Monofasiske Salmonella Typhimurium-lignende 4,12:i:- og 4,5,12:i:- i husdyrproduktion og fødevarer i Danmark the new kid on the block

Transkript

1 Monofasiske Salmonella Typhimurium-lignende og i husdyrproduktion og fødevarer i Danmark the new kid on the block Summary Monophasic Salmonella with the antigenic formula S. 4,:i.- or S. 4,5,:i.- has emerged in several countries in recent years, both as zoonotic agents in animals and food animal production and as causes of foodborne disease in humans. These Salmonella types have a close resemblance to S. Typhimurium, and investigations have revealed that they are in fact derivatives of S. Typhimurium. In the present paper, we will account for the presence of both S. and S. in Danish food animal production. Approximately three out of four isolates are genotypically monophasic whereas the remaining isolates possess a fljb gene, which is obviously not functional or not expressed. A closer characterization of 4 monophasic isolates revealed that the majority belonged to phage type DT1 followed by DT0. They had a pronounced tendency to display antimicrobial resistance, in particular to ampicillin, streptomycin, sulphonamides and tetracyclines. By genotyping, a single DT1 clone turned out to be dominant. This clone has also been found as a prevalent monophasic clone in several other countries. KARL PEDERSEN 1, HeCtor Arguello 2, gitte sørensen 1, AnA CArvAjAl ureña 2, Pedro rubio 2, sven erik jorsal, dorte lau BAggesen 1 1 danmarks tekniske universitet, FØdevAreinstituttet, MØrkHØj BygAde 1, 260 søborg 2 university of león, FACulty of veterinary science, department of AniMAl HeAltH, infectious diseases And epidemiology unit, león, spanien danmarks tekniske universitet, veterinærinstituttet, Bülowsvej 27, 170 FrederiksBerg C Sammendrag Monofasiske Salmonella med den antigene formel S. 4,:i.- eller S. 4,5,:i.- er de seneste år dukket op i flere lande både som zoonotiske agens hos dyr i den animalske produktion og som årsag til sygdomstilfælde hos mennesker. Disse Salmonella-typer ligner meget S. Typhimurium, og undersøgelser har da også vist, at de er afledte former af S. Typhimurium. I denne artikel vil vi redegøre for, at både S. og S. forekommer i dansk husdyrproduktion. Knap tre fjerdedele af isolaterne er genotypisk monofasiske, mens der hos den sidste godt en fjerdedel findes et ikke funktionelt fljb gen. Ved nærmere karakterisering af 4 isolater kunne de fleste isolater fagtypes med DT1 som langt hyppigst forekommende fagtype, fulgt af DT0. Isolaterne havde stor tendens til antibiotikaresistens, især overfor ampicillin, streptomycin, sulfonamider og tetracykliner. Ved genotypning fandtes en enkelt klon af DT1 at være dominerende. Denne klon er ligeledes kendt fra udenlandske undersøgelser. FOTO: COLOURBOX 16 DVT 201

2 Indledning Nye Salmonella-kloner har det med at dukke op med mellemrum. Nogle af disse forsvinder formentlig igen i ubemærkethed, mens andre har held til at sprede sig, undertiden over flere lande til stor glæde og fornøjelse for mikrobiologer og epidemiologer, men til plage for menneskeheden i øvrigt. Den mest kendte, og den, som de fleste kan nikke genkendende til, er nok S. Typhimurium DT4, som dukkede op i slutningen af 0-erne og spredte sig op gennem 0-erne og i begyndelsen af dette århundrede i flere lande både i og udenfor Europa. Denne klon var især kendt for sin kromosomalt bundne ampicillin-chloramphenikol-streptomycin-sulfonamid-tetracyklin multiresistens, somme tider endda med flere resistensfaktorer. Da denne type første gang dukkede op i Danmark forventede man at kunne klare problemet ved»stamping out«, og en del af os vil stadig huske de dramatiske billeder fra tv, hvor man rykkede ud fra Axelborg med Erik Bisgaard Madsen i spidsen og aflivede den første smittede svinebesætning. Efterhånden stod det imidlertid klart, at denne strategi ikke var mulig, og den blev derfor forladt, men alligevel gav denne klon anledning til ny lovgivning om bekæmpelse. Årsagerne til sådanne kloners opdukken og eventuelt forsvinden er i alt væsentlighed ukendte. Og nu er der øjensynligt en ny klon på spil: Monofasiske Salmonella med den antigene formel S. 4,:i.- eller S. 4,5,:i.- er de seneste år dukket op i flere lande både som zoonotiske agens hos dyr i den animalske produktion og som årsag til sygdomstilfælde hos mennesker. Disse Salmonella typer ligner meget S. Typhimurium, og undersøgelser har da også vist, at de er afledte former af S. Typhimurium. Herhjemme har der måske hidtil ikke været så meget fokus på disse monofasiske Salmonella i relation til fødevarer og husdyr, dels fordi de ikke har været så udbredte, dels fordi der er diagnostiske problemer forbundet med dem. Serotypning er det første trin i karakteriseringen af Salmonella isolater [1]. O-antigenerne i den ydre cellemembrans lipopolysakkarid afgør sammen med flagel-antigenerne, kodet af to strukturelle flagellin-gener (flic og fljb), et isolats antigenformel. De fleste af de Salmonellatyper, vi møder, kan altså lave to forskellige flageller med hver sine antigene egenskaber. Det er dem, vi kalder bifasiske Salmonella. Nogle Salmonella er dog naturligt monofasiske, dvs. at de kun kan lave én slags flagel. Dette gælder blandt andet mange af de typer, man finder hos krybdyr, men det gælder også visse almindelige typer såsom S. Enteritidis og S. Dublin. Endelig findes der enkelte typer, der slet ikke laver flageller afasiske Salmonella. Dette gælder S. Gallinarum, årsag til hønsetyfus, men der kan også være tale om beskadigede monofasiske stammer. S. Typhimurium er en bifasisk Salmonella med antigen formlen 4,[5],:i:1,2. O-antigenfaktor O:5 kan være til stede (nogle anvender betegnelsen Copenhagen variant om disse) eller mangle, men faktor O:4 og O: er altid til stede, og dertil har den de to flagel antigener H:i (første fase flagel) og H:1,2 (anden fase flagel). De monofasiske stammer, der er begyndt at dukke op igennem de seneste år, har antigenformlen 4,[5],:i:- og mangler således anden fase flagellen. Salmonella med denne antigenformel kunne i princippet også være monofasiske former af S. Lagos, S. Agama, S. Farsta, S. Tsevie, S. Glouchester, S. Tumodi eller S. Typhimurium [1]. Til at skelne mellem S. Typhimurium og disse øvrige er der udviklet en PCR reaktion, som kan påvise et 1 kb IS200 fragment, der er specifikt for S. Typhimurium og monofasiske afledede af S. Typhimurium og sidder mellem flib og flia generne. Dette har vist, at disse monofasiske alle er afledt af S. Typhimurium [2], hvilket også giver sig udslag i, at de kan fagtypes med fagtypningssystemet for S. Typhimurium. For at gøre tingene mere komplicerede, har det dog vist sig, at der kan være indtil flere grunde til, at anden fase flagellen mangler: Nogle stammer har ganske enkelt mistet genet, fljb, for denne flagel, dette er de»ægte«, genotypisk monofasiske, mens andre blot har mistet evnen til at udtrykke det, fx pga. en fejl i switch-mekanismen mellem de to flageller, flja genet eller Hin recombinase, eller i ekspressionen af fljb, måske som følge af punktmutationer. Disse kan man kalde fænotypisk monofasiske. Monofasiske S. Typhimurium-lignende stammer er kun sjældent rapporteret før midt -erne, men siden da er rapporter om disse stammer i overvågningsprogrammer, veterinære diagnostiske programmer, fødevarer og humane tilfælde og udbrud steget, så de nu er blandt de største humane Salmonella problemer [,4,5,6,7,,]. Det står klart ud fra både fænotypiske og genotypiske iagttagelser, at der ikke er tale om en enkelt klon, men at der parallelt er opstået flere kloner [2,7,,, 1,,]. Sådanne er måske jævnligt opstået og forsvundet igen ubemærket, og mange er formentlig blot blevet identificerede og rapporteret som S. Typhimurium, men trods diversiteten af fagtyper, resistensmønstre og genotyper blandt S. 4,[5],:i:- isolater, er det dog bemærkelsesværdigt, at der er en enkelt type, der især ser ud til at dominere, en DT1 med tetra-resistensmønstret ampicillin-streptomycin-sulfonamid-tetracyklin og nogle få dominerende genotyper. Indtil nu findes der ingen opgørelser over veterinære monofasiske S. Typhimurium-lignende isolater fra Danmark. DTU Fødevareinstituttet har jævnligt fået henvendelser fra forskellige sider, hvor der er blevet spurgt til, om vi kender til disse stammer, hvor hyppige de er, om de skal betragtes som patogene, mv. I denne artikel vil vi derfor forklare, hvad der menes med monofasiske Salmonella, præsentere nogle opgørelser over prævalensen af monofasiske S. Typhimurium i forskellige kilder og give en nærmere karakterisering af en repræsentativ samling af fundne isolater fra veldefinerede kilder. Vi vil også diskutere disse monofasiske Salmonellas betydning som patogener og i relation til lovgivning og risikohåndtering. Materialer og metoder Forekomst og prævalensstudier Forekomsten af monofasiske Salmonella er opgjort ved udtræk fra laboratoriets elektroniske LIMS, hvori alle oplysninger om indsendelser til laboratoriet fremgår, og omfatter perioden 1. januar 1. december 20. Ligeledes er det ved udtræk fra laboratoriesystemet opgjort, hvor mange monofasiske isolater, der er fundet ud af det samlede antal Salmonella-positive prøver i denne periode. Her er opgjort på veldefinerede prøvetyper, nemlig isolater fra primærproduktionen, indsamlet i forbindelse > DVT

3 FOTO: COLOURBOX med Salmonella-handlingsplanerne for svin og for fjerkræ, samt kliniske indsendelser fra svin og kvæg, og prøver fra slagterierne (ferskkødsovervågningen og eksportprøver (Sverige og Finland) fra svin og kvæg). Endelig indgår der prøver fra DAN- MAP overvågningen i svin for 20, som er blindtarmsprøver, udtaget på slagterierne, der dyrkes for Salmonella. Kortlægning i slagtesvinebesætninger blev ophævet i januar 20, men der foreligger alligevel et antal isolater fra den efterfølgende periode, hvilket kan skyldes, at de pågældende besætninger blev udpeget til kortlægning ud fra serologiske data fra før ikrafttræden af den nye handlingsplan. Karakterisering af isolater Et antal isolater (n=4) fra danske besætninger, opsamlet i perioden blev underkastet nærmere karakterisering. Disse isolater var ligeledes fra veldefinerede kilder, således at oprindelsesbesætningens CHR nummer og/eller slagteriets autorisationsnummer var kendt: Prøver fra Salmonella-handlingsplanerne for svin og fjerkræ, ferskkødsovervågningen, kliniske indsendelser fra kvæg og EU-baseline studierne. Der var isolater fra svin (6), kvæg (7) og fjerkræ (1). Serotypning Serotypning blev udført ved konventionel objektglas-agglutination med Salmonella antisera (Statens Serum Institut) i overensstemmelse med White-Kauffmann-Le Minor skemaet [1]. Isolater, som ikke viste anden fase flagellen, blev gentestet, ligesom det for nogle blev forsøgt at lade dem migrere gennem U-rør med tilsat faktor H:i antiserum. Isolater, som stadig ikke udviste anden fase, blev betragtet som monofasiske. PCR-verifikation Alle isolater inkluderet i undersøgelsen blev testet med en PCR-reaktion ifølge guidelines fra EFSA [16]. En duplex PCR blev udført med to primersæt: Et sæt for at amplificere flib-flia intergenic region (FFLIB/RFLIA) og et sæt for at amplificere fljb genet for anden fase flagellen (sense-5/antisense-). Amplifikation af det 1 kb fragment store flib-flia intergenic region er specifik for S. Typhimurium, men det findes altså også i de monofasiske, der er afledt af S. Typhimurium, og fravær af fljb PCR fragmentet er specifikt for de genotypisk monofasiske isolater S. 4,[5],:i:- [16]. Fagtypning Da disse monofasiske isolater er afledte af S. Typhimurium, er de også følsomme for S. Typhimurium bakteriofager. Fagtypning blev derfor foretaget i henhold til Colindale skemaet (Health Protection Agency, Colindale, London) [17]. Antibiotikaresistens Følsomhed for antibiotika blev testet med bouillon fortyndingsmetoden ved brug af SensiTitre systemet (Trek Diagnostic Systems Ltd., England) i henhold til procedurer beskrevet af CLSI og DANMAP. Følgende stoffer blev testet: Amoxycillin-clavulansyre (AUG), ampicillin (), apramycin (APR), cefotaxime (FOT), ceftiofur (XNL), chloramphenicol (CHL), ciprofloxacin (CIP), colistin (COL), florfenicol (FFN), gentamicin (GEN), nalidixinsyre (NAL), neomycin (NEO), spectinomycin (SPE), streptomycin (STR), sulphamethoxazol (SMX), tetracyklin () og trimethoprim (TMP). MIC værdier blev fortolket ud fra EUCAST epidemiologiske cut-off værdier ( Genotypning med Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) og Multiple Locus Variable number tandem repeats Analysis (MLVA) Genotypning ved PFGE med XbaI som restriktionsenzym blev udført stort set som beskrevet i Centers for Disease Control and Prevention (CDC) PulseNet protokol [1]. MLVA blev udført ved brug af Lindstedts primere [1] med protokol modificeret efter Torpdahl et al. [20]. Fragmentstørrelserne blev omregnet til antal repeat units for hvert locus i rækkefølgen STTR-STTR5-STTR6-STTR- STTR. Båndmønstrene fra PFGE og antal 1 DVT 201

4 repeat units for hvert locus i MLVA blev bearbejdet i softwareprogrammet BioNumerics (Applied Maths) med henblik på beregning af slægtskab og eventuelt udarbejdelse af slægtskabstræer. Resultater Forekomst og prævalensstudier Monofasiske S. Typhimurium-lignende isolater er blevet fundet i den animalske produktion i både svin, kvæg og fjerkræ, men klart mest i svin. De aktuelle fund, der er gjort i Zoonoselaboratoriet, er anført i Tabel 1. Som det fremgår, har de monofasiske udgjort 17,2 %, 16, % og 20,7 % af alle salmonellafund i hhv. slagtesvinebesætninger, sobesætninger og avls- og opformeringsbesætninger i kortlægningsprøverne. Der er ikke statistisk forskel på disse procenttal (χ 2 med Yates korrektion, p=0,). I DANMAP prøverne, som udtages randomiseret på slagterierne, var andelen af monofasiske noget mindre,,1 %, men forskellen til kortlægningsprøverne er dog ikke statistisk signifikante (χ 2 med Yates korrektion, p=0,17). Dermed udgør de monofasiske en stor andel af alle Salmonella i svineproduktionen. Hvis man tæller antallene af S. Typhimurium og monofasiske sammen, finder man, at de monofasiske udgør en meget betragtelig andel af de samlede S. Typhimurium og S. Typhimurium-lignende salmonellaisolater, ca. en tredjedel (Tabel 1). For så vidt angår fundene i de kliniske prøver er der ingen tvivl om, at i kvægbesætningerne har de påviste isolater i langt de fleste tilfælde været årsag til klinisk salmonellose. For svinebesætningerne er deres betydning vanskeligere at vurdere. Fundene er gjort som led i en udredning af klinisk sygdom i besætningerne, men det kan være vanskeligt at vurdere, hvorvidt Salmonella har været den primære årsag eller en del af et mere kompliceret sygdomskompleks. Nogenlunde samme fundprocenter blev gjort på slagterierne (Tabel 2), når det gælder prøver fra ferskkødsovervågningen og eksportprøver for svinekød. På kreaturslagterierne blev der påvist væsentligt færre S. Typhimurium og monofasiske, idet det langt overvejende fund her er S. Dublin. Karakterisering af 4 isolater Af de 4 nøjere karakteriserede isolater udviste de 60 antigenformlen S. (6, %), mens 4 var S. (6,2 %) (Tabel ). Ved PCR-undersøgelse kunne der hos alle 4 isolater amplificeres det 1 kb store fragment svarende til flib-flia intergenic region, hvilket viser, at de alle var S. Typhimuriumafledte. Otteogtres isolater (72, %) var negative for fljb genet ved PCR, hvilket viser, at disse isolater var»ægte«monofasiske S 4,[5],:i:- uden genet kodende for anden fase flagellen. De resterende 26 (27,7 %) havde et fljb gen, et 1 basepar stort PCR-fragment, hvilket gør dem til fænotypisk monofasiske og genotypisk S. Typhimurium. Tilstedeværelsen af fljb-genet var ikke ligelig fordelt i de enkelte genotypiske grupper; fljb-negative isolater forekom Tabel 1. Fund af monofasiske Salmonella Typhimurium-lignende isolater i dansk husdyrproduktion i 20. Dyreart Oprindelse Antal i perioden Antal Antal S. Typhimurium Samlet antal Salmonella isolater Monofasiske i % af alle Salmonella Kvæg Klinisk sygdom * $ - 62,5 Svin Klinisk sygdom , Svin DANMAP prøver , 2,1 Monofasiske i % af alle S. Typhimurium og S. Typhimurium-lignende Svin Kortlægningsprøver i slagtesvin ,2 2, Svin Kortlægningsprøver, , 42,2 sobesætninger Svin Kortlægningsprøver, avls- og 2 20,7 5, opformeringsbesætnnger Fjerkræ Overvågningsprøver ,5 *Dog kun hidrørende fra forskellige besætninger. To besætninger var repræsenteret med hver to isolater, men fra materiale udtaget på forskellige tidspunkter. $ -: Antal ikke kendt eller ikke opgjort Tabel 2. Fund af monofasiske Salmonella Typhimurium-lignende isolater på slagterier i 20. Dyreart Oprindelse Antal S. Antal S. Antal S. Typhimurium Samlet antal Salmonella isolater Monofasiske i % af alle Salmonella Svin Ferskkødsovervågning ,5 4,4 Kvæg Ferskkødsovervågning 1 0 1,5 50,0 Svin Eksportprøver , 44,7 Kvæg Eksportprøver Monofasiske i % af alle S. Typhimurium og S. Typhimuriumlignende > DVT 201 1

5 således hyppigere blandt S. end blandt S., og hyppigere hos DT1 end andre fagtyper (Tabel ). Fagtyper Det viste sig, at monofasiske findes indenfor flere forskellige fagtyper (Tabel 4, Figur 1). Den klart dominerende fagtype var DT1 med 56 isolater (5,6 %) fulgt af DT0 med isolater (,7 %) og U02 med isolater (,7 %). Derudover fandtes U (4), DT4b (1), og DT41 (1). Fire isolater havde fagreaktioner, der ikke var forenelige med nogen kendt fagtype (rdnc), og de sidste var ikke typbare. Resistensforhold Resistensundersøgelserne viste en udstrakt grad af resistens, idet 0 (5,7 %) af isolaterne var resistente over ét eller flere stoffer, mens kun fire isolater var fuldt følsomme (Tabel 4). Af de 4 isolater udviste de 67 (71, %) multiresistens, defineret som resistens overfor fire eller flere antibiotika (stofgrupper). Især resistensmønstret var meget udbredt idet, 5 isolater (62, %) havde denne resistensprofil, mens 64 (6,1 %) havde denne resistensprofil alene eller i kombination med andre resistensfaktorer, altså næsten alle de multiresistente isolater. Mens resistensen således var meget høj overfor ampicillin (, %), tetracyklin (0, %), streptomycin (76,6 %) og sulfonamider (77,7 %), var der til gengæld meget lav resistens overfor andre stoffer. Alle var således følsomme overfor colistin, apramycin og amoxycillin-clavulansyre og overfor de kritiske antibiotika cefalosporiner (ceftiofur og cefotaxime) og quinoloner (nalidixinsyre og ciprofloxacin), mens hhv. 2 og 1 isolater udviste resistens overfor Tabel. Forekomst af fljb genet kodende for anden fase flagellen hos danske fænotypisk monofasiske S. Typhimurium-lignende isolater. Total DT 1 Andre fagtyper * fljb fljb Total * rdnc og ikke-typbare ikke medregnet chloramphenicol og florfenicol, 1 overfor gentamicin, 1 overfor neomycin og 2 overfor trimethoprim. Selvom resistensmønstret var mest udbredt blandt DT1 isolaterne (40/56 svarende til 71,4 %), fandtes det også hos de andre fagtyper, /4 af U, / af U02 og 5/ af DT0 isolaterne. Det ene DT4b isolat havde den typiske DT4 multiresistens, som også er, men tillige med resistens overfor chloramphenicol og her også spectinomycin. Molekylære typningsresultater I alt 17 forskellige XbaI PFGE profiler blev identificeret (Fig. 1), hvilket viser både en vis genetisk diversitet og tilstedeværelsen af specifikke kloner. Dendrogrammet afslørede tre store klynger, A, B, and C, bestående af hhv. 17, 1 og isolater. Indenfor hver af disse klynger kunne der imidlertid findes flere fagtyper. Klynge A bestod således 7 DT0 isolater, 5 DT1, U og ét af hver af fagtyperne DT4b og U02. Klynge B bestod af U02 og DT 1, 5 isolater af hver, men også af 2 rdnc og en ikke-typbar. I den største klynge C, var af de isolater DT1, mens den sidste var ikke-typbar. Af de isolater i denne klynge havde hele 6 -STR- Tabel 4. Resistensprofiler for danske monofasiske Salmonella Typhimurium-lignende isolater og deres fordeling på fagtyper Resistensprofil Antal resistenser Antal isolater Fagtyper (antal isolater) Fuldt følsomme 0 4 DT 1 (), (1) 1 6 DT 1 (), DT 0 (1), U02 (1), (1) 1 7 DT 1 (4), DT 0 (2), U02 (1) DT 1 (1), DT 0 (1) -SMX 2 1 DT 1 (1) -STR- 1 U02 (1) -GEN- 1 rdnc -SMX- 1 DT 0 (1) -STR-SMX 4 DT 1 (1), U02 (2), DT 41 (1) 4 5 DT 1 (40), DT 0 (5), U02 (), U (), rdnc (), (5) -SPE-SMX- 4 1 (1) -SPE-STR-SMX- 5 2 DT 1 (2) -SPE-STR-SMX-TMP 5 1 DT 0 (1) -CHL-FFN-STR-SMX- 6 1 U (1) -CHL-SPE-STR-SMX- 6 1 DT 4b (1) -NEO-SPE-STR-SMX- 6 1 DT 1 (1) -SPE-STR-SMX--TMP 6 1 DT 0 (1) 20 DVT 201

6 Figur 1. Slægtskabstræ beregnet ud fra PFGE profiler. Information om isolaternes antigen formel, fagtype, MLVA profil og resistensmønster er vist tillige med, hvorvidt de besidder fljb genet eller ikke. Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-0.0%] pfge pfge Isolat nummer Antigen Fagtype fljb gen MLVA loci repeats Resistent overfor DT 1 -NEO-SPE-STR-SMX DT 0 -SPE-STR-SMX--TMP DT 1 1 -SPE-STR-SMX U -CHL-FFN-STR-SMX U U DT DT DT DT4b U02 -CHL-SPE-STR-SMX-TMP Klynge A DT 0 DT 1 DT N= DT DT DT 0 -SMX DT DT DT DT U02 1 -STR U DT 1 SUSCEPTIBLE DT 1 -SMX RDNC U U02 -STR-SMX U02 DT 1 -STR-SMX - Klynge B U02 DT 1 -STR-SMX N= DT RDNC -GEN RDNC RDNC U DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT 1 1 SUSCEPTIBLE DT 1 DT 1 DT 1 Klynge C DT 1 DT 1 1 N= DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT DT 1 -SPE-STR-SMX DT DT DT DT DT DT DT 1 1 SUSCEPTIBLE DT DT DT DT DT DT SPE-STR-SMX DT DT 41 -STR-SMX SUSCEPTIBLE -SPE-STR-SMX-TMP > DVT

7 SMX- resistensprofilen og alle manglede fljb-genet, dvs. de var genotypisk monofasiske. Et enkelt isolat i klynge C var kun resistent overfor tetracyklin, ét var fuldt følsomt, og den sidste havde - STR-SMX- profilen, men med en yderligere resistens overfor spectinomycin. Øvrige PFGE-profiler var enten unikke (n=) eller bestod af to (n=2), tre (n=2) eller fire (n=1) isolater. Flere profiler var dog meget tæt beslægtet med klynge C profilen. De mest afvigende PFGE-profiler tilhørte et DT41-isolat og to ikke-typbare isolater, som havde ens profiler, og et tredje ikke-typbart isolat, som havde den mest afvigende profil (Figur 1). MLVA-resultaterne opdelte isolaterne i 24 forskellige profiler. De mest almindelige (Figur 1) var -1--NA med isolater, ---NA ( isolater), --- NA ( isolater), ---NA ( isolater), -1--NA ( isolater) og ---NA (7 isolater). Disse seks MLVA-typer omfattede tilsammen 60 isolater (6, % af alle). MLVA-typerne -1- -NA og ---NA tilhørte mest PFGE-klynge C, dvs. de var DT1, ægte fænotypiske isolater med resistensprofilen. Øvrige MLVA-typer var mere fordelt blandt PFGE-profilerne. Diskussion Dette er den første egentlige opgørelse af forekomst af karakterisering af monofasiske S. Typhimurium-lignende S. 4,[5],:i:- i den danske husdyrproduktion. Resultaterne viste, at disse monofasiske Salmo - nella kan findes i både svin, kvæg og fjerkræ. Også i udenlandske opgørelser er de påvist i alle husdyrarter, og ligesom i denne undersøgelse ser de ud til oftest at være relateret til svin [21]. Svinekød og produkter heraf har også været kilden til flere udbrud [5,6,,22,2,24], og Salmonella 4,[5],:i:- var én af de mest prævalente serotyper hos svin og svinekød i 2006 [,16]. I levnedsmidler har vi endnu relativt sparsomt kendskab til deres forekomst, men de forekommer, og har også i Danmark givet anledning til humane tilfælde og udbrud [25]. De danske tal viser også, at monofasiske S. 4,[5],:i:- er én af de allerhyppigst forekommende typer hos svin og udgør omkring en tredjedel af alle S. Typhimurium og S. Typhimurium-lignende isolater. Dette er tilsyneladende en større andel, end der er set i visse andre lande, bl.a. Polen [26]. Fravær eller tilstedeværelse af fljb-genet er ifølge den nye EFSA guideline (EFSA 20) kriteriet for at kunne skelne mellem»ægte«monofasiske S. 4,[5],:i:- og S. Typhimurium, som blot ikke udtrykker anden fase flagellen. Af de isolater, der blev undersøgt i dette studie, manglede de 6 fljb-genet og var således ægte monofasiske. Ved almindelig objektglasagglutination blev de resterende 26 (27,7 %) af isolaterne således kategoriseret som mono - fasiske, selvom de genotypisk reelt var S. Typhimurium. Dette er ikke ulig andre observationer [21], og det viser, at den metode, der er anvendt til påvisning af de monofasiske, har betydning for udfaldet. Der kan være flere forklaringer på denne tilsyneladende diskrepans. Nogle isolater mangler øjensynligt evnen til at danne anden fase flagellen trods det, at de besidder genet herfor. Der er således beskrevet»stammer med inkonsistent serotype«, som udtrykker fljb genet intermitterende [], eller stammer, hvor punktmutationer i fljb genet bevirker, at det ikke kan udtrykkes []. Endvidere kan der være beskadigelser i den mekanisme, der gør, at bakterien switcher mellem første og anden fase, recombinasen Hin eller første phase repressoren flja [7,21]. I mange opgørelser over forekomst af forskellige serotyper er monofasiske hidtil blevet rapporteret som S. Typhimurium, hvilket også har været tilfældet for vore egne opgørelser. Størstedelen af isolaterne i denne undersøgelse (6, %) udtrykte O:5 faktoren. Dette er i overensstemmelse med, hvad andre forskere har fundet []. Samtidig manglede også en større andel af disse S. fljb genet, end det var tilfældet for 4,:i.- isolaterne (Tabel ). Dette kan i vid udstrækning tilskrives den udbredte klon af S. DT1 (Fig. 1). I rapporter fra andre lande er det også DT1, der er den fremherskende fagtype blandt de monofasiske []. Flertallet af de FOTO: COLOURBOX 22 DVT 201

8 danske isolater (62, %) havde resistensprofilen, hvilket også er rapporteret fra andre lande, og det gælder i øvrigt DT1 uanset om de er S. 4,[5],:i:- eller typiske S. Typhimurium [,27]. Flertallet af DT1 isolaterne, ud af 56, blev grupperet sammen ved PFGE (klynge C, Figur 1), idet de havde en PFGE profil, som er forenelig med en dominerende profil, STYMXB.0 [21], tillige MLVA typerne -1--NA og --- NA, som også er rapporteret fra andre lande [6,21], og 6 af disse havde - STR-SMX- resistensprofilen. Disse manglede endvidere alle fljb-genet. Der er således tydeligvis tale om en klon, som er udbredt i mange lande, og også hos flere dyrearter her både svin (n=4), kvæg (n=4) og fjerkræ (n=1). Det er endnu uvist, hvorfor denne klon er blevet så succesfuld, men der pågår netop nu nærmere undersøgelser i flere lande i Europa, blandt andet ved brug af fuldgenom sekventering, i forsøg på at afklare dette (Liljana Petrovska, AHVLA, England, personlig meddelelse). Op gennem 10-erne og 0-erne var det som tidligere nævnt DT4 klonen, der bredte sig, og heller ikke for den klon blev det klart, hvorfor netop den blev så succesfuld. Nyere undersøgelser tyder på, at der ikke kan peges på én enkelt faktor eller egenskab, som afgør, om en klon får succes eller ej, men at der er tale om en kombination af faktorer, hvoraf nogle formodes at være betinget af integration af bakteriofager [2]. Ligesom i andre undersøgelser fandt vi den næsthyppigste fagtype til at være DT0 [,21], omend halvdelen af disse kun var fænotypisk monofasiske. Et enkelt isolat blev karakteriseret som fagtype DT41, som ikke tidligere er rapporteret som monofasisk. Ved PFGE undersøgelsen havde dette isolat same profil som 2 ikkefagtypebare isolater, hvilket kan tyde på, at disse også kunne være DT41 afledte. Kun fire isolater blev fundet følsomme for alle antibiotika, og et stort antal var resistente overfor ampicillin, tetracycliner, streptomycin og sulfonamider, hvilket vidner om en høj grad af resistens hos S. 4,[5],:i:-. Dette er ligeledes i overensstemmelse med andre europæiske undersøgelser [6,,21,22,2], og det ser ud til, at disse resistensfaktorer sidder på kromosomale gener blatem-1, stra-strb, sul2, og tet(b) [,,2]. I amerikanske studier er der til gengæld rapporteret om lav resistensforekomst []. Det er imidlertid glædeligt, at der ikke fandtes resistens overfor de kritiske antibiotika cefalosporiner og fluoroquinoloner. Humant udgjorde monofasiske S. 4,[5],:i:- den tredjehyppigste årsag til salmonellose i Danmark i 20, kun overgået af S. Typhimurium og S. Enteritidis [25]. Veterinært har de også været årsag til klinisk salmonellose, i hvert fald i kvægbesætninger, og de er isoleret i forbindelse med klinisk sygdom hos svin. Alt tyder således på, at de er ligeså patogene for dyr og mennesker som S. Typhimurium. Det har længe været uklart, hvorledes de monofasiske skulle håndteres, og de har således ikke været omfattet af den lovgivning, der gælder S. Typhimurium og S. Enteritidis. Der blev derfor nedsat en arbejdsgruppe under EFSA til at afklare dette spørgsmål. Denne arbejdsgruppe barslede med en rapport i efteråret 20, hvor den redegjorde for, at S. 4,[5],:i:- er varianter af S. Typhimurium og derfor meget klart anbefalede, at monofasiske S. 4,[5],:i:- lovgivningsmæssigt skal betragtes som S. Typhimurium og risikohåndteres som sådanne (EFSA 20). Disse anbefalinger har EU Kommissionen taget til sig, således at dette vil blive indskrevet i EU lovgivningen på området (Klaus Kostenzer, DG-SANCO, personlig meddelelse). Konklusioner Ud fra denne første opgørelse og beskrivelse af monofasiske S. Typhimurium-lignende Salmonella i husdyr og fødevarer kan vi drage følgende konklusioner: Monofasiske S. Typhimurium-lignende Salmonella er langt fra ualmindelige i Danmark Både antigenformen S. og S. forekommer (med og uden O:5 faktor) De er påvist i primærproduktionen hos både svin, kvæg og slagtekyllinger, og i levnedsmidler Kan veterinært give klinisk salmonellose, i hvert fald hos kvæg Alt tyder på, at de har samme virulens som S. Typhimurium Mange klonale linjer er påvist Men især en enkelt klon S. fagtype DT1 fljb negativ dominerer den er også beskrevet fra mange andre lande som den dominerende klon De har tendens til at være multiresistente, men resistens over kritiske antibiotika som cefalosporiner og fluoroquinoloner er ikke påvist herhjemme Nogle stammer har fljb genet, men er øjensynligt ikke i stand til at udtrykke det Der er nu udviklet en fljb PCR, som kan hjælpe til at skelne mellem sande monofasiske og fænotypisk monofasiske stammer Lovgivningsmæssigt og risikohåndteringsmæssigt vil de fremover blive sidestillet med S. Typhimurium Type I artikler i DVT omfatter både originalartikler (den første offentliggørelse af et resultat) og oversigtsartikler (videnskabelige artikler, der giver en samlet vurdering af den forskning, som findes om et bestemt emne). Type 1 artikler er fagfællebedømte, idet det videnskabelige indhold er vurderet og godkendt af en faglig redaktør inden publicering. Referencer 1. Grimont, P.A.D., Weill, F.-X. (2007). Antigenic formulae of the Salmonella serovars. th ed., Institut Pasteur, Paris, pp Echeita M.A., Herrera S., Usera M.A., (2001). Atypical, fljb-negative Salmonella enterica subsp. enterica strain of serovar appears to be a monophasic variant of serovar Typhimurium. J. Clin. Microbiol., 21.. Echeita M.A., Aladueña A., Cruchaga S., Usera M.A., (1). Emergence and spread of an atypical Salmonella enterica subsp. enterica serotype strain in Spain. J. Clin. Microbiol. 7, CDC, (200). Salmonella surveillance: annual summary, CDC, Department of Health and Human Services, Atlanta, GA. > DVT 201 2

9 5. Mossong J., Marques P., Ragimbeau C., Huberty-Krau P., Losch S., Meyer G., Moris G., Strottner C., Rabsch W., Schneider F., (2007). Outbreaks of monophasic Salmonella enterica serovar 4,[5],:i:- in Luxembourg. Euro Surveill., v07n02.pdf. 6. Dionisi A.M., Graziani C., Lucarelli C., Filetici E., Villa L., Owczarek S., Caprioli A., Luzzi I., (200). Molecular characterization of multidrug-resistant strains of Salmonella enterica serotype Typhimurium and monophasic variant (S. 4,[5],:i:-) isolated from human infections in Italy. Foodborne Pathog. Dis. 6, Soyer Y., Moreno Switt A., Davis M.A., Maurer J., McDonough P.L., Schoonmaker-Bopp D.J., Dumas N.B., Root T., Warnick L.D., Gröhn Y.T., Wiedmann M., (200). Salmonella enterica serotype, an emerging Salmonella serotype that represents multiple distinct clones. J. Clin. Microbiol. 47, Switt A.I., Soyer Y., Warnick L.D., Wiedmann M., (200). Emergence, distribution, and molecular and phenotypic characteristics of Salmonella enterica serotype. Foodborne Pathog. Dis. 6, Trüpschuch S., Laverde Gomez J.A., Ediberidze I., Flieger A., Rabsch W., (20). Characterisation of multidrug-resistant Salmonella Typhimurium 4,[5],:i:- DT1 strains carrying a novel genomic island adjacent to the thrw trna locus. Int. J. Med. Microbiol. 00, 27.. Hauser E., Tietze E., Helmuth R., Junker E., Blank K., Prager R., Rabsch W., Appel B., Fruth A., Malorny B., (20). Pork contaminated with Salmonella enterica serovar 4,[5],:i:-, an emerging health risk for humans. Appl. Environ. Microbiol Guerra B., Laconcha I., Soto S.M., González-Hevia M.A., Mendoza M.C., (2000). Molecular characterisation of emergent multiresistant Salmonella enterica serotype [] organisms causing human salmonellosis. FEMS Microbiol. Lett., Agasan A., Kornblum J., Williams G., Pratt C.C., Fleckenstein P., Wong M., Ramon A., (2002). Profile of Salmonella enterica subsp. enterica (subspecies I) serotype strains causing food-borne infections in New York City. J. Clin. Microbiol. 40, Garaizar J., Porwollik S., Echeita A., Rementeria A., Herrera S., Wong R.M., Frye J., Usera M.A., McClelland M., (2002). DNA microarray-based typing of an atypical monophasic Salmonella enterica serovar. J. Clin. Microbiol. 40, Amavisit P., Boonyawiwat W., Bangtrakulnont A., (2005). Characterization of Salmonella enterica serovar Typhimurium and monophasic Salmonella serovar 1,4,[5],:i:- isolates in Thailand. J. Clin. Microbiol. 4, Zamperini K., Soni V., Waltman D., Sanchez S., Theriault E.C., Bray J., Maurer J.J., (2007). Molecular characterization reveals Salmonella enterica serovar 4,[5],:i:- from poultry is a variant Typhimurium serovar. Avian Dis. 51, EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), (20). Scientific Opinion on monitoring and assessment of the public health risk of»salmonella Typhimurium-like«strains. EFSA Journal,, (), Anderson, E.S., Ward, L.R., Saxe, M.J., de Sa, J.D., (177). Bacteriophage-typing designations of Salmonella typhimurium. J. Hyg. 7, Ribot E.M., Fair M.A., Gautom R., Cameron D.N., Hunter S.B., Swaminathan B., Barrett T.J., (2006). Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O7:H7, Salmonella, and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathog. Dis., Lindstedt B.A., Vardund T., Aas L., Kapperud G., (2004). Multiple-locus variable-number tandem-repeats analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and multicolor capillary electrophoresis. J. Microbiol. Methods. 5, Torpdahl M., Sørensen G., Lindstedt B.A., Nielsen E.M., (2007). Tandem repeat analysis for surveillance of human Salmonella Typhimurium infections. Emerg. Infect. Dis. 1, Hopkins K.L., Kirchner M., Guerra B., Granier S.A., Lucarelli C., Porrero M.C., Jakubczak A., Threlfall E.J., Mevius D.J., (20). Multiresistant Salmonella enterica serovar 4,[5],:i:- in Europe: a new pandemic strain? Euro Surveill.,(22):pii=0. ViewArticle.aspx?ArticleId= Barone L., Dal V.A., Pellissier N., Viganò A., Romani C., Pontello M., (200). Emergence of Salmonella Typhimurium monophasic serovar: determinants of antimicrobial resistance in porcine and human strains. Ann. Ig. 20, Bone A., Noel H., Le Hello S., Pihier N., Danan C., Raguenaud M.E., Salah S., Bellali H., Vaillant V., Weill F.X., Jourdan-da Silva N., (20). Nationwide outbreak of Salmonella enterica serotype infections in France, linked to dried pork sausage, March-May 20. Euro Surveill. (24):pii=2. aspx?articleid= Gossner C.M., van Cauteren D., le Hello S., Weill F.X., Terrien E., Tessier S., Janin C., Brisabois A., Dusch V., Vaillant V., Jourdan-da Silva N., (20). Nationwide outbreak of Salmonella enterica serotype 4,[5],:i:- infection associated with consumption of dried pork sausage, France, November to December 20. Euro Surveill. 17,(5):pii= aspx?articleid= Anonymous (20). Annual report on zoonoses in Denmark 20. National Food Institute, Technical University of Denmark, pp Wasyl D., Hoszowski A., (20). Occurrence and characterization of monophasic Salmonella enterica serovar Typhimurium on non-human origin in Poland. Foodborne Pathog. Dis., Hampton M.D., Threlfall E.J., Frost J.A., Ward L.R., Rowe B., (). Salmonella typhimurium DT 1: differentiation of an epidemic phage type by antibiogram, plasmid profile, plasmid fingerprint and salmonella plasmid virulence (spv) gene probe. J. Appl. Bacteriol. 7, Müller, K. Genetic and phenotypic characteristics of importance for clonal success and diversity in Salmonella. Ph.D. afhandling, DTU Food, Lucarelli C., Dionisi A.M., Torpdahl M., Villa L., Graziani C., Hopkins K., Threlfall J., Caprioli A., Luzzi I., (20). Evidence for a second genomic island conferring multidrug resistance in a clonal group of strains of Salmonella enterica serovar Typhimurium and its monophasic variant circulating in Italy, Denmark, and the United Kingdom. J. Clin. Microbiol. 4, DVT 201