PLATELIA ASPERGILLUS EIA 96 TESTS 62796

Transkript

1 PLATELIA ASPERGILLUS EIA 96 TESTS PLATELIA ASPERGILLUS EIA ER EN IMMUNOENZYMATISK SANDWICH MIKROTITERPLADE-ANALYSE TIL PÅVISNING AF ASPERGILLUS GALACTOMANNAN ANTIGEN I SERUM.

2 1- FORMÅL Platelia Aspergillus EIA er en immunenzymatisk sandwich mikrotiterplade-analyse til påvisning af Aspergillus galactomannan antigen i serumprøver. 2- INDIKATIONER FOR BRUG Platelia Aspergillus EIA er en analyse som, når den bruges sammen med andre diagnostiske procedurer såsom mikrobiologisk kultur, histologiske undersøgelser af biopsiprøver og radiologisk påvisning, kan bruges som et hjælpemiddel til at diagnosticere Invasiv Aspergillosis. 3- RESUME OG FORKLARING Aspergillus infektioner opstår som regel efter inhalation af Aspergillus sporer, der er til stede i omgivelserne. Invasive former, som der er blevet flere af i løbet af de sidste 10 år, medfører de mest alvorlige infektioner. De opstår hovedsageligt hos neutropeniske patienter (efter behandling mod cancer) og hos patienter behandlet med immunosuppressiva (organtransplantationer, især knoglemarvstransplantation) og kortikosteroider 7. Aspergillus er sjældent isoleret fra blodkultur. Diagnosen er ofte baseret på nonspecifik diagnostisk eller radiologisk påvisning (kliniske symptomer, CT scan, røntgenbilleder af brystkasse, etc.) På nuværende tidspunkt viser analysen for opløseligt galactomannan antigen i serum sig at være en serologisk metode, der kan være en hjælp til at stille diagnosen på Invasiv Aspergillosis 6, 9, 14, 34, PRINCIPPER FOR PROCEDUREN 27 Platelia Aspergillus EIA er en et-trins immunenzymatisk sandwich mikrotiterplade-analyse, som påviser galactomannan i humant serum. Analysen bruger monoklonale antistoffer EBA-2 fra rotter, som er rettet mod Aspergillus galactomannan og som er blevet karakteriseret i tidligere studier 16, 28. Monoklonale antistoffer bruges (1) til at dække mikrotiterpladens brønde og binde antigenet og (2) til at påvise antigenet bundet til den sensibiliserede mikrotiterplade (konjugat-reagens: peroxidasebundne monoklonale antistoffer). Serum prøverne varmebehandles under tilstedeværelse af EDTA for at adskille immune komplekser og bundfælde serumproteiner, som muligvis kan interferere med testen 15. De behandlede serumprøver og konjugatet fordeles i brøndene dækket med monoklonale antistoffer og inkuberes. Et monoklonalt antistof - galactomannan - monoklonalt antistof / peroxidasekompleks dannes ved tilstedeværelse af galactomannan antigen. Strimlerne vaskes for at fjerne ubundet materiale. Derefter tilføjes substratopløsningen, som vil reagere med komplekserne bundet til brønden for at danne en blå farvereaktion. Enzymreaktionen standses ved at tilsætte syre, der ændrer den blå farve til gul. Den optiske absorbans af prøver og kontroller bestemmes med spektrofotometer indstillet på bølgelængderne 450 og 620 nm. 5- REAGENSER Platelia Aspergillus EIA: Produkt nr (96 Tests) Opbevar kittet ved 2-8 C. Bring alle reagenserne til stuetemperatur (18-25 C) før brug. Straks efter brug skal alle reagenser, undtagen kontroller, igen bringes til 2-8 C. Efter rekonstitution skal ubrugt negativ kontrol, cut-off kontrol og positiv kontrol fryses til -20 C. Kom ubrugte strimler/plader tilbage i posen og forsegl den. Fjern ikke tørremidlet. Strimlerne bør bruges indenfor 5 uger efter posen er blevet åbnet og lukket igen. Efter fortynding kan vaskeopløsninger opbevares i 14 dage ved 2-8 C. Alle de andre reagenser er holdbare indtil udløbsdatoen efter åbning. Reagenser leveres i tilstrækkelig mængde til at foretage 96 test i højst 9 omgange. 130

3 R1 R2 R3 R4 R5 Komponent Indhold Mængde Microwell Mikrotiterplade : 1 Plade / Strip - 96 brønde (12 strimler med hver 8 brønde) belagt 12 x 8 brønde Plate med anti-galactomannan monoklonale antistoffer Concentrated Washing Solution Negative Control Serum Cut-off Control Serum Positive Control Serum Koncentreret vaskeopløsning (10X): - Tris NaCl buffer - 1% Tween 20-0,01% thimerosal Negativ kontrolserum: - Frysetørret humant serum negativ for galactomannan - Negativ for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBs antigen Cut-off kontrolserum: - Frysetørret humant serum som indeholder galactomannan - Negativ for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBs antigen Positiv kontrolserum: - Frysetørret humant serum som indeholder galactomannan - Negativ for anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antistoffer og HBs antigen R6 Conjugate Konjugat (klar til brug): - Anti-galactomannan monoklonal antistof / peroxidase mærket - Konserveringsmiddel: 0,01% thimerosal R7 R8 R9 R10 Serum Treatment Solution TMB Substrate Buffer Chromogen: TMB Solution Stopping Solution Serumbehandlet opløsning (klar til brug): - EDTA syreopløsning TMB Substratbuffer (klar til brug): - Citronsyre- og natriumacetatopløsning - 0,009% Hydrogenperoxid - 4% Dimethylsulfoxid (DMSO) Kromogen TMB opløsning (koncentreret): - 90% dimethylsulfoxid (DMSO) opløsningen som indeholder 0,6% tetramethylbenzidin (TMB) Stopopløsning (klar til brug): - 1,5 N svovlsyre (H 2 SO 4 ) 1 x 100 ml 3 x qs* 1 ml 3 x qs* 1mL 3 x qs* 1 ml 1 x 8 ml 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml 1 x 12 ml Plate sealers - Selvklæbende ark til mikrotiterplader 1 x 8 ark NB: TMB (Tetramethylbenzidin) er et non-carcinogent og non-mutagent kromogen til peroxidase. *NB: qs: Tilstrækkelig mængde 6- ADVARSLER TIL BRUGERE 1. Vedrørende in vitro-diagnosticering. 2. Kun til professionelt brug. 3. Det anbefales ikke at bruge dette testsæt med andre prøver end humant serum. 131

4 4. Den positive kontrol, cut-off-kontrollen og den negative kontrol udføres med humant serum, som er testet og fundet ikke-reaktivt for HBsAg og antistoffer for HIV-1, HIV-2 og HCV med CEmærkede test. Alle reagenser skal dog behandles som mulige infektionsbærere. Alle test skal udføres i overensstemmelse med OSHA-standard for blodbårne patogener, biosikkerhed niveau 2 eller korrekte metoder for biosikkerhed. 5. Bær beskyttelsesdragt inklusive laboratoriekittel, øjen-/ansigtsbeskyttelse og engangshandsker (syntetiske non-latex handsker anbefales), og behandl reagenssættet og patientpøverne i henhold til korrekt laboratoriepraksis. Vask hænderne grundigt efter udførelse af testen. 6. Undgå at pipettere med munden. 7. Undgå at ryge, drikke eller spise i de områder, hvor prøverne eller reagenserne i sættet håndteres. 8. Undgå at stænke med prøvematerialer eller opløsninger. 9. Biologisk væske, der spildes, og som ikke indeholder syre, skal tørres grundigt op med et effektivt desinfektionsmiddel. De desinfektionsmidler, der kan bruges (men ikke kun disse), er f.eks. en 10 % blegemiddelopløsning (0,5 % natriumhypochloritopløsning), 70 % ethanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Materialer, der er brugt til at tørre spildte væsker op, skal muligvis bortskaffes som biologisk farligt affald. ADVARSEL: Anbring ikke opløsninger, der indeholder blegemiddel, i autoklaven. 10. Spild, der indeholder syre, skal absorberes (tørres op) korrekt eller neutraliseres med natriumbikarbonat, og området skal rengøres og tørres; hvis der har været indhold af biologisk farligt materiale, skal området tørres over med et af de kemiske desinfektionsmidler. 11. Bortskaf alle prøver og materialer, der har været anvendt ved udførelsen af testen, som om de indeholder smitsomme stoffer. Kemisk og biologisk farligt laboratorieaffald skal behandles og bortskaffes i henhold til gældende krav for bortskaffelse af affald. 12. ADVARSEL: Følgende liste angiver potentielle kemiske farer, som findes i nogle af sættets komponenter (se afsnit 5- REAGENSER): 1,5 N svovlsyre (7,2 % H 2 SO 4 ) stopopløsningen er ætsende, kan forbrænde øjne og hud; kan være farligt, hvis det indtages eller kommer i kontakt med huden; kan forårsage alvorlige øjenskader, inklusive permanent svækkelse af synet eller blindhed. C-Ætsende Skal holdes på afstand af stærke baser og reduktionsstoffer. R34-41 Forårsager forbrændinger. Risiko for alvorlige skader på øjnene. S24/ /37/ Undgå kontakt med hud og øjne. Hvis stoffet kommer i øjnene, skal der straks skylles grundigt med vand, og der skal søges lægehjælp. Tilsæt aldrig vand til dette produkt. Benyt egnet beskyttelsestøj, handsker og briller/maske. Dette materiale og dets beholder skal bortskaffes som farligt affald. Spild fra dette materiale betragtes som farligt syreholdigt affald, men hvis det er tilladt i henhold til gældende krav for bortskaffelse af affald, kan det neutraliseres til ph 6-9 for ikke-farligt affald, hvis personalet er uddannet og udstyret til dette. 0,01 % Thimerosal (natriummertiolat), et organisk kviksølv biocid-konserveringsmiddel, som retter sig mod centralnervesystemet (CNC), er et reproduktivt giftstof og en betydelig sensibilisator; langvarig eller gentagen påvirkning kan forårsage allergiske reaktioner hos særligt følsomme personer; der findes flere tilfælde af overfølsomhed som resultat af påvirkning med fortyndinger af Thimerosal-opløsninger. Undgå udslip til miljøet, fare for kumulative virkninger. Brugte opløsninger, der indeholder kviksølv med en koncentration på mere end 0,2 ppm, skal bortskaffes som farligt affald (D009) i henhold til US Federal RCRA, dog skal alt affald bortskaffes i overensstemmelse med de lokale, regionale og nationale love. (Bemærk: Kviksølv (Hg) udgør 49,55 % af Thimerosalmolekylet, så en komponent med 0,01 % Thimerosal indeholder ~0,005 % (~50 ppm) kviksølv w/v). Hvis stoffet kommer på huden, skal det straks skylles af med rigeligt vand. Advarsel! I Californien er Thimerosal kendt for at forårsage reproduktiv toksicitet. 13. Materialesikkerhedsdataarket (MSDS) udleveres efter anmodning. 132

5 7- FORHOLDSREGLER FOR BRUGERE 1. FROSNE SERUMPRØVER OPBEVARET UNDER UKENDTE FORHOLD KAN GIVE FALSKE POSITIVE RESULTATER PÅ GRUND AF KONTAMINERING MED SVAMPE OG/ELLER BAKTERIER. 2. Brug ikke kittet eller et reagens fra et kit efter den anførte udløbsdato. 3. Bland ikke reagenser fra andre kit med et andet lotnummer sammen, med undtagelse af koncentreret vaskeopløsning (R2) og stopopløsning (R10). 4. Bring alle reagenser til stuetemperatur i mindst 15 minutter før brug. 5. Bland reagenserne grundigt under rekonstitution og udvis forsigtighed for at undgå mikrobiel kontaminering. 6. Kør ikke testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyder) eller støv, der kan ændre konjugaternes enzymaktivitet. 7. Brug rene, engangsbeholdere i polypropylen til at forberede den substrat-kromogene reaktionsopløsning. Hvis der bruges udstyr i glas, skal det først vaskes i 1N saltsyre, skylles med destilleret vand og tørres. 8. Brug nye pipettespidser hver gang ved manual afpipettering af kontroller og prøver for at undgå overføring af prøver. 9. Overhold det anbefalede antal vaskecyklusser for at sikre en passende vask af brøndene og at alle brøndene bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Vask bør ikke udføres manuelt med en plasticflaske. 10. Lad ikke mikrotiterpladen tørre mellem afslutningen af vaskecyklussen og tilføjelsen af reagenser. 11. Brug ikke den samme beholder til konjugat- og substratopløsninger. 12. Lad ikke konjugat eller substratkromogene reaktionsopløsninger komme i berøring med metal eller metalioner. 13. Undgå at udsætte kromogenopløsingen eller den substratkromogene reaktionsopløsning for stærkt lys under opbevaring eller inkubation. Lad ikke kromogenopløsninger komme i berøring med et oxiderende stof. 14. Undgå at stopopløsningen kommer i berøring med et oxiderende stof. Lad ikke stopopløsningen komme i berøring med metal eller metalioner. 15. Brug rent udstyr uden støv (glas, spidser, beholdere, etc.) for at minimere muligheden for kontaminering med Aspergillus sporer fra miljøet. Da galactomannan er varmestabil, garanterer sterilisationen af brugt udstyr ikke, at der ikke findes kontaminerende antigener. Pyrogenfrit udstyr er optimalt, men standard udstyr kan bruges med passende forholdsregler. 16. Opløsninger (sera, behandlingsopløsning, konjugat) eller åbne beholdere (plader, glas, pipetter) skal udsættes mindst muligt for luft. 17. Hæld ikke et ubrugt konjugat tilbage i den oprindelige beholder. 18. Den substratkromogene reaktionsopløsning skal være farveløs. Hvis der opstår en blå farve efter fortynding, betyder det at reagenset er kontamineret og det bør ikke bruges. Kasser det og forbered et nyt reagens. 8- FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENSER Mikrotiterplade med brønde (R1) Efter åbning af posen er mikrotiterpladerne holdbare i 5 uger, når de opbevares ved +2-8 C i deres omhyggeligt lukkede oprindelige pose med tørremidlet. Arbejds vaskeopløsning (R2) Forbered arbejdsvaskeopløsningen ved at tilføje 1 del koncentreret vaskeopløsning til 9 dele sterilt deioniseret eller destilleret vand. Arbejdsvaskeopløsningen kan opbevares i 14 dage ved 2-8 C. Forbered en tilstrækkelig mængde arbejdsvaskeopløsning til at fuldende testforløbet (80 ml til en strimmel: 8 ml R ml destilleret vand). Efter åbning er den koncentrerede vaskeopløsning holdbar indtil udløbsdatoen, når den opbevares ved C og den ikke er kontamineret. 133

6 Negativ kontrolserum (R3) Rekonstituer indholdet i en flaske kontrol med 1000 µl (1 ml) sterilt, renset vand (helst pyrogenfrit vand). Serummet skal rehydreres lige før testen køres. Bland grundigt efter at have ladet serummet rehydrere i 2-3 minutter. Afmål 300 µl i hver af 3 mikrocentrifugeglas i polypropylen. Alle resterende centrifugeglas i polypropylen, der ikke skal bruges efter rehydrering, skal straks fryses ned til -20 C. NB: Kontrolserum, der er blevet rehydreret og straks efter frosset ned til -20 C, kan optøs og bruges uden yderligere rehydrering. Frosne rehydrerede kontroller kan opbevares ved -20 C i op til fem uger. Håndter kontrolserumet på samme måde som patientprøver (300 µl serum µl behandlingsopløsning, osv...). Cut-off kontrolserum (R4) og positivt kontrolserum (R5) Forberedes som beskrevet ovenfor for negativ kontrolserum. Substrat-kromogen reaktionsopløsning (R8 + R9) Forbered substrat-kromogen reaktionsopløsning ved at tilsætte 1 del koncentreret kromogen TMB opløsning, R9, til 50 dele TMB substratbuffer, R8. Forbered 2 ml substrat-kromogen reaktionsopløsning pr. strimmel: 40 µl R9 + 2 ml R8. Opløsningen er holdbar i 6 timer, når den opbevares i mørke ved stuetemperatur ( C). Efter åbning er R8 og R9 reagenserne holdbare indtil udløbsdatoen anført på etiketten, når de opbevares ved +2-8 C og de ikke er kontaminerede. Konjugat (R6), Serum behandlingsopløsning (R7) og Stopopløsning (R10) Efter åbning er R6, R7 og R10 reagenser holdbare indtil udløbsdatoen anført på etiketten, når de opbevares ved +2-8 C og de ikke er kontaminerede. 9- INDSAMLING AF PRØVEMATERIALE Tag blodprøver i overensstemmelse med standard laboratorieprocedurer. Testen skal udføres på serum. Serumprøverne må ikke være kontaminerede med svampesporer og/eller bakterier. Transporter og opbevar prøverne i forseglede glas, så de ikke udsættes for luft. Uåbnede prøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 5 dage, før de testes. Efter første åbning kan prøverne opbevares ved 2-8 C i 48 timer, før de testes. For længere opbevaring skal serumet fryses ned til -70 C. Serumprøverne kan udsættes for højst 4 nedfrysnings- / optøningscykler. Tidligere frossent prøvemateriale bør blandes grundigt efter optøning, før det testes. Resultaterne påvirkes ikke af prøver, der indeholder op til 20mg/L bilirubin, lipæmiske prøver der indeholder mængder op til det, der svarer til 2g/L triolein (triglycerid) eller hæmolyserede prøver der indeholder op til 165 mg/l hæmoglobin. Interferenser i forbindelse med et overskud af albumin er ikke blevet testet. Deaktiver ikke komplement sera. 10- PROCEDURE Medfølgende materiale Se afsnittet REAGENSER. Nødvendigt, ikke medfølgende materiale 1. Sterilt, destilleret eller deioniseret vand til fortynding af vaskeopløsning. 2. Sterilt, renset vand til rekonstitution af kontrolserum. 3. Absorberende papir. 4. Engangshandsker. 5. Beskyttelsesbriller. 6. Natriumhypochlorit (blegemiddel) og natriumbikarbonat. 7. Justerbare eller forindstillede pipetter eller multipipetter til måling og fordeling af 50 µl, 100 µl, 300 µl, og 1000 µl. 8. 1,5 ml mikrocentrifugeglas i polypropylen med lufttætte hætter, som kan tåle en opvarmning til 120 C (varmeskab) elle 100 C (kogende vandbad). 134

7 a. Glas med skruehætter: 1,5 ml koniske glas, Bio-Rad Kat. # eller lignende. b. Glas med tryklågshætte: EZ Mikro testglas, 1,5 ml, Bio-Rad Kat. # eller lignende. 9. Hættelås til mikroglas (VWR Kat. # eller lignende). Disse låse forsegler glas med smækhætter på en sikker måde ved at forhindre, at de åbner sig under temperatur- og trykændringer og de gør det også let at løfte glassene ud af varmeskabet eller vandbadet. 10. Laboratoriecentrifuge til 1,5 ml glas i polypropylen som kan nå op på g. 11. Rund, flydende mikro-centrifugestativ til 1 l bægerglas. 12. Vortex-blander. 13. Varmeskab. Følgende varmeskabsmodeller anbefales: a. model med 1 skab: Grant kat. # QBD1 (VWR kat. # ) b. model med 2 skabe: Grant kat. # QBD2 (VWR kat. # ) 14. Skab til varmeskab: Begge skabe skal kunne bruges sammen med Grant skab kat. # QB-E1 (VWR kat. # ) 15. Kogende vandbad med temperatur på 100 C 16. Mikrotiterplade inkubator med temperatur på 37 ± 1 C. 17. Halvautomatisk eller automatisk mikrotiterpladevasker. 18. Mikroplade aflæser udstyret med 450 nm og 620 nm filtre. Kommentarer vedrørende proceduren Negative, positive og cut-off kontroller skal testes ved hver kørsel for at validere testresultaterne. Behandling af sera Alle kontrol sera: Negative(R3), cut-off(r4) og positive(r5) skal forberedes samtidigt med testprøverne: 1. Pipetter 300 µl af alle testsera og kontroller i individuelle 1,5 ml polypropylen glas 2. Tilsæt 100 µl serum behandlingsopløsning (R7) til hvert glas. 3. Bland grundigt ved at ryste glassene kraftigt eller bruge Vortex-blanderen for at blande godt. Luk hvert glas godt for at undgå, at de åbner sig under opvarmning. Brug en hættelås til smækhætter. Prik ikke hul i hætten. 4. Ved brug af varmeblok: Varm glassene op i 6 minutter i varmeskabet ved 120 C. Stil ikke glassene ind i varmeskabet, før den foreskrevne temperatur er nået.(*) ELLER Ved brug af vandbad: Hvis der bruges kogende vandbad: Varm glassene op i 3 minutter ved 100 C. (*) 5. Tag forsigtigt de varme glas ud af varmeskabet eller det kogende vandbad og stil dem i en centrifuge. Centrifuger glassene ved x g i 10 minutter. 6. Supernatanten (det øverste lag) bruges til at påvise galactomannan antigen. 7. Supernatanten testes ved hjælp af følgende procedure. Efter forberedelse kan, supernatanten fjernes og opbevares ved 2-8 C i op til 48 timer, før det skal testes. Hvis analysen af resultaterne indikerer, at der kræves en ny test, skal et nyt glas med afmålt serum behandles til test. (*) En streng overholdelse af den foreskrevne temperatur og den foreskrevne gennemløbstid ligesom brug af anbefalet materiale er væsentlige faktorer for at opnå et vellykket udfald af testen. Stol ikke på den temperatur, der vises på apparaterne, men kontroller venligst at temperaturen er i overensstemmelse med specifikationerne ved hjælp af et kalibreret termometer, som skal føres ind i et glas med mineralolie: Termometret skal vise 120 C inde i glasset i et varmeskab og 100 C i et kogende vandbad. EIA Procedure Følg den foreliggende protokol nøje. Følg god laboratoriepraksis. 1. Bring reagenserne til stuetemperatur (18-25 C) mindst 15 minutter før brug. 135

8 2. Forbered vaskeopløsning, substrat-kromogen reaktionsopløsning, samt negative, positive og cutoff kontroller. 3. Forbered et diagram til identificering af testsera og kontroller på mikrotiterpladen. Brug en brønd til negativ kontrolserum (R3), to brønde til cut-off kontrolserum (R4) og en brønd til positiv kontrolserum (R5). 4. Tag pladeholderen og mikrotiterpladen (R1) ud af posen. Læg de strimler, der ikke vil blive brugt, tilbage i posen sammen med tørremidlet og forsegl posen igen. 5. Bland indholdet i konjugat-flasken (R6) ved at vende den op og ned før brug. Kom 50 µl konjugat (R6) ned i alle brøndene. Kom derefter 50 µl behandlet serum, supernatant, ned i alle brøndene, som nævnt ovenfor. Kom ikke serumprøver ned i brøndene før konjugat. 6. Dæk pladen med pladeforseglingen eller et andet middel fordampning undgås og for at sikre at hele overfladen er dækket og vandtæt. 7. Lad mikrotiterpladen inkubere i en tør mikrotiterpladeinkubator i 90 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Tag pladeforseglingen af. Sug brøndenes indhold op i en affaldsbeholder (som indeholder natriumhypochlorit). Vask pladen 5 gange ved hjælp af mindst 370 µl arbejdsvaskeopløsning. Vend mikrotiterpladen om efter sidste vask og klap den forsigtigt mod absorberende papir for at fjerne tilbageblivende væske. 9. Kom hurtigt 200 µl substrat-kromogen reaktionsopløsning (R8 + R9) ned i alle brøndene og undgå at udsætte opløsningen for stærkt lys. 10. Lad mikrotiterpladen inkubere i mørke ved stuetemperatur (18 til 25 C) i 30 ± 5 minutter. Brug ikke selvklæbende film under inkubationstrinnet. 11. Kom 100 µl stopopløsning (R10) ned i alle brøndene i den samme rækkefølge som for tilsætning af substratopløsningen. Bland godt. 12. Tør undersiden af hver plade godt af. 13. Aflæs hver brønds optiske densitet ved 450 nm (referencefilter 620 nm). Mikrotiterpladerne skal aflæses indenfor 30 minutter efter tilsætning af stopopløsning. 11- KVALITETSKONTROL (VALIDITETSKRITERIER) Cut-off kontrol : O.D. af hver cut-off kontrolserum skal være 0,300 og 0,800. Positiv kontrol : Indekstallet for det positive kontrolserum skal være større end 2,00. I = OD positiv kontrol (R5) > 2,00 middel cut-off kontrol OD Negativ kontrol : Indekstallet for det negative kontrolserum skal være mindre end 0,40. I = OD negativ kontrol (R3) < 0,40 middel cut-off kontrol OD Hvis en af kontrollerne ikke lever op til validitetskriterierne beskrevet ovenfor, er analysen ugyldig, og resultaterne for patientprøvematerialet bør ikke rapporteres. Operatøren kan beslutte at gentage analysen, efter at have gennemlæst proceduren igen, eller kontakte fabrikanten for assistance. Hvis analysen gentages, skal der bruges en ny måling på samme prøve i den gentagne analyse. Eksempel på beregning : Prøvemateriale Absorbans (OD) Negativ kontrol (R3) OD 0,117 Cut-off kontrol (R4) OD 0,596 0,576 Positiv kontrol (R5) OD 2,

9 Beregninger Middel cut-off kontrolværdi For at beregne middel cut-off kontrol (R4) OD, læg de to OD værdier for hver gentagne cut-off kontrol sammen og divider resultatet med 2: (0, ,576) 2 = 0,586 Negativ kontrolindekstal Divider den negative kontrols OD med middel cut-off kontrol OD for at beregne indekstallet for den negative kontrol: I = 0,117 = 0,20 0,586 Positiv kontrolindekstal Divider den positive kontrols OD med middel cut-off kontrol OD for at beregne indekstallet for den positive kontrol: Validitet I = 2,602 = 4,44 0,586 I eksemplet ovenfor: Begge cut-off kontrollernes OD er 0,300 og 0,800, hvilket angiver at cut-off kontrollen er gyldig. Indekstallet for den negative kontrol er < 0,40, hvilket angiver at den negative kontrol er gyldig. Indekstallet for den positive kontrol er > 2,00, hvilket angiver at den positive kontrol er gyldig. Testkørslen i dette eksempel anses for at være gyldig, da resultaterne opfylder validitetskriteriet for hver kontrol. 12- TOLKNING AF RESULTATERNE Hvorvidt galactomannan antigen er tilstede i testprøven eller ej bestemmes ved beregning af et indekstal for hver patientprøve. Indekstallet (I) er prøvens OD værdi divideret med middel optisk densitet for brøndene, som indeholder cut-off kontrolserum. Beregning af middel cut-off kontrol optisk densitet: Læg værdien for optisk densitet sammen for de to brønde, der indeholder cut-off kontrolserum (R4), og divider med 2. Beregning af et indekstal (I) for hvert testserum: Beregn følgende kvotient for hvert testserum: OD prøve I = Middel cut-off kontrol OD Sera med et indekstal < 0,50 anses for at være negative for galactomannan antigen. NB: Et negativt resultat kan angive, at patientens resultater ligger under analysens sporbare niveau. NB: Negative resultater udelukker ikke diagnose på Invasiv Aspergillosis. Det anbefales at gentage testen, hvis resultatet er negativt, men lidelsen er mistænkt. Sera med et indekstal 0,50 anses for at være positive for galactomannan antigen. For alle positive patienter anbefales det, at en ny mængde af samme prøve gentages, og at der tages en ny prøve fra patienten for efterfølgende test. Bemærk: En absorptionsværdi under 0,000 kan indikere en fejl ved proceduren eller udstyret, som skal evalueres. Det pågældende resultat er ugyldigt, og prøven skal køres igen. Regelmæssig screening (to gange om ugen) af højrisikopatienter anbefales for at øge sensitiviteten og for at opnå tidlig konstatering ved en positiv test. Bemærk: Platelia Aspergillus EIA er tænkt som hjælp til diagnosticering af invasiv aspergillose. Positive resultater, der er opnået med Platelia Aspergillus EIA, bør sammenholdes med andre diagnosticeringsmetoder såsom mikrobiologisk kultur, histologisk undersøgelse af biopsiprøver og radiografiske undersøgelser. 137

10 Eksempel på beregning: Prøve Absorbans (OD) Negativ kontrol (R3) OD 0,117 Cut-off kontrol (R4) OD 0,596 0,576 Positiv kontrol (R5) OD 2,602 Patientprøve #1 0,134 Patientprøve #2 0,436 Patientprøve #3 1,196 Beregninger I afsnittet Kvalitetskontrol (Validitetskriterier) er der anført et eksempel på beregninger for at bestemme analysens validitet. Middel cut-off kontrolværdi For at beregne middel cut-off kontrol (R4) OD, skal man lægge OD værdierne for begge cut-off kontroller sammen og dividere resultatet med 2: (0, ,576) 2 = 0,586 Patientprøve #1 For at beregne indekstallet for patientprøve #1, skal man dividere OD for patientprøve #1 med middel cut-off kontrol OD: I = 0,134 = 0,23 0,586 I dette eksempel er patientprøve #1 negativ, da indekset på 0,23 er < 0,50. Patientprøve #2 For at beregne indekstallet for patientprøve #2, skal man dividere OD for patientprøve #2 med middel cut-off kontrol OD: I = 0,436 = 0,74 0,586 I dette eksempel er patientprøve #2 positiv, da indekset på 0,74 er 0,50. Patientprøve #3 For at beregne indekstallet for patientprøve #3, skal man dividere OD for patientprøve #3 med middel cut-off kontrol OD: I = 1,196 = 2,04 0,586 I dette eksempel er patientprøve #3 positiv, da indekstallet på 2,04 er 0, PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. En negativ test kan ikke udelukke en diagnose på Invasiv Aspergillosis. Patienter med risiko for Invasiv Aspergillosis bør testes to gange om ugen. 2. Man skal følge Platelia Aspergillus proceduren og tolkningen af resultaterne, når man tester prøver for tilstedeværelse af galactomannan antigen. Kittets bruger skal læse indlægssedlen omhyggeligt, før testen køres. Det er især vigtigt at følge testproceduren nøje hvad angår afpipettering af prøver og reagens, vask af plader og tidtagning af inkubationstrinene. 3. Hvis man ikke tilføjer prøvemateriale eller reagens som anført i proceduren, kan det resultere i en falsk negativ test. Man bør overveje at gentage testen med ekstra prøver, når der er klinisk mistanke om Invasiv Aspergillosis eller procedurefejl. 4. Det er muligt at kontaminere negativt patientprøvemateriale i brøndene med positivt kontrol/patientprøvemateriale, hvis indholdet i en brønd spildes over i en anden brønd på grund af en uforsigtig behandling af mikrotiterpladen eller en dårlig afpipetteringsteknik under tilføjelse af reagenser. 138

11 5. Platelia Aspergillus EIA s ydeevne er ikke blevet evalueret med serumprøver fra nyfødte eller børn. 6. Platelia Aspergillus EIA kan udvise en reduceret sporing af galactomannan hos patienter med kronisk granulomatøs lidelse (CGD) og Jobs syndrom 36, Samtidig brug af en skimmel-aktiv fungicid terapi hos nogle patienter med Invasiv Aspergillosis kan resultere i reduceret sensitivitet med Platelia Aspergillus EIA Platelia Aspergillus EIA er ikke blevet evalueret for brug sammen med plasma eller andre prøvetyper såsom urin, BAL eller CSF. 9. Platelia Aspergillus EIA s ydeevne er ikke blevet etableret for manuel aflæsning og/eller visuel bestemmelse af resultatet. 10. Andre svampeslægter som Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum og Histoplasma har vist reaktion med rotter, EBA-2 monoklonale antistoffer brugt i analysen for detektion af Aspergillus galactomannan. Histoplasmose skal tages med i betragtningerne i endemiske områder inklusive 23, 32, 38. dele af USA 11. Positive reaktioner uden kliniske tegn: I betragtning af den tidlige påvisning af galactomannan antigen i serum, selv før der er indtruffet kliniske og/eller radiologiske egenskaber, observeres der ofte positive reaktioner uden kliniske tegn: De svarer til "sande positive" tests hos patienter for hvem der senere stilles en diagnose på påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis. I visse særtilfælde skal man dog tage hensyn til visse faktorer, når testen tolkes: a. Der er blevet rapporteret om positive reaktioner uden kliniske tegn, især hos små børn 26. Skønt nogle af disse tilfælde kan være forbundet med en reel cirkulation af Aspergillus antigens 5, kan de fleste tilfælde anses for at være falske positive. b. Galactofuranose er blevet påvist i forskellige fødevarer, især kornsorter, kornprodukter og flødedesserter 1, 17. I modsætning til humant mælk, indeholder humaniseret mælk ofte høje koncentrationer af galactomannan 10. Man skal derfor tage hensyn til kostens sammensætning ved tolkning af forløbet af antigenemi hos små børn og mere generelt hos alle patienter med en forandret tarmbarriere 4, 10. Ethvert tilfælde af positiv antigenemi, der ikke er ledsaget af kliniske tegn, bør tolkes endnu mere forsigtigt i denne patientgruppe 17. c. Der er blevet rapporteret om positive galactomannan testresultater hos patienter, der modtager piperacillin / tazobactam. Der er også blevet rapporteret om visse lots eller batches af piperacillin / tazobactam, som har vist sig at være positive for galactomannan antigen. Derfor bør positive testresultater hos patienter, som modtager piperacillin / tazobactam tolkes forsigtigt og bekræftes af andre diagnostiske metoder. Der er også blevet rapporteret om sporing af galactomannan i nogle batches amoxicillin forbundet med clavulansyre i parenterale behandlinger. Man skal derfor tage hensyn til semisyntetisk b-lactam behandlinger, når man tolker testen 1, 21. Da Platelia Aspergillus EIA ikke desto mindre kan spore galactomannan antigen, længe før der indtræffer kliniske eller radiologiske tegn, kan forekomsten af Invasiv Aspergillosis ikke udelukkes. Patienter, der behandles med piperacillin/tazobactam med positive testresultater, skal derfor følges nøje. d. Der kan observeres positive reaktioner ved fravær af kliniske tegn hos patienter, der enten parenteralt eller oralt modtager produkter med indhold af galactomannan (ved forekomst af ændret tarmvæg). Tilstedeværelsen af galactomannan i disse produkter kan ofte forklares ved brug af en gæringsproces baseret på svampemikroorganismer. Der observeres dog ikke et positivt resultat, medmindre serumkoncentrationen for eksogen galactomannan når eller overskrider testens detektionstærskel. Hvis der forekommer et mistænkeligt positivt resultat under fravær af andre kliniske tegn, anbefaler vi, at produkterne, som patienten indtager, og især produktionsmetoderne og de anvendte råmaterialers oprindelse undersøges 11, 24, FORVENTEDE VÆRDIER Den forventede udbredelse af Invasiv Aspergillosis varierer i forhold til patient populationen; der er blevet rapporteret om kvotienter fra 5-20 % 7,

12 Der er blevet kørt et klinisk studie på i alt 4873 serumprøver fra 239 episoder (203 patienter) med hæmatologisk malignitet eller hæmatopoetisk stamcelletransplantation diagnosticeret med eller uden Invasiv Aspergillosis i to testcentre i Europa for at bestemme karakteristika for Platelia Aspergillus EIA s ydeevne. Da en patient kunne blive optaget i studiet ved mere end en lejlighed, blev analyserne udført i henhold til behandlingsepisoder. En episode anses for at være den periode, der omfatter en klinisk behandling (f.eks. transplantation, GVHD etc.) Som et resultat heraf, kan der være observeret mere end en episode for en enkelt patient. Den gennemsnitlige udbredelseskvotient for dette studie var 16 % (38/239). Fordelingen af indeksværdier for disse målgrupper er vist i følgende diagrammer. Patienter diagnosticeret uden Invasiv Aspergillosis (kontrolgruppe) I alt 3691 serumprøver fra 201 episoder (168 patienter) i to testcentre i Europa blev testet med Platelia Aspergillus EIA test. Fordelingen af indeksværdier er vist i følgende diagram. Antal sera Fordeling af serum indeksværdier fra kontrolgruppen N = Indekstal Denne punktspredning beskriver galactomannan analyseresul taterne for 3691 serumprøver fra 201 episoder (168 kontrol patienter) i dette studie (patienter under immunosuppressiv terapi for HSCT eller for behandling af hæmatologisk malignitet). Indekstal 2 1,5 1 0,5 0 KONTROLGRUPPE : FORDELING AF INDEKSTAL / EPISODE (N = 201 episoder fra 168 patienter) Episodenummer Patienter diagnosticeret med Invasiv Aspergillosis Denne punktspredning beskriver galactomannan analyseresultaterne for 1182 serumprøver fra 38 episoder (35 patienter) i dette studie diagnosticeret med påvist eller sandsynlig Invasiv Aspergillosis defineret ved EORTC/NIAID definitionerne. Ikke alle serumprøver fra hver patient forventes at være positive. Den forventede udbredelse af Invasiv Aspergillosis varierer i forhold til patient populationene; der er blevet rapporteret om kvotienter fra 5-20 % 7, 13. Udbredelseskvotien ten for dette studie var 16 %. Indekstal 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 PÅVIST / SANDSYNLIG INVASIV ASPERGILLOSIS: FORDELING AF INDEKSTAL / EPISODE (N = 38 episoder fra 35 patienter) Episodenummer Cut-off 0,5 140

13 Følgende grafiske afbildninger viser eksempler på henholdsvis en patient uden kliniske tegn eller symptomer på Invasiv Aspergillosis (negativ for Aspergillus) og en patient med påvist Invasiv Aspergillosis (positiv for Aspergillus). Negativ patient: KONTROLPATIENT Positiv patient : indekstal 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Dage PATIENT MED PÅVIST INVASIV ASPERGILLOSIS Indekstal 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Dage 15. SPECIFIKKE KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE A. Studier angående reproducerbarhed Variabiliteten af inter- og intraanalyse for Platelia Aspergillus EIA blev bestemt i et studie ved hjælp af et panel med 6 patient serumprøver (en negativ, en lav positiv, to positive og to høje positive) indhentet fra tre kliniske forsøgscentre i Nordamerika. Alle de 6 panelmedlemmer blev testet tredobbelt (x3) på 3 forskellige dage, med 1 lot, i to centre (samlet antal gentagelser i hvert center = 9). Alle de 6 panelmedlemmer blev testet dobbelt (x2) på tre forskellige dage, med 1 lot, i et tredje center (samlet antal gentagelser i det tredje center = 6). En (1) operatør udførte al præcisionstestning i hvert center. Dataene blev analyseret i henhold til National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Skemaerne nedenfor viser middel optisk densitet (OD) og middel indeksværdi, standard afvigelse (SD), procent variationskoefficient (% CV), præcision indenfor kørsel (intraanalyse) og præcision indenfor centret (interanalyse) for hvert panelmedlem i hvert center. 141

14 N/A = ikke anvendelig 1 NCCLS EP5-A, Del 19, Nr. 2, Side 24, Ligning (C2) 2 NCCLS EP5-A, Del 19, Nr. 2, Side 25, Ligning (C3) og Ligning (C4) 142

15 B. Reaktivitet på tværs For at evaluere effekten af potentielt interfererende medicinske forhold, som ikke er forbundet med Invasiv Aspergillosis, er der blevet kørt et studie med et lot Platelia Aspergillus EIA kit. Følgende serumprøver blev testet for reaktivitet på tværs med Platelia Aspergillus EIA. Der blev testet i alt 151 sera. Patologi # Testede prøver # Positive Rheumatoid faktor 10 0 ANA positiv 10 0 IgG Hypergammaglobulinæmi 10 0 IgM Hypergammaglobulinæmi 10 0 Cancer* 11 0 Ikke viral cirrose (primær biliær; alkoholinduceret; lægemiddelinduceret) 10 0 Gentagne transfusioner 10 0 Multipara kvinder 10 0 HAV 10 0 HCV 10 0 Rubella 10 0 CMV 10 0 Syfilis (RPR+) 10 0 Toxoplasmose 10 0 Mycoplasma 10 0 * En af hver type cancer i urinblære, bryst(2), tyktarm, endometrium, lunge, prostata, nyre og pladecelle(3). C. Klinisk afprøvning Der er blevet kørt en klinisk afprøvning for at evaluere sensitivitet, specificitet og forudsigelig værdi af Platelia Aspergillus i to centre i Belgien og Holland. Studiet blev kørt retrospektivt med i alt 4873 serumprøver indhentet fra 203 patienter fra følgende patientgrupper *: patienter uden tegn på Invasiv Aspergillosis (kontrolpatienter) patienter med sandsynlig Invasiv Aspergillosis patienter med påvist Invasiv Aspergillosis * Samarbejdsgruppen for invasiv svampeinfektion (IFICG) i den Europæiske Organisation for Forskning og Behandling af Cancer (EORTC) og Mykosestudiegruppen (MSG) på Nationalinstituttet for Allergiske og Infektiøse Sygdomme (NIAID) har defineret kriterier for diagnose af Invasiv Aspergillosis (IA) hos patienter med hæmatologisk malignitet eller hæmatopoetisk stamcelletransplantation 2. Påvist Invasiv Aspergillosis er defineret ved positiv mikrobiologisk kultur opnået ved hjælp af en steril procedure fra de berørte steder, og histopatologisk påvisning af de passende morfologiske former hos en værtorganisme med symptomer, der tilskrives svampeinfektionen. Sandsynlig Invasiv Aspergillosis er defineret som mindst et mikrobiologisk kriterium og et væsentligt eller to mindre væsentlige kliniske kriterier fra et sted, der er foreneligt med infektion hos en værtorganisme med symptomer, der tilskrives svampeinfektionen. Mulig Invasiv Aspergillosis er defineret som mindst et mikrobiologisk kriterium, eller et væsentligt eller to mindre væsentlige kriterier fra et sted, der er foreneligt med infektion hos en værtorganisme med symptomer, der tilskrives svampeinfektionen. Da mulig og påvist Invasiv Aspergillosis er et relativt sjældent fænomen, tilbyder vi følgende definition af klinisk sensitivitet og specificitet hvad angår dette studie. 143

16 SENSITIVITET Resultaterne fra dette studie er blevet analyseret på grundlag af patientsensitivitet. Der er blevet kørt en sensitivitetsafprøvning med Platelia Aspergillus EIA i to centre på i alt 38 episoder fra 35 patienter der har fået transplanteret knoglemarv og leukæmipatienter diagnosticeret med påvist eller mulig Invasiv Aspergillosis. 1. Påvist Aspergillosis (som defineret af IFICG / EORTC; se ovenfor) Begge centre N = 19 episoder fra 16 patienter Sensitivitet: 100 % (19/19). NB: 95 % konfidensintervallet kunne ikke beregnes, da prøvens størrelse ikke var tilstrækkelig. 2. Mulig Aspergillosis (som defineret af IFICG / EORTC; se ovenfor) Begge centre N = 19 episoder fra 19 patienter Sensitivitet: 94,7 % (18/19). NB: 95 % konfidensintervallet kunne ikke beregnes, da prøvens størrelse ikke var tilstrækkelig. 3. Kombineret påvist og mulig (som defineret af IFICG / EORTC; se ovenfor) Begge centre N = 38 episoder fra 35 patienter Sensitivitet: 97,4 % (37/38). 95 % konfidensintervallet er på 86,2 99,9 %. SPECIFICITET Der er blevet kørt specificitetsafprøvning med Platelia Aspergillus EIA i to centre på i alt 3691 prøver opnået fra 201 episoder (168 patienter) uden tegn på Invasiv Aspergillosis (kontrolpatienter). Center 1: N = 3060 prøver fra 103 episoder (70 patienter) Specificitet : 92,2 % (95/103) 95 % konfidensintervallet er på 85,3 96,6 %. Center 2: N = 631 prøver fra 98 episoder (98 patienter) Specificitet : 88,8 % (87/98) 95 % konfidensintervallet er på 80,8 94,3 %. Begge centre N = 3691 prøver fra 201 episoder (168 patienter) Specificitet: 90,5 % (182/201) 95 % konfidensintervallet er på 85,6 94,2 %. FORUDSIGELIG VÆRDI Forudsigelige positive og negative værdier (PPV, NPV) er blevet analyseret for patientgruppen i dette studie på grundlag af den aktuelle gennemsnitlige udbredelseskvotient på 16 % observeret i dette studie. PPV: 66,1 % (37/56) NPV: 99,4 % (182/183) Der blev også udført analyser vedrørende positive resultater, når 2 på hinanden følgende prøver havde et indekstal på over eller lig med 0,5. Ydeevnen er resumeret i følgende skema: Sensitivitet* Specificitet PPV NPV Begge centre vedrørende 1 prøve 0,5 97,4 % (37/38) 90,5 % (182/201) 66,1 % (37/56) 99,4 % (182/183) Begge centre vedrørende 2 på hinanden følgende prøver 0,5 92,1 % (35/38) 97,5 % (196/201) 87,5 % (35/40) 98,5 % (196/199) *: sensitiviteten blev beregnet for påvist og sandsynlig Invasiv Aspergillosis 144

17 16- FABRIKANTENS KVALITETSKONTROL Alle de fremstillede reagenser er forberedt i overensstemmelse med vort kvalitetssystem, som strækker sig fra modtagelse af råmaterialer og til den endelige markedsføring af produktet. Alle lots underkastes en kvalitetskontrol og de kommer først på markedet efter de lever op til de forudbestemte godkendelseskriterier. Optegnelser i forbindelse med produktion og kontrol for hvert enkelt lot opbevares hos Bio-Rad. 17- HENVISNINGER Se den engelske version. 145

18 17- BIBLIOGRAPHY 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P. M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p De Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 26: p Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis Invasive Aspergillosis. Medical Mycology 38: p Erjavec, Z. and P. E. Verweij Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox Plasmalyte as a Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p Latge, J. P Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p

19 15. Latge, J. P Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E. Candolfi Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par Platelia TM Aspergillus: antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: p Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: p Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p Nareddy, S., P. H. Chandrasekar False-positive Aspergillus galactomannan (GM) assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer Intravenous PLASMA- LYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia Aspergillus EIA Test for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in Germany. Mycoses 42: p Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude False positive results in premature infants with the Platelia TM Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Mycoses 41: p Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33: p Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J. P. Latge Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun. 60: p

20 29. Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study. Cancer 91: p Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15: p Surmont,I., W. Stockman Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause of false-positive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij Specificity of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J. Clin. Microbiol. 35: p Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis. Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p Verweij, P. E. and J. F. Meis Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in transplant recipients. Transpl. Infect. Dis. 2: p Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F. Meis Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J. Clin. Microbiol. 33: p Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs, J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland Reduced expression of galactomannan antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or Job s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C. Hage Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p Yeo, S. F. and B. Wong Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p