Indholdsfortegnelse Indledning... 3 Formål... 3 Mål... 4 Problemformulering:... 4 Begrebsdefinitioner... 4 Teori... 5 HTR... 5 Trombocytter... 6 AB0 antistoffer... 7 Saltvands teknik... 8 Glas- /Mikrotiterpladermetoden... 8 Saltvands teknik i gelkort... 9 IAT... 10 Suspensionsmediet... 11 Gelkort med IAT... 11 Analytisk sensitivitet... 12 Serologisk titrering... 12 Metodevalg:... 12 Titerværdierne... 12 Gelkort... 13 De anvendte metoder... 13 Testerytrocytter A1 frem for A2... 13 Kontroller... 13 Aflæsning... 13 LISS... 13 Databehandling... 14 1
Materialer og Metoder... 14 Materialer:... 14 Apparatur:... 14 Reagenser:... 14 Metode... 15 Titreringsrække:... 15 Gelkortmetode med IAT... 15 Gelkortmetode med saltvandsteknik... 16 Glasmetode med saltvandsteknik... 16 Mikrotiterplade med saltvand... 17 Resultater... 17 Diskussion... 21 IAT/ Gelkort... 21 Glasmetoden kontra gelkort... 22 Mikrotiterplader... 23 Kontroller... 24 Effekten af screeningsmetoden på andelen af højtitret komponenter... 25 Indflydelsen af Cut-off titeren på andelen af højtitret prøver... 26 IAT/Gelkort... 27 Forekomsten af transfusionskomplikationer... 28 Pooled og affererede trombocytter... 31 Konklusion... 33 Perspektivering... 34 Litteraturliste:... 35 Bøger... 35 Artikler... 35 Links... 36 2
Indledning Transfusion af minor AB0- uforligelig trombocytkomponenter er associeret med risiko for hæmolytisk transfusions reaktioner (HTR). Minor AB0- uforligelig trombocytter refererer til tilstedeværelse af anti- A eller anti-b i donor plasma, hvilket vil være uforligeligt med A eller B antigener, præsenteret på patientens egne erytrocytter. 8 Det er især anti-a, anti-b og anti- A,B i donorplasma fra blodtype 0, der ved transfusion i tilstrækkelige mængder til patienter med blodtyperne A eller B, kan medføre hæmolytiske transfusionsreaktioner. 8,11 Sådanne hæmolytiske reaktioner kan blive forhindret ved at screene blodtype 0 donorer og opdage dem, der har højtitret anti- A og anti- B i plasmaet, således at trombocytkomponenter fra disse donorer ikke transfunderes til patienter med blodtype A eller B. 13 Den effektive cut-off titerværdi for anti-a og anti- B samt den optimale metode til bestemmelsen af titerværdierne for plasmaet fra blodtype 0 er dog ukendt. 13 Europarådet anbefaler i den forbindelse, screening af donorer for højtitret anti- A og anti-b ved fortynding af plasmaet på minimum 1:50 efterfulgt af enten saltvandsteknik eller indirekte antiglobulin- test (IAT). 2 Der tages dermed ikke højde for, at der kan være tale om forskel i sensitiviteten mellem de to teknikker. Desuden nævnes ikke en konkret metode, teknikkerne skal kombineres med. Saltvandsteknikken kan kombineres med både glas, gelkort og mikrotiterplade metoderne, og IAT teknikken kan også kombineres med glas, gelkort samt mikrotiterplade metoderne. Formål Ved indførelse af screening af type 0 donorblodet, undersøges hvilke blodportioner, der indeholder højtitret anti-a og anti-b i forhold til en fastlagt cut-off titergrænse. Derved sikres, at den pågældende trombocytprodukt kun transfunderes til patienter med en bestemt blodtype. Dette er bl.a. tilfældet i England, hvor type 0 donorblodet screenes for højtitret anti-a af IgM karakter, og blodportioner med en titerværdi der ligger over 1:100 mærkes således, at kun blodtype 0 patienter kan transfunderes med disse. 11 Målgruppen er naturligvis først og fremmest patienterne, da man er interesseret i at reducere risici for transfusions komplikationer i form af bl.a. intravaskulære hæmolyse, som kan opstå som følge af passivt transfunderet højtitret anti-a og anti-b i trombocytpools eller trombaferese. Screening af blodtype 0 donorer for højtitret ABO- antistoffer vil som udgangspunkt medføre frasortering af højtitret blodkomponenter fra blodtype 0, som øremærkes til blodtype 0 patienter. 13 3
For blodbanken vil dette bl.a. betyde, at færre blodkomponenter fra blodtype 0 bl.a. trombocytter vil være til rådighed, når det gælder transfusion af blodtype 0 til blodtype A og blodtype B patienter. Derudover er der tale om en indførelse af en ny analyseprocedurer, der kan kræve flere reagenser såsom suspensionsmedier og erytrocytter, samt flere materialer i form af gelkort og evt. mikrotiterplader til automatiseret analyse. Derudover kan der også blive behov for evt. nyt apparat til udførelse af titreringerne. Dette vil i det hele taget indebære et økonomisk aspekt. Mål Med udgangspunkt i Europarådets anbefaling om en titergrænse på 1:50, og på baggrund af fastlæggelsen af titerværdier på plasmaprøver udtaget fra 100 donorer, undersøges i projektet om det er realistisk at fastlægge cut-off titergrænsen for anti-a og anti-b på 1:50, og dermed betragte trombocytkomponenter fra blodtype 0 med titerværdi på 1:50 eller højere som højtitret. Dette undersøges i forhold til blodbankens samlede produktion af trombocytkomponenter fra blodtype 0, andelen af trombocytter der som følge af screeningen frasorteres samt andelen af trombocytter der efterfølgende vil være til rådighed for patienter med blodtyperne A og B. Problemformulering: Hvorvidt er Europarådets anbefaling om titerværdien på 1:50 en realistisk grænse for højtitret anti -A og anti -B i blodtype 0, i forhold til andelen af trombocytkomponenter fra blodtype 0, der efterfølgende vil være til rådighed for patienter med blodtyperne A og B? Begrebsdefinitioner Cut-off titergrænse: Titerværdien for anti-a og anti-b, som udgør grænsen mellem højtitret og lavtitret trombocytkomponenter fra blodtype 0. Metoder: I forsøget har vi valgt at definere metoderne som glas, gelkort og mikrotiterplader. Teknikker: I forsøget har vi valgt at definere teknikkerne som Indirekte Antiglobulin Test (IAT) og Saltvandsteknikken. 4
Teori HTR Ved transfusionsreaktion forstås enhver ugunstig transfusionsrelateret reaktion, der opstår hos patienten under eller efter transfusion af blodprodukter. 4 Hæmolytisk transfusionsreaktion (HTR) opstår enten øjeblikkeligt dvs. indenfor 24 timer 5 efter en transfusion, eller nogle dage (3 til 7) senere. 4 HTR opstår ofte ved transfusion af uforligelige erytrocytter, men kan også opstå ved transfusion af plasma eller trombocytkomponenter indeholdende ABO uforligeligt plasma. Ved HTR kan erytrocytterne destrueres ved intravaskulære eller ekstravaskulære hæmolyse. I begge hæmolyse tilfælde bindes patientens antistoffer til de transfunderede uforligelige erytrocytter, hvilket resulterer i dannelsen af et antigen-antistof kompleks på erytrocytternesoverflade. 4 Ved intravaskulære hæmolyse bindes et komplement molekyle til antigen-antistof komplekset, hvorved komplementsystemet aktiveres og resulterer i erytrocytternes hæmolyse. 5 Det er oftest anti-a og anti- B af IgM karakter, der er involveret. 3 Som følge af intravaskulære hæmolyse bliver der bl.a. frigivet hæmoglobin, som i begrænset omfang bindes til plasmaproteinet haptoglobin. Ved en hæmoglobin mængde, der overskrider haptoglobinets bindings kapacitet, kan hemoglobinemia, (frit hæmoglobin i plasmaet) og efterfølgende hæmoglobinurea (hæmoglobin i urin) opstå. 5 Som følge deraf kan nyrer og lever skade opstå. 4 Intravaskulære hæmolyse opstår oftest som følge af ABO antistoffer. 5 Aktiveringen af komplementsystemet via den klassiske aktiveringsvej fremgår af figur 1. 4 5
Fig. 1. Komplement aktiveringen via den klassiske vej. Ved ekstravasculære hæmolyse fjernes erytrocytterne fra blodbanen og destrueres af fagocytterne. Antistoffer, der involveres i denne hæmolyse er typisk af IgG karakter som anti- Jk a, -K og -Fy a. Ekstravaskulære hæmolyse er sjældent ligeså alvorlig som intravaskulære hæmolyse, da IgG antistoffer ikke er i stand til at fuldføre aktiveringen af komplementsystemet. 5 Trombocytter Trombocytter spiller en central rolle i hæmostasen og transfunderes derfor til blødende patienter eller til patienter med høj risiko for blødning. Trombocytkomponenter anvendes til behandling af blødning associeret med trombocytopeni, som er et markant fald i trombocytter. 4 Trombocytopeni kan enten skyldes en nedsat produktion af trombocytter som følge af f.eks. kemoterapibehandling eller øget destruktion af trombocytter som følge af f.eks. en udbredt intravaskulære koagulation (DIC). Yderligere transfunderes trombocytter profylaktisk for at øge antallet af cirkulerende trombocytter og forhindre derved blødning som følge af bl.a. strålebehandling. Dette gør sig især gældende hos stamcelle transplanterede patienter efter kemoterapibehandling. 4 Ved transfusion af trombocytter, kan der enten anvendes trombocytter, der separeres fra fuldblodsportioner eller høstes ved aferese. Ved aferese tappeproceduren overføres donorblodet fra donoren og videre til en aferesemaskine, der centrifugerer blodet. Derved tilbageholdes donor 6
trombocytter og en del plasma, mens erytrocytter, leukocytter samt den resterende plasma mængde returneres til donoren. Afererede trombocytkomponenter indeholder mindst 4 til 6 gange så mange trombocytter som en trombocyt portion, der opsamles fra fuldblod samt ca. 300 ml plasma. 4 Ved anvendelse af trombaferese, er det bl.a. muligt at udvælge trombocytdonorer, der er HLA forligelige med patienter, der efterhånden er blevet alloimmuniseret. 5 Ud over aferesemetoden er buffy coat metoden i Europa den mest udbredte. Fuldblodsportionerne centrifugeres ved høj rotation således at trombocytterne opkoncentreres i buffy coaten. Derefter centrifugeres single eller pooled buffy coats langsomt således at trombocytterne befinder sig i plasma supernatanten. 4 Trombocytopbevaringsvæske anvendes til at erstatte en stor del af plasmaet i trombocytsuspensionerne. Det resterende plasma udgør ca. 20 35 %. 4 Trombocytter opsamlet fra fuldblod transfunderes i form af pools. Både trombocytkomponenter, der er opsamlet fra fuldblod såvel som dem der er høstet ved aferese opbevares ved 20-24º C under fortsat bevægelse i op til 5 dage. 4 Fig. 2. lagdelingen af blodlegemerne ved centrifugering. AB0 antistoffer Antistofferne anti- A og anti- B dannes normalt mod de tilsvarende A og/eller B antigener, man ikke har på egne erytrocytter. Antistofferne beskrives som naturlige forekommende antistoffer, da de ikke dannes som respons på fremmede erytrocytter. AB0 antistoffer er hovedsagligt IgM klasse, der er i stand til at fremme direkte og stærke agglutinater. Bestemmelse af AB0 antistoffer kan først finde sted, når individet er mellem 3 og 6 måneder gammelt. Antistof produktionen er maksimalt når individet er mellem 5 og 10 år, og falder senere i livet. AB0 antistoffer kan forårsage hurtig intravaskulære hæmolyse, hvis patienten transfunderes med den forkerte AB0 type. 4 7
Anti-A fra blodtype B individer og anti-b fra blodtype A individer består hovedsagligt af IgM antistoffer samt mindre mængder af IgG antistoffer. Serum fra blodtype 0 individer indeholder udover antistofferne anti- A og anti-b et anti- A,B antistof, som reagerer med både A og B antigener. 4 Anti A,B molekyler er hovedsagligt IgG, men kan også være IgM eller IgA. 2 Begge AB0 antistoffers immunglobulin klasser reagerer optimalt ved stuetemperatur ca. 20-24 ºC eller lavere og aktiverer komplement systemet ved 37 ºC. 4 ABO antistoffernes evne til at aktivere komplement systemet gør, at de er kliniske vigtige. Ved transfusion af major ABO- uforligelige blod, vil patientens ABO antistoffer aktivere komplement systemet og forårsage akut transfusions reaktion. 5 Saltvands teknik I saltvandsteknikken anvendes 0,9 % fysiologisk saltvand som et suspensionsmedium til in vitro påvisning af IgM antistoffer. 5 IgM - antistof molekylet er et pentamer med 10 antigenbindingssteder og kan pga. størrelse og struktur spænde over en afstand på ca. 30 nm. Derfor kan IgM antistoffer let spænde over afstanden (ca. 30 nm) mellem erytrocytter suspenderet i fysiologisk saltvand, hvorved de binder sig til tilsvarende antigener på flere erytrocytter samtidigt. Antigen- antistof reaktionen indtræder spontant under inkubationen ved ca. 4-24º C. 4 IgM antistoffer er dermed i stand til at fremme direkte agglutination, som fremmes ved centrifugering. 3,4,6 Via figur 2 ses IgM antistoffets størrelse og dermed evnen til at fremme agglutination. 4 Fig. 3. IgM antistoffets evne, til at danne agglutination. Glas- /Mikrotiterplader metoden Saltvandsteknikken kan kombineres med Plade og glasmetoden. I glasmetoden aflæses agglutinater øjeblikkeligt efter centrifugering, hvor evt. agglutination vil observeres som en lille klump i bunden 8
af glasset. 5 Ved aflæsning af reaktioner i glas rystes glasset forsigtigt indtil erytrocytterne er rystet op fra bunden, hvorefter agglutinationens styrke kan bedømmes. Oprystningen er det svage punkt ved denne metode, da svage agglutinater kan let rystes i stykker. 6 Ligeledes oprystes mikrotiterpladerne efter centrifugeringen i henhold til procedurerne i laboratoriet og derefter står de i hvile i ca. 60 sekunder, hvorefter aflæsningen kan finde sted. Overensstemmelse i bestemmelsen af agglutinationsstyrkerne er nødvendigt. Derfor anvendes et standardiseret gradueringsskema, der sikrer semiqvantitative resultater for de observerede reaktioner. Ved observering af agglutinater kan der gradueres fra 1-4. Graduering af agglutinater ses ud fra figur 3 5 Fig.4. Gradueringsprincippet i glasmetoden. Saltvands teknik i gelkort Gelkort metoden påviser anigen-antistof reaktionerne vha. mikrosøjler fyldt med dextranacrylamide gel partikler, der er suspenderet i et diluent eller et reagens. 4 Gel partiklerne udgør 75 % af gel opløsningen. Oven på gelen er der et reaktionskammer, hvortil prøvematerialet overføres og inkuberes. Gelen virker som et reaktionsmedie og et filter, der under centrifugering tilbageholder agglutinerede erytrocytter mens uagglutinerede erytrocytter sænkes i bunden. Gelkort kan være neutrale eller tilsatte reagenser som AHG. Et neutralt gelkort indeholder ingen reagenser, og fungerer blot som et filter for agglutinater, hvilket benyttes ved saltvandsteknikken. 4 Gelkort kan generelt anvendes på samme måde som glas og mikrotiterplader. 6 Neutrale gelkort anvendes hovedsageligt til screening og identificering af antistoffer med både enzym behandlede og ikke behandlede erytrocytter samt til den reverse ABO typebestemmelse. 4 9
Agglutinationsreaktionerne gradueres fra 1+ til 4+, hvor 4+ er en solid klump af agglutinerede erytrocytter på toppen af gel søjlen, mens 1+ er mindre svage agglutinater i den nederste del af søjlen. Gradueringsprincippet ses ud fra figur 4. 4 Fig.5. Gradueringsprincippet i gelkort. Der er flere fordele ved gelkort metoden i forhold til glasmetoden. Standardiseringen er en af de vigtigste fordele, da der i gelkort ikke vil være tale om oprystning, som ellers finder sted ved anvendelsen af glasmetoden og kan medføre opløsning af svage agglutinater. Oprystning af glas varierer fra en bioanalytiker til en anden, hvilket kan resultere i variation i aflæsning, graduering og dermed fortolkning af resultaterne. I gelkortmetoden er der derimod tale om stabiliserede og veldefinerede agglutinater, der sikrer ens resultater, der kan reproduceres. Blandt de andre fordele ved gelkort metoden, er kravet om mindre prøvemateriale samt den fremhævede sensitivitet, specificitet og muligheden for automatisering. Der er dermed tale om forbedret produktion og standardisering i forhold til traditionel glasmetode. 4 IAT Med undtagelse af anti- A, -B og -A,B reagerer IgG antistoffer sædvanligvis ikke i saltvandsmiljø. 6 IgG antistof molekyler betsår af 2 antigenbindingssteder, som kun kan spænde over en afstand på 14-15 nm. Da afstanden mellem erytrocytter suspenderet i fysiologisk saltvand er ca. 30 nm vil IgG antistoffer kun sjældent kunne agglutinere erytrocytter. Derfor kaldes IgG antistoffer for inkomplette antistoffer, da de ikke direkte kan fremme agglutination af erytrocytter. 3,6 Til påvisning af inkomplette antistoffer anvendes indirekte antiglobulin test (IAT). Indirekte Antiglobulin test 10
anvendes til påvisning af in-vitro sensibiliserede erytrocytter. Princippet er baseret på antihuman globuliner (AHG), som er opsamlet fra immuniserede dyr arter og kan binde sig til humane globuliner såsom IgG eller komplement molekyler. Ved at tilsætte AHG indeholdende anti- IgG til erytrocytter, der er sensibiliseret med IgG antistoffer, vil AHG binde sig til flere sensibiliserede erytrocytter samtidigt, hvorved agglutination fremmes. 4,5 AHG er derved et af de vigtigste reagenser, der gør analyserne i blodbanken mere sensitive. 4 Fig. 6. Funktionen af AHG i IAT. 17 Suspensionsmediet Erytrocytter er negativt ladet og vil i saltvandsmiljø derfor være omgivet af positivt ladede ioner, som vil lægge sig som sky omkring erytrocytterne. Jo færre ioner der er i reaktionsmediet, des lettere vil antistof få adgang til antigenerne. 3,6 Ved at anvende LISS (Lav Ion Styrke Saltvand) frem for normalt ion styrke saltvandvand sænkes antallet af frie Na - og Cl - ioner, hvorved reaktionshastigheden øges. Dette hænger sammen med at antallet af ioner, der i normal saltvands opløsning vil neutralisere de modsatte ladninger på antigenerne og antistofferne reduceres, hvorved hastigheden for dannelsen af antigen-antistof kompleks øges. 3 Derfor er der i forbindelse med anvendelse af LISS tale om en reduktion i inkubationstiden fra ca. 30 minutter til 10-15 minutter. 4 Anvendelsen af LISS som et reaktionsmedie øger muligheden for sensibilisering, men hæmmer samtidigt agglutinationen, da den elektriske spænding (zeta potentialet), der får erytrocytter til at frastøde hinanden øges. Som følge af en øget frastødning øges afstanden mellem de negative ladede erytrocytter, hvorved agglutinationsevnen nedsættes. Agglutination kan efterfølgende visualiseres ved tilsætning af AHG. 6 Gelkort med IAT I 1980 opdagede Dr. Yves Lapierre en gel metode, der visualiserer agglutination, hvilket blev udviklet af DiaMed AG. Metoden kræver ingen vaske trin, som man ellers anvendte i forbindelse med IAT i glasmetoden. 3 Dette skyldes, at den afpipetterede erytrocytsuspension samt plasmaet centrifugeres efter inkubationen ved 37º C, hvorved reaktionsmediet forbliver i det øvre 11
reaktionskammer ovenpå gelen. Dette resulterer i adskillelse af erytrocytterne fra reaktionsmediet uden et vasketrin. 4,5 I gelkort indeholdende AHG, vil erytrocytterne under centrifugering komme i kontakt med AHG i den øverste del af gelen, hvorved de sensibiliserede erytrocytter danner agglutinater og tilbageholdes af gelen, mens uagglutinerede erytrocytter centrifugeres ned i bunden. 3,5 Da de flydende reagenser ikke kan trænge ind i gelen, er der ingen risiko for at AHG reagenset kan neutraliseres, hvilket kan finde sted i glas metoden. 3 Desuden er svage positive reaktioner også mere robuste i IAT i gelkort sammenlignet med IAT i glasmetoden, da der ikke kan forekomme adskillelse af antigen-antistof komplekset ved f.eks. et kraftigt vasketrin 3 Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet er et mål for, hvor følsom analysemetoden er overfor det stof der skal måles. Sensitiviteten er et udtryk, for hvor meget responset ændres, når koncentrationen ændres. Jo mindre koncentration af et stof, der skal til for at udløse en signalændring, des større sensitivitet. 1 Serologisk titrering Ved serologisk titrering forstås en halveringstitrering, som er en serie af fortyndinger, hvor koncentrationen af antistof i en tilfældig fortynding i serien altid er det halve af den foregående fortynding. 6 Fortyndingerne af serum indeholdende bestemte antistoffer testes overfor erytrocytter med tilsvarende antigener. Et antistofs styrke vurderes ved at finde den højeste fortynding, hvor antistoffet kan agglutinere erytrocytter. Den højeste fortynding af antistoffet, der giver positiv reaktion er antistoffets titer. Titeren angives som den reciprokke værdi af den højeste fortynding af antistoffet hvorved agglutination observeres. 6,4 Overførsel af en højere antistofkoncentration fra et foregående glas kan medføre falsk titerværdi. Derfor kan udskiftning af pipette spidser mellem hver glas under fremstillingen af fortyndingerne samt aflæsning fra den mest fortyndede glas til den mindst fortyndet hjælpe på at undgå problemet. 4 Metodevalg: Titerværdierne: Problemet undersøges, ved at udføre en halveringstitrering af donor plasma fra blodtype 0. Plasmaet fortyndes i forholdene: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 og 1: 1024, dels fordi de dokumenterede hæmolytiske transfusionsreaktioner i forbindelse med transfusion af trombocytter indeholdende ABO uforligelig plasma, er påvist med en titterværdi fra 1:32 8, og dels fordi der opnås fortyndinger af plasmaet der ligger hhv. over og under den anbefalede fortynding fra Europarådet. Da fortyndingen på 1:50 ikke ligger inden for den valgte titreringsrække udføres en separat fortynding på 1:50. Det fortyndede plasma fra hver donor testes overfor A 1 og B testerytrocytter med henblik på at finde titerværdien. 12
Gelkort: Da plasma fra blodtype 0 indeholder både IgG og IgM antistoffer, anvendes i forsøget både neutrale gelkort indeholdende NaCl og gelkort tilsat Anti Human Globulin (AHG) reagens således, at begge Immunglobulin klasser kan indgå i reaktioner. De anvendte metoder: Gelkort- glas- og mikrotiterplade metoderne anvendes, da disse er til rådighed på Rigshospitalet, og kan kombineres med de teknikker der nævnes i Europarådets anbefaling til minimum kravene. Mikrotiterpladernes metode kombineret med IAT teknikken fravælges, da IAT teknikken i mikrotiterpladerne anvendes normalt i forbindelse med screentesten, hvori brøndene i forvejen er coatet med antigenerne fra fabrikanten. Da dette i praksis ikke er muligt hverken for os eller personalet kan det ikke lade sig gøre at anvende mikrotiterpladerne kombineret med IAT. Glasmetoden kombineret med IAT udelades, da denne teknik aldrig vil bruges i laboratoriet, hvis man skulle indføre screeningen for højtitret anti-a og anti-b. Dette skyldes indførelsen af gelkort metoden, som er en standardiseret metode i forhold til glas metoden og er mere eftertragtet i laboratorierne pga. nemheden samt effektiviteten i forhold til glasmetoden. Testerytrocytter A1 frem for A2: Påvisningen af flest mulige reaktioner mellem erytrocytter fra blodtype A og plasma fra blodtype 0 er blandt målene i forsøget, da det er den risiko der er forbundet med transfusion af blodkomponenter fra blodtype 0 til blodtype A patienter. Derfor anvendes testerytrocytter fra A blodtypen, der kan påvise flest mulige reaktioner, hvilket opfyldes via blodtype A 1, som har flest A antigener på erytrocytterne og påviser dermed flere reaktioner end A 2. Ydereligere fremgår valget af A 1 blodtypen også af artiklerne samt Europarådets anbefaling. 1 Kontroller: Der anvendes plasma fra blodtype A og B, som kontrol for de anvendte A 1 og B testerytrocytter. De polyklonale humaneantistoffer fra blodtyperne A og B repræsenterer forsøgsmaterialet og kontrollerer både de anvendte testerytrocytter samt de anvendte metoder/teknikker. Aflæsning: For at minimere fejlkilder som følge af forskellige aflæsninger, er aflæsningerne stort set blevet fordelt således, at den ene af os aflæser gelkort, mens den anden aflæser mikrotiterplader samt glassene. LISS: Suspensionsmediet LISS anvendes normalt efterfulgt af IAT teknikken, da suspensionsmediet på trods af, at det øger reaktionshastigheden og dermed sensibiliseringen hæmmer agglutinationen. 13
Dog anvendes LISS i forsøget også som et suspensionsmedie i forbindelse med saltvandsteknikken i gelkort. Dette skyldes, at vi følger arbejdsproceduren i laboratoriet, hvori LISS anvendes som et suspensionsmedie i forbindelse med alle gelkort metoderne. Dette er noget producenten af kortene anbefaler. Databehandling: Dataene plottes ind i en (X,Y) - graf, hvor prøvenumrene udgør X-aksen mens titerværdierne udgør Y-aksen. Derved visualiseres den overordnede fordeling af titerværdierne for de enkelte prøver i de forskellige metoder og teknikker. Desuden afspejles procentfordelingen for titerværdierne for hver af anti-a og anti-b i de forskellige metoder og teknikker vha. søjlediagrammer. Materialer og Metoder Materialer: Apparatur: 2 DiaMed digitalpipetter Finnpipetter 40 200 µl DiaMed ID inkubator 37 SI DiaMed ID centrifuge 24 S HETO bordcentrifuge Analyseglas Stativ Reagenser: PBS (phosphate buffered saline-0,9 % saltvand) RAP 9468201, 12/12/2009 DiaMed Cellstab (LISS) Lot nr: 05740.05.10 Diluent Immucor Gamma, ( metylcellulose og 0,1 % natriumazid) Lot nr: 772071, 2010-05-04 DiaMed ID gelkort: NaCl, enzyme test and cold agglutinins, Lot nr: 50520.27.46 DiaMed ID gelkort: Coombs Anti-IgG, Lot: 50540.60.09 Til påvisning af antistofferne i plasmaet blev testerytrocytterne vasket i henhold til laboratoriets procedure, hvorefter følgende suspensioner blev fremstillet: A 1 og B 1 % erytrocytsuspension i DiaMed cellstab (til gelkortmetoden) A 1 og B 5 % erytrocytsuspension i PBS (til glasmetoden) 14
A 1 og B 1 % erytrocytsuspension i Diluent (til mikrotiterplade metoden) Som kontrol for de anvendte testerytrocytter: Anvendes plasma med blodtyperne A og B fra blodbankens produktion i Rigshospitalet Forsøgsmateriale: 100 EDTA plasma prøver med blodtypen 0 fra blodbankens produktion i Rigshospitalet Metode Titreringsrække: Der udføres en titreringsrække, for hver enkelt prøve ved at fortynde plasmaet i saltvand i følgende forhold: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512 og 1:1024. Dette er en halveringstitrering hvor mængden af plasmaet i hvert glas er det halve af det foregående glas. Der opsættes en titreringsrække á 12 titreringsglas Rækken mærkes med 12 titreringsetiketter (1:1 til 1:1024), hvorpå prøvenummer påskrive Der tilsættes 500 µl 0,9 % PBS til alle glas, bortset fra glas 1 (1:1) 500 µl donorplasma tilsættes hver af glassene 1(1:1) og 2 (1:2) I glas 2 blandes plasmaet grundigt med det tilsatte PBS Fra glas 2 overføres 500 µl fortyndet plasma til glas 3 (1:4) Overførslen af det fortyndede plasma fortsættes rækken ud, hvor der hver gang overføres 500 µl. I titreringsglas nr. 12 udføres en enkelt fortynding på 1:50 således: Dvs. fortyndingen udføres ved at fortynde 10 µl plasma i 490 µl saltvand. Gelkortmetode med IAT 2 anti-igg gelkort mærkes med prøve nummer og brøndende mærkes med titerværdier 12 brønde, svarende til de 12 titreringsglas, tilsættes 50 mikroliter 1 % Cellstab erytrocytsuspension (blodtype A 1 ), fremstillet af A 1 testerytrocytter 25 mikroliter fortyndet plasma fra glas 12 tilsættes til brønd 12. Dette fortsættes indtil glas 1 Gelkortene inkuberes 15 minutter ved 37 grader i varmeblokken 15
Derefter centrifugeres gelkortene i gelkortcentrifuge Aflæsningen foregår fra brønd 12 1 Fremgangsmåden gentages ved at teste plasmaet fra de 12 titreringsglas overfor B testerytrocytter Som kontrol medtages 4 brønde, hvori A og B testerytrocytterne som anvendes i forsøget, testes overfor både A og B plasma. Gelkortmetode med saltvandsteknik 2 DiaMed ID gelkort: NaCl, enzyme test and cold agglutinins mærkes med prøve nummer og brøndende mærkes med titerværdier Til alle 12 brønde tilsættes 50 mikroliter 1 % Cellstab erytrocytsuspension fremstillet af testerytrocytter fra blodtype A 1 25 mikroliter fortyndet plasma fra glas 12 tilsættes til brønd 12. Dette fortsættes indtil glas 1 Gelkortene inkuberes 15 minutter ved 20 grader Derefter centrifugeres gelkortene i gelkortcentrifuge Aflæsningen foregår fra brønd 12 1 Fremgangsmåden gentages med B testerytrocytter Som kontrol medtages 4 brønde, hvori A og B testerytrocytterne som anvendes i forsøget, testes overfor både A og B plasma. Glasmetode med saltvandsteknik 12 analyseglas mærkes med prøve nummer og titerværdier Til alle 12 glas tilsættes 1 dråbe 5 % saltvands erytrocytsuspension fremstillet af A 1 testerytrocytter 2 dråber fortyndet plasma fra titreringsglas nr. 12 tilsættes analyseglas nr. 12. Dette fortsættes indtil glas 1 Glassene inkuberes i 10 minutter ved 20 grader Derefter centrifugeres i ½ minut i HETO bordcentrifuge Aflæsningen foregår fra glas 12 1 Fremgangsmåden gentages med testerytrocytter fra blodtype B Som kontroller medtages 4 glas hvori A og B testerytrocytterne, som anvendes i forsøget, testes overfor både anti- A og -B i plasma fra blodtype B og A, ved at tilsætte 2 dråber plasma overfor en dråbe 5 % erytrocytsuspension. 16
Titerværdier Titerværdier Bachelorprojekt Andelen af højtitret trombocytportioner ved anvendelsen af EU - Rådets anbefaling Mikrotiterplade med saltvand Brøndene A1 A12 tilsættes 50 µl 1 % diluent erytrocytsuspension fremstillet af testerytrocytter fra blodtype A 1 10 µl fortyndet plasma fra glas 12 tilsættes brønd A12. Dette fortsættes indtil glas 1 og brønd A1 Resultater Pladen inkuberes i 10 minutter ved 20 grader Derefter centrifugeres i 2 minutter ved 600 omdr./min Fremgangsmåden gentages med testerytrocytter fra blodtype B IAT I Gelkort 1050 1000 950 900 850 800 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 50 100 150 200 Prøvenr Fig. 7. Fordelingen af 200 titerværdier, der blev opnået ved screening af 100 plasmaprøver med A 1 og B testerytrocytter i IAT teknikken kombineret med gelkort metoden. Dog er de sidste 7 prøver med titeren 2048 ikke medtaget her, for at opnå bedre visualisering af fordelingen af titerværdierne. Saltvandsteknik I Gelkort 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 50 100 150 200 Prøvenr Fig. 8. Fordelingen af 200 titerværdier, der blev opnået ved screening af 100 plasmaprøver med A 1 og B testerytrocytter i saltvandsteknikken kombineret med gelkort metoden. 17
Procentandel % Titerværdier Titerværdier Bachelorprojekt Andelen af højtitret trombocytportioner ved anvendelsen af EU - Rådets anbefaling Saltvandsteknik I Glas 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 50 100 150 200 Prøvenr Fig. 9. Fordelingen af 200 titerværdier, der blev opnået ved screening af 100 plasmaprøver med A 1 og B testerytrocytter i saltvandsteknikken kombineret med glas metoden. En enkelt prøve med en titerværdi på 1024 er ikke medtaget her, for at opnå bedre visualisering af titerværdierne. Saltvandsteknik I Mikrotiterplader 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 50 100 150 200 Prøvenr Fig. 10. Fordelingen af 200 titerværdier, der blev opnået ved screening af 100 plasmaprøver med A 1 og B testerytrocytter i saltvandsteknikken kombineret med mikrotiterplader metoden. 30 25 Anti-A I IAT Gelkort 26 25 20 15 16 12 10 5 0 2 1 1 4 8 3 3 2 16 32 50 1 64 Titerværdier 6 4 0 128 256 512 1024 2048 4096 Fig. 11A. Procentfordelingen af titerværdierne for anti-a i IAT teknikken i gelkort. 18
Procentandel % Procentandel % 2 4 8 16 32 50 64 128 256 512 1024 2048 4096 Procentandel % Bachelorprojekt Andelen af højtitret trombocytportioner ved anvendelsen af EU - Rådets anbefaling 20 Anti-B I IAT Gelkort 19 19 19 15 10 5 0 0 5 6 4 7 8 9 1 3 0 Titerværdier Fig. 11B. Procentfordelingen af titerværdierne for anti-b i IAT teknikken i gelkort. 30 25 20 15 10 5 0 2 0 4 10 Anti-A I Saltvandsteknik I Gelkort 8 5 16 16 32 26 50 5 64 23 13 Titerværdier 2 0 0 0 0 128 256 512 1024 2048 4096 Fig. 12A. Procentfordelingen af titerværdierne for anti-a i saltvandsteknikken i gelkort. Anti-B I Saltvandsteknik I Gelkort 30 25 20 15 10 5 0 2 6 10 22 15 10 16 13 5 1 0 0 0 2 4 8 16 32 50 64 128 Titerværdier 256 512 1024 2048 4096 Fig. 12B. Procentfordelingen af titerværdierne for anti-b i saltvandsteknikken i gelkort. 19
Procentandel % Procentandel % 2 4 8 16 32 50 64 128 256 512 1024 2048 4096 Procentandel % Bachelorprojekt Andelen af højtitret trombocytportioner ved anvendelsen af EU - Rådets anbefaling 25 20 Anti-A i Glasm etoden 20 22 16 15 15 10 5 0 0 1 10 7 6 3 0 0 0 Titerværdier Fig. 13A. Procentfordelingen af titerværdierne for anti-a i saltvandsteknikken i glasmetoden. 25 20 15 10 5 0 2 0 4 7 8 9 16 Anti-B I Glasm etode 23 32 15 50 11 64 20 8 Titerværdier 3 3 1 0 0 128 256 512 1024 2048 4096 Fig. 13B. Procentfordelingen af titerværdierne for anti-b i saltvandsteknikken i glasmetoden. Anti-A I Mikrotiterplader 30 25 20 15 10 5 0 1 7 19 24 16 7 17 7 2 0 0 0 0 2 4 8 16 32 50 64 Titerværdier 128 256 512 1024 2048 4096 Fig. 14A. Procentfordelingen af titerværdierne for anti-a i saltvandsteknikken i mikrotiterplader. 20