Indholdsortegnelse Indledning...3 Problemormulering...3 grænsning...3 Metode...4 Målgruppe og læsevejledning...4 Introduktionsasnit...5 Termodynamiske størrelser og relationer...5 Hovedsætninger...5 Termodynamiske potentialer...6 Varmekapacitet...7 Latent varme...8 Kemisk potentiale...9 lkoholer...12 Phospholipider...12 Faseskit...14 Sammenhæng mellem H og S ved aseskit...16 Sammenhæng mellem µ og H, S ved aseskit...17 Dierentiel scanning kalorimetri (DSC)...18 Modellen...23 Partitionskoeicienten...26 Forsøgsbeskrivelse...29 Fejlkilder...31 Metode til databehandling...33 Databehandling a de eksperimentelle data...33 Databehandling a modellen...37 nalyse a data...41 Resultater ra det eksperimentelle arbejde...41 Resultaterne or modelleringsarbejdet...44 Sammenholdelse a data or eksperiment og model...46 Diskussion...47 Diskussion a eksperimentelle data...47 Diskussion a model vs. eksperiment...49 Konklusion...53 Perspektivering...55 Litteraturliste...57 1
Indholdsortegnelse ppendiks 1...59 ppendiks 2...61 Rådataplot ra eksperimentet...61 Eksperimentelle graer or H og Cp...66 Graer ra modeldata a H og Cp...71 ppendiks 3...75 2
1 indledning Indledning Virkningerne a alkohol på bevidstheden er alment kendt, og ligeledes er den viden der i dag hovedsageligt indes omkring alkohols bedøvende eekt, dens virkning som anæstesi, empirisk. Da der ikke indes så meget teoretisk viden blot empirisk viden der tidligere er opnået ved aprøvning a stoer se hvordan de virker sker der en del banebrydende orskning indenor området. For at orstå alkohols anæstetiske virkning (i blandt andet Heimburg, 27), inddrages der lere orskellige agområder. Disse agområder er blandt andet bioysik og kemi, hvilket i dette projekt, primært har gjort sig gældende i den eksperimentelle del. Projektet har dog sit ståsted inden or ysik, med bidrag ra bioysik og kemi. I den indledende ase a dette projekt lod vi os inspirere a en artikel a (Heimburg, Jackson, 27), der omhandler anæstesis indvirkning på cellerne. Der påpeges blandt andet, at der er orskellige stoer, der kan benyttes som anæstesi, men at det stadig er uklart hvoror og hvordan disse stoer virker i kroppen. I artiklen ses der på hvordan lipidmembraner påvirkes a alkohol og der benyttes en model, der er uddybet i (Heimburg, 27). En a artiklens pointer er at lipidens som er en del a cellemembraner i kroppen smeltepunkt sænkes ved tilsætning a alkohol og at dette kan sættes i orbindelse med, hvordan anæstesi virker. Modellen, som viser henholdsvis enthalpiændringen og varmekapaciteten som en unktion a temperaturen, er aprøvet or lipiden DPPC og alkoholen octanol og er sammenlignet med data opsamlet ra Dierentiel Scanning Kalorimetri (DSC). Med udgangspunkt i denne model ønskes det undersøgt, om modellen kan benyttes, til at orudsige smeltetemperatursænkning på blandinger a andre alkoholer og en anden lipid ved at sammenholde disse data, med opsamlede data ra DSC-scanninger. Dette leder os rem til ølgende problemormulering. Problemormulering Det ønskes undersøgt om modellens orudsigelser a smeltetemperatursænkningen, giver en brugbar sammenligning med DSC-målinger a DMPCs smeltepunkt når lipiden er blandet med orskellige alkoholer. grænsning Valget a problemstilling er rettet ind eter valg a model og eksperiment og modellen danner grundlag or valget a eksperiment. Valget a den benyttede lipid aspejles a, at den er orholdsvis velundersøgt idet smeltetemperaturen og H er kendte størrelser. Valg a alkoholer har været en 3
1 indledning løbende proces, idet vi startede med at teste heanol og så ortsatte med de alkoholer, der har ærre eller lere kulstoatomer, dog begrænset a eksperimentet. Disse orbehold er blandt andre, at der skal tilsættes så små mængder alkohol, idet alkoholernes molarmasser er væsentlig mindre end lipidens. På den baggrund er alkoholer med ærre end 5 kulstoatomer ravalgt. Et andet orbehold er, at inden or det temperaturinterval, der arbejdes med, skal kun lipiden have en aseovergangstemperatur. Dette orbehold betyder, at alkoholer med lere end 1 kulstoatomer er blevet ravalgt. Yderligere begrænsninger or hvilke alkoholer der kan benyttes er opstået som ølge a, at det i litteraturen ikke har været muligt at inde partitionskoeicienter or andre end pentanol, heanol, heptanol og octanol. Nogle ekstra begrænsninger, der er dukket op i projektorløbet omhandler omanget a brugbare eksperimentelle data, da hver måling med DSC-apparatet har taget omkring 2 timer. Ydermere er det ravalgt at diskutere anvendeligheden a DSC-apparatet som måleredskab, mens okus har været på hvorvidt resultater or model og eksperiment har været sammenlignelige. Metode Projektrapportens problemormulering søges besvaret ved litteraturstudier og ved undersøgelse a model og ved rembringelse a egne måleresultater. Modellen benyttes til at orudsige smeltetemperatursænkningen og denne orudsigelse sammenlignes med de eksperimentelle data. Ydermere udormes der graer or henholdsvis enthalpiændringen og varmekapaciteten som unktion a temperaturen. Graerne sammenlignes og eventuelle overvejelser vedrørende både model og eksperiment udgør en samlet vurdering a modellens generelle brugbarhed. Et a de vigtigste redskaber til både at orstå modellen og eksperimentet er termodynamik og deror vil der i rapporten orekomme et asnit, der omhandler den del a termodynamikken, der anvendes i orbindelse med modellen og eksperimentet. Målgruppe og læsevejledning Rapporten henvender sig til olk med et agligt niveau, tilsvarende niveauet or en studerende på en ysikoverbygning. Derudover vil de begreber der ligger uden or disse blive beskrevet, så som hvad en alkohol og en lipid er. Besidder du allerede denne viden, kan de sider springes over, ligeledes kan asnittet termodynamik springes over hvis du er velbevandret inden or emnet. 4
2 introduktionsasnit Introduktionsasnit Formålet med dette asnit er at give en introduktion til nogle vigtige termodynamiske begreber, som bliver anvendt både i orståelsen a eksperimentet og i udarbejdelsen a modellen. Derudover orklares begrebet aseskit, der er relevant, idet vi måler på lipiden under et aseskit. Ydermere introduceres til alkohol og phospholipider som igen arbejdes med i både eksperimentet og modellen. Sidst i asnittet vil målemetoden og måleapparatet dierentiel scanning kalorimetri (DSC) blive orklaret med henblik på at opnå en orståelse a, hvordan apparaturet der benyttes i eksperimentet, virker. Termodynamiske størrelser og relationer 1 Følgende gennemgang a termodynamiske størrelser og relationer er et teoretisk undament or orståelse a modellen, der anvendes til at modellere henholdsvis enthalpiændringen og varmekapaciteten som unktion a temperaturen ved et aseskit. Hovedsætninger de ire hovedsætninger vil den ørste (1. H.S.) og orudsætningerne or anden (2. H.S.) blive beskrevet og senere taget i anvendelse. 1. Hovedsætning Denne er essentielt et udtryk or energibevarelse U = Q+ W (2.1) Der udtrykt med ord siger, at ændringen i systemets indre energi U er lig summen a den tilørte energi i orm a varme Q til systemet og det ydede arbejde W på systemet. På dierentialorm kan 1. H.S. skrives som du = d ' Q + d ' W (2.2) Hvor det bemærkes, at du er på eksakt dierentialorm, mens dqog ' dw ' ikke er på eksakt dierentialorm. Dette ligger i, at den indre energi kun ahænger a, hvilken tilstand systemet beinder sig i, mens energien der tiløres til systemet i orm a varme eller arbejde ahænger a, hvordan det er oregået. Det vil sige, at både den tilørte energi i orm a varme og arbejde er procesahængig. Endvidere skal den anvendte ortegnskonvention bemærkes, idet den positive angiver, at der tiløres energi ra omgivelserne til systemet. 1 Kilderne til dette asnit er (Schröeder, 2), (tkins, 199) og (Both og Christensen, 24) 5
2 introduktionsasnit 2. Hovedsætning I ord udtrykker 2. H.S. ølgende; Det er ikke muligt at udøre en proces, hvis eneste resultat er overørsel a varme ra et koldere til et varmere legeme (Clausius ormuleringen). For at matematisere 2. H.S. må begrebet entropi ørst introduceres. Entropi er en tilstandsunktion, hvis ændring ahænger a den tilørte energi Ændringen a entropien ved en reversibel proces skrives som dqi ' orm a varme ved en given temperatur T. dq ' dsrev = (2.3) T 2. H.S. udtrykker, at entropien or et lukket system kun kan vokse eller orblive konstant. Matematisk kan det skrives som ds (2.4) Her i ligger også entropiens nytte, da den ortæller noget om hvilken vej en proces kan oregå. Termodynamiske potentialer Foruden 1. H.S. indes der andre tilstandsunktioner med dimensionen energi, der alle kaldes termodynamiske potentialer. Hera er der, or modellen, tre relevante potentialer: den indre energi, enthalpi (H) og Gibbs ri energi (G). De to sidste potentialer vil her blive udledt vha. en matematisk omskrivning kaldet Legendretransormationen. Der tages udgangspunkt i 1. H.S. hvor det ved en reversibel proces gør sig gældende at dq ' = TdSjævnør ligning (2.3) og at dw ' = PdVda en positiv ændring a volumen V, er en ekspansion a systemet, som så yder et arbejde på omgivelserne. Deror du = TdS PdV (2.5) Denne ligning kaldes den termodynamiske identitet. Der benyttes nu ølgende Legendretransormation d( PV ) = PdV + VdP PdV = d( PV ) VdP (2.6) Således at PdV kan substitueres med dierentialet a PV minus den anden dierentialorm VdP. Udtrykket or den indre energi bliver da du = TdS ( d( PV ) VdP) = TdS d( PV ) + VdP (2.7) Der ønskes nu at inde et potentiale, hvori der indgår de uahængige variable S og V, således at ligning (2.7) omskrives til Hvor enthalpi er deineret som d( U + PV ) = TdS + VdP (2.8) 6
2 introduktionsasnit H U + PV (2.9) Således at dierentialet bliver dh = TdS + VdP (2.1) Der ortæller, hvordan ændringen i enthalpien ahænger a ændringen i entropien og trykket. Der kan nu udøres endnu en Legendretransormation i orm a d( TS) = TdS + SdT TdS = d( TS) SdT (2.11) der indsættes i ligningen (2.8) d( U + PV ) = ( d( TS) SdT ) + VdP (2.12) Og hvor der denne gang ønskes at inde et potentiale, hvori der indgår de uahængige variable T og P således at Hvor den Gibbs ri energi deineres ved d( U + PV TS) = SdT + VdP (2.13) G U TS + PV (2.14) Således at dierentialet a potentialet bliver dg = SdT + VdP (2.15) Der ortæller, hvordan ændringen i den Gibbs ri energi ahænger a ændringen i temperaturen og trykket or systemet. Ønskes ændringen a den gibbs ri energi udtrykt ved andre variable, kan der oretages endnu en Legendretransormation ved hjælp a SdT = TdS d( TS) således at dg = TdS d( TS) + VdP (2.16) Indsætter udtrykket or dierentialet a enthalpien (ligning 2.1) dg = dh d( TS) = dh SdT TdS (2.17) Og ved konstant temperatur dg = dh d( TS) = dh TdS ( T = konst.) (2.18) Varmekapacitet Varmekapacitet er deineret som dq ' c dt (2.19) Der er orholdet mellem den tilørte energi til systemet og den tilsvarende temperatur ændring. Dette er imidlertid ikke en entydig størrelse, da det skal speciiceres hvilken proces, der er tale om. Det vil sige, under hvilke orhold energi tiløres og hvordan det tiløres. Hertil benyttes størrelserne 7
2 introduktionsasnit c p ' Q = T p c v ' Q = T v (2.2) Der henholdsvis er varmekapaciteten under konstant tryk og ved konstant volumen. Under kalorimetrimålingerne tilstræbes både et konstant tryk og volumen. t trykket er konstant skal senere vise sig at være nyttigt, idet det giver muligheden or at anvende en relation mellem enthalpi og varmekapaciteten. dierentialet or enthalpien (ligning 2.1) vides det, at ændringen a enthalpien ved konstant tryk er lig dh = TdS = d ' Q ( P = konst) (2.21) Således at der i det simple tilælde, hvor der blot ønskes en opvarmning a systemet, som det er tilældet med kalorimetri, er varmekapaciteten givet som c p H = T p (2.22) Hvorved enthalpiændringen kan indes ved at oretage separation a de variable og tage i integralet på begge sider H1 T1 dh = p H c dt (2.23) T T1 H = c dt (2.24) T p Latent varme Under et aseskit tiløres der energi til systemet uden at temperaturen øges. I dette tilælde er varmekapaciteten teoretisk set uendelig da d' Q c = = dt or dt (2.25) En anden måde at deinere mængden a energi der tiløres til et sto, under et aseskit, er en størrelse kendt som latent varme. Denne størrelse er et mål or hvor meget energi der skal tiløres pr. mængde sto ved et aseskit. Q L m (2.26) 8
2 introduktionsasnit Kemisk potentiale Kemisk potentiale er symboliseret ved µ og siger noget om, hvorvidt et system vil agive eller modtage partikler til et andet system. Ved diusionsligevægt, dvs. når der ikke er nogen netto udveksling a partikler mellem systemerne, der er i kontakt med hinanden, gælder det at Hvor µ µ µ = µ (2.27) B µ og µ B er det kemiske potentiale or henholdsvis system og system B. I tilælde a at B vil det gælde, at systemet med det højeste kemiske potentiale vil agive partikler og det med det laveste vil modtage. Tilørslen a partikler til systemet kan ses som et arbejde, der udøres på systemet, der deineres som W = dn (2.28) µ µ Og da ændringen i partikler dn er en dimensionsløs størrelse, har det kemiske potentiale dimensionen joule. Er et system både tilladt at komprimere/ekspandere og ændre antallet a partikler, kan den termodynamiske identitet (ligning 2.5) udvides til du = TdS PdV + µ dn (2.29) Hvilket ølgelig også ændrer dierentialet a de andre termodynamiske potentialer, således at dierentialet a den Gibbs ri energi (ligning 2.15) bliver dg = SdT + VdP + µ dn (2.3) Ved konstant temperatur T og konstant antal partikler N har vi således at V G = P T, N (2.31) Ligeledes ved konstant temperatur og tryk har vi at G µ = N TP, (2.32) Udtrykket ortæller, at ændres antallet a molekyler, så må ændringen i Gibbs ri energi ændre sig tilsvarende, idet G er en ekstensiv variabel, mens både µ og T, P intensive variable 2. Følgende sammenhæng er da gældende G = µ ( T, P) N (2.33) Hvor µ blot er proportionalitetskonstanten, der er en unktion a temperaturen og trykket. Hvis der er lere slags partikler i systemet, gælder det at 2 De ekstensive størrelser ordobles ved ordobling a antallet a partikler, mens at de intensive størrelser orbliver uændrede. 9
2 introduktionsasnit G = µ N (2.34) i i i Hvor i er antallet komponenter i systemet. I tilældet a et to-komponent system bliver det G = µ N + µ N (2.35) B B Og ændringen i Gibbs ri energi kan skrives som dg = µ dn + µ dn (2.36) B B Ud ra ligning (2.31) og (2.33), kan der udledes et udtryk or det kemiske potentiale som unktion a tryk og temperatur or en ideal gas. Ligning (2.33) kan omskrives til det kemiske potentiale 1 µ = G (2.37) N Der betragtes nu en idealgas med et konstant antal partikler og med en konstant temperatur, men hvor det kemiske potentiale er tilladt at ændre, som ølge a at trykket ændrer sig. Den partielle aledte a µ i orhold til trykket P er derved µ 1 G = P N P TN, TN, (2.38) Og a ligning (2.31) har vi at V ( G P), =, således at ændringen i det kemiske potentiale, som / T N ølge a ændringen i trykket er µ V kt = = (2.39) P N P Hvor det er benyttet, at V / N = kt / P idet det er en idealgas, vi betragter. Der udøres separation a de variable og eterølgende integration T, P P 1 µ = kt P Tstd, P (2.4) std Pstd P Hvor Pstd og Tstd er standardtilstandene, hvor trykket deineres som 1 bar og 25 ºC (tkins, 1999, s. 11) som temperaturen under dette tryk. Integralet giver Og omskrives til P µ ( T, P) µ ( Tstd, Pstd ) = ktln Pstd (2.41) P µ = µ std + kt ln Pstd hvor µ = µ ( T, P ) (2.42) std std std 1
2 introduktionsasnit Dette udtryk gælder or en idealgas, men hvis der eksempelvis betragtes en beholder med et sto (), der både er på gas (v) og væske () orm i diusionsligevægt, der skal det som tidligere nævnt gælde at deror µ = µ (2.43) v v P v, µ, = µ std, + kt ln P std v Hvor µ, er det kemiske potentiale or et ublandet sto på lydende orm, imens P, (2.44) er trykket or et ublandet sto på gas orm. Ved tilstedeværelsen a et andet sto i beholderen, således at væsken er blandet, kan det kemiske potentiale or sto skrives som v v P µ = µ, std + kt ln Pstd (2.45) v Hvis ligning (2.44) og (2.45) løses i orhold til µ, og sættes lig hinanden og dernæst løses i std orhold til det kemiske potentiale or væsken ( µ ) ås v v v v P, P P, P µ, kt ln µ kt ln µ µ, kt ln kt ln P = = + std P std P std Pstd Og ved brug a logaritmeregneregler omskrives det til (2.46) v P µ = µ, + kt ln v (2.47) P, Dereter anvendes Raoult s lov (tkins, 199, s. 162) der beskriver sammenhængen mellem trykorholdet og andelen (molbrøken) a stoet i væsken ( ). Denne er undet som P v v, Hvilket giver det endelige udtryk or det kemiske potentiale = P (2.48) µ = µ + (2.49), kt ln ( ) Hvor det kemiske potentiale har enheden joule pr partikel ( J / N ), hvor antallet N er et helt tal uden dimensioner, således det kemiske potentiale blot er et mål or en energi. Det kan imidlertid omskrives til joule pr. mol ( J / mol) og endvidere skrives på en mere generel orm µ = µ + (2.5), RT ln ( ) t t t Z Z Z 11
2 introduktionsasnit Hvor notationen t er tilstandsormen, mens Z er det pågældende sto, der betragtes i opløsningen. Denne ligning vil blive anvendt i modeludledningen. lkoholer 3 lkoholer er polære molekyler, der består henholdsvis a en hydroil del og en hydroob del. Den hydroile del består a en OH-gruppe og den hydroobe del er en CH 2 -gruppe. lkoholer, der har lere end 5 kulstoatomer, er overvejende hydroobe, ordi den hydroobe ende bliver dominerende. Egenskaben gør, at alkoholerne vil blande sig med lipiden, når denne er lydende, da lipiden ligesom alkoholen er polær (j. asnit om phospholipider). Navn rysepunkt C kogepunkt C densitet g/cm 3 molarmasse g/mol Pentanol C 5 H 12 O -77,6 137,99,8144 88,15 Heanol C 6 H 14 O -52 156,4,8136 12,17 Heptanol C 7 H 16 O -34,6 175,8,8187 116,2 Octanol C 8 H 18 O -16 195,824 136,23 Tabel 2.1: Tabellen viser værdier or de orskellige alkoholer der benyttes i eksperimentet. De alkoholer, der benyttes, er udvalgt eter tre kriterier. Det ørste kriterium er deres molarmasse, da der vil opstå store usikkerheder på avejningen a mængden a alkohol, der skal tilsættes lipidblandingen, jo lavere molarmassen er (or nærmere beskrivelse se asnit 4 under ejlkilder). Det andet kriterium er alkoholernes aseovergangstemperaturer. I eksperimentet måles der ra 1 C til 4 C. Det er påkrævet, at kun lipiden har en aseovergangstemperatur i dette interval, Hvilket eksempelvis ikke vil være gældende or dodecanol, der har en smeltetemperatur på 24 C. Grunden til at kun lipiden bør have en aseovergang i temperaturintervallet, skyldes modellen (se asnit 3), der netop beskriver en blanding, hvor kun det ene sto undergår et aseskit. Det tredje kriterium er, at der i litteraturen kun var muligt at inde partitionskoeicienter or de udvalgte alkoholer. Phospholipider 4 Phospholipider er en a cellemembranens bestanddele. Phospholipider består a et vandopløseligt hoved (den hydroile del) og to edtopløselige haler (den hydroobe del). I cellemembranen sidder phospholipiderne i et dobbeltlag hvor de hydroile ender vender ud mod omgivelser og ind mod 3 Kilden til oplysningerne i dette asnit er (http://en.wikipedia.org/wiki/) 4 Kilden til dette asnit er hovedsageligt (Campbell, 1987, kapitel 8.) 12
2 introduktionsasnit cellens indre. Dette betyder, at de hydroobe dele vender ind mod hinanden (se igur 2.1 og igur 2.2 or at se hvordan én phospholipid ser ud). Figur 2.1: Model a hvordan phospholipiderne sidder i membranen (Bøgeskov, Hansen og Prom, 1988, s. 43). Lipider, der er uldt hydrerede, gennemgår tre aser ved opvarmning (se igur 2.3), hvora gel og lydende er de to interessante i orhold til eksperimentet og modellen, hvor der sker en aseovergang ra gel til lydende. Phospholipiderne har i den lydende ase ikke aste pladser, men de diunderer, hvilket gør membranen meget lydende i sin struktur. Den lipid, der vil blive benyttet i eksperimentet, er DMPC, der er en phosphocholin og er en kunstigt remstillet lipid, hvis ulde navn er Di-Myristoyl-Phosphatidyl-Cholin. For den uldt hydrerede lipid indes der i litteraturen ølgende værdier or DMPC; en smeltetemperatur på 24,1 ºC og en enthalpiændring ved smeltetemperaturen på 25 kj/mol (Jutila og Kinnunen, 1997). Phospholipiderne vil danne en sluttet kreds. Dvs. at enderne vil sætte sig sammen og danne en vesikel lidt a la sæbebobler. I en lipidblanding vil der både dannes vesikler i et lag og i lere lag. Disse kaldes or henholdsvis unilamellare og multilamellare vesikler, og da vi til eksperimentet kun er interesseret i unilamellare vesikler, et enkelt lipid dobbeltlag, så skal de multilamellare vesikler laves om til unilamellare vesikler (se asnit 4 om orsøgsbeskrivelsen). Grunden til, at der kun ønskes unilamellare vesikler er, at dette imiterer en model a en cellemembran mest. Figur 2.2: Model a DMPC hvor man i venstre halvdel kan se de to haler og i højre halvdel hovedgruppen. bildningen i igur 2.1 er således en orsimpling. Kilde (http://en.wikipedia.org/wiki/cholesterol) 13
2 introduktionsasnit Figur 2.3: Figuren viser en illustration a lipidens aser. Til venstre er det aserne ved orskellig vandprocent og aseovergangstemperaturer der kan alæses og til højre i den del a iguren, ses de tre aser der er abilledet ved en vandprocent på over 4% på iguren til venstre. Disse er lipidens aser når den er uldt hydreret. L den lydende krystallinske ase, P er rippleasen og det er overgangen mellem disse to aser der undersøges eksperimentelt og modelleringsmæssigt - L er gelase ved meget lave temperaturer (Cevc og Marsh, 1987, s.15). Faseskit 5 I aseligevægt gælder det, at de termodynamiske tilstandsvariable P,T,V,N er konstante. Dertil gælder det, at systemet beinder sig i en tilstand a størst mulig entropi og mindst mulig Gibbs ri energi. Et aseskit er en diskontinuert ændring i de ysiske egenskaber or et sto ved kun ininitesimale ændringer a omgivelserne. Omgivelsernes ændring kan eksempelvis være temperaturen, som systemet vil skabe ligevægt ved. Er omgivelsernes temperatur højere vil systemet modtage energi i orm a varme, der vil hæve temperaturen, indtil systemet når en karakteristisk temperatur, hvor det gennemgå et aseskit. Temperaturen, ved et givet tryk, hvor lydende og ast sto eksisterer i ligevægt, kaldes smeltetemperaturen T m. Denne er pr. deinition angivet under et standard tryk P std = 1 bar (,987 atm), og kaldes dera standard smeltetemperaturen (tkins, 199, s. 133). Karakterisering a aseskit eter, hvordan et termodynamisk potentiale som unktion a temperaturen opører sig. Lad os som eksempel tage enthalpien som unktion a temperaturen. Her gælder det ved et ørste-ordens aseskit, at der enten agives eller absorberes energi, hvilket ses som et spring på enthalpikurven (se igur 2.2). Dette spring kan ses som den latente varm. Dvs. den 5 Kilderne til dette asnit er hovedsageligt (Schröeder, 2), (tkins, 199) og (Wikipedia) 14
2 introduktionsasnit energi der skal til at smelte lipidet ra gel ase til lydende ase. Dette betyder, at der ved aseskitet er en endelig (init) ændring i enthalpien ved en ininitesimal ændring i temperaturen, hvilket vil sige at hældningen a kurven, og dermed varmekapaciteten, går mod uendelig. Ved et anden-ordens aseskit er der ikke noget spring på enthalpikurven og dermed ingen latent varme orbundet med aseskitet. Da energi i praksis ikke kan blive udvekslet instantant mellem omgivelserne og systemet, er ørste-ordens aseskit orbundet med områder, hvor dele a systemet er på gel asen og andre på den lydende ase. En kvalitativ tegning a enthalpien som unktion a temperaturen ved et aseskit, samt c p unktion a temperaturen ved et aseskit kan ses på igur (2.4). som ) H c P B) H Tm T c P Tm T Tm T Tm T Figur 2.4: Enthalpien som unktion a temperaturen, samt cp som unktion a temperaturen ved () et ørste-ordens aseskit og (B) et anden-ordens aseskit. Da den partielle aledte a enthalpien i orhold til temperaturen er lig cp, svarer hældningen på enthalpikurven (venstre) til cp kurven (højre). Det ses at ved et ørste-ordens aseskit der sker der et spring på enthalpikurven og som ølge a det går cp mod uendelig ved smeltetemperaturen T m,. Ved et anden-ordens aseskit er der ikke noget spring på enthalpikurven, men blot en ændring i hældningen, der, modsat et ørste-ordens aseskit, ikke går mod uendelig, således at ændringen i cp ligeledes er en endelig størrelse. Figuren er rit skitseret ra (tkins, 199, s. 145) 15
2 introduktionsasnit Et DMPC lipid aseskit ra gel til lydende ase er a ørste-ordens karakter, hvilket medører at c p. Men da det inder sted tæt på et kritisk punkt, hvorved aseskitet vil gå hen og blive anden-ordens, er aseskitet også præget hera (Doniach, 1977). Et kritisk punkt er deineret ved at være en tilstand ved et speciikt tryk (kritisk tryk) og temperatur (kritisk temperatur), hvorover der ikke længere sker nogle aseskit. Dette skyldes, at tilstandene over de kritiske størrelser ikke gennemgår nogle abrupte skit i densiteten or stoet, således at egenskaberne or de orskellige aser bliver identiske. Med andre ord er det ikke længere muligt at skelne de enkelte aser ra hinanden. (Schroeder, 2, s. 184) Blandingen, der bliver behandlet, består a lipid (DMPC) og alkohol (pentanol, heanol, heptanol, octanol), som begge er opløst i vand. Forholdet nh 2 O /( nalk + nlip ) 1 således at lipidet er tilstrækkeligt hydreret, samt at det kemiske potentiale or vandet kan anses or værende konstant. 7,81 Eksempel or blanding med lipid og heanol: 7 6 ( 9,994 1 mol + 4,9971 mol ) 2 mol = 137,8 hvilket betyder, at lipiden er uldt hydreret. t lipidet er hydreret gør, at vandkoncentration i membranen ikke er varierende, således at vandets tilstedeværelse ikke ændrer ved lipidets ysiske egenskaber. Er vandkoncentrationen derimod varierende, vil der udover gel og den lydende ase, ahængigt hera, inddrages lere sub-aser i det givne temperaturinterval (se asediagram på igur 2.3) (Heimburg, 27, s.16-17). Som ølge a, at der strømmer alkoholmolekyler ind og ud a membranen, er udvekslingen a vandmolekyler mellem lipidmembranen og vandet meget lille i orhold til det totale antal vandmolekyler. Dette er grunden til at det kemiske potentiale er konstant or vandet. På baggrund a det har vandet altså ideelt set ikke nogen indlydelse på interaktionen mellem lipidet og alkoholen, hvoror de i modellen kan ses som en opløsning i sig selv. Her er lipidet solventet, mens alkoholen er soluttet, da der benyttes et orhold på n / n = 1/5. lkoholen, der anvendes, oretager ikke noget aseskit, indenor det betragtede temperaturinterval (283-323 K) blandingen opvarmes i under en scanning. Det antages, at alkoholen blandes ideelt med lipiden i den lydende ase og slet ikke under gel asen. Sammenhæng mellem /H og /S ved aseskit I modellen benyttes der et udtryk som beskriver sammenhængen mellem enthalpiændringen og entropiændringen, der inder sted ved aseovergangstemperaturen. Udtrykket udledes ved at tage alk lip 16
2 introduktionsasnit udgangspunkt i udtrykket or varmekapaciteten ved konstant tryk c p (ligning 2.2). Da kan udtrykket omskrives til dq ' = TdS c p S = T T p (2.51) Entropiændringen indes ved at oretage separation a de variable og integralet tages på begge sider c S1 T1 p ds = S dt (2.52) T c T T1 p S = dt (2.53) T T Entropiændringen under en aseovergang or lipid ra ast til lydende (dvs. smeltning) kan nu indes ved at tage integralet i intervallet [ Tm T : Tm + T], hvor Tm er smeltetemperaturen og T er et lille temperaturinterval ør og eter smeltetemperaturen. Entropiændringen kan da approksimeres til 1 Tm +T Sm cpdt T (2.54) Tm T m Da Tm kan betragtes som en konstant. Ligning (2.24) or enthalpien indsættes H m Sm (2.55) Tm Som er sammenhængen mellem entropiændringen og enthalpiændringen ved smelteaseovergangen. Sammenhæng mellem /µ og /H, /S ved aseskit Ud ra ligning (2.36) kan ændringen, i Gibbs ri energi ved et g aseskit or lipid udtrykkes dg = µ dn µ dn (2.56) g g Idet både lipid molekylerne i gel asen og de smeltede lipider er en del a systemet, der betragtes, vil en orøgelse a antallet på gel orm medøre et tilsvarende tab a antallet på lydende orm. Det vil sige at dn g = dn. Ligning (2.56) kan deror omskrives til dg = ( µ µ ) dn (2.57) g Eller hvis der regnes med molespeciikke størrelser i stedet or antal molekyler dg = ( µ µ ) dn (2.58) g 17
2 introduktionsasnit Hvor altså µ g og µ er de kemiske potentialer or henholdsvis lipider på gelorm og lipider i lydende orm og n er antal mol a lydende lipider (Heimburg, 27, s.14). Ved termodynamisk ligevægt er dg / dn =, hvilket er i en situation, hvor der ikke er orskel på det kemiske potentiale or gelasen og den lydende ase µ g = µ (2.59) Hvilket som tidligere nævnt er gældende ved aseligevægt. Dernæst substitueres ændringen i den Gibbs ri energi med dg = dh TdS (ligning 2.18), og derved ås Tager integralet på begge sider ( µ µ ) dn = dh TdS (2.6) g ( µ µ ) dn = dh T ds g (2.61) ( µ µ ) n = H T S (2.62) g Er det lipid, der oretager aseskitet, kan det ved molspeciikke størrelser skrives som µ = H T S (2.63),,, Der således giver det endelige udtryk, der viser sammenhængen mellem ændringen a det kemiske potentiale og ændringen a enthalpi og entropi, ved aseskit. Dette udtryk vil blive benyttet i modelleringsarbejdet. Dierentiel scanning kalorimetri (DSC) 6 DSC er en metode til at måle den eekt, der skal til or at ændre et præparats temperatur som unktion a temperaturen. Derved kan termodynamiske størrelser så som varmekapacitet, aseskitstemperatur og tilhørende enthalpiændring bestemmes. Der eksisterer lere ormer or DSC. Følgende beskrivelse baserer sig på eekt-kompensations kalorimetri, da der blev anvendt et instrument a denne type i det eksperimentelle arbejde. Instrumentet der er anvendt er Microcals MC-2D, som har et eksternt vandbad, Neslab LT-5DD. Det grundlæggende princip i målemetoden er, at kalorimetret indeholder to prøver; en prøve samt en reerence. Reerencen har en veldeineret varmekapacitet og tiløres en ast mængde energi i orm a varme pr. tid således, at temperaturen stiger lineært indenor målingsintervallet. Prøven har 6 Kilderne til dette asnit er hovedsageligt: en manual der ulgte med microcal-apparatet, (Höhne et al., 1996) og (Wikipedia) 18
2 introduktionsasnit derimod en ukendt varmekapacitet og gennemgår aseskit under opvarmningen, der orudsætter, at eekten der tiløres varierer idet temperaturen a prøven bestræbes på at holdes ens med reerencen. Deri ligger muligheden or at bestemme temperaturen prøven oretager aseskit ved og om der skal tiløres mere eller mindre energi under aseskitet i orhold til reerencen or at holde temperaturen mellem dem ens. Tiløres der mere energi til prøven, er der tale om en endotermisk reaktion. Reduceres energitilørslen, er der tale om en eotermisk reaktion. Da der i orsøget bliver tilørt mere energi til prøven under aseskitet, sker der en endotermisk reaktion. Begrebet eekt-kompensations kalorimetri henviser til, at temperaturændringen i prøven ved aseskit udlignes ved, at der tiløres mere eller mindre elektrisk energi (dvs. eekt) til det varmelegeme der opvarmer prøven. DSC enheden består a to celler med hvert et volumen på 1,4 ml (se igur 2.5). Disse er indesluttet i et adiabatisk kammer or at undgå varmeudveksling med omgivelserne. Cellerne er opvarmet via to primære varmelegemer, der er tilørt en konstant eekt under en scanning ahængig a scanraten. Derudover modtager et sekundært varmelegeme eekt til yderligere opvarmning a reerencecellen. Denne anordning gør det muligt at tiløre mere energi til prøven i orhold til reerencen i det tilælde, hvor der sker en endoterm reaktion. Ydermere er der et sekundært varmelegeme ved prøvecellen, kaldet kalibreringsvarmelegeme. Temperaturorskellen T mellem de to celler er målt ortløbende og ud ra det registreres det, om der skal tiløres mere eller mindre eekt til kalibreringsvarmelegeme, således at T er gående mod. Denne eekt er benævnt som eedback eekten (mcal/min), der målt i sammenhæng med temperaturen (ºC) og tiden (sekund), udgør rådata, der opsamles. Idet temperaturen er målt ved hjælp a termoelementer placeret på ydersiden a cellerne, er målingerne orbundet med en vis usikkerhed, da varmen skal ledes igennem materialet og selve opløsningen, således der til en given tid måles en højere temperatur end den reelle i midten a cellen. 19
2 introduktionsasnit Figur 2.5: Figuren er en illustration a ovenstående beskrivelse a DSC-apparatet. I væggene a det adiabatiske kammer cirkulerer der vand rundt, der er ledt ra et eksternt vandbad. Vandets temperatur er reguleret vha. to varmelegemer, der tilstræber at holde vandets temperatur tilsvarende til den i cellerne. Der er tilkoblet en gaslaske, som er sat til ca. 1 bar or at have konstant tryk. Resultaterne ra målingerne abilledes typisk i et diagram, der viser heatlow (Q/t) som unktion a temperaturen T. Resultaterne vil yderligere blive behandlet således, at det er enthalpiændringen som unktion a temperaturen, samt varmekapaciteten ved konstant tryk c p som unktion a temperaturen, der bliver plottet. Som nævnt i asnittet om aseskit vil c p gå mod uendelig ved et 1.ordens-aseskit, idet temperaturen ikke ændrer sig som unktion a energitilørslen ved kvasistatiske antagelser. I praksis er energitilørslen dq begrænset a DSC apparatets scanrate, der er et mål or hvor mange grader, det skal opvarme i timen den anvendte scanrate på 45 C / Time C / Time. Idet er en absolut størrelse, brydes der med de kvasistatiske antagelser, idet systemet ikke opnår ligevægt under energitilørslen. Dette gør, at graen or dq / T orekommer kontinuerlig i det temperaturinterval, hvor aseskitstemperaturen sker. Derved registreres aseskitet som et maksimum på graen i stedet or et ikke-kontinuert spring. Se igur (2.6) or et eksempel på data plot. 2
2 introduktionsasnit -1.8 1-3 Plot a Heatlow som unktion a temperaturen or pentanol 2-1.9-2 Heatlow [J/sek] -2.1-2.2-2.3-2.4-2.5 28 285 29 295 3 35 31 315 Figur 2.6: Eksempel på dataplot. 21
2 introduktionsasnit. 22
3 Modellen Modellen Der benyttes en model, der beskriver henholdsvis enthalpiændringen og varmekapaciteten som en unktion a temperaturen. Modellen er udledt i (Heimburg, 27) og anvendt på DPPC og octanol. Formålet med at anvende denne model er at se, hvorvidt modellen passer på måledata or en anden lipid og andre alkoholer. Sidst i asnittet vil der blive introduceret et begreb, som skal benyttes til at orklare en a modelparametrene. Dette er partitionskoeicienten. J. ligning (2.51) kan det kemiske potentiale or lipiden på henholdsvis gel ase og lydende ase opskrives som µ g = µ g, + RT ln g (3.1) µ = µ, + RT ln (3.2) Hvor g er andelen a lipiden, der er på gelorm og er andelen a lipid, der er på lydende orm. g g g I tilælde a at = 1, så er µ = µ, og hvis = 1, så er µ = µ,. Dette betyder, at vi har en standardtilstand or det kemiske potentiale, der er svarende til, at hele lipiden er på samme orm. Ligningerne (3.1) og (3.2) trækkes ra hinanden g g g µ µ = µ + RT ln ) ( µ + RT ln (,, ) (3.3) µ g g, µ, = RT ln RT ln (3.4) Og omskrives til µ, µ RT g, = ln g ln = ln g (3.5) µ µ g g,, = ep RT (3.6) Brøken g vendes g µ, µ, = ep RT g (3.7) Der arbejdes med et ikke-ideelt system, da alkohol og lipid ikke blander sig i gelasen. Det betyder, g g at det kemiske potentiale ikke vil ændre sig i gelasen dvs. µ = µ. Eller sagt på en anden måde, 23
3 Modellen g vil de to potentialer ikke ændre sig, ordi der kun er en ase, så RT ln( ) = RT ln(1). Det kemiske potentiale or den lydende orm a lipiden, vil være det samme som ligning (3.2). Da de to kemiske potentialer or lipiden i de to aser er lig hinanden µ = så g µ µ g, = µ, + RT ln( ) (3.8) g µ, µ, ln( = ) RT Så bruges der at µ, = H, T S, og S, H, / Tm, (ligning 2.62 og 2.56 ) (3.9) ln( ln( H, H, T Tm, ) = (3.1) RT H, H, T Tm, ) = (3.11) R H 1 1, T T m, ln( ) = (3.12) R Ved at tage den eksponentielle unktion på begge sider ås et udtryk or H, 1 1 = ep (3.13) R T T m, Da den blanding, der modelleres over, er en blanding a alkohol og lipid, kan modellen tage udgangspunkt i et tilælde med to ensartede stoer, som antages at være lipider, or hvilke det gælder at g + g B = + B = 11 (3.14) Hvor B angiver den anden lipid. Dette kan så benyttes til at angive hvor meget a sto B, der er i blandingen g g B = B + B (3.15) Under orudsætningen at g + = 1, som betyder at i blandingen skal andelen a den lydende ase og andelen a blandingen der er på gelorm, angive alle blandingens aser, kan dette omskrives til g B = B + )1 B ( (3.16) 24
3 Modellen B g g = + + ( ) (3.17) B B B Hvilket giver g B = B B ) + ( (3.18) g B = (3.19) B B g B g B Dette benyttes or at å en unktion or enthalpien som unktion a temperaturen ved ( ) ( B B,, ) H T = H + H (3.2) Der udtrykker i ord, at den samlede enthalpiændring H som unktion a temperaturen T er givet ved summen a enthalpiændringsbidraget ra hhv. sto og B på lydende ase. Hvor andelen a sto er undet som produktet mellem andelen a sto på lydende ase og andelen a lydende sto. Ligeledes er andelen a sto B undet som produktet mellem andelen a sto B på lydende ase og andelen a lydende sto. Ved hjælp a ligning (3.19) substitueres derved B og derudover udnyttes det, at ( 1 B ) g B ( B B, B, ) g B B ( ) ( 1 H T = H + ) H = og år (3.21) Således udtrykket kun ahænger a andele a sto B. Da sto B (alkohol), der modelleres over, ikke har noget aseskit i intervallet, der ses på, betyder det, at andelen a sto B, der indes på gelorm, g er lig, dvs. =. Dette betyder også, at enthalpibidraget or sto B ikke har indlydelse på B modellen. Så ormel (3.21) kommer til at se ud som ølgende H B ( T ) = ( H ) B, (3.22) Hvor 1 = og deror er også B B = 1 hvorved ligningen kommer til at se ud som ølgende H B ( T ) = ( H ) 1, (3.23) Heri indsættes udtrykket or undet i ligning (3.13) H H B ep R H 1 ep R, m, ( T ) = H,, 1 1 T T 1 1 T T m, (3.24) 25
3 Modellen dh For at inde varmekapaciteten skal ovenstående dierentieres eter orskriten. dt Funktionen dierentieres som en brøk, hvor tæller og nævner begge er sammensatte unktioner, der dierentieres således, at den ydre unktion er a arten Udtrykket or cp indes derved som k ep og den indre unktion a arten ( T) k 1. c p 2 2 H, H, 1 1 H, H, 1 1 B ep ep 2 B 2 RT R T T m, RT R T T m, = + 2 H, 1 1 1 ep H, 1 1 R T T 1ep m, R T T m, 2 (3.26) Partitionskoeicienten Formålet med asnittet er at introducere partitionskoeicienten, der benyttes til at inde størrelsen B, som er blevet anvendt tidligere i kapitlet og ydermere at præsentere de udregnede størrelser a B. Partitionskoeicienten er et mål or, hvor opløseligt et sto er i et andet, hvor det gør sig gældende at jo højere partitionskoeicienten er, jo lavere er opløseligheden. Dette mål tages i en ligevægtstilstand, der udtrykt i molorhold er givet som n n (3.27) L, W, Hvor n, L er antal mol alkohol, der opholder sig i lipid dobbeltlaget og n, W er antal mol alkohol, der opholder sig i vandig opløsning. Ud ra dette er den molære partitionskoeicient deineret således: K, L = (3.28), W Hvor n, L, L = og n + n, L L n, W, W =, og hvor nl n + n, W W er antal mol lipid og nw er antal mol vand og hvor, L og, W henholdsvis er andelen a alkohol i lipiden og andelen a alkohol i vandet (Lund, 27, s. 15-17). Den størrelse, der er interessant i orhold til modellen, er, L, der svarer til B. ltså andelen a alkohol i lipiden. I modelleringsasnittet benævnes B som andelen a sto uden en aseovergang i 26
3 Modellen temperaturintervallet, og i modellen er der intet vandelement, hvilket betyder, at B i modellen tolkes som andelen a alkohol og i ovenstående som andelen a alkohol i lipiden. Det har kun været muligt at remskae partitionskoeicienter or DMPC or pentanol og heanol, mens værdierne or heptanol og octanol er or DPPC. Det antages at værdierne or DMPC vil være højere end de benyttede or DPPC, idet vi i litteraturen har set at partionskoeicienten mellem DPPC og heanol næsten kun var halvt så stor som den or DMPC. Pentanol 6 v.35 C (Shen et. al., 1999). Heanol 1458 v. 3 C (Suurkuusk og Singh, 1998) Heptanol 215 DPPC (Rowe et.al., 1998) Octanol 1,81W1 4 DPPC (Rowe et.al, 1998) For at inde ud a hvor meget alkohol der er i lipiden, indsættes i (3.28) udtrykkene or, L og, ( ) W K = n n, l, w n, w ( n + n ), l + n w l (3.29) For at kunne reducere mængden a ubekendte vurderes n, W til at være meget lille, i orhold til de andre størrelser, især n W n w n, l, dette betyder at nogle led kan approksimeres til. Dette drejer sig om,. Ligning 3.29 kommer deror til at se ud som ølgende K = n n, l, w n w n l (3.3) Dereter indsættes or n, W = n n, l K = n, l n w ( n n, l ) nl (3.31) Isolering a n, l n = n K Dereter indsættes (3.32) i ligning or n l, l (3.32) nw + nl K, L, L nl K n nw nl K + = nl K n + n nw nl K + l 27
3 Modellen Tallene or de orskellige størrelser indsættes og B beregnes or de respektive alkoholer til Pentanol Heanol Heptanol, L =,1556, L =,1689, L =,2771 Octanol, L =,1447 28
4 Forsøgsbeskrivelse Forsøgsbeskrivelse Der blev under det eksperimentelle arbejde produceret ire DMPC/vand opløsninger a ~8 ml. Fremstilling a DMPC opløsning sker ved, at Milli-Q vand opvarmes til 5 ºC, hvilket betyder at lipiden smelter eter blanding med vandet. Dernæst tages lipidet ud a ryseren or at opnå stuetemperatur. Dereter avejes og blandes lipid og vand i det ønskede blandingsorhold, som i orbindelse med eksperimentet har været en koncentration a lipid på ca.,3 %, svarende til 24 mg lipidpulver i en 8 ml opløsning. Blandingen omrystes i mindst en time ved en temperatur på 4 ºC (mindst 1 C over lipidens aseovergangstemperatur). Blandingen er klar, når der ikke er lere synlige korn a den rene lipid. Etruderingen påbegyndes, der i essensen har til ormål at kreere unilamellare vesikler (ULV), idet lipiden skubbes gennem ilteret og kommer ud på den anden side, lidt ligesom hvis der blæses sæbebobler (Hecksher og Plesner, 27). Dette sker ved en temperatur på 38 ºC svarende til 14 ºC over DMPC lipidernes smeltepunkt (1 C over plus lidt ekstra da vandet i etruderen taber varme under etruderingen). Der anvendes iltre ned til 1 nm og vesiklerne vil så have en størrelse, der ligger i omegnen (dog større j. sæbebobleprincippet) a de 1 nm. Desuden ahænger den iltrerede vesikelstørrelse a, hvilket tryk etruderingen oretages under. Den tilsluttede tryklaske indstilles til 3 bar, da der ønskes et tryk på 2 bar og da trykket alder ca. 1 bar ved etruderingen. De 2 bar sørger or at vesikelstørrelser ikke bliver større end 64 nm (Hecksher og Plesner, 27). Etruderingen gentages 1 gange og det observeres hereter at opløsningen er mere transparent end orinden. Koncentrationsbestemmelse a lipiden sker via en gravimetrisk bestemmelse (avejning), hvortil der anvendes 3-4 små skåle 7, der hver tilsættes en mængde a lipid opløsningen. Vægten a opløsningen noteres i et interval på 15 sek. i en periode på 2 min. Vægten vurderes ørst at have, stabiliseret sig eter 3 sek. hvoror data ra dette tidspunkt og rem medtages til at oretage ekstrapolation til tidspunktet. Eksempel på ekstrapolation kan ses på igur 4.1. Skålene sættes hereter i varmeskab i 24 timer ved 5 ºC or at ordampe vandet og dereter i ecicator i 1 time ligeledes or at ekstrahere 7 I et enkelt tilælde er der oretaget en gravimetrisk bestemmelse med 8 skåle, or at øge præcisionen a koncentrationsbestemmelsen. 29
4 Forsøgsbeskrivelse vandet ra lipiden. Skålene vejes igen or at måle mængden a lipid. Det vurderes, at den avejede mængde eter 3 sek. stabiliseringstid, er en gyldig måling, da der ikke sker nogen betydelig ordampning eller optagelse a vand i dette tidsrum, idet vægten ikke varierer hereter. Idet koncentrationen målt i skålene varierer anvendes en middelværdi or dem som værende koncentration a lipidopløsningen. Målingerne samt beregningerne a koncentrationerne kan ses i appendiks 1. 68.3 68.2 Ekstrapolation a massen a lipid/vand opløsning Opløsning nr. 3 Skål nr. 1 68.1 massen [mg] 68 67.9 67.8 67.7 67.6 67.5 2 4 6 8 1 12 tiden [sek] Figur 4.1: Eksempel ekstrapolation a vægten tilbage til tiden or en opløsning a lipid og vand. Koncentrationsorholdet a alkohol/lipid vælges til 1/5. Der ønskes en opløsningsmængde på ca. 2 ml or hver alkohol, der testes med, da der kun kan være 1,4 ml i DSC-kamrene. Eter tilsætningen a alkohol rystes blandingen i ca. 24 timer. Under DSC- kørsler er der kun oretaget up-scanninger, idet apparatet tilsyneladende ikke er i stand til at oretage down-scanninger. Inden Computerprogrammet startes og dermed også orsøget, sættes apparatet til ølgende indstillinger: Først sættes temperaturen på vandbadet, på en ekstern boks til ca. 5 C og vandbadet tændes. Hvis ikke vandbadet er tændt i orvejen kan det sættes til at køle hurtigt ned med rapid cool knappen. 3
4 Forsøgsbeskrivelse Dernæst yldes cellerne med henholdsvis vand i reerencen og lipidblanding i prøvecellen. Cellerne yldes med en kanyle og væsken, der er over røret (se igur 2.6 i asnit 2 der omhandler dierentiel scanning kalorimetri), som kun kanylen kan passere, jernes. Dereter orsegles celleåbningen (låget skrues på), og der åbnes or tryklasken, som er sat til ca. 1 bar. Dereter tændes boksen med kontrolpanelet, og scanraten sættes til den ønskede, der senere indtastes i microcalprogrammet. Knappen cooling in trykkes ind og vandbadet pumper koldt vand ind i væggene a det adiabatiske kammer. Når T mellem cellerne er og temperaturen på kontrolpanelet er under de 1 C, der ønskes som starttemperatur, startes microcalprogrammet på computeren. DSC målingerne blev ortaget i et temperaturinterval ra 1 C til 4 C med en scanrate på 45 C. Og de øvrige værdier der skal tastes i microcalprogrammet er Kalibrerings tid 2 min Tmin 1 C Tma 4 C Scanrate 45 C Filter 15 som er tidsintervallet mellem målingerne Tryk 1 or nedkøling til 1 C eter de 4 C er nået. Lige når programmet er startet trykkes cooling in knappen ud igen og der trykkes på reset knappen, or at tidligere indstillinger ikke skal å indlydelse på de nye målinger. En a de ørste scanninger der blev oretaget viste, at y-aksen var meget negativ og deror er der oretaget 7-8 eksperimenter, hvor både prøvecellen og reerencecellen har kørt med vand. Den største udordring herved var at å cellen så ren, at der ikke var antydning a en aseovergang. Dette blev udørt or at kende en baseline som så senere er blevet trukket ra de endelige data. Fejlkilder I dette underasnit præsenteres de ejlkilder, der dukkede op under den eksperimentelle del a projektorløbet. Forsøget er præget a mange usikkerheder, og dera er der blevet observeret mange besynderlige resultater. Vi har ikke været i stand til at redegøre or disse resultater. Det succeskriterium der er blevet stillet or godtagelse a et resultat har været reproducerbarhed. Det vil 31
4 Forsøgsbeskrivelse sige at en scanning, som minimum skulle kunne gentages to gange, med ensartede resultater. Fejlkilder som vurderes at have størst betydning or resultaterne er: Ved tilsætning a alkoholen til lipidblandingen opstod der som tidligere nævnt problemer med vægtens kapacitet, hvilket betyder, at det reelle molorhold ligger lidt over eller lidt under 1/5 i lipidens avør. Den valgte scannrate kan være et problem, da der ikke når at opstå termisk ligevægt i cellerne ved energitilørslen. Dette resulterer i, at der måles en højere temperatur end temperaturen i midten a cellen, da temperaturmåleren sidder på ydersiden a cellen. Hvad disse ejlkilder har hat a betydning or resultaterne, vil senere blive taget op i diskussionsasnittet (asnit 7). 32
5 Databehandlingsmetode Metode til databehandling Dette asnit vil omhandle den tilgang der benyttes til ortolkning a både de eksperimentelle data og data ra modelleringsarbejdet. Databehandling a de eksperimentelle data Datailen ra DSC-scanningen indeholder data or eekt (mcal/min), temperaturen ( C) og tiden (sekunder). Under databehandlingen omregnes eekten til enhederne J/s og temperaturen til enheden kelvin. Disse udgør datamængden der benyttes til rådataplot (se appendiks 2). Idet kurverne or plottet ud ra rådata lå orskudt ra nul på y-aksen, blev der oretaget orsøg med vand i begge celler or at bestemme en baseline or data. En kalibrering kunne da oretages ved at trække denne ra rådata. Et plot or en vand-vand scanning kan ses på igur 5.1. -2.15 1-3 Plot a kalibreringsorsøg med vand -2.2-2.25-2.3 Heatlow [J/sek] -2.35-2.4-2.45-2.5-2.55-2.6 28 285 29 295 3 35 31 315 Figur 5.1: Plot a et DSC scan med vand i begge celler. Dette havde til ormål at bestemme en baseline or data, som rådata kunne kalibreres eter. For at opnå en baselinie med tilnærmelsesvis konstant heatlow, var det påkrævet at rense cellerne grundigt ved at skylle gentagende gange med henholdsvis et opløsningsmiddel (contrad) og dereter vand. Herimellem blev der kørt scanninger der udviste en systematisk variation a heatlow som unktion a temperaturen, og dermed urenheder i cellerne. Som det remgår a plot or rådata er orskydningen ra ikke en konstant værdi men varierer omkring den målte baseline. Det er således 33
5 Databehandlingsmetode ikke tilstrækkeligt blot at anvende den målte baseline til kalibrering. Deror må der oretages en individuel baselinekalibrering or hver enkel scanningen. Til dette tages databehandlingsprogrammet Origin i brug. Denne procedure er illustreret på igur 5.2 og 5.3 og beskrevet i igurteksten 8.,1,8 Heatlow [J/sek],6,4,2, 5 1 15 2 25 tid [sek] Figur 5.2: Baselinekalibrering oretaget i Origin på data ra scanning på DMPC/vand. De lineære segmenter der er placeret hhv. til venstre og højre or toppen, placeres således at de itter kurven. Dernæst beregner programmet baseline ved at ekstrapolere data ra venstre til højre segment. Hældningen på baseline under toppen (her skitseret i ri hånd), er bestemt ved, andelen a det samlede areal under kurven, kurven har bevæget sig over til en given temperatur. Dereter trækkes baseline ra data.,1,8 Integ o DSC_Data_ rom T Range = 15 --> 24 rea=,9996 Heatlow [J/sek],6,4,2, 5 1 15 2 25 tid [sek] Figur 5.3: Kurven eter baselinekalibreringen. Det er nu muligt at å Origin til at beregne arealet under kurven, hvilket svarer til den samlede enthalpiændring under smeltningen a lipidet. I dette tilældet med DMPC/vand scanningen er 8 Kilde: Tutorial guide, DSC data analysis in Origin. 34
5 Databehandlingsmetode arealet,996 J. Det målte lipidmængde i blandingen er 4.997W1-6 mol, hvilket giver en enthalpiændring pr. mol på 2 kj/mol. Eter baselinekalibreringen er det muligt at alæse smeltetemperaturen. Denne bliver alæst som temperaturen ved toppunktet a heatlow kurven. Denne metode er anvendt eter en vurdering a hvor godt de eksperimentelle data stemmer overens med data or DMPC undet i litteraturen. I litteraturen er smeltetemperaturen or DMPC undet som 297,25 K (Jutila og Kinnunen, 1997)). Temperaturen ved toppunktet a kurven er alæst til 297,7 (se igur 5.4). ltså en orskel på,45 K. En anden alæsningsmetode, der iølge (Höhne et al., 1997) er bedre, oregår ved at tangenten på orsiden at toppunktskurven orlænges ned på temperaturaksen, hvor den reelle temperatur alæses. Her argumenteres med at DSC apparatet har en orsinket reaktionstid og at toppunktet vil remkomme ved en højere temperatur end den hvorved aseskitet aktisk sker (Höhne et al., 1997, s. 48). læsningen a smeltetemperaturen vha. de to metoder kan ses på igur 5.5 og igur 5.6. Her ses det at smeltetemperatursænkningen a DMPC/octanol er 3,7 K ved toppunktsmetoden og 6,1 K ved tangentmetoden. For DMPC/heanol der er smeltetemperaturen 1,1 K ved toppunktsmetoden og 2,8 K ved tangentmetoden. Den relative orskel på ændringen i smeltetemperaturen bliver altså større hvis tangentmetoden anvendes. Dette skyldes at aseskitet ikke inder sted under det samme temperaturinterval, ej heller med den samme signalstørrelse or de orskellige målinger. På baggrund a det vurderes det at tangentmetoden ikke er anvendelig or de pågældende data der skal behandles. 1-4 Plot a Heatlow som unktion a temperaturen or ren DMPC 8 7 6 Heatlow [J/sek] 5 4 3 2 1 28 282 284 286 288 29 292 294 296 298 3 32 34 Figur 5.4: læsning a smeltetemperaturen (T m ) vha. de to metoder. Ved anvendelse a toppunktsmetoden er T m alæst til 297.7 K, mens ved tangentmetoden er T m alæst til 296,7. 35
5 Databehandlingsmetode 1-4 Plot a Heatlow som unktion a temperaturen or DMPC/octanol 8 7 6 Heatlow [J/sek] 5 4 3 2 1 28 282 284 286 288 29 292 294 296 298 3 32 3435 Figur 5.5 læsning a smeltetemperaturen vha. de to metoder. Ved anvendelse a toppunktsmetoden er T m alæst til 294 K, mens ved tangentmetoden er T m alæst til 291,6. 1-4 Plot a Heatlow som unktion a temperaturen or DMPC/heanol 8 7 6 Heatlow [J/sek] 5 4 3 2 1 28 282 284 286 288 29 292 294 296 298 3 32 34 Figur 5.6 læsning a smeltetemperaturen vha. de to metoder. Ved anvendelse a toppunktsmetoden er T m alæst til 296.6 K, mens ved tangentmetoden er T m alæst til 294,9. Eter kalibreringen omregnes data til enheden J/mol og abildes som ørst enthalpiændring som unktion a temperaturen og dernæst varmekapacitet som unktion a temperaturen. Enthalpiændringen pr. mol som unktion a temperaturen beregnes manuelt eter orskriten 36
5 Databehandlingsmetode H j Q1 t Q2 Q Q 1 t j Qj 1 t = + + + + + (5.1) n t 2n t t 2n t t 2n Hvor t er tidsintervallet mellem hver måling på 15 sekunder og n er antallet a mol lipid. Denne orskrit er et estimat or integration a kurven til en given tid og dermed temperatur, der bygger på at der beregnes en undersum og en oversum, der trækkes ra hinanden og divideres med to. Varmekapaciteten er hældningen på enthalpikurven, er estimeret som lineær i de enkelte temperaturintervaller, således at orskriten her er cp j ( H j / n) ( H j1 / n) = ( T T ) j j1 (5.2) Databehandling a modellen ligning (3.24) har vi et udtryk or enthalpiændringen som unktion a temperaturen Hvor B H H B ep R H 1 ep R, m, ( T ) = H,, 1 1 T T 1 1 T T m, (5.3) er andelen a alkohol i lipiden, der er undet vha. partitionskoeicienten og koncentrationsbestemmelser ra orsøget. R er gaskonstanten i enheden J/molWK, Tm er smeltetemperaturen or ren lipid. H, er i modelasnittet deineret som den enthalpi det kræver at smelte et mol ren lipid, og er undet som tabelværdi på 25 kj/mol (Jutila og Kinnunen, 1997). Ud ra udtrykket kan det ses at or T T m, vil nævneren gå mod nul, således at H. Dette giver ikke nogen ysisk mening, idet enthalpiændringen ved et aseskit har en øvre grænse svarende til den enthalpi det kræver at smelte lipiderne i blandingen. Følgende igurer er plottet or ét mol hvorved den øvre grænse er sat til H,. I modelasnittet dierentieres udtrykket or enthalpiændringen i orhold til temperaturen, hvilket gav ølgende udtryk or varmekapaciteten ved konstant tryk c p 2 2 H, H, 1 1 H, H, 1 1 B ep ep 2 B 2 RT R T T m, RT R T T m, = + 2 H, 1 1 1 ep H, 1 1 R T T 1ep m, R T T m, 2 (5.2) 37
5 Databehandlingsmetode Som det her remgår, så består udtrykket a to led, hvor nævneren i dem begge vil går mod nul or T T m,. Nævneren i det sidste led er imidlertid kvadreret, hvilket medører at den går hurtigst mod nul. Det essentielle heri er at dette sker or T T m,, hvilket er udenor modellens gyldighedsområde (se igur 5.8). Dette betyder at c p ikke gå mod uendelig ved den sænkede smeltetemperatur. Plot or enthalpiændringen og c p, som de ses i (Heimburg, 27, s. 112) er vist på igur 5.7. Figur 5.7: Plot or enthalpiændringen og cp, som de ses i (Heimburg, 27, s. 112). Her er ølgende parametre anvendt B =,2, T m =314 K, T =-,47 og, = 35kJ/mol. m Tilsvarende parametre er indsat i de udledte udtryk or H ( T) H ligning (5.1) og c p ligning (5.2). De tilhørende plot kan ses på igur 5.8 og Matlabkoden hvorudra de er plottet kan ses i appendiks 3. Plot a enthalpiændringen som unktion a temperaturen 4 14 ud ra modellen or DPPC 6 15 Plot a cp som unktion a temperaturen or DPPC ud ra modellen. Enthalpiændringen [J/mol] 3.5 3 2.5 2 1.5 1.5 cp [J/(mol*K)] 5 4 3 2 1 37 38 39 31 311 312 313 314 315 316 37 38 39 31 311 312 313 314 315 316 Figur 5.8: Plot or enthalpiændringen og cp, ud ra de udledte udtryk. Her er ølgende parametre anvendt B =,2, T m =314 K og, = 35kJ/mol. De stiplede linier angiver modellens gyldighedsområde. H 38