EGFR pharmdx. Kode K1492 35 analyser til manuelt brug Udgave 9/27/2006. Tilsigtet anvendelse Til in vitro diagnostisk brug.

EGFR pharmdx Kode K1492 35 analyser til manuelt brug Udgave 9/27/2006 Tilsigtet anvendelse Til in vitro diagnostisk brug. EGFR pharmdx -analysen er et kvalitativt immunhistokemisk (IHC) sætsystem til identificering af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR)- ekspression i normalt og neoplastisk væv, der er rutinemæssigt fikseret med henblik på histologisk evaluering. EGFR pharmdx detekterer specifikt EGFR-proteinet (HER1) i EGFR-udtrykkende celler. EGFR pharmdx er indiceret som en hjælp ved identificering af colonrektale cancerpatienter, som kan tilbydes behandling med ERBITUX (cetuximab) eller Vectibix (panitumumab). Resume og forklaring Indledning Epidermal vækstfaktorreceptor er en 170 kd transmembranreceptor, der er kodet af det humane HER1-gen. EGFR-proteinet indeholder et ekstracellulært ligand-bindende domæne, en transmembranregion og et intracellulært domæne med egen protein-tyrosinkinase-aktivitet. EGFR er homologt med andre medlemmer af EGF-receptor/erbB-familien, herunder HER2/erbB2 eller neu, HER3/erbB3 og HER4/erbB4. 1,2 EGFR-proteinet udtrykkes af flere forskellige normale celler, herunder mange epitelcelletyper og tumorer afledt af disse. 3-9 Blandt de ikkeepitelcelletyper, der udtrykker EGFR, findes glat muskulatur, fibroblaster og nerver. 10 Specificitet Monoklonal murin anti-human EGFR, klon 2-18C9 leveres som en hybridoma-vævskultursupernatant, der er fremstillet af en mus, der er immuniseret med EGFR, som er immunudfældet fra A431-cellelinjen (humant epidermoidt karcinom). Epitop-mapping-undersøgelser indikerer, at antistoffet genkender en epitop i den ekstracellulære cysteinrige region af molekylet, der strækker sig over underdomæne S2 og proksimalt til transmembrandomænet. Yderligere mapping af kritiske aminosyrer indikerer, at epitopen er konformationel og afhængig af disulfid-broer i det native molekyle. 11 Denne monoklonale antistofklon har vist sig ikke at krydsreagere med HER2, HER3 eller HER4 og vektor-indmærkningen, myc. Cytoplasmatisk farvning ses ofte; dog bør testen gentages, hvis en betydelig cytoplasmatisk farvning gør det vanskeligt at skelne den diagnostiske membranfarvning og fortolke resultaterne. Procedurens princip EGFR pharmdx IHC sætsystemet indeholder de reagenser, som er nødvendige for at udføre en IHC-farvningsprocedure på rutinemæssigt fikserede, paraffinindstøbte præparater. Efter inkubation med det primære monoklonale antistof, klon 2-18C9, mod humant EGFR-protein anvender dette sæt et klar-til-brug-visualiseringsreagens, baseret på dextranteknologi. Dette reagens består af både sekundære ged antimus-antistofmolekyler og peberrodsperoxidase-molekyler, der er bundet til en fælles dextranpolymerbase, hvorved behovet for sekventiel påføring af link-antistof og peroxidasekonjugat elimineres. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilføjede kromogen medfører dannelse af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Kontrolglas, der indeholder to formalinfikserede, paraffinindstøbte humane cellelinjer med en farvningsintensitet på 2+ og 0, medfølger med henblik på kvalitetskontrol af sætreagensernes effektivitet. Reagenser EGFR pharmdx til manuel brug. De anførte materialer rækker til 35 analyser (35 objektglas inkuberet med primært antistof mod EGFR-protein og 35 objektglas inkuberet med det tilsvarende negative kontrolreagens). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 3 dråber af hvert klar-til-brug-reagens pr. objektglas. Sættet indeholder materialer til maks. 5 individuelle farvninger. (108186-003) 305997DK_005 s. 1/13

Medfølgende materialer Mængde Beskrivelse 1x8 ml Proteinase K < 0,1% Proteinase K proteolytisk enzym, fortyndet i en Tris-HCl buffer indeholdende 0,015 mol/l natriumazid. 1x8 ml Peroxidaseblokker 3% hydrogenperoxid. 1x4 ml EGFR pharmdx monoklonalt murint IgG 1-antistof Monoklonal murin anti- human EGFR (klon 2-18C9) IgG 1 -antistof-vævskultursupernatant i en Tris-HCl-buffer, indeholdende stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1x4 ml Murint IgG 1-negativt kontrolreagens Monoklonal murin IgG 1-antistof-vævskultursupernatant i en Tris-HCl-buffer, indeholdende stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1x8 ml Mærket polymer, HRP Dextranpolymer konjugeret med peberrodperoxidase og affinitetsisolerende ged anti-mus-immunglobuliner. Leveres i Tris-HCl-buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. 1x10 ml DAB+ Substrate Buffer Substratbufferopløsning, ph 7,5, indeholdende < 0,1% hydrogenperoxid, stabilisatorer, forstærkere og et antimikrobielt stof. 1x1 ml Flydende DAB+-kromogen 5% 3,3'-diaminobenzidin i kromogenopløsning. 1x1 l Wash Buffer 10x Tris-bufferjusteret saltvandsopløsning indeholdende Tween 20, ph 7,6. 5 objektglas EGFR pharmdx -kontrolobjektglas Hvert objektglas indeholder vævssnit af to pelleterede, formalinfikserede, paraffinindstøbte humane cellelinjer, som repræsenterer en moderat EGFR-proteinekspression og ingen EGFR-ekspression. IHC-farvningen af cellepillerne er 2+ og 0. Cellelinje: CAMA-1 Ekspressionsniveau: 0 Cellelinje: HT-29 Ekspressionsniveau: 2+ (108186-003) 305997DK_005 s. 2/13

Nødvendige materialer, der ikke medfølger Ammoniumhydroxid, 15 mol/l fortyndet til 0,037 mol/l Kontrastfarve: Hæmatoxylin, alkohol- eller vandbaseret, f.eks. Dakos Hematoxylin (kode S3302) eller Dakos Automation Hematoxylin (kode S3301). Dækglas Destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) Tørreovn, der kan holde en temperatur på 56-60 C Ethanol, absolut og 95% Fugtkammer Lysmikroskop (4x 40x objektivforstørrelse) Monteringsmedium, såsom Dakos Faramount (kode S3025) eller Dakos Glycergel (kode C0563) eller Dakos Ultramount (kode S1964) Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas, Fisher s SuperFrost Plus, poly-l-lysin-belagte objektglas, ladede objektglas eller Dakos Silanized Slides (kode S3003) (se afsnittet Klargøring af prøver) Farvningsglas eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 2-30 minutter) Vaskeflaske Xylen, toluen eller xylen-erstatninger Bemærk: Alle reagenser, som medfølger eller kan købes separat, såsom Dakos Wash Buffer (kode S3006), er formuleret specifikt til anvendelse med denne analyse. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke udskiftes med andre. Klargøring af prøver Biopsipræparater skal behandles, så vævet bevares til IHC-farvning. Der skal anvendes standardmetoder til vævsbehandling til alle præparater. 13 Præparater, som opbevares i nedenstående fiksativer, er egnede til analysering med EGFR pharmdx: 10% (v/v) neutral buffered formalin, 10% (v/v) ikke-buffered formalin, 25% (v/v) ikke-buffered formalin, AFA (acetic formalin alcohol), Richard-Allen Scientific s Pen-fix og Bouin s væske. Væv, der er fikseret i Anatech s PreFer, egner sig ikke til analysering med EGFR pharmdx. Anvendelse af EGFR pharmdx på PreFer-fikserede væv medfører en utilfredsstillende bevarelse af morfologien og kan forårsage fejlbehæftede resultater. 14 Paraffinindstøbte snit Rutinemæssigt behandlede og paraffinindstøbte vævsprøver er egnede til brug. Præparater fra biopsier skal skæres i blokke med en tykkelse på 3-4 mm og fikseres i en periode, der passer til fikseringsvæsken. Vævene skal derefter dehydreres og renses i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af imprægnering med smeltet paraffin. Paraffintemperaturen må ikke overstige 60 C. Korrekt fikserede og indstøbte vævsblokke, der udtrykker EGFR-proteinet, vil holde sig uendeligt inden udskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares køligt (15-25 C). 13,15 Vævssnit skal skæres i en tykkelse på 3-5 µm. Efter udskæringen skal vævene monteres på objektglas og anbringes i tørrestativer. Det anbefales at anvende følgende objektglas: Fisher s SuperFrost Plus, Dakos Silanized (kode S3003), ladede eller poly-l-lysin-belagte objektglas. Objektglasstativerne skal bankes let imod et sugende klæde for at fjerne vand, der er fanget under paraffinen og på glassene, hvorefter de tørres ved stuetemperatur i en time. Stativet med objektglas anbringes derefter i en inkubator ved 56-60 C i en time. Hvis der stadig er overskydende vand på objektglassene, når de tages ud af inkubatoren, fjernes dette ved at banke glassene let imod et klæde, hvorefter de tørres endnu en time i inkubatoren. Når glassene tages ud af inkubatoren, skal de opbevares ved stuetemperatur, indtil de er afkølet, og paraffinen er hærdet. For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, som er monteret på objektglas (Fisher s SuperFrost Plus, poly- L-lysin, ladede eller Dakos Silanized Slides (kode S3003), farves inden 2 måneder efter udskæringen, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20-25 C). 14 Se Dako-håndbogen: Immunochemical Staining Methods 16 (immunkemiske farvningsmetoder) eller reference 13 og 15 vedrørende yderligere oplysninger om klargøring af prøver. Anvendelse af denne analyse på afkalkede væv er ikke godkendt og frarådes. Objektglas, der er påkrævet til EGFR-evaluering og verificering af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Det tilrådes at anvende mindst 5 objektglas: 1 objektglas til verificering af tilstedeværelse af tumorer, 2 objektglas til evaluering af EGFRprotein (et objektglas til primære antistoffer og et objektglas til negativt kontrolreagens) og 2 objektglas som reserve. Sikkerheds-foranstaltninger 1. Til professionelle brugere. 2. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3), et kemikalie, der er yderst giftigt i ren form. Selvom det ikke er klassificeret som farligt, kan ophobninger af NaN 3 i produktkoncentrationer reagere med bly- og kobberrør og danne yderst eksplosive metalazider. Ved bortskaffelse skal der skylles med store mængder vand for at forhindre azidophobninger i rørene. 17 3. Som ved alle produkter, der er afledt af biologisk materiale, gælder det, at præparater og reagenser skal håndteres på korrekt vis. 4. Minimér mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå uspecifik farvning. 5. Andre inkubationstider, -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 6. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvning. 7. Undlad at udskifte primære antistoffer eller negative kontrolreagenser med primære antistoffer og negative kontrolreagenser fra andre produktionspartier (partinummeret fremgår af flaskernes etiket) eller med reagenser fra andre producenter. 8. Mærket polymer, flydende Liquid DAB+-kromogen og klargjort DAB+-substratkromogenopløsning kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 9. Brug egnet personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 18 Ubrugte opløsninger skal bortskaffes i overensstemmelse med den lokale og nationale lovgivning. 10. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. (108186-003) 305997DK_005 s. 3/13

Risiko- og sikkerhedserklæringer DAB-Kromogen R 40 Mulighed for kræftfremkaldende effekt. R43 Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. R68 Mulighed for varig skade på helbred. S35 Materialet og dets beholder skal bortskaffes på en sikker måde. S 36/37 Brug særligt arbejdstøj og egnede beskyttelseshandsker. Som hovedregel må personer under 18 år ikke deltage i arbejdet med dette produkt. Brugerne skal have omhyggelige anvisninger om den korrekte arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsanvisninger (efter EUs direktiv 94/33/EF). Opbevaring Opbevar EGFR pharmdx-sætsystemet ved 2-8 C. Kontrolobjektglas skal ligeledes opbevares ved 2-8 C. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt udvendigt på æsken. Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Derfor skal der udføres positive og negative kontroller samtidig med patientpræparater. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er angivet på indlægssedlen, skal brugeren verificere disse betingelser. 12 Klargøring af reagens Følgende reagenser skal klargøres forud for farvning: Vaskebufferopløsning Klargør en tilstrækkelig mængde vaskebuffer ved at fortynde vaskebuffer 10x, 1:10 med destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) til vasketrinnene. Kassér bufferen, hvis den er uklar. DAB+-substratkromogenopløsning Denne opløsning skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. Nedenstående procedure giver 1 ml DAB+ substratkromogenopløsning. TRIN 1. Overfør 1 ml DAB+ substratbuffer til et prøverør. TRIN 2. Tilsæt én dråbe flydende DAB+ kromogen. Bland og påfør på vævssnittene med en pipette. Klargjort Substrate-Chromogen Solution (DAB) er stabilt i ca. 5 dage, når opløsningen opbevares ved 2-8 C. Vigtig bemærkning: Farven på den flydende DAB+ kromogen i flasken kan variere fra klar til lys lavendelbrun. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i henhold til ovenstående retningslinjer. Hvis der tilsættes for meget flydende DAB+ kromogen til DAB+ substratbufferen, vil det medføre en forringelse af det positive signal. Kontrastfarve Klargør om nødvendigt ammoniakvand til kontrastblånelse. Ammoniakvand (0,037 mol/l) klargøres ved at blande 2,5 (±0,5) ml 15 mol/l (koncentreret) ammoniumhydroxid med 1 liter vand af reagenskvalitet. Ubrugt 0,037 mol/l ammoniakvand kan opbevares ved stuetemperatur (20-25 C) i en flaske med tætsluttende prop i max. 12 måneder. Monteringsmedie Monteringsmedier såsom Dakos Faramount Aqueous Mounting Medium, klar-til-brug (kode S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kode C0563) anbefales til vandig montering. Glycergel gøres flydende ved opvarmning til ca. 40(±5) C inden brug. Ikke-vandig, permanent montering kan også anvendes, såsom Dakos Ultramount (kode S1964). Farvningsprocedure Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se afsnittet Forholdsregler). Alle reagenser skal have stuetemperatur (20 25 C) inden immunfarvningen. Desuden skal alle inkubationer foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget non-specifik farvning. Udtørring af vævssnit kan forhindres ved at anbringe objektglassene i et fugtkammer. Afparaffinering og rehydrering Forud for farvning skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og derefter skal de rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmedium vil medføre øget uspecifik farvning. TRIN 1. TRIN 2. TRIN 3. TRIN 4. Objektglassene anbringes i et xylenbad og inkuberes i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. Overskydende væske bankes af, og objektglassene anbringes i absolut ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. Overskydende væske bankes af, og objektglassene anbringes i 95% ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. Overskydende væske bankes af, og objektglassene anbringes i vand af reagenskvalitet i 5 (±1) minutter. Påbegynd farvningsproceduren som beskrevet i afsnit C, Farvningsprotokol. Xylen- og alkoholopløsningerne skal udskiftes efter 40 objektglas. (108186-003) 305997DK_005 s. 4/13

Toluen- eller xylenerstatninger, så som Histoclear, kan anvendes i stedet for xylen. Farvningsprotokol TRIN 1. Proteinase K proteolytisk fordøjelse Overskydende vand af reagenskvalitet bankes af. Brug en fnugfri klud (f.eks. Kimwipe eller gaze) og tør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenserne inden for det foreskrevne område. Påfør tilstrækkeligt med proteinase K-opløsning til at dække præparatet (mindst 3 dråber (100 µl)). Inkuber i 5 (±0,5) minutter. Skyl forsigtigt med vand af reagenskvalitet fra en vaskeflaske (undgå at vandet rammer vævet direkte). Anbring i friskt vandbad med vand af reagenskvalitet i 5 (±1) minutter. EGFR pharmdx omfatter forbehandling ved anvendelse af et proteolytisk enzymfordøjelsestrin. Det kan ske, at vævssnit overfordøjes, hvilket medfører, at cellemembraner og den generelle vævsstruktur ødelægges. Vær ekstra omhyggelig med det proteolytiske fordøjelsestrins varighed under analysen. Bemærk: Hvis overfordøjelse er et vedvarende problem, kan væv fikseret i 10% neutral buffered formalin efterfikseres i 10% neutral buffered formalin i 10 minutter efter afparaffineringen. Se nedenstående procedure: Efterfiksering 1. Afparaffinér snittene og nedsænk dem i vand af reagenskvalitet. 2. Nedsænk objektglassene i 10% neutral buffered formalin i 10 minutter. 3. Skyl objektglassene to gange i deioniseret eller destilleret vand. 4. Fortsæt med EGFR pharmdx-farvningsproceduren. TRIN 2. TRIN 3. TRIN 4. TRIN 5. Peroxidase-blokker Bank overskydende vand af og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Påfør tilstrækkeligt med peroxidase-blokker til at dække præparatet (mindst 3 dråber (100 µl)). Inkuber i 5 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med vaskebuffer fra en vaskeflaske (undgå at vandet rammer vævet direkte). Anbring i friskt vandbad med vaskebuffer i 5 (±1) minutter. Primært antistof eller negativt kontrolreagens Anbring objektglassene i et fugtkammer under inkubation af primært antistof/negativt kontrolreagens og mærket polymer for at undgå udtørring af vævspræparaterne. Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Påfør tilstrækkeligt med primært antistof eller negativt kontrolreagens til at dække præparatet (mindst 3 dråber (100 µl)). Inkubér i 30 (±1) minutter i et fugtkammer. Skyl objektglassene som i trin 2. Mærket polymer, HRP Bank overskydende buffer af og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Påfør tilstrækkeligt med mærket polymer til at dække præparatet (mindst 3 dråber (100 µl)). Inkubér i 30 (±1) minutter i et fugtkammer. Skyl objektglassene som i trin 2. DAB+ substrat-kromogen-opløsning Bank overskydende buffer af og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Påfør tilstrækkeligt med DAB+ substratkromogenopløsning til at dække præparatet (mindst 3 dråber (100 µl)). Inkuber i 10 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med vand af reagenskvalitet fra en vaskeflaske (undgå, at vandet rammer vævet direkte). Affald fra DAB+ substratkromogenopløsning opsamles i en beholder til farligt materiale og bortskaffes på korrekt vis. Anbring i vandbad med vand af reagenskvalitet i 2-5 (±1) minutter. Kontrastfarvning (vejledning til hæmatoxylin) Det farvede slutprodukt fra farvningsreaktionen er uopløseligt i alkohol og vand. Hæmatoxylin, enten alkohol- eller vandbaseret, f.eks. Dakos Hematoxylin (kode S3302) eller Dakos Automation Hematoxylin (kode S3301), kan anvendes. Der må ikke anvendes regressive kontrastfarvestoffer. TRIN 1. TRIN 2. Objektglassene dyppes i et hæmatoxylin-bad. Inkubér i 2 5 minutter afhængigt af styrken af den anvendte hæmatoxylin. Der skylles forsigtigt i et bad med vand af reagenskvalitet. Sørg for, at alle rester af hæmatoxylinen er fjernet. Valgfrit: Dyp objektglassene 10 gange i et bad med 0,037 mol/l ammoniakvand (se afsnittet Klargøring af reagenser). Trinnet med ammoniakvand er ikke påkrævet, når der anvendes Dakos Hematoxylin (kode S3302) eller Dakos Automation Hematoxylin (kode S3301). Bemærk: Det anbefales kraftigt at anvende Dakos Hematoxylin (kode S3302) eller Dakos Automation Hematoxylin (kode S3301). Med en 5-minutters inkubation frembringer dette kontrastfarvestof et svagt violet/blåt slutprodukt, som ikke slører specifik immunfarvning. Stærk kontrastfarvning kan maskere en svag EGFR-ekspression. TRIN 3. Der skylles forsigtigt i et bad med vand af reagenskvalitet i 2-5 minutter. Montering Monteringsmedier såsom Dakos Faramount Aqueous Mounting Medium, klar-til-brug (kode S3025) eller Dako Glycergel Mounting Medium (kode C0563) anbefales til vandig montering. Glycergel gøres flydende ved opvarmning til ca. 40(±5) C inden brug. (108186-003) 305997DK_005 s. 5/13

Ikke-vandig, permanent montering kan også anvendes, såsom Dakos Ultramount (kode S1964). Bemærk: Objektglassene kan aflæses når som helst. Farven kan dog falme en smule, hvis objektglassene forsynes med dækglas med et vandigt monteringsmedium og udsættes for kraftigt lys. Dette kan minimeres ved at objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20-25 C). Kvalitetskontrol Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet udover de af Dako leverede kontrolobjektglas. I USA konsulteres retningslinjerne for kvalitetskontrol fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. Se også CLSI s Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline, 19 og reference 20-23 for yderligere oplysninger. EGFR pharmdx-kontrolobjektglas (medfølger) Hvert af de medfølgende kontrolobjektglas indeholder to pelleterede, formalinfikserede, paraffinindstøbte humane cellelinjer med en farvningsintensitet på 2+ og 0. Der skal farves ét objektglas i hver farvningsprocedure. Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed. De må ikke anvendes som en hjælp til fortolkningen af patientresultaterne. Positivt kontrolvæv Kontrollerne skal være friske autopsi-/biopsi-/kirurgiske præparater, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Positivt kontrolvæv bruges som tegn på korrekt præpareret væv og korrekte farvningsteknikker. Der skal foretages én positiv vævskontrol for hvert sæt af testbetingelser i hver farvningskørsel. Vævene, der bruges i de positive vævskontroller, skal give en svag positiv farvning, så de kan detektere små forandringer i følsomheden for det primære antistof. Kontrolobjektglassene, der leveres sammen med dette system, eller præparater, der behandles anderledes end patientprøven (-prøverne), vurderer udelukkende reagenseffektiviteten og verificerer ikke klargøringen af vævene. Kendte positive vævskontroller må kun anvendes til overvågning af, om de behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Hvis de positive vævskontroller ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra de analyserede præparater betragtes som ugyldige. Normale celletyper, der kan anvendes som en svag EGFR-positiv, omfatter kirtelepitelceller fra prostata og normale lunge- /bronkieepitelceller. Svagt farvende, normale vævselementer kan også være negative på grund af EGFR-farvningsmønsteret. Perineurium er et stærkt positivt, internt kontrolvæv. Normale celler, der udviser moderat, positiv EGFR-farvning, omfatter epitelceller fra cervix og hud. Negativt kontrolvæv Brug negativt kontrolvæv (som vides at være negativt for EGFR-protein), der er fikseret, behandlet og indstøbt på en måde, som svarer til patientprøven (-prøverne), i hver farvningskørsel for at verificere specificiteten af det primære antistof og tilvejebringe en indikation for specifik baggrundsfarvning. De mange forskellige celletyper, der findes i de fleste vævssnit, indeholder interne, negative kontrolsteder (dette skal kontrolleres af brugeren). Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Vævselementer, der kan anvendes som negative kontroller, omfatter hjertets kardielle myocytter. Acinære pancreasceller er ligeledes EGFR-negative, mens pankreatiske epitelceller fra galdegangen farver positivt. Eventuelle tilstedeværende lymfocytter farves ikke med EGFR pharmdx og kan anvendes som en negativ, intern kontrol. Uspecifikt negativt kontrolreagens Brug det medfølgende negative kontrolreagens i stedet for det primære antistof sammen med et snit af hvert patientpræparat med henblik på at evaluere uspecifik farvning og muliggøre en bedre fortolkning af specifik farvning på antigenstedet. Inkubationsperioden for det negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. Verificering af analysen Før et farvningssystem anvendes første gang i en diagnostisk procedure, skal brugeren kontrollere analysens effektivitet ved at teste den på en række interne væv med kendte IHC-effektivitetskarakteristika, der repræsenterer kendte positive og negative væv. Disse kontrolprocedurer skal gentages på hvert nyt testparti. Se procedurerne for kvalitetskontrol, som er beskrevet tidligere i dette afsnit af indlægssedlen, og kravene for kvalitetskontrol i CAP s Certification Program for Immunohistochemistry og/eller CLSIs Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 19 Carcinomer med kendte EGFR-proteinfarvningsintensiteter og negative væv er egnede til verificering af analysen. (108186-003) 305997DK_005 s. 6/13

Tabel 1: Formålet med daglig kvalitetskontrol Væv: Fikseret og behandlet som patientprøven Kontrolobjektglas leveret af Dako. Positiv kontrol: Væv eller celler indeholdende målantigen, der skal detekteres (kan findes i patientvæv). Den ideelle kontrol er svagt positivt farvende væv af hensyn til følsomheden for antistof- eller antigennedbrydning. Negativ kontrol: Væv eller celler, der forventes at være negative (kan findes i patientvæv eller positivt kontrolvæv). Patientvæv. Specifikt antistof & detektionssystem Kontrollerer udelukkende farvningsproceduren. Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed. Kontrollerer alle trin i analysen. Validerer reagenser og procedurer anvendt ved EGFR-farvning. Detektering af utilsigtet antistof-krydsreaktivitet med celler/cellekomponenter. Detektering af specifik farvning. Baggrund: uspecifikt antistof (murint IgG 1 negativt kontrolreagens) medfølger Detektering af uspecifik baggrundsfarvning. Detektering af uspecifik baggrundsfarvning. Detektering af uspecifik baggrundsfarvning. Fortolkning af farvningsprocedure En patolog skal evaluere objektglassene ved hjælp af et lysmikroskop. Alle evalueringer skal baseres på præparatets tumorsektion. Et objektiv med en forstørrelse på 10X eller 20x er velegnet til evaluering af den immuncytokemiske farvning og scoring. Anvend intakte celler til fortolkning af farvningsresultaterne; nekrotiske eller degenererede celler farves ofte uspecifikt. 19 Positive og negative cellelinjer leveres sammen med hvert EGFR pharmdx-sæt med henblik på validering af farvningskørsler, hver gang analysen udføres. Hensigtsmæssig farvning af kontrolcellelinjerne indikerer, at EGFR pharmdx-analysen fungerer korrekt. membranfarvning af CAMA-1 kontrolcellelinjen (0) og moderat brun, komplet eller ufuldstændig membranfarvning i HT-29 kontrolcellelinjen (2+) angiver, at farvningskørslen er gyldig. Hvis den positive kontrolcellelinjes farvningsintensitet er for svag eller for høj, kan der opnås et fejlagtigt negativt eller fejlagtigt positivt resultat, og analysen skal gentages. Referencebilleder kan ses i EGFR pharmdx fortolkningsguiden. EGFR pharmdx farver primært cellemembraner med både komplet og ufuldstændig farvning af omkredsen. Immunfarvningsmønsteret er ofte heterogent, idet det udviser forskellige farvningsintensiteter inden for en enkelt neoplasme. Der er også observeret farvning af cytoplasma og det ekstracellulære rum. Cytoplasmatisk farvning ses ofte, dog bør testen gentages, hvis en betydelig cytoplasmatisk farvning gør det vanskeligt at skelne membranfarvningen og fortolke resultaterne. Tumorer skal rapporteres som EGFR-positive eller EGFR-negative, baseret på evaluering af membranfarvningen. En tumorcelle er EGFRpositiv ved enhver membranfarvning over baggrunden, hvad enten omkredsen er fuldstændig farvet eller ikke. En tumor uden membranfarvning over baggrunden i alle tumorceller rapporteres som en EGFR-negativ tumor. Afhængigt af inkubationstiden og den anvendte hæmatoxylins styrke vil kontrastfarvning medføre en lyse- til mørkeblå farvning af cellekernen. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke fortolkningen af resultaterne. Tabel 2: EGFR pharmdx farvningsresultater Rapporteres til den behandlende læge EGFR-negativ tumor EGFR-positiv tumor Definition Manglende membranfarvning over baggrund i alle tumorceller. EGFR-positiv farvning defineres som enhver IHC-farvning af tumorcelle membraner over baggrundsniveau, uanset om denne dækker omkredsen helt eller ej. Farvningsintensitet Tumorcellefarvning i procent 1+, 2+ eller 3+ >0% Disse definitioner for positive og negative resultater er i overensstemmelse med offentligtgjort literatur 24, men har muligvis behov for modifikation i en specifik sammenhæng (se afsnittet Produktspecifikke begrænsninger). (108186-003) 305997DK_005 s. 7/13

Begrænsninger Generelle begrænsninger IHC er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser; udvælgelse af væv, fiksering og behandling; klargøring af IHC-objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, skæring eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof-trapping eller falsk negative resultater. Uregelmæssige resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævene. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal foretages i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske tests. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. Vævsprøver fra personer, som er inficerede med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), kan udvise uspecifik farvning med peberrodperoxidase. 25 Reagenser kan udvise uventede reaktioner i væv, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævsgrupper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv. 22 Kontakt Dakos tekniske serviceafdeling med dokumenterede uventede reaktioner. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke-immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrom C). 21 Bemærk: Reagenserne og vejledningen i dette system er udviklet til at yde optimalt. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Produktspecifikke begrænsninger Responsraten for cetuximab for EGFR-negative patienter og for patienter med EGFR-positiv farvning af mindre end én procent af tumorcellerne er ukendt, da sådanne patienter ikke deltog i de kliniske lægemiddelforsøg. Tumorer med EGFR-positiv farvning i >1% af deres celler regnes som EGFR-udtrykkende, for så vidt angår de nuværende indikationer for cetuximab. Patienter med EGFR-membranfarvning i mindre end én procent af tumorcellerne deltog ikke i det randomiserede kontrolforsøg med panitumumab, og panitumumabs aktivitet i denne patientpopulation er derfor ukendt. Tumorer med EGFR-positiv farvning i >1% af deres celler regnes som EGFR-udtrykkende, for så vidt angår de nuværende indikationer for panitumumab. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Præparaterne skal farves inden 2 måneder efter monteringen af vævene på objektglas, når de opbevares ved stuetemperatur (20-25 C). 14,26 For at opnå optimale og reproducerbare resultater kræver EGFR-proteinet proteolytisk fordøjelse, når vævene fikseres og paraffinindstøbes rutinemæssigt. Produktegenskaber Specificitet EGFR-antistoffet, klon 2-18C9 (2-18C9) er testet for reaktivitet over for cellelinjer, der udtrykker EGFR, HER2, HER3 og HER4. I Western blots af SKBR3- og A431-cellelysater, genkendte 2-18C9 et 170 kd-bånd, som er konsistent med EGFR s kendte molekylevægt. Det er ligeledes fundet, at klon 2-18C9 genkender EGFRvIII (145 kd)-formen af receptoren i immunhistokemi, flowcytometri og Western blotting af EGFRvIII-transficerede cellelinjer. I Western blotting-forsøg var 2-18C9 ikke-reaktiv med HER2-positive CAMA-1-cellelysater, HER3- transformerede E. coli BL-21-proteinekstrakter og CHO-HER4-transficerede cellelysater. Derudover blev gensplejsede ovarieceller fra kinesiske hamstere (CHO) med myc-ekspression (vektor-indmærkning), enten alene eller sammen med en af HER-familien, dyrket i kammerobjektglas, som blev formalinfikserede, paraffinindstøbte og farvede med anti-myc og 2-18C9. Myc-antistoffet farvede alle fem CHOtransfektanter, mens 2-18C9 kun farvede de CHO-celler, der var transficeret med HER1. Kliniske forsøg Kliniske forsøg med Cetuximab Der er gennemført tre colonrektalt carcinom (CRC) cetuximab-lægemiddelforsøg (EMD 62202-007, IMCL CP02-9923 og IMCL CP02-0141), hvor resultaterne af Dako EGFR-udtrykkende immunhistokemi (IHC)-farvningstest blev anvendt som et af kriterierne for indlemmelse i undersøgelsen. I 2 ud af 3 forsøg, herunder det centrale forsøg (EMD 62202-007), blev tærsklen for EGFR-udtrykkende tumorer sat til 1+ ud af 0 til 3+ mulige for EGFR-positiv farvningsintensitet og >1% farvning af det samlede antal tumorceller. Denne tærskel blev valgt, fordi en undergruppeanalyse af samtlige tærskler for membranfarvningskriterier og andre differentierende kriterier ikke kunne påvise nogen forskel af betydning i de kliniske resultater. Centralt forsøg med Cetuximab Det centrale forsøg (EMD 62202-007) gav mulighed for indlemmelse af patienter med tumorer, for hvilke alle EGFR-positive celler blev påvist ved brug af Dako EGFR pharmdx-testen. Alle sådanne tumorer, som blev fundet i undersøgelsen, havde mindst 1% EGFR-positive celler, og disse tumorer blev opført som EGFR-udtrykkende. Patienter med EGFR-udtrykkende tumorer blev behandlet med cetuximab kombineret med irinotecan, eller udelukkende med cetuximab. 577 tumorpræparater blev analyseret. 474/577 (82%, 95% CI = 78,1%, 86,1%) af de analyserede CRC-præparater var EGFR-udtrykkende. 329 EGFR pharmdx-patienter stod til rådighed for 2:1-randomisering til de to afdelinger af det centrale forsøg. I dette forsøg opnåede patienter, som fik irinotecan plus cetuximab, en responsrate på 50/218 (22,9%, 95% CI = 17,5%, 29,1%). Patienter, som udelukkende fik cetuximab, opnåede en responsrate på 12/111 (10,8%, 95% CI = 5,7%, 18,1%). Kun patienter med Dako EGFR-udtrykkende tumorer, som beskrevet ovenfor, modtog behandling med cetuximab. (108186-003) 305997DK_005 s. 8/13

Responsraten for tumorer, der ikke er EGFR-udtrykkende, kendes ikke og kan derfor ikke sammenlignes. Der var ingen sammenhæng mellem graden af tumorrespons og procentdelen af EGFR-positive celler eller EGFR-farvningsintensiteten (Se tabel 3) Tabel 3: Responsrater for det centrale forsøg med cetuximab (EMD 62202-007) Antal testede patienter ialt Responsrate # for tilfælde, der blev behandlet med cetuximab og irinotecan Responsrate # for tilfælde, der udelukkende blev behandlet med cetuximab 12/111 (10,8%, 95% CI = 5,7%, 18,1%) EGFR pharmdx + (>1%) 474* 50/218 (22,9%, 95% CI = 17,5%, 29,1%) EGFR pharmdx - 103 behandlede behandlede *329 patienter stod til rådighed for 2:1-randomisering til de to dele af lægemiddelforsøget # Responsraten var andelen af patienter i hele undersøgelsen med en reduktion med =50% i hele den perpendikulære diameter af alle målbare tumorer (dvs. en reduktion af tumoren på 50% eller mere efter overfladeareal), der varede ved i mindst 28 dage. Støtteundersøgelser med Cetuximab EGFR pharmdx-analysen blev anvendt ved indlemmelsen af patienter i det centrale forsøg (EMD 62202-007) og én støtteundersøgelse (IMCL CP02-0141) under udviklingen af cetuximab. I IMCL CP02-0141 forsøget blev 140 præparater analyseret. Ud af disse præparater indeholdt de 105 /140 (75%, 95% CI = 66,9%, 83,1%) tumorer, som blev identificeret som EGFR-udtrykkende. I alt 61 patienter blev indlemmet i dette forsøg, 57 patienter fik cetuximab. I en støtteundersøgelse (IMCL CP02-9923) blev et prototype-egfr pharmdx-sæt (bestående af det samme antistof- og detektionssystem som ovenfor) anvendt ved indlemmelsen af patienter. I alt 412 præparater fra 401 patienter blev analyseret. 292/401 (72,8%, 95% CI = 68,0%, 77,6%) patienter testede positive. 139 patienter blev indlemmet. 138 blev behandlet med cetuximab plus irinotecan. Tabel 4: Resumé af EGFR-udtrykkelsen hos coloncancerpatienter i procent Undersøgelses-ID Centralt forsøg EMD 62202-007 Støtteundersøgelse IMCL CP02-0141 Prototype-EGFR-forsøg IMCL CP02-9923 EGFR-udtrykkelsesforhold (antal udtrykkende/antal analyserede) % EGFRudtrykkende 95% konfidensintervaller 474/577 82,1% 78,1 86,1% 105/140 75,0% 66,9 83,1% 292/401 72,8% 68,0 77,6% Kliniske forsøg med Panitumumab Effektivitetsdata, der understøtter brug af panitumumab til behandling af patienter med refraktær metastatisk colonrektal cancer (mcrc), blev udledt af forsøg med patienter, hvis tumorer var EGFR-udtrykkende i henhold til Dako EGFR pharmdx analysen. Randomiseret kontrolleret forsøg med Panitumumab Dette randomiserede, open-label, komparative multicenterforsøg med panitumumab (20020408, tilhørende udvidet forsøg 20030194) plus best supportive care (BSC) kontra BSC alene omfattede mcrc-patienter, som ikke reagerede på kemoterapi med oxaliplatin- og irinotecan, og hvis tumorer udtrykte EGFR-membranfarvning i 1% af de evaluerede tumorceller. I begge behandlingsgrupper var middelprocentsatsen for tumorceller med positiv EGFR-membranfarvning 20% (område: 1% til 100%). I forsøg 20020408 blev der observeret en statistisk set signifikant forbedring i det primære endpoint for progression-free survival (PFS) for panitumumab plus BSC-gruppen sammenlignet med BSC-alene-gruppen (p < 0.0001, stratificeret log-rank test). I dette randomiserede, kontrollerede forsøg var responsraten 8,3% (19/229, 95% CI: 5,1%, 12,6%) og defineret som enten en komplet eller delvis respons (modificeret RECIST), med en bekræftet varighed på mindst 4 uger. Den tilsvarende responsrate i de 174 patienter, som blev overført fra BSC til panitumumab i det tilhørende udvidede forsøg, var 9,8% (17/174, 95% CI: 5.8%,15.2%). Der var ingen sammenhæng mellem behandlingseffekten på PFS og procentdelen af EGFR-tumormembranfarvning eller EGFR-farvningsintensiteten. (Se tabel 5 herunder) (108186-003) 305997DK_005 s. 9/13

Tabel 5: Behandlingseffekt på Progression-free Survival ved EGFR-farvning Forsøg 20020408 N-patienter/ hændelser Risiko for død a 95% konfidensinterval for risiko for død p-værdi Alle randomiserede 463 / 401 0.54 (0.44, 0.66) <0.0001 % EGFR-membranfarvning b 1-<10% 114 / 91 0.46 (0.30, 0.71) 0.0004 10-35% 182 / 157 0.55 (0.40, 0.76) 0.0004 >35% 164 / 150 0.56 (0.40, 0.78) 0.0007 Maksimal intensitet af EGFR-membranfarvning c 1+ 138 / 113 0.61 (0.41, 0.90) 0.0140 2+ 235 / 206 0.49 (0.37, 0.65) <0.0001 3+ 88 / 80 0.61 (0.39, 0.97) 0.0379 a Risiko for død for panitumumab plus BSC i forhold til BSC alene er anslået udfra en Cox proportionel risikomodel, som er justeret for ECOG-ydeevnegrad og geografisk region. En værdi < 1,0 indikererer en lavere gennemsnitlig hændelseshastighed og længere tid inden hændelsen for panitumumab plus BSC i forhold til BSC alene. b indeholdt ikke 3 patienter, hvis tumorer udtrykte < 1 % EGFR-membranfarvning (protokol ikke overholdt) c indeholdt ikke 2 patienter, hvis tumorer udtrykte < 1 % EGFR-membranfarvning og < 1+ maksimal intensitets EGFR-membranfarvning (protokol ikke overholdt) Tabel 6: Resumé af EGFR-ekspressionen hos coloncancerpatienter i procent Undersøgelses-ID Centralt forsøg 20020408 EGFRekspressionsforhold (antal udtrykkende/antal analyserede) % EGFRudtrykkende 95% konfidensintervaller 735/1004 73.2% 70.4 75.9% Reproducerbarhed Reproducerbarhed mellem kørsler Reproducerbarheden mellem kørsler blev afprøvet manuelt på to laboratorier af to teknikere på hvert laboratorium over 3 dage med 5 forskellige præparater (4 positive og 1 negativ på hvert laboratorium) med varierende farvningsintensitet, som blev randomiseret og maskeret. Der blev set en overbevisende reproducerbarhed (100%) for EGFR-positive kontra EGFR-negative resultater (0 mod 1+, 2+ og 3+). Farvningsintensiteten varierede med 1+ i to af de positive præparater og med 2+ i ét præparat (i en af analyserne var det positive vævselement stort set vasket af objektglasset). De to negative præparater forblev negative. Farvningsreproducerbarhed mellem laboratorier Reproducerbarheden mellem laboratorier blev afprøvet på tre geografisk adskilte laboratorier med 30 randomiserede og maskerede præparater med forskellig IHC-farvningsintensitet. Friskt skårne snit på objektglas blev sendt til hvert testlaboratorium til manuel og automatisk farvning og evaluering foretaget af en patolog. Overensstemmelsen mellem laboratorierne var på 100% for en dikotom positiv/negativ bestemmelse, hvor 0 var negativ, og 1+, 2+ og 3+ var positiv for EGFR-proteinekspression i både manuelle og automatiske analyseprocedurer. Immunreaktivitet Tabel 7 viser en oversigt over EGFR pharmdx-immunreaktiviteten på det anbefalede udvalg af normalt væv. Alt væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt. (108186-003) 305997DK_005 s. 10/13

Tabel 7: Evaluering af farvning af normalt væv med EGFR pharmdx* Vævstype (antal analyser) EGFR-positivt farvet vævsbestandel og farvningsmønster Adrenal (2) Kortikale celler (2+): Cytoplasma Knoglemarv (3) Bryst (2) Lobulære epitelceller (2+): Membran og cytoplasma Hjerne/cerebellum (3) Molekylært lag (1+): Ekstracellulær Hjerne/cerebrum (3) Cervix (3) Basilære pladeepitelceller (2+): Membran Kolon (3) ** Esophagus (2) Basilære pladeepitelceller (2+): Membran Hjerte (3) Nyre (3) Tubuli (1+): Cytoplasmatisk farvning (granulær) Lever (3) Hepatocytter (sinusoide) (3+); galdegange (3+): Membran og cytoplasma Lunge (3) Alveolære beklædende celler / basilære bronkieceller (myoepitelceller) (2+): Membran og cytoplasma Mesoteliale celler (3) Mesoteliale celler (2+): Membran og cytoplasma Ovarie (3) Pancreas (3) Udførselsgange (2+): Membran Parathyreoidea (1) Perifere nerver (3) Nervecelleprocesser (1+): Fibrøs Hypofyse (3) Prostata (3) Kirtelepitelceller (2+): Membran Spytkirtel (3) Duktale elementer (1+): Cytoplasma Skeletmuskulatur (3) Hud (3) Pladeceller, adnexstrukturer (2+): Membran og cytoplasma Tyndtarm (3) Milt (3) Mave (3) Testikler (3) Thymus (3) Thyroidea (3) Tonsil (3) Pladeepitel (3+): Membran og cytoplasma Uterus (3) Endometrisk kirtelepitel (2+): Membran og cytoplasma Endometriske stromale celler (2+): Membran og cytoplasma Myometrium: *Flertallet af de analyserede væv viste farvning af fibroblaster i stromalt væv (1+, fibrøs) samt perineurium og myoepiteliale celler. Der har været observeret lejlighedsvis farvning af eosinofiler induceret af endogen peroxidase. **Der er observeret variabel immunfarvning af normale epitelceller i colon. (108186-003) 305997DK_005 s. 11/13

Fejlfinding Tabel 8: Fejlfinding Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. farvning af objektglas. 2. Svag farvning af objektglas. 3. For megen baggrundsfarvning af objektglas. 4. Vævet løsner sig fra objektglasset. 5. For kraftig specifik farvning. 6. Svag farvning af 2+cellelinjen på kontrolobjektglasset. 1a. Reagenserne anvendes ikke i den korrekte rækkefølge. 1b. Natriumazid i vaskebufferbadet. 2a. Utilstrækkelig Proteinase K proteolytisk fordøjelse. 2b. Der er for meget opløsning tilbage i snittene efter vaskebadet. 2c. Objektglassene inkuberes ikke længe nok med antistoffer eller DAB+substratkromogenopløsning. 2d. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 3a. Paraffinen er ikke helt fjernet. 3b. Der har været anvendt stivelsesadditiver ved monteringen af vævet på objektglasset. 3c. Objektglassene er ikke skyllet korrekt. 3d. Snittene er tørret ud under farvningen. 3e. Non-specifik reagensbinding til vævssnittet. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 5a. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 5b. For lange reagensinkubationstider. 5c. Der er anvendt en uegnet vaskeopløsning. 6a. Utilstrækkelig Proteinase K proteolytisk fordøjelse. 6b. Objektglassene inkuberes ikke længe nok med antistoffer eller DAB+substratkromogenopløsning. 6c. Nedbrydning af kontrolobjektglas. 7. Overfordøjelse af væv. 7a. For lang inkubation med Proteinase K. 7b. Utilstrækkelig fiksering. 1a. Gennemgå tilsættelsen af reagenser. 1b. Brug frisk azid-fri vaskebuffer, der følger med sættet. 2a. Sørg for, at Proteinase K-opløsningen inkuberes i fulde 5 minutter. 2b. Bank forsigtigt overskydende opløsning af, inden der tørres rundt omkring snittet. 2c. Gennemgå de anbefalede inkubationstider. 2d. Kontrollér, at patientvævet ikke overfikseres, og at der anvendes en godkendt fikseringsvæske. (Se afsnittet Klargøring af prøver). 3a. Brug friske renseopløsninger og følg proceduren, der er beskrevet i afsnittet Afparaffinering og rehydrering. 3b. Undlad at anvende additiver til vedhæftning af vævssnit til objektglas. Mange af disse er immunreaktive. 3c. Anvend friske opløsninger i bufferbade og vaskeflasker. 3d. Anvend fugtkammer. Kontrollér, at der tilsættes den korrekte mængde reagens til objektglassene. Tør kun 3-4 objektglas af ad gangen, inden der tilsættes reagens. 3e. Kontrollér, om præparatet er fikseret korrekt, og/eller om der er nekrose til stede. 4a. Brug ladede (Fisher s SuperFrost Plus) eller silaniserede objektglas såsom Dakos Silanized Slides (kode S3003). 5a. Sørg for, at der kun anvendes godkendte fikseringsvæsker og -metoder. (Se afsnittet Klargøring af prøver). 5b. Gennemgå vejledningen for farvningsprotokollen. 5c. Anvend kun den fortyndede vaskebuffer, som følger med sættet. 6a. Sørg for, at Proteinase K-opløsningen inkuberes i fulde 5 minutter. 6b. Gennemgå de anbefalede inkubationstider. 6c. Kontrollér udløbsdatoen og opbevaringsbetingelserne, som er trykt på pakkens etiket. 7a. Sørg for, at Proteinase K-opløsningen ikke inkuberes i mere end 5 minutter. 7b. Brug efterfikseringsproceduren under farvningsprotokollen på nye objektglas, og farv ved hjælp af den eksisterende procedure. Bemærk: Se også afsnittet Fejlfinding i Dako-håndbogen: Immunochemical Staining Methods, 3. udgave, 16 Atlas of Immunohistology 23 eller Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 20 Kontakt Dako teknisk serviceafdeling for at rapportere usædvanlig farvning. (108186-003) 305997DK_005 s. 12/13

Referencer 1. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem 1990; 265:7709 2. Riese DJ, Stern DF. Specificity within the EGF family/erbb receptor family signaling network. Bioessays 1998; 20:41 3. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230:1132 4. Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, Saito T, Toyoshima K. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319:230 5. Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Ullrich A, Coussens L. The neu gene: An erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229:976 6. Gusterson B, Cowley G, Smith JA, Ozanne B. Cellular localization of human epidermal growth factor receptor. Cell Biol Intl Rpts 1984; 8(8):649 7. Gullick WJ. Prevalence of aberrant expression of the epidermal growth factor receptor in human cancers. Br Med Bull 1991; 47(1):87 8. Sainsbury JRC, Farndon JR, Sherbet GV, Harris AL. Epidermal-growth-factor receptors and oestrogen receptors in human breast cancer. Lancet 1985; 1(8425):364 9. Ozanne B, Richards CS, Hendler F, Burns D, Gusterson B. Over-expression of the EGF receptor is a hallmark of squamous cell carcinomas. J Pathol 1986; 149:9 10. Werner MH, Nanney LB, Stoscheck CM, King LE. Localization of immunoreactive epidermal growth factor receptors in human nervous system. J Histochem Cytochem 1988; 36:81 11.Pii K, Andersen FG, Jensen S, Spaulding B. Characterization of a new monoclonal antibody, clone 2-18C9, for the measurement of Epidermal Growth Factor Receptor expression in solid tumors. Am Assoc Canc Res 95 th annual meeting, Abst #5029 Orlando, Fl Mar 27 31 2004 12. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 13. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980 14. Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS and Störkel S. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffinembedded tumor tissues: Variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem 2004; 52:893. 15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001 17. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 18. CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved guideline. Villanova, PA 2001. Order code M29-A2 19. CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA 1999. Order code MM4-A. 20. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 21. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 22. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66:194 23. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immuno-histology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 24. Goldstein NS, Armin M. Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on Cancer Stage IV colon adenocarcinoma: implications for a standardized scoring system. Cancer 2001; 92:1331 25. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626 26 Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: Potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54:2771 (108186-003) 305997DK_005 s. 13/13