PLATELIA H. PYLORI IgG TESTES PÅVISNING AF IGG ANTI-HELICOBACTER PYLORI I HUMANT SERUM VED IMMUNOENZYMATISK ANALYSE

Transkript

1 PLATELIA H. PYLORI IgG TESTES PÅVISNING AF IGG ANTI-HELICOBACTER PYLORI I HUMANT SERUM VED IMMUNOENZYMATISK ANALYSE 1- KLINISKE VÆRDIERO Helicobacter pylori blev identificeret i 1983 af Warren og Marshall som en spiralformet Gram-negativ bakterie, der var skyld i en række gastroduodenale betændelsessygdomme. Den er nu blevet fuldt identificeret [1]. Udbredelsen af H. pylori-infektion er meget stor. H. pylori-infektion kan forekomme hos helt op til 50 % af indbyggerne i lande, der har været betegnet som industrialiserede i mere end 50 år, og hos 90 % af den samlede befolkning i udviklingslandene [2]. H. pylori-koloniseringen af tarmslimhinderne kan forblive asymptomatisk eller give anledning til alvorlige kliniske manifestationer, herunder kronisk mavekatar, duodenal eller gastrisk ulcus, lymphoma i slimhindeassocieret lymfoidt væv og gastrisk cancer [3]. Test af H. pylori er et afgørende diagnostisk trin hos patienter med symptomer på gastroduodenal betændelse. Der er med tydelighed bevist, at effektiv og varig helbredelse af duodenale ulcus afhænger af udryddelsen af H.pylori [4]. Test og konstatering af denne bakterie kan udføres: direkte fra biopsiprøver (histologiske undersøgelser og kulturer). Det omfatter en invasiv procedure, der er forbundet med ubehag og trauma for patienten, en risiko for at fremkalde bivirkninger og muligheden for at opnå fejlagtige negative resultater på grund af forkert målretning af biopsierne. Indirekte ved serologisk test. Denne ikke-invasive metode tilbyder en overordnet metodes sensitivitet, og den er både let og forholdsvis billig at udføre. 2- ANALYSEPRINCIP Platelia H. pylori er en immunoenzymatisk analyse, der påviser antistoffer mod H. pylori i humant serum. Mikrotiterpladerne er sensitiviseret med et delvist oprenset antigenekstrakt, der ikke indeholder nogen antigener, der er tilbøjelige til at kunne fremkalde krydsreaktioner [6]. Testsera og kalibratorer fortyndes og placeres i mikrotiterpladens brønde, som er dækket med H. pylori-antigenet. I løbet af den første inkubationsperiode, binder H. pylori IgG-antistofferne i prøven sig til H. pylori-antigenerne. Efter inkubationen fjernes de ikke-specifikke immunglobuliner og serumproteiner ved vask. Derefter tilføjes konjugatet, der er et peroxidasemærket, monoklonalt antistof, som er specifikt rettet mod humane gammakæder, til mikrotiterpladebrøndene og inkuberes. I løbet af anden inkubationsperiode binder det mærkede, monoklonale antistof sig til komplekset af H. pylori IgG-antistof og H. pyloriantigener. Efter inkubationen fjernes ubundet, mærket antistof ved vask. Tilsætningen af en opløsning, der består af peroxidasesubstrat og kromogen, starter en farveudviklingsreaktion. Den enzymatiske reaktion stoppes ved at tilsætte en syre. Den optiske densitet aflæses med et spektrofotometer ved 450/620 nm. Den optiske densitet er proportional med den mængde H. pylori IgG-antistoffer, der findes i testprøven. 3- PRODUKTOPLYSNINGER Opbevaringsbetingelser og udløbsdato fremgår af kassen. Etiket Reagenser Mængde R1 Microplate Mikrotiterplade (klar til brug): 12 teststrimler med hver 8 aftagelige brønde, dækket med H. pylori-antigener, pakket i en forseglet foliepose. R2 R3 Concentrated Washing Solution Negative Control Koncentreret vaskesopløsning (10 x): TRIS-NaCl-buffer (ph 7,4), 1% Tween 20. Negativ kontrol (human) Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid 1 1 x 100 ml R4 Cut-off Control Cut-off-kontrol (human) Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid R5 Positive Control Positiv kontrol (human) Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid 1

2 R6 Sample Diluent Prøvefortynder: 1 x 110 ml R7a R7b Conjugate (40x) Conjugate Diluent Koncentreret konjugat (40 x): Murint, monoklonalt antistof mod humane gammakæder, der er bundet til peroxidase fra peberrod. Konjugatfortynder: 1 x 0,45 ml 1 x 12 ml R8 R9 TMB Substrate Buffer Chromogen: TMB Solution TMB-substratopløsning (klar til brug): Opløsning af citronsyre og natriumacetat (ph 5,2) med 0,009% H 2 O 2 og 4% DMSO Kromogen: 0,6% tetrametylbenzidin (TMB)/DMSO-opløsning. 1 x 60 ml R10 Stopping Solution Stopopløsning (klar til brug): 1,5N-svovlsyreopløsning 1 x 12 ml Pladeforsegling 4 4- FORHOLDSREGLER Resultaternes pålidelighed afhænger af en korrekt implementering af følgende regler for 'god laboratoriepraksis': Undgå at anvende forældede reagenser. Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur (18 30 C), før de anvendes. Undgå at blande eller bruge reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel. Vaskeopløsningen (R2) kan bruges til forskellige lot, forudsat at der anvendes det samme lot inden for den enkelte testkørsel. Rekonstituer eller fortynd reagenserne forsigtigt for at undgå kontaminering. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan påvirke konjugatets enzymaktivitet. Enzymreaktionen er meget følsom over for metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige konjugat- eller substratopløsninger. Den fortyndede kromogenopløsning (substratbuffer + kromogen) skal være farveløs. Brug ikke opløsningen, hvis der viser sig en blå farve få minutter efter rekonstitueringen. Klargør denne opløsning i en ny engangsplastikbakke eller en glasbeholder, der først er rengjort med 1N HCI og derefter skyllet grundigt med destilleret vand og tørret. Opbevar opløsningen et mørkt sted. Brug en ny pipettespids til hver prøve. Grundig vask af mikrotiterpladen er et afgørende trin i proceduren: Overhold det anbefalede antal vaske, og kontroller, at alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Forkert vask kan medføre unøjagtige resultater. Undgå, at mikrotiterpladen tørrer ud mellem vasken og fordelingen af reagensen. Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat- og udviklingsopløsning. Kontroller, at pipetterne og andet udstyr er i orden og fungerer korrekt. SUNDHEDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER Brug engangshandsker, når du håndterer reagenser. Undgå at pipettere med munden. Humant kildemateriale, der er brugt til klargøring af reagenser, er blevet testet og fundet ikke-reaktivt for hepatitis B- overfladeantigen (HBs Ag), antistoffer mod hepatitis C og antistoffer mod HIV 1 og HIV 2 (Human Immunodeficiency Virus). Eftersom ingen metode kan give fuld garanti for fravær af smitsomme stoffer, skal du håndtere reagenser af human oprindelse og patientprøverne som potentielt smittefarlige. Ethvert materiale, herunder vaskeopløsninger, der kommer i direkte kontakt med prøver og reagenser, som indeholder humant kildemateriale, skal betragtes som potentielt smittefarligt. Undgå at spilde. Hvis du spilder syre, skal du neutralisere syren med natriumbikarbonat og derefter rengøre med 12% natriumhypoklorit, der er fortyndet i forholdet 1:10, og tørre efter med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal kasseres og placeres i en beholder til farligt affald. Patientprøver, reagenser med humant kildemateriale samt kontamineret materiale og produkter må først kasseres efter desinficering. Placer ikke opløsninger, der indeholder natriumhypochlorit, i autoklaven. Undgå, at hud eller slimhinder kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og vaskeopløsningen, eftersom det kan fremkalde forgiftning, irritation eller forbrændinger. ADVARSEL Xi - Lokal Svovlsyre (H 2 SO 4 ) 1,5N i DMSO (dimethylsulfoxyde) 90% R36/38 Irriterer øjnene og huden. S26-30 Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes. Hæld aldrig vand på eller i produktet. Materialesikkerhedsdataarket (MSDS) udleveres efter anmodning. 2

3 5- PRØVEMATERIALE 1. Den anbefalede prøvetype er serum, der er indsamlet i tørglas. 2. Følg nedenstående anbefalinger for håndtering, behandling og opbevaring af serumprøver: - Indsaml alle serumprøver under overholdelse af de generelle forholdsregler. - Lad serumprøverne størkne fuldstændigt, før de centrifugeres. - Sørg for, at rørene altid er lukkede. - Efter centrifugeringen adskilles serummet fra koaglet. Serum opbevares i et tæt tillukket opbevaringsrør. - Prøverne kan opbevares ved 2 8 C, hvis screeningen udføres inden for 24 timer. - Hvis analysen ikke udføres inden for 24 timer, eller prøverne skal sendes, skal de nedfryses til mindst -20 C. - Det foretrækkes, at prøverne kun optøs en enkelt gang. Tidligere nedfrosne prøver skal omrystes grundigt efter optøning, før testen udføres. 3. Prøver, der indeholder op til 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipæmiske prøver med mængder, der svarer til 30 g/l triolein (triglycerid), og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 10 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. 4. Undgå at opvarme prøverne. 6- ANALYSEPROCEDURE 6.1 Anvendte materialer, der ikke medfølger Vortexmixer. Mikrotiterpladelæser med filtre på 450 nm og 620 nm (*). Vandbad eller tilsvarende varmeskab til mikrotiterplader med termostatindstilling til 37±1 C (*). Manuel, halvautomatisk eller automatisk mikrotiterpladevasker (*). Beholder til farligt biologisk affald. Natriumhypochlorit og natriumbikarbonat. Bakteriefrit, destilleret eller deioniseret vand. Graduerede cylinderglas med kapaciteter på hhv. 25, 50, 100 og ml. Engangslatexhandsker. Beskyttelsesbriller. Sugende papir. Automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forudindstillede pipetter eller multipipetter til måling og fordeling af µl og 1, 2 og 10 ml. Engangsrør. (*) Kontakt vores tekniske afdeling for at få detaljerede oplysninger om det anbefalede udstyr. 6.2 Rekonstituering af reagenser R1: Skær posen op 0,5 1 cm over stregen. Læg straks de ubrugte teststrimler tilbage i posen. Kontroller, at tørremidlet er i posen. Luk posen omhyggeligt, og opbevar den ved 2 8 C. R2: Fortynd reagensen i destilleret vand i forholdet 1:10. Klargør 350 ml til en enkelt plade med 12 teststrimler ved manuel vask. R7: Klargør løbende den nødvendige mængde konjugat til en kørsel ved at opløse en mængde af konjugatkoncentrat (R7a, blå) i 40 mængder konjugatfortynder (R7b, rød). Konjugatet bliver således lilla (indeholder natriummerthiolat i en koncentration på maksimalt 0,01%). R9: Fortynd i substratbufferen (R8) i forholdet 1:51 (f.eks.: 200 µl R ml R8). Klargør 4 ml reagens pr. teststrimmel. 6.3 Opbevaring af åbne og/eller rekonstituerede reagenser R1: Når vacuumforseglede poser er blevet åbnet, forbliver teststrimlerne stabile i op til seks uger, når de opbevares ved 2 8 C i den samme, omhyggeligt lukkede pose, som indeholder tørremiddel. R2: Den ufortyndede vaskeopløsningen kan opbevares i 15 dage ved 2 8 C. Den koncentrerede vaskeopløsning kan opbevares ved 2 25 C. R3, R4, R5, R7a og R7b: Når kontrolseraene R3, R4, R5, konjugatet R7a og dets fortynder R7b er åbnet kan de opbevares ved 2 8 C i deres, tæt tillukkede flasker i op til seks uger efter åbningen. R7: Når konjugatopløsningen er rekonstitueret, kan den opbevares i to timer ved stuetemperatur ( C). R9: Den fortyndede opløsningen er holdbar i op til seks timer ved opbevaring på et mørkt sted ved stuetemperatur (18 30 C). R6, R8, R9, R10: Når reagenserne er åbnet, er de stabile indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved 2 8 C. 6.4 Procedure Følg analyseproceduren nøje. Brug kalibratorerne med hver kørsel for at vurdere analyseresultaterne. Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur (18 30 C), før de anvendes. 1. Opret en nøjagtig fordelingsplan for prøvematerialet, herunder en brønd til den negative control (R3), tre brønde til cut-offkontrol (R4) og en brønd til den positive kontrol (R5). 2. Forbered den fortyndede vaskeopløsning (R2). (Se afsnit 6.2). 3. Tag bakken og teststrimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen. 4. Opløs testprøven og kontrolserummet i fortynderen R6 i forholdet 1:101 (10 µl serum + 1 ml fortynder R6). Klargør tre fortyndinger af cut-off-kontrolserummet i forholdet 1:101 (10 µl in 1 ml R6), og fordel dem i tre forskellige rør. Der bruges en ny brønd til hvert rør. Mix de fortyndede prøver. 3

4 5. Ved manuel udførelse af analysen, tilsættes 100 µl af de kontroller, der er fortyndet i forholdet 1:101 (R3, R4, R5), og de tilsvarende fortyndede testprøver (S1, S2 osv ) i brøndene som foreslået nedenfor: A R3 S4 B R4 S5 C R4 S6 D R4 S7 E R5 S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Dæk mikrotiterpladen med selvklæbende pladeforsegling, og pres den ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Mikrotiterpladen inkuberes i et termostatstyret vandbad eller et varmeskab til mikrotiterplader ved 37 C i 30 minutter. 7. Før afslutningen af den første inkubationsperiode, skal du klargøre konjugatet (R7) i en fortynding i forholdet 1:40. opløs 25 µl R7a (blå) i 1 ml R7b (rød) (for en teststrimmel) (se i afsnit 6.2). Bland grundigt. 8. Fjern den selvklæbende pladeforsegling i slutningen af første inkubationsperiode. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypochlorit). Vask mikrotiterpladen tre gange. Vend mikrotiterpladen, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 9. Tilsæt 100 µl konjugatopløsning (R7) til alle brønde. Opløsningen skal omrystes forsigtigt før brug. 10. Dæk mikrotiterpladen med selvklæbende pladeforsegling, og pres den ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Mikrotiterpladen inkuberes i et termostatstyret vandbad eller et varmeskab til mikrotiterplader ved 37 C i 30 minutter. 11. Ved afslutningen af den anden inkubationsperiode, skal du fjerne den selvklæbende pladeforsegling, suge indholdet af alle brønde op, og vaske pladen fire gange. Vend mikrotiterpladen, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 12. Klargør opløsningen til enzymatisk farveudvikling (R9 der er opløst i R8 i forholdet 1:51) (se afsnit 6.2), og tilsæt 200 µl til hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur ( C). Undgå at bruge selvklæbende pladeforsegling under inkubationen. 13. Tilsæt 100 µl stopopløsning (R10) til hver brønd. Fordel opløsningen i samme rækkefølge og tempo som for farveudviklingsopløsningen. 14. Tør undersiden af pladen forsigtigt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/620 nm ved hjælp af en mikrotiterpladelæser inden for 30 minutter, efter reaktionen er stoppet (teststrimlerne må aldrig udsættes for lys før aflæsningen). 15. Kontroller for alle resultater, at de spektrofotometriske og visuelle aflæsninger stemmer overens, og sammenlign dem med pladen, prøvefordelingen og identifikationsoversigterne. 7- FORTOLKNING AF RESULTATER 7.1 Kvalitetskontrol Medtag alle kalibratorerne til hver testkørsel. Følgende kriterier skal overholdes, hvis analysen skal betragtes som gyldig. Værdier for optisk densitet: - OD R4 0,500 - OD R4 1,100 Ratio: - OD R3/gennemsnitlig OD R4 0,250 - OD R5/gennemsnitlig OD R4 1,500 Hvis kriterierne til kvalitetskontrollen ikke opfyldes, skal testkørslen gentages. 7.2 Beregning af cut-off-værdi (cov) COV = gennemsnitlig OD (R4) NB: Cut-off (COV) er den gennemsnitlige optiske densitet (OD) for de brønde, der indeholder cut-off-kontrol R4. Se bort fra værdier med OD R4 0,500 eller OD R4 1, Beregning af ratioen for hver prøv Prøveratioen = prøvens OD/COV (gennemsnitlig OD R4) 4

5 7.4 Fortolkning af resultaterne Forholdet for voksne Forholdet for børn Resultat > 1,10 0,90 Positivt 1,10 0,90 < 0,90 0,80 Tvivlsomt < 0,90 < 0,80 Negativt Fortolkning Forekomst af antistoffer i en betydelig titer, der er konsistent med en H. pyloriinfektion. Ingen betydelig antistoftiter Hvis der er mistanke om en nylig infektion, anbefales det at tage en anden serumprøve to til tre uger efter den første. De to serumprøver testes i samme kørsel. Ingen immunologisk påvisning af en H.pylori-infektionHvis der er mistanke om en nylig infektion, anbefales det at tage en andenserumprøve to til tre uger efter den første. De to serumprøver testes i samme kørsel. For at øge sensitiviteten, bør cut-off værdien sættes lavere for børn. 7.5 Hjælp til fejlfinding Reaktioner, der ikke godkendes eller bekræftes ved gentagelse, skyldes ofte: Utilstrækkelig vask af mikrotiterplader. Kontaminering af negativprøver med serum eller plasma med høj antistoftiter. Kontaminering af farveudviklingsopløsningen med iltningsmiddel (natriumhypoklorit, metalioner). Kontaminering af stopopløsningen. 8- PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER NEGATIVT RESULTAT: Det angiver normalt, at der ingen H. pylori-infektion er. Tidligt i infektionsforløbet, kan antistoftiteren imidlertid være for lav til at give et positivt testresultat. Hvis der er mistanke om en nylig infektion, skal der tages en anden serumprøve to til tre uger efter den første. De to serumprøver skal testes i samme kørsel. En stigning i den specifikke IgG-titer fra den ene prøve til den anden angiver en H. pylori-infektion. POSITIVT RESULTAT: Testen kan ikke skelne mellem en svag og en aktiv infektion, og resultatet skal fortolkes ud fra til de kliniske manifestationer. Diagnosticering af en nylig infektion kan kun fastlægges på baggrund af en kombination af kliniske observationer og serologiske data. Resultatet af en enkelt serumprøve leverer ikke tilstrækkeligt bevis til en diagnosticering af en nylig infektion. Der er ingen korrelation mellem antistoftiterratioen, og omfanget af de kliniske manifestationer. 9- SPECIFIKATIONER FOR FUNKTIONSEVNE 9.1 Sensitivitet og specificitet Kliniske undersøgelser af Platelia H. pylori-testen er blevet udført på to grupper af sera fra patienter med dyspepsia. Der er taget biopsiprøver fra alle patienter samtidigt med blodprøverne. Testens sensitivitet og specificitet blev beregnet med henvisning til resultaterne i forbindelse med de mikrobiologiske og histologiske undersøgelser af biopsiprøverne: H. pyloriinfektionen blev defineret som fremvækst af H. pylori i kulturer og/eller påvisning af H. pylori i histologiske sektioner og/eller en positiv ureasetest, mens fraværet af H. pylori-infektion blev defineret som udtryk for et negativt resultat af alle tre test. Resultater voksne (gennemsnitsalder) (på 44±15 år) børn (gennemsnitsalder) (på 9 ±4,7 år) Antal sera 92 (31Hp-; 61 Hp+) 160 (106 Hp-; 54 Hp+) Sensitivitet 100,0 % (61/61) 98,1 % (51/52) Specificitet 90,0 % (27/30) 89,3 % (92/103) PPV 95,3 % (61/64) 82,2 % (51/62) NPV 100,0 % (27/27) 98,9 % (92/93) Mellemliggende resultater 1,1 % (1/92) 3,1 % (5/160) 5

6 9.2 Præcision Reproducerbarhed i samme analyseserie Otte sera blev testet ti gange i samme analyseserie: Fire positive serumprøver (P1, P2, P3 og den positive kontrol R5) og fire 4 negative serumprøver (N1, N2, N3 og det negative kontrolserum R3). sera Gennemsnitlige ratio CV P1 P2 P3 R5 N1 N2 N3 R3 1,42 2,47 1,91 2,03 0,43 0,15 0,21 0,08 4,0 % 4,4 % 5,2 % 3,9 % 3,3 % 3,8 % 3,7 % 9,7 % Reproducérbarhed i mellem analyseserier Fire positive serumprøver (P1, P2, P3 og det positive kontrolserum R5) og otte negative serumprøver (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7 og det negative kontrolserum R3) blev testet under fem forskellige kørsler på fem forskellige datoer. sera Gennemsnitlige ratio DS CV P1 P2 P3 R5 2,64 2,00 2,38 2,16 0,161 0,067 0,074 0,097 6,1 % 3,4 % 3,1 % 4,5 % N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 R3 0,10 0,21 0,39 0,10 0,05 0,13 0,12 0,08 0,012 0,005 0,008 3,6 % 1,8 % 3,1 % 5,2 % 7,6 % 6,3 % 3,6 % 5,2 % 9.3 Krydsreaktivitet Med henblik på at eliminere krydsreaktioner med flagellare strukturer på f.eks. Campylobacter jejuni, er det antigen, der bruges i sættet, fra en H. pylori stamme uden flagellare strukturer. 10- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede og kommercialiserede reagenser er underlagt et komplet kvalitetssystem lige fra modtagelsen af råmaterialet til den endelige kommercialisering af produktet. Hvert parti sendes til kvalitetskontrol og frigives kun på markedet, når det overholder kravene for godkendelse. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for virksomheden. 6

7 11- REFERENCER 1. Blaser M.J., Hypothesis on the pathogenesis and natural history of Helicobacter pylori-induced inflammation. Gastroenterology, 102 : Vincent P., Epidémiologie de l infection à Helicobacter pylori. La Lettre de l infectiologue : VIII, De Korwin JD. Les pathologies associées à l'infection par Helicobacter pylori. Ann. Inst. Pasteur/actualités, 1995, 2 : Patchett S., Beattle S., Leen C., Keane C., O Morain C., Helicobacter and duodenal ulcer recurrence. Am. J. Gastr., 87 : Widmer M., de Korwin JD, Aucher P., Thiberge J.M., Labigne A., Fauchère JL, Performances of native and recombinant antigens for Helicobacter pylori serology. Gut, suppl.2, 39, A Lee A., Logan S.M., Trust T.J., Demonstration of flagellar antigen shared by a diverse group of spiral shaped Bacteria that colonize intestinal mucus. Inf. Immun. 55 : Newell D.G., Identification of the outer membrane proteins of C. pyloridis and antigenic cross-reactivity between C. pyloridis and C.jejuni. J. Gen. Microbiol., 133 : Warren JR & Marshall BJ,1983. Unidentified curved Bacilli on gastric epithelium in active gastritis. Lancet, i : Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /2009 7