden/ikke ulden fænomenet med real time PCR som golden standard, er opnået en sensitivitet på 100 %, mens specificiteten kun er på 80 %. Dermed kan vi trods projektets lille datasæt med undersøgelse af blot 64 Enterococcus-stammer, have en formodning om, at denne fænotypisk analysemetode, ikke er en optimal analysemetode til detektionen af vancomycinsensitive Enterococcus. Med en sensitivitet på 100 %, kan det dog siges, at ulden/ikke ulden fænomenet er ligeså god til at påvise VRE som ved E-test. Grundet den lave specificitet på 80 %, kan vancomycinsensitive Enterococcus, udefra nærværende studie, ikke bestemmes ved anvendelse af dette fænomen. Med denne specificitet på 80 % er der opnået falsk positive resultater ved 20 % af de undersøgte Enterococcus-stammer, der er blevet påvist værende vancomycinresistente, hvor de reelt har været sensitive. I tilfælde af falsk positive resultater, risikerer patienten at blive fejlbehandlet, ved at udsættes for evt. unødvendige bivirkninger, ved behandling med eksempelvis linezolid eller daptomycin, som i dag kan anvendes til behandling af VRE [1]. Eftersom undersøgelsen af sidstnævnte fænomens anvendelighed, er basseret på resultater opnået ved sidste års projekt, udført af studerende, som dermed formodes ikke har været tilstrækkelige rutinerede i aflæsning af zonekanten, kunne det have haft indflydelse på pålideligheden af resultaterne. Har denne problemstilling været aktuelt, betyder det, at det nærværende studiets beregninger af specificiteten ved ulden/ ikke ulden fænomenet må antages værende upålidelig. Dette betyder at der med dette studie, ikke med 100 % sikkerhed, kan siges noget om hvor effektiv ulden/ikke ulden fænomen er til detektering af VRE. Inden det med 100 % sikkerhed kan siges, at ulden/ ikke ulden fænomenet er upålideligt til anvendelse i rutinearbejdet, bør dette undersøges yderligere med en større population med både kendte VRE og vancomycin sensitive Enterococcus. Ifølge EUCAST skal identifikationen af VRE ikke kun baseres på vurdering af ulden/ikke ulden fænomenet, men også ud fra MIC-bestemmelse i form af E-test [14]. Dette skyldes, ifølge Side 25 af 44

EUCAST, at der netop ved en stamme, der ellers har en ulden kant, og dermed indikerer værende resistens, kan være sensitiv på trods heraf. Næreværende studiets resultater peger i samme retning som EUCAST anbefalinger. På baggrund af det nærværende studiets beregnede specificiteter jf. tabel 3, der viser, at E-test klart vil være den bedst anvendelig fænotypisk test fremfor ulden/ikke ulden fænomenet. På bagrund af nærværende studiets resultater opnået ved ulden/ ikke ulden fænomenet ved sammenligning af fænomenet med real time PCR, som golden standard, og ikke mindst EUCAST anbefalingerne om, at sidstnævnte fænotypisk test ikke kan stå alene ved identifikation af VRE, formodes den fænotypisk test, ulden/ikke uden fænomenet, at være uspecifikt til detektion af vancomycinresistente Enterococcus. Derfor passer KMA, OUH s metodevalg til detektion af VRE, hvoraf, der ikke længere tages højde for ulden/ ikke uldenfænomenet, fint i overensstemmelse med nærværende studiets resultater og EUCAST anbefalinger. I den elektroniske spørgeundersøgelse sendt til diverse KMA afdelinger i Danmark, herunder Nykøbing Falster-, Slagelse-, Aalborg-, Viborg- og Skejby sygehus, (bilag 1), til undersøgelse af VRE detektionsmetoder, er KMA, Viborgs tilbagemeldingen, mest interessant sammenholdt med nærværende studiets resultater og ikke mindst EUCAST retningslinjer. På KMA, Viborg, identificeres VRE vha. diskdiffusionsmetoden, ulden/ ikke ulden fænomenet, hvor zonekanten vurderes. I tilfælde af en ulden zonekant, antages Enterococcus-stammen at være resistens og sendes videre til SSI. Sammenholdes KMA, Viborgs detektionsmetode af VRE med nærværende studiets resultater, svarer det til, at der på KMA, Viborg, i 20 % af de undersøgte Enterococcusstammer, vil blive fejldiagnosticeret værende falsk positive, eftersom nærværende studie har påvist 80 % specificitet ved ulden/ikke uldenfænomenet. Ydermere lever KMA, Viborgs VRE detektionsmetoden, ikke op til EUCAST retningslinjer, der understreger, at identifikationen af VRE kan ikke udelukkende bestemmes på baggrund af vurderingen af Enterococcus-stammens zonekant vha. ulden/ ikke ulden fænomenet men bør også vurderes vha. målingen af MIC værdien. Desuden mener KMA, Viborg sygehus, at en konfirmatorisk MIC-bestemmelse er mindre sensitiv end ved tolkning af zonekanten ved ulden/ ikke ulden fænomenet (Bilag1), hvilket også er en modsigelse til nærværende studiets resultater, da ellers viste 100 % sensitivitet ved måling af MIC vha. E-test. De øvrige adspurgte Klinisk Mikrobiologiske Afdelinger, detekterer VRE vha. fænotypiske test i kombination med en molekylærbiologisk analysemetode (bilag 1). Side 26 af 44

Konklusion I nærværende projekt blev real time PCR opsat til undersøgelse af dens anvendelighed i rutinediagnostikken af vancomycinresistente Enterococcus (VRE) med vana, vanb og vanc, i en kollektion af 64 Enterococcus-stammer, med det formål at sammenligne med E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. På baggrund af 7 kendte kontrolstammer blev følgende assays valgt; in-house 2 vana, in-house 1 vanb og begge in-house 1 vanc, 23s som intern kontrol, og følgende 4 positiv kontroller; E. faecium vana (2), E. faecalis vanb1, E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus vanc2, til en real time PCR opsætning, efterfølgende med undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer. Til undersøgelse af den kliniske anvendelse af E-test overfor real time PCR, er der både opnået en sensitivitet og specificitet på 100 %, mens der ved ulden/ ikke ulden fænomenet er opnået en sensitivitet på 100 % og specificitet på 80 %. På baggrund af de ovennævnte sensitiviteter og specificiteter kan det konkluderes, at E-test er en bedre fænotypisk test til detektion af VRE sammenlignet med ulden/ ikke ulden fænomenet. Ved anvendelse af E-test er der stor risiko for fejldiagnosticering af van-gener i gråzoner, derfor kan anvendelsen af real time PCR være optimal til specifik detektion af et van-gen. I betragtning af real time PCR er en dyr detektionsmetode, kan KMA med fordel anvende E-test i kombination med real time PCR, til detektion af VRE. Perspektivering Eftersom næreværende studie bygger på et begrænset datasæt, kan studiet kun bidrage med vejledende viden til, hvad der vil være bedst for en Mikrobiologisk Afdeling, at anvende af detektionsmetoder til VRE. Det vil derfor anbefales, at opsætning af real time PCR undersøges med en større population med flere kendte VRE stammer, for at afgøre om sidstnævnte analysemetode kan anvendes til diagnostik af VRE og dermed om rutineproceduren på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, skal ændres. Ligeledes bør der medtages flere kendte vanb-stammer, til bekræftelse af real time PCR s evne til detektion af Enterococcus resistensmekanisme for vancomycin, der ligger i gråzonen. Desuden kan det være interessant at undersøge de 64 Enterococcus-stammer, der er anvendt i nærværende studie, med simpel Multiplex PCR. Ved Multiplex PCR kan flere gener påvises samtidig, eftersom der i den forbindelse køres flere primer sammen. Dette giver denne analysemetode den fordel, som savnes ved real time PCR, at de tre undersøgte vana, vanb og vanc Side 27 af 44

gener, i næreværende studie, kan undersøges samtidig. Dette letter arbejdsgangen herunder tidsbesparelse, og giver ikke mindst mulighed for en hurtigere diagnose, som herved kan få patienten hurtigere videre i behandlingen. Litteratur 1. Statens Serum Institut, DANMAP rapport, Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark, 2013, [04+11+14], Lokaliseret på: http://www.danmap.org/~/media/projekt%20sites/danmap/danmap%20reports/danma P%202013/DANMAP%202013.ashx S. 6, 10, 13, 14, 85, 86 2. Bonten MJM, Willems R, Weinstein RA, Vancomycin-resistant enterococci: why are they here, and where do they come from?, The Lancet Infectious Diseases, 2001; 1 S. 314, 315 3. Praharaj I, Sujatha S, Parija SC, Phenotypic & genotypic characterization of vancomycin resistant Enterococcus isolates from clinical specimens, Department of Microbiology, Jawaharlal Institute of Postgraduate Medical Education & Research, Puducherry, India, 2013 S. 550, 554 4. Yarlagadda V, Akkapeddi P, Manjunath GB, Haldar J, Membran Active Vancomycin Analogues: A Strategy to Combat Bacterial Resistance, Journal of Medicinal Chemistry, 2014 S. 4558 5. Tripathi A, Shukla SK, Singh A, Prasad KN, A new approach of real time polymerase chain reaction in detection of vancomycin-resistant enterococci and its comparison with other methods, Indian Journal of Medical Microbiology, 2013; 31 (1) S. 47, 48, 49, 51 6. Shepard BD, Gilmore MS, Antibiotic-resistant enterococci: the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance, Microbes and Infection, Elsevier, 2002 S. 215, 216, 217 7. Arias CA, Barbara EM, The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance, NIH Public Acces Author Manuscript, 2013; 10 (4) Side 28 af 44

S. 1, 2, 3, 7, 8, 9 8. Hollenbek BL, Rice LB, Intrinsic and acquired resistance mechanisms in enterococcus, Landes Bioscience, 2012 S. 421, 423, 425, 426 9. Versalovic J, Carroll KC, Funke G, Jorgensen JH, Landry ML, Warnock DW, Manual of clinical microbiology, 10. udgave, 1 volumen, 2011, American Society for Microbiology, Washington DC S. 350, 352 10. Murray BE, The Life and Times of the Enterococcus, Clinical Microbiology, 1990; 3 (1) S. 47 11. Kuriyama T, Williams DW, Patel M, Lewis MAO, Jenkins LE, Hill DW, et al., Molecular characterization of clinical and environmental isolates of vancomycin-resistant Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis from a teaching hospital in Wales, Journal of Medical Microbiology, 2003 S. 821, 822 12. Werner G, Klare I, Fleige C, Geringer U, Witte W, Just HM, et al., Vancomycin-resistant vanb-type Enterococcus faecium isolates expressing varying levels of vancomycin resistance and being highly prevalent among neonatal patients in single ICU, Antimicrobial Resistance and Infection Control, 2012 S. 2. 13. Mak A, Miller MA, Chong G, Monczak Y, Comparison of PCR and Culture for Screening of Vancomycin-Resistant Enterococci: Highly Disparate Results for vana and vanb, Journal OF Clinical Microbiology, 2009; 47(12) S. 4136 14. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, 2014; Version 4.0 S. 26 15., OUH, Qwalivare, IRT Enterococcus, version 15.11.2013, forskrift, [12+10+14+28] 16. Thuesen AH, Resistensbestemmelse af Enterococcus med VITEK2 og agardiffusion med Rosco Neo-Sensitabs, Oxoiddisk og E-test, Antimicrobial Susceptibility Testing of Side 29 af 44

Enterococcus with VITEK2 and Agar Diffusion with Rosco Neo-Sensitabs, Oxoid disc and E-test, Professionsbachelorprojekt Modul 14, University College Lillebælt, 2013 17. Buckingham L, Molecular Diagnostics, Fundamentals, Methods & Clinical Applications, 2. udgave, 2012, F.A. Davis Companys S. 130-151 18. Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, et al., Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing, Clinical Microbiology Reviews, 2006 S. 168-169, 207 19. Pedersen PA, En genteknologisk værktøjskasse, Institute of Molecular Biology, 2007 s. 47-50 20. Klaringsrapport, Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi, 2004 S. 6, 7, 9, 14 21. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance, 2013; Version 1.0 S. 32, 33 22. Citron DM, Ostovari MI, Karlsson A, Goldstein EJC, Evaluation of the E test for Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria, Journal Of Clinical Microbiology, 1991, 29 (10) S. 2197 23. Baker CN, Stocker SA, Culver DH, Thornsberry C, Comparison of the E test to Agar Dilution, Broth Microdilution, and Agar Diffusion Susceptibility Testing Techniques by Using a Special Challenge Set of Bacteria, Journal Of Clinical Microbiology, 1991, 29 (3) S. 533 24. Schulz JE, Sahm DF, Reliability of the E test for Detection of Ampicillin, Vancomycin, and High-Level Aminoglycoside Resistance in Enterococcus spp., Journal Of Clinical Microbiology, 1993, 31 (12) S. 3336, 3338 25. Schuetz AN, Antimicrobial Resistance and Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria, Antimicrobial Resistance, 2014 s. 701 Side 30 af 44

26. Fang H, Ohlsson AK, Jiang GX, Ullberg M, Screening for vancomycin-resistant enterococci: an efficient and economical laboratory-developed test, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012 S.262 27. Ryu H, Henson M, Elk M, Toledo-Hernandez C, Griffith J, Blackwood D, et al., Development of Quantitative PCR Assays Targeting the 16s rrna Genes of Enterococcus spp. and Their Application to the Identification of Enterococccus Species in Enviromental Samples, Applied ans Enviromental Microbiology, 2013; 79 (01) S. 198, 200 28. Kim TS, Kwon HL, Song SH, Song KH, Kim HB, Park KU, et al., Real-time PCR surveillance of vana for vancomycin-resistant Enterococcus faecium, Molecular Medicine Reports, 2012 S. 488, 489, 491 29. Mackay IM, Real-time PCR in the microbiology laboratory, Clin Microbiol Infect, 2004 S. 190-192 30. Bendsen T, Noter i statistisk, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen, 2009-2014, [12+10+14], Lokaliseret på: http://statnoter.biolyt.dk/index.php?pageid=56 31. Griffin PM, Price GR, Schooneveldt JM, Schlebusch S, Tilse MH, Urbanski T, et al.,use of Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry to identify Vancomycin-Resistant Enterococci and investigate the epidemiology of an outbreak, Journals, ASM.org, 2012 S. 2918 Side 31 af 44

Bilag Bilag 1 Svar fra elektronisk spørgeundersøgelse Spørgsmål, der er sendt ud til KMAer i Danmark: Hej Vi er en bachelor gruppe på KMA, OUH, der undersøger om E-test og ulden/ikke ulden fænomenet kan valideres til detektion af vancomycinresistente Enterococcus ud fra en opsætning af real time PCR. I denne henseende synes vi, at det vil være interessant, at vide, hvordan diverse Kliniske Mikrobiologiske Afdelinger i Danmark detekterer vancomycinresistente Enterococcus. Vi håber at høre fra dig/jer og på forhånd mange tak. Venlig Hilsen Reem Kazem, Sara Dallal, Asmaa Dallal, Ditte Bertelsen, Laura Pedersen og Mette Erichsen. Bioanalytikeruddannelsen M14, UCL Blangstedgårdsvej, Odense. Sygehus Bodil Hansen (boh@regionsjaelland.dk) Slagelse/Nykøbing Falster sygehus Helga Schumacher Mikrobiologisk afdeling Midt- Vest Hospitalsenheden Midt Regionshospitalet Viborg Svar Vi laver disc - diffusion med Vanco og hvis zonen er <12 eller zonekanten er uskarp udføres E-test for Vancomycin. Vancomycinreststente enterococcer sendes til SSI til overvågning. På KMA Midt-Vest er vi efter nylig foretaget analyse af metoder til påvisning af VRE gået over til følgende metodologi: Urinanalyser: der anvendes Vitek 2 Alt andet, hvor resistens er indiceret: der anvendes diskdiffusion, hvor man tolker på zonekanten. Er denne ulden svares bakterien som Resistent og isolatet sendes til SSI. Vi laver ikke konfrimatorisk MIC-us. da en sådan er mindre følsom end tolkning af zonekant. Kirsten Inger Paulsen Afsnitsledende bioanalytiker 97 665450 I Aalborg undersøger vi først for vancomycin med diskdiffusion (Mueller Hinton agar med tablet fra Rosco). Hvis zonen er diffus eller zonestørrelsen for lille laver vi Etest (BioMerieux). Finder vi stammen Side 32 af 44

kip@rn.dk resistent sender vi den til SSI til konfirmatorisk test. Ålborg Anne Bonde Jensen Bioanalytikerunderviser Region Sjælland Sygehus Syd Klinisk Mikrobiologisk afdeling (3.3.49) Vancomycinresistente Enterokokker (VRE) - Rektalpodning eller fæces 3.3 Udsåning Dag 0: Opformering i opformeringsbouillon (BHI med Vancomycin 4 mg/l og 60 mg/l Aztreonam) Rektalpodning: Slagelse: prøverøret rystes, væsken fra E-swab hældes over i opformeringsboullionen og låget skrues på. Nykøbing F.: Kulpodepinden overføres i opformeringsbouillonen og låget skrues på. Fæces: En 10 µl øjepodenål dyppes i prøven og prøvemateriale svarende til ca. ærtestørrelse overføres til opformeringsbouillonen. Inkuberes ved 35 C uden CO 2 i 1 døgn. 3.4 Aflæsning og sekundær udsåning: Dag 1: Udsåning på chromogen plade (chromid VRE, biomérieux). Rektalpodning: Slagelse: En 10 µl øjepodenål dyppes i bouillonen og efter omrøring afsættes materialet i 1. strøg på chromogen plade. Nykøbing F.: Ved hjælp af podepinden røres opformeringsbouillonen om og der afsættes materiale i 1. strøg på chromogen plade. Fæces: En 10 µl øjepodenål dyppes i bouillonen og efter omrøring afsættes materialet i 1. strøg på chromogen plade. Med en steril podenål foretages en trekantspredning. Inkuberes ved 35 C uden CO 2 i 2 døgn. 3.5 Resultatvurdering og svarafgivelse: Dag 2 og 3: Aflæsning 1. Ved manglende vækst efter 2 døgns inkubation svares ud med stempeltekst: "Ingen vækst af Vancomycinresistente Enterokokker (VRE)". 2. Ved vækst af VRE-lignende kolonier (E. faecium: violette, E. faecalis: blågrønlige kolonier) udføres identifikation med MALDI- TOF. 3. Ved førstegangsfund af VRE hos patienten bekræftes resultatet med E-test for vancomycin. Der laves ikke yderligere resistensbestemmelse. 4. Ved vækst af vancomycinresistente enterokokker svares prøven ud med: "Vækst af E. faecium" eller "Vækst af E. faecalis" uden resistensbestemmelse, og med stempeltekst: Vækst af Vancomycinresistente Enterokokker (VRE)". 5. VRE-positive prøver skal flagmarkeres (VRE), fryses, sendes til SSI Side 33 af 44

(Annette Hammerum) og sendes som OBS post til LAB-2 læge. Marianne Kragh Thomsen, overlæge Aarhus Universitetshospital Tel. +45 7845 5652 Fax +45 7845 5611 E-mail: marthoms@rm.dk www.kma.auh.dk KMA, Skejby undersøger vancomycinresistens hos enterokokker ved diskdiffussion (EUCAST) og real time PCR. Er zonen < 12 mm eller er der en ulden zonekant (uanset zonestørrelse) udføre vi PCR. Tabel 1 Svar fra spørgeundersøgelse, der viser, hvilke metoder forskellige KMA er i Danmark anvender til detektion af VRE. Bilag 2 Liste over 65 Enterococcus-stammer Prøve nr. Isolats nr. Prøve nr. Isolats nr. Prøve nr. Isolats nr. Prøve nr. Isolats nr. 1 334516-02 E. faecalis 18 303843-05 E. faecium 35 329513-07 E. faecalis 52 327466-11 E. durans 2 303485-03 E. faecalis 19 305041-06 E. faecium 36 319825-08 E. casseliflavus 53 329329-11 E. avium 3 317335-03 E. faecalis 20 305044-06 E. faecium 37 324469-08 E. faecium 54 327466-11 E. faecium 4 328037-03 E. casseliflavus 21 306918-06 E. faecium 38 301413-09 E. avium 55 337070-11 E. raffinosus 5 306669-04 E. gallinarum 22 306947-06 E. gallinarum 39 333897-09 E. faecalis 56 337118-11 E. avium 6 309412-04 E. faecalis 23 307411-06 E. faecium 40 309619-09 E. faecium 57 340765-11 E. raffinosus 7 330128-04 E. avium 24 315076-06 E. faecium 41 311734-09 E. casselflavus 58 3473380-11 E. avium Side 34 af 44

8 327710-05 E. faecium 25 316319-06 E. faecium 42 327220-09 E. faecium 59 302172-12 E. gallinarum 9 328981-05 E. faecium 26 318684-06 E. faecium 43 331091-09 E. durans 60 308866-12 E. casseliflavus 10 328979-05 E. faecium 27 319501-06 E. faecium 44 334753-09 E. durans 61 311342-12 E. gilvus 11 329418-05 E. faecium 28 321550-06 E. faecium 45 341772-09 E. dispar 62 319826-12 E. casseliflavus 12 329508-05 E. faecium 29 321895-06 E. faecalis 46 313300-10 E. casseliflavus 63 319825-12 E. casseliflavus 13 330799-05 E. casseliflavus 30 300051-07 E. durans 47 343165-10 E. avium 64 323678-12 E. casseliflavus 14 332468-05 E. faecium 31 301215-07 E. faecalis 48 301121-11 E. mundtii 65 332232-12 E. avium 15 335219-05 E. faecium 32 307250-07 E. pseudoaviu m 49 306519-11 E. gallinarum 16 335422-05 E. faecalis 33 316266-07 E. durans 50 320931-11 E. gallinarum 17 300132-06 E. durans 34 324937-07 E. durans 51 324531-11 E. raffinosus Tabel 2 Liste over 65 Enterococcus-stammer. Prøve nr. 34 er udgået. Side 35 af 44

Bilag 3 Eksempel på et PCR-pladelayout Figur 1 Eksempel på et PCR-pladelayout Bilag 4 Tabeller over ct-værdier, samt middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af forskellige assays In-house 1 vana-assay In-house 2 vana-assay Kontrolstamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) 16,44 16,42 16,43 18,56 18,58 18,57 (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) 15,42 15,35 15,39 17,06 17,13 17,10 (B 700221) E. faecium vanb 38,11 37,50 37,81 - - - (N-AST 4) E. faecalis vanb1 - - - - - - (N-AST 9) E. faecium vanb2 - - - - - - (N-AST 5) E. gallinarum vanc1 - - - - - - (G ATCC 49 573) E. casseliflavus vanc2 - - - - - - (H ATCC 12755) Negativ kontrol - - - - - - (Rnase frit vand) Tabel 3 viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt beregnede middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vana assays. Side 36 af 44

In-house 1 vanb-assay In-house 2 vanb-assay Kontrolstamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) - - - - - - (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) - - - - - - (B 700221) E. faecium vanb 22,11 20,67 21,39 21,48 20,38 20,93 (N-AST 4) E. faecalis vanb1 19,41 19,13 19,27 19,72 18,10 18,91 (N-AST 9) E. faecium vanb2 25,40 25,29 25,39 25,82 24,48 25,15 (N-AST 5) E. gallinarum vanc1 - - - - - - (G ATCC 49 573) E. casseliflavus vanc2 - - - - - - (H ATCC 12755) Negativ kontrol (Rnase frit vand) - - - - - - Tabel 4 viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt beregnede middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vanb assays. In-house 1 vanc1-assay In-house 1 vanc2/3-assay Kontrolstamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) - - - - - - (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) - - - - - - (B 700221) E. faecium vanb - - - - - - (N-AST 4) E. faecalis vanb1 - - - - - - (N-AST 9) E. faecium vanb2 - - - - - - (N-AST 5) E. gallinarum vanc1 21,48 21,18 21,33 - - - (G ATCC 49 573) E. casseliflavus vanc2 - - - 21,28 21,36 21,32 (H ATCC 12755) Negativ kontrol - - - - - - (Rnase frit vand) Tabel 5 viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt beregnede middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vanc assays. Til udregning af middelværdien er følgende formel anvendt: Side 37 af 44

x x x x x... 1 2 3 n n Overføres ovenstående på de opnåede resultater fås følgende: ct 1 ct x 2 2 Nedenstående er eksempel på beregning af middelværdi med udgangspunkt i en dobbeltbestemmelse opnået ved anvendelse af vanc1-assay (tabel 5): x 21,48 21,18 21,33 2 Side 38 af 44

Bilag 5 Rådata Figur 1 Skemaet viser en oversigt over de indsamlede data fra de samme 64 Enterococcus-stammer analyseret med E-test, ulden/ikke ulden og Real time PCR. Resultaterne fra E-test og ulden/ikke ulden holdes op mod resultaterne fra real time PCR som en golden standard, hvorfra der er bedømt om de er falsk Side 39 af 44

negative (FN), sandt negative (SN), sandt positive (SP) eller falsk positive (FP), som ses i de 8 sidste kolonner under tolkning. Dette er gjort for at kunne undersøge E-test og ulden/ikke ulden som anvendes i dagligt brug. U=undetected, der er ikke detekteret et van-gen for den pågældende stamme. Bilag 6 Udregninger til tabel 3 Til udregning af sensitivitet og specificitet er følgende formler anvendt: Sensitivitet = Specificitet = Antal sande positive Antal sande positive + antal falske negative 100 % Antal sande negative Antal sande neagtive + antal falske positive 100 % Følgende skema er brugt som skabelon til at sætte tal ind i, for overblikkets skyld: Metode Resistent Sensitiv I alt Positive SP FP SP + FP Negative FN SN FN + SN I alt SP + FN FP + SN Total E-test Med E. casseliflavus og E. gallinarum: E-test (Med E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive 7 0 7 Negative 10 49 59 I alt 17 49 66 7 Sensitivitet = *100% 41,17647% 41% 7 10 49 Specificitet = *100% 100% 49 0 Ulden/ikke ulden fænomenet Med E. casseliflavus og E. gallinarum: Ulden/ikke ulden fænomenet (Med E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive 4 10 14 Negative 13 39 52 I alt 17 49 66 4 Sensitivitet = *100% 23,52941% 24% 4 13 Side 40 af 44

39 Specificitet = *100% 79,59184% 80% 39 10 E-test Uden E. casseliflavus og E. gallinarum: E-test (Uden E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive 4 0 4 Negative 0 49 49 I alt 4 49 53 4 Sensitivitet = *100% 100% 4 0 49 Specificitet = *100% 100% 49 0 Ulden/ikke ulden fænomenet Uden E. casseliflavus og E. gallinarum: Ulden/ikke ulden fænomenet (Uden E. casseliflavus og E. gallinarum) Resistent Sensitiv I alt Positive 4 10 14 Negative 0 39 39 I alt 4 49 53 4 Sensitivitet = *100% 100% 4 0 39 Specificitet = *79,59184% 80% 39 10 Side 41 af 44

Bilag 7 ct-værdier i dobbeltbestemmelser opnået ved undersøgelse af 64 Enterococcus-stammer vha. real time PCR Side 42 af 44

Side 43 af 44

Side 44 af 44