KVANTITERING AF M-KOMPONENTER I URIN VED ANVENDELSE AF KAPILLÆRELEKTROFORESE OG GELELEKTROFORESE EN METODESAMMENLIGNING

Transkript

1 20. DECEMBER 2016 BACHELORPROJEKT KVANTITERING AF M-KOMPONENTER I URIN VED ANVENDELSE AF KAPILLÆRELEKTROFORESE OG GELELEKTROFORESE EN METODESAMMENLIGNING QUANTITATING M-COMPONENTS IN URINE BY CAPILLARYELECTROPHORESIS AND GELELECTROPHORESIS A COMPARATIVE STUDY UDARBEJDET AF, ba13s004 UDDANNELSESINSTITUTION Bioanalytikeruddannelsen, KLINISK UDDANNELSESSTED Sygehus Lillebælt, Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling, Vejle UC SYD VEJLEDER Francisco Mansilla Castaño KLINISK VEJLEDER Cilia Sindt ANTAL ANSLAG

2 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Forord Dette bachelorprojekt, udarbejdet som afsluttende eksamensopgave på bioanalytikeruddannelsen ved, omhandler analysemetoder til kvantitering af M-komponenter i urin. Projektet henvender sig til bioanalytikere, bioanalytikerstuderende og andre faggrupper med interesse for analyse af M-komponenter. Projektet er udført i samarbejde med Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling (KIBA), Vejle Sygehus. I den forbindelse skal lyde tak til afdelingsledelsen, for udlån af apparatur og finansiering af projektet, samt til afdelingsbioanalytiker Liselotte B. Laursen og klinisk vejleder Cilia Sindt, for hjælp til indhentning af priser samt kontakt til den økonomiansvarlige i ledelsen. Indsamling af prøver til projektet er foretaget fra juli til oktober 2016, af personalet i Palmeafsnittet KIBA Vejle. En stor tak skal derfor rettes til personalet i Palmeafsnittet, uden hvis hjælp projektet ikke ville kunne gennemføres. En stor tak skal ligeledes rettes til hele personalet på KIBA. Alle har været venlige og imødekommende, og mange har hjulpet med indhentning af oplysninger, vejledning og sparring. En særlig tak skal rettes til bioanalytiker Connie L. Duborg for hendes store arbejdsindsats i forbindelse med oplæring i anvendelse af apparatur, hjælp til vurdering af elektroferogrammer, samt problemløsning og sparring undervejs i projektet. En tak skal også rettes til Lars Bendixen, videnchef hos ILS Danmark, for teknisk support og opklaring af spørgsmål til analysemetoder og apparatur. Tak til

3 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Biokemiker Erik D. Lund for rådgivning og sparring i projektets planlægningsfase, samt udlevering af resultater fra prøverundsendelser. Tak til personalet på Biokemisk Afdeling, Roskilde Sygehus, for fremsendelse af patientprøver. Sidst men ikke mindst stor tak til min bachelormakker Line S. Lorenzen for godt og hyggeligt samarbejde under forberedelse og udarbejdelse af projektet og for støtte og sparring under opgaveskrivningen. Endelig tak til mine vejledere Francisco M. Castaño og Cilia Sindt for god vejledning og hjælp til fremskaffelse af prøver fra Roskilde Sygehus.

4 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Abstract Baggrund Kvantitering af M-komponenter i urin kan foretages ved agarose-gelelektroforese (AGE) eller kapillærzoneelektroforese (CZ). Prøverundenelser har vist store variationer imellem laboratorierne, hvilket kan være problematisk i fht. myelomatosepatienters sygdomsmonitorering. Overvejelser om centralisering af analysen er derfor oplaget. Forud for dette bør metodernes effekt på kvalitet, organisation, økonomi og patientsikkerhed undersøges. Metode M-komponenter i 21 døgnuriner kvantiteres ved AGE på Hydrasys2 og på Capillarys2 efter dialysebehandling. 7 prøver analyseres ved AGE efter dialysebehandling og 3 fortyndinger analyseres ved AGE og CZ. Internt kontrolmateriale analyseres gentagne gange med begge metoder og to døgnuriner, indsamlet og tidligere analyseret af Roskilde Sygehus, analyseres ved AGE og CZ. Electroferogrammer dannes med softwaren Phoresis. Resultater Bland-Altman plot viser systematisk højere værdier ved AGE end ved CZ. I 7 ud af 21 prøver fås difference på 0,1 g/24h. Den intermediære præcision bestemmes til 6,3% ved AGE og 11,1% ved CZ. Fortyndingsforsøget viser at klinisk relevante detektionsgrænser på hhv. 0,1 g/24h, 0,2 g/24h og 90% reduktion i M-komponenten kan detekteres med begge metoder. Konklusion Anvendelsen af CZ og AGE viser sammenlignelig repeterbarhed og intermediær præcision. AGE påvirkes af usikkerheder ved farvning af gelen, mens CZ påvirkes af usikkerheder ved dialysebehandlingen. Der er ingen forskelle i økonomiske aspekter, men AGE fører til væsentlige tidsbesparelser. Ved fire af 21 prøver ses klinisk relevante forskelle, som kan få betydning for patienten. Der ses muligvis interferens fra lægemidlet Daratumumab ved AGE, hvilket elimineres ved CZ.

5 Indhold 1. Introduktion Baggrund Formål Problemformulering Afgrænsning Teoretisk baggrund Immunglobuliner Myelomatose og M-komponenter Analysemetoder til påvisning af M-komponenter i urin Materialer og metode Design Materialer Prøvemateriale Apparatur, reagenser og utensilier Juridiske og etiske overvejelser Metode Dataindsamling i BCC, Phoresis og kontrolskema Hydrasys2 analyse, kvantitering og kvalitetssikring Capillarys analyse, kvantitering og kvalitetssikring Analyse af intern kontrol Analyse af patientprøver Dialyseforsøg Fortyndingsforsøg Analyse af ekstern prøve Databearbejdning Litteratursøgning Resultater Resultater ved analyse af intern kontrol Analyseresultater af patientprøver Resultater af dialyseforsøg Resultater af fortyndingsforsøg Resultater ved analyse af ekstern prøve Diskussion

6 4.1. Vurdering af analysekvaliteten Fortolkning af projektets resultater og vurdering af intern validitet Ekstern validitet Organisatoriske elementer Tidsforbrug og arbejdsgange Kvantitering i kombination med typebestemmelse Bioanalytikerens arbejdsmiljø Konsekvenser for patienter Økonomiske aspekter Forslag til metodeforbedring Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilagsoversigt

7 Anvendte forkortelser AGE: Agarose-gelelektroforese BJP: Bence Jones Protein CE: Kapillærelektroforese CZ: Kapillærzoneelektroforese FLC: Serum frie lette kæder IF: Immunfixation Ig : Immunglobulin IS: Immunsubstraktion KIBA: Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling pi: isoelektriske punkt 3

8 1. Introduktion Dette bachelorprojekt omhandler analysemetoder til kvantitering af M-komponenter i urin. Projektets praktiske del er udarbejdet i samarbejde med bachelorstuderende Line S. Lorenzen og Klinisk Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus. Indledningsvis gennemgås problembaggrunden, som ligger til grund for udarbejdelse af bachelorprojektet. Projektets formål beskrives, problemformuleringen præsenteres og projektet afgrænses, hvorefter det teoretiske grundlag for projektet gennemgås Baggrund Myelomatose udgør, med en årlig incidens på 370 personer, omkring 1% af alle cancertilfælde i Danmark. Sygdommen har en høj dødelighed med gennemsnitligt 224 dødsfald pr. år og en relativ 5-årig overlevelse på 50% (CI: 46-54%)(1). Der lever ca myelomatose-patienter i Danmark(1). Disse patienters sygdomsudvikling og effekten af deres behandling monitoreres ved en tværfaglig indsats, der involverer mange forskellige specialer, heriblandt biokemiske analyser. Vigtige parametre til såvel diagnostik og monitorering er påvisning, kvantitering og typebestemmelse af M-komponenten, et protein, der dannes ved bl.a. myelomatose og udskilles i blod og urin(2). Den hyppigst anvendte metode til påvisning og kvantitering af M-komponenter er agarose-gelelektroforese (AGE), mens den hyppigst anvendte metode til typebestemmelse er immunfixation (IF) i kombination med AGE(3 5). På Immunologisk og Biokemisk Afdeling (KIBA) i Vejle anvendes 4

9 imidlertid kapillærelektroforese (CE) til påvisning og kvantitering, og immunsubstraktion (IS) til typebestemmelse(3). Forskellene i analysemetoder og procedurer for tolkning og svarafgivelse mellem landets laboratorier, fører til store interlaboratoriele analysevariationer. Hvis patienter følges af forskellige laboratorier, kan variationerne føre til problematikker i forbindelse med monitorering og vurdering af behandlingseffekt og sygdomsprogression(3,6). For at undersøge problematikken nedsatte Dansk Selskab for Klinisk Biokemi (DSKB) og Dansk Myelomatose Studie Gruppe (DMSG) i 2010 en arbejdsgruppe, der havde til formål at udarbejde en dansk retningslinje for analyse af M- komponenter og dermed ensrette M-komponent analyserne i Danmark. For at undersøge metodevariationen på M-komponent analyserne blev en prøverundsendelse til 10 af landets laboratorier foretaget. Resultaterne viste gode overensstemmelser ved påvisning og typebestemmelse af M-komponenter i serum og urin, samt ved typebestemmelse i urin. Kvantitering af M-komponenter i urin viste imidlertid interlaboratorielle variationer på op til 120%(3,6). De store variationer ved kvantitering af M-komponent i urin er ligeledes beskrevet i Dansk retningslinje for M-komponent analyser (6), hvor der henvises til, at der i eksterne kontrolsystemer er fundet variationer på op til 300%. De beskrevne variationer gør det oplagt at overveje muligheden for at centralisere kvantiteringen af M-komponenter i urin på få af landets sygehuse og dermed mindske risikoen for varierende svarafgivelser. I den forbindelse er det relevant at undersøge hvilken analysemetode der bør anvendes til kvantitering. Metoderne bør 5

10 derfor sammenlignes med henblik på at belyse fordele og ulemper ved deres anvendelse. En sammenligning af metoderne er ligeledes relevant til vurdering af lokale forhold på KIBA i Vejle. Afdelingen anvender, i modsætning til de fleste andre laboratorier i Danmark, kapillærelektroforese til kvantitering af M-komponenter i urin(3). Afdelingen råder imidlertid over apparatur til kvantitering ved gelelektroforese. Da der ved kapillærelektroforese kræves omfattende manuel prøveforbehandling er det oplagt at undersøge om anvendelse af gelelektroforese kan lette arbejdsgange og medføre tidsbesparelser. Sammenligningen af metoderne bør ikke udelukkende fokusere på effektivisering af analysearbejdet, men foretages med henblik på at afdække, hvordan anvendelse af metoderne påvirker analysekvaliteten og dermed patientsikkerheden. Endvidere skal metodernes indflydelse på bioanalytikerens arbejdsgange og arbejdsmiljø, samt økonomiske hensyn tages til eftertragtning Formål Dette bachelorprojekt har til formål at foretage ovennævnte sammenligning af metoder til kvantitering af M-komponenter. Hertil sammenlignes gelelektroforese ved anvendelse af Hydrasys2 med kapillærelektroforese foretaget ved anvendelse af Capillarys2. Metodernes styrker og svagheder forsøges afdækket og analysekvaliteten sammenlignes. Forhold med betydning for organisation og økonomi undersøges, idet tidsforbrug, arbejdsgange, prøvehåndtering, arbejdsmiljøfaktorer og omkostninger sammenlignes. Det undersøges endvidere, hvordan 6

11 anvendelse af metoderne kan påvirke analysesvar, diagnostik og sygdomsmonitorering, og hvilken konsekvens dette vil have for patienterne Problemformulering Hvilken betydning har anvendelse af henholdsvis kapillær- og gelelektroforese for bestemmelse af M-komponenter i urin, vurderet ud fra økonomiske, organisatoriske, analysemæssige og patientmæssige perspektiver? 1.4. Afgrænsning Projektet beskæftiger sig udelukkende med bestemmelse af M-komponenter i urin og fokuserer på kvantiteringen af M-komponenten. Typebestemmelse af M- komponenter berøres kun overfladisk. Den teoretiske gennemgang af M- komponenten og dens rolle i diagnostik og behandling, fokuserer på M-komponenten i forbindelse med myelomatose. M-komponenter kan dannes i forbindelse med andre sygdomme(7), hvilket dog ikke omtales nærmere i dette projekt. 7

12 1.5. Teoretisk baggrund Immunglobuliner Immunglobuliner (Ig) (fig. 1) er proteiner der dannes og secerneres af plasmaceller. De er opbygget af to tunge (MW 50 kd) og to lette (MW 25 kd) polypeptidkæder, bundet let kæde let kæde tung kæde sammen af disulfidbindinger. Polypeptidkæderne har en variabel og en konstant del. I den variable del findes forskellige amminosyresekvenser. I den konstante del Fig. 1: Skematisk tegning af et immunglobulin. To lette og to tunge polypeptidkæder er bundet sammen af disulfidbroer (grå). Hver kæde består af en konstant (sort) og en variabel (blå) del. (F1) gentages den samme aminosyresekvens. Sekvensen, der gentages i de tunge kæder, er forskellig i hver af de 5 typer af tunge kæder. Den lette kædes konstante del kan have to forskellige sekvenser (kappa og lambda). Ved kombinationer af tunge og lette kæder findes antistofklasserne IgG, -A, -M, -D og -E, i varianter med lette kæder af enten kappa eller lambda type(8) Myelomatose og M-komponenter Ved Myelomatose fører en malign plasmacelle proliferation til forstyrrelser i immunglobulinproduktionen. De maligne plasmaceller (myelomceller) er primært lokaliseret til knoglemarven. I stedet for den normale produktion af polyklonale immunglobuliner producerer myelomceller monoklonalt protein, M-komponenten (2,9). M-komponenten kan være et komplet Ig, dog oftest uden immunologisk funktion, eller bestå udelukkende af tunge eller lette kæder. De hyppigst forekommende typer er IgG-, IgA- og letkæde-myelomatose(2,10). 8

13 Bence Jones Protein Ved letkæde-myelomatose produceres frie lette kæder af enten lambda eller kappa typen. I normale plasmaceller produceres flere lette end tunge kæder. Overskydende frie lette kæder vil dermed altid findes i mindre mængde i blodet. Ved letkædemyelomatose stiger produktionen af lette kæder og nyrernes evne til at tilbageholde proteiner overskrides, så de lette kæder udskilles i urinen. Frie lette kæder i urinen kaldes Bence Jones Protein (BJP)(11). Der findes analysemetoder til bestemmelse af frie lette kæder i serum, men da bestemmelse af BJP indgår i responskriterierne, som anvendes til vurdering af behandlingseffekten, kan analyse af frie lette kæder i serum ikke erstatte analyse af BJP(2). M-komponentens betydning Analyse af M-komponenter sker oftest i forbindelse med diagnostik og monitorering af myelomatose, men andre sygdomme, som lymfomer og kronisk lymfatisk leukæmi, kan ligeledes føre til dannelse af M-komponenter(7). Proteinet kan findes i blodet hos ældre mennesker og patienter med MGUS (monoklonal gammopathy of undifined signifikance), uden at være tegn på en malign tilstand (7,10). Symptomer på myelomatose er forskellige fra patient til patient, men omfatter hyppigt nyreinsufficiens, anæmi, nedsat immunforsvar og øget infektionstendens, samt knoglesmerter og øget tendens til frakturer, som følge af knoglevævsnedbrydning(12). M-komponenten selv har i mange tilfælde ingen skadelig effekt, og koncentrationen af M-komponenten i blod og urin måles primært for at følge sygdommens udvikling. M-komponenten kan dog aflejres i organer, hvilket kan føre til organernes funktionsnedsættelse. Nedsat nyrefunktion ses især 9

14 hyppigt hos patienter med letkæde-myelomatose. Det øgede proteinindhold i blodet kan endvidere føre til hyperviscositet og deraf følgende nedsat strømningsevne og ilttransport, mens kryoglobulinæmi ses ved M-komponenter af IgM-typen, hvor kuldeagglutination fører til dannelse af blodpropper i perifere kar(10). Diagnostik I Sundhedsstyrelsens pakkeforløb for myelomatose(13) beskrives patientforløbet fra mistanke om myelomatose opstår, over diagnostik og behandling, til opfølgning og rehabilitering. Ved mistanke om myelomatose rekvirerer den praktiserende læge en række biokemiske og hæmatologiske analyser af blod og urin, heriblandt analyser for påvisning af M-komponent. Ved begrundet mistanke henvises patienten til Hæmatologisk Afdeling, hvor yderligere udredning sker ved tværfagligt samarbejde, som beskrevet i de nationale retningslinjer fra Dansk Myelomatose Studie Gruppe (2,13). Indledende undersøgelser omfatter bl.a. biokemisk analyse af blod og urin(13). De danske retningslinjer for diagnostik og behandling bygger på anbefalinger fra The International Myeloma Working Group. Denne internationale gruppe af næsten 200 forskere(14), har udarbejdet en række diagnostiske kriterier og kriterier til stadieinddeling. De diagnostiske kriterier omfatter bl.a. påvisning af M-komponent i serum og/eller urin(2). Hvis der påvises en M-komponent i serum eller urinprøve, typebestemmes og kvantiteres M-komponenten(6). Ved kvantitering af M-komponenten i urin foretages undersøgelsen på døgnurin, og udskillelse af M-komponenten i g/døgn beregnes. 10

15 Kvantiteringen anvendes primært til vurdering af sygdommens progression og effekt af behandlinger(2,10). Behandling Der findes ingen kurativ behandling af myelomatose. Formålet med den nuværende behandlingen er at opnå remission, en dvaletilstand, hvor sygdommen ikke er aktiv. Den cytoreduktive behandling omfatter bl.a. højdosis kemoterapi og evt. stråleterapi i kombination med autolog stamcelletransplantation. Derudover anvendes forskellige lægemidler til understøttende behandling og profylakse af knoglesygdom(2,13). De nyeste lægemidler til behandling af myelomatose består af monoklonale antistoffer, rettet mod antigener på myelomcellerne. Det første lægemiddel af denne type, Elotuzumab, blev godkendt til anvendelse i foråret 2016, mens et andet lægemiddel, Daratumumab er under afprøvning(15 17). Måling af M-komponenten er én af de vigtigste parametre i vurdering af behandlingseffekten(2). Den procentuelle og absolutte ændring i M-komponenten anvendes til at definere graden af opnået respons. Responskriterierne, udarbejdet af The International Myeloma Working Group beskriver at den komplette respons bl.a. omfatter en negativ immunfixation på serum- og urin. Det gode partielle respons defineres bl.a. ved urin M-komponent under 0,1 g/døgn, mens det partielle respons bl.a. defineres ved 90% reduktion i urin M-komponent eller urin M-komponent under 0,2 g/døgn(2). Myelomatosepatienter i remission monitoreres med M-komponent kvantitering i blod og urin hver 3. måned for hurtigt at opfange aktiv sygdom, mens patienter med aktiv sygdom monitoreres med M-komponent kontrol hver uge(18). 11

16 Analysemetoder til påvisning af M-komponenter i urin Til kvantitering af M-komponenter i urin bør døgnurin anvendes som prøvemateriale(6). Kvantitering kan foretages vha. kapillærelektroforese eller gelelektroforese, mens typebestemmelse sker ved immunsubstraktion og kapillærelektroforese eller ved immunfixation i kombination med gelelektroforese(19 22). De nævnte metoder kan udføres ved anvendelse af forskelligt apparatur, forskellige reagenser og geler og under forskellige forhold for migration mm. I det følgende beskrives metoderne, som de er anvendt i dette projekt. Kapillærzoneelektroforese Ved kapillærelektroforese separeres proteiner ud fra deres størrelse og ladning(23). I dette projekt er anvendt kapillærzoneelektroforese (CZ), på Capillarys2 (Sebia). Capillarys2 er fuldautomatisk, men analysen af urin kræver prøveforbehandling, som eliminerer interferens fra lægemidler og salte og op koncentrerer prøven, hvilket øger analysens sensitivitet. Prøveforbehandlingen består af en dialysering ved blanding af 2 ml urin og en basisk dialysebuffer, i et dialysesystem (fig. 2). Fig. 2: Tv. Dialysesystem fra Sebia. Midt & th. dialysesystem uden bundstykke, brønden med omgivende PES membran ses som den hvide fordybning midt i glasset. (F2) 12

17 EOF Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Bufferens ph på 9,9 er højere end de fleste proteiners isoelektriske punkt (pi), hvorfor proteinerne vil blive negativt ladet. Dialysesystemet består af et centrifugeglas i to dele, der er adskilt af en prøvebrønd omgivet af en polyethersulfon-membran (PESmembran) (fig. 2) (19,24 26). Ved centrifugering presses opløsningen igennem membranen. Pga. membranens porestørrelse tilbageholdes proteiner i brønden, mens salte og lægemidler trænger igennem membranen(24). Proteinerne i brønden opløses i 400 µl buffer og opløsningen overføres til hang-in tubes og sættes i racks på Capillarys2(19). Capillarys2 har 8 parallelle kapillærer og kan derfor analysere 8 prøver ad gangen. Kapillærene består af silica, er 17,5 cm lange og har en indre diameter på omkring 25 µm(24). Under elektroforesen virker kapillærenes silica-væg som den faste fase, mens væskefasen består af buffer med ph 9,9. Kapillærene fyldes med bufferen, hvorefter der påsættes en konstant spænding på 5000 V. Prøvemateriale injiceres i kapillærets anode-ende. I kapillæret påvirkes proteinerne af to kræfter: det elektro-osmotiske flow og katode ( - ) deres elektriske mobilitet(19,27). Det elektroosmotiske flow (fig. 3) er den dominerende kraft ved CZ. Det opstår pga. silica-vægens silanolgrupper (Si-O-H), som let dissocierer i den basiske buffer, så der blotlægges negativt ladede grupper (Si-O - ) på kapillærets væg. Kationer i bufferen danner et dobbelt lag på den negativt ladede kapillærvæg, idet ét lag kationer tiltrækkes kraftigt af de negative grupper og danner et anode ( + ) Fig. 3: Det elektroosmotiske flow (EOF) opstår ved dannelse af et dobbelt lag af kationer på den negativt ladede kapillærvæg. (F3) 13

18 stabilt lag på væggen, mens overliggende kationers tiltrækning er svagere pga. den øgede afstand til væggen. Det overliggende mobile lag tiltrækkes af katoden i kapillærets ende. Kationernes bevægelse mod katoden trækker væsken i midten af kapillæret med. Det elektroosmotiske flow trækker således alle proteiner i kapillæret mod katoden(19,27). Proteinerne bremses i deres bevægelse mod katoden af deres elektriske mobilitet, som afhænger af forholdet mellem deres ladning og størrelse. Ved bufferens ph (9,9) er proteiner negativt ladet og tiltrækkes af anoden. Idet deres ladning er forskellig, tiltrækkes de i forskellig grad. Derudover bremses de, afhængigt af deres størrelse, i forskellig grad af friktion. Svagt ladede og små proteiner tilbageholdes dermed mindre af anodetiltrækning samt friktion, og migrerer derfor hurtigere igennem kapillæret end kraftigt ladede og store proteiner(19,24,27). Da albumin er et forholdsvist stort protein (66 kd)(7), og med pi på 5,1(28) er kraftigt negativt ladet ved bufferens ph (ph 9,9), vil albumins migration bremses kraftigt af de elektriske kræfter, hvorfor proteinet migrerer langsomt mod katoden. BJP, er små molekyler (23 kd), der med pi omkring 8,6 er svagt ladet. BJP tilbageholdes dermed næsten ikke og migrerer hurtigt igennem kapillæret. Komplette Ig har ligeledes høj pi og migrerer hurtigt igennem kapillæret(19,24,27). Proteinerne opdeles under migrationen i 12 fraktioner, der migrere i fem zoner. Zonerne benævnes gamma-, beta-, alpha2-, alpha1- og albumin. Proteiner, der migrerer i gammazonen detekteres først ved katoden, mens proteiner i albuminzonen detekteres sidst. Immunglobuliner og BJP migrerer oftest i gama- eller evt. 14

19 absorbans absorbans Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt betazonen. Ved katoden detekteres proteinerne direkte ved absorbansmåling ved 200 nm(19,24,27). Absorbansmåling foretages ved afsendelse af monokromatisk lys fra en lyskilde i retning mod en detektor. Lyset absorberes af proteinerne når de passerer detektoren. Absorbansen (A) beregnes ved: A = log ( I I 0 ) (formel 1) (29) Hvor I0 er intensiteten af det detekterede lys uden prøvemateriale i kapillæret, mens I er intensiteten af lyset når prøvematerialet passerer detektoren(29). Ud fra signalet ved absorbansmålingen dannes, ved anvendelse af programmet Phoresis, et elektroferogram (fig. 4). Elektroferogrammet viser således den detekterede absorbans som funktion af tiden(23,24,30). Tolkning af elektroferogrammet beskrives i senere afsnit. tid tid Fig. 4: Elektroferogrammer af samme urin analyseret på Capillarys (tv.) og Hydrasys (th.) (eksempel fra projektets resultater). 15

20 Kvalitetskontrol på Capillarys2 udføres ved analyse af normalkontrol fra Sebia forud for prøveanalysering. Kontrollen, en normal serumprøve, analyseres på alle 8 kapillærer, hvorefter elektroferogrammerne sammenlignes ved visuel inspektion. For at sikre ensartet detektion i alle kapillærer kræves ensartede kurveforløb ved kontrolmålingen. Kontrolmålingerne anvendes endvidere til automatisk indstilling af elektroferogrammets 5 zoner(19,24). Ved analyse medtages en positiv urin kontrol ( Vejle urinkontrol )(19,31). Gelelektroforese Ved gelelektroforesen (AGE) separeres proteiner også på baggrund af forskelle i ladning og størrelse. Til AGE anvendes Hydrasys2 scan fra Sebia, som er et semiautomatisk system, der ikke kræver prøveforbehandling og som kan analysere 14 prøver (+kontrol) pr. gel. 10 µl urin afpippeteres til en applikatorkam, som sættes i fugtkammer i 5 min til prøven er diffunderet ud i kammens tænder. En agarosegel med ph 8,8 lægges i migrationskammeret. To buffer-strips sættes på elektrodeholderen. Elektrodeholderen og applikatorholderen sænkes og applikatorkammen sættes i applikator-holderen (fig. 5)(21). Ved start af migrationsprogrammet 7/15 HR sænkes bufferstripsene ned, øverst og nederst C D B A C på gelen. Bufferstripsene er i kontakt med hver sin elektrode. Der påsættes en spænding på C C 225 V, som via bufferstripsene overføres til gelen. Kammen sænkes ned på gelen så prøvematerialet overføres til gelen i Fig. 5: Migrationskammer i Hydrasys2. A: applikatorkam. B: bufferstrip i anodeenden. C: elektrodeholder. D: agarosegel (F4) 16

21 katodeenden. Ved valg af migrationsprogrammet 7/15 HR udføres migration ved 20 C i ca. 10 min., hvorefter gelen tørres ved 60 o C i ca. 9 min(21). Ved AGE påvirkes proteinerne primært af elektriske kræfter. Da de fleste proteiner er negativt ladede ved ph 8,8 vil de migrere mod anoden. Som tidligere beskrevet har albumin lavere pi end Ig og BJP. Albumin er derfor kraftigt negativt ladet og migrerer hurtigt mod anoden. Ig og BJP er, pga. deres høje pi næsten uden ladning ved ph 8,8, hvorfor tiltrækningen til anoden er meget svag. Da gelen indeholder ioner, opstår det endoosmotiske flow også ved AGE, dog i mindre grad end ved CZ. Det endoosmotiske flow bremser proteinerne i deres migration mod anoden. I BJP og immunglobuliners tilfælde er påvirkningen af det endoosmotiske flow kraftigere end deres elektriske mobilitet, hvorfor de migrere mod katoden. Det endoosmotiske flow øger dermed separationen af proteinerne(21,24,32). For at sikre at migrationen har fundet sted medtages Vejle urinkontrol på hver gel(21). Efter migration og tørring farves gelen i apparaturets farvemodul med Acid Violet (ph 2,0). Farvens ph er under proteinernes pi, hvorfor proteinerne er positivt ladede og binder det negativt ladede anionfarvestof(21,32,33). Efter farvningen affarves gelen med affarvevæske og tørres. Farvning, affarvning og tørring varer ca. 20 min. De migrerede proteiner fremstår som farvede, adskilte bånd på gelen (fig. 6), som scannes densiometrisk i apparaturets scannermodul(21,32). 17

22 absorbans Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Fig. 6: Resultater af gelelektroforese på Hydrasys2. Tv. færdig gel med prøve afsat i spor 1-3. Th. færdig gel i migrationsmodulet. Pilen viser bånd i gammafraktionen, proteinerne er migreret i anoderetningen(f5). Nederst th. ses elektroferogrammet fra samme prøve (resultat fra projektet). tid Den densiometriske scanning foregår i princippet som den tidligere beskrevne fotometriske detektion. I dette tilfælde transmitteres lys igennem gelen og absorberes i større eller mindre grad afhængigt af båndenes densitet(34). Ved hjælp af Phoresis software dannes et elektroferogram, med den detekterede absorbans som funktion af tiden (migrations-strækningen). For hvert bånd i gelen dannes en top i elektroferogrammet. M-komponenter migrere typisk i gammafraktionen og vil dermed danne bånd nederst på gelen(21). 18

23 absorbans absorbans absorbans absorbans Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Kvantitering af M-komponenten Kvantiteringen af M-komponenten foretages vha. elektroferogrammet. Fig. 7 viser elektroferogrammer fra en normal urin (A) og tre uriner med M-komponenter (B,C,D). Som beskrevet viser elektroferogrammerne absorbansen som funktion af tid. Arealet under kurven svarer dermed til den samlede mængde protein der detekteres i prøven. Da migrationen er baseret på proteinernes ladning og størrelse vil ens proteiner migrere samlet og detekteres samlet. Idet M-komponenter er monoklonale proteiner, er deres struktur, ladning og størrelse identisk, hvorfor de migrerer samlet. M-komponenten vil derfor danne en top i elektroferogrammet, typisk i gamma- eller betafraktionen(19,24,30). tid tid tid Fig. 7: Elektroferogrammer dannet ved analyse af urin på Capillarys2. (Resultater fra projektet) A: normal urin med meget lidt proteinindhold. B: urin med M-komponent i gammafraktionen. C: urin med meget albumin, flere andre proteiner i alpha- og betafraktioner og M-komponent i gammafraktionen. D: urin med lidt albumin og stor M- komponent i beta-/gammafraktionen. tid 19

24 Ved at integrere arealet af signalet under toppen (peak integration) og sammenholde det med det integrerede areal under hele kurven beregner Phoresis hvor stor en andel (peak %) af prøvens totale proteinindhold der udgøres af M-komponenten. Via måling af prøvens totale proteinindhold på Cobas 8000 kan peak % værdien omregnes til en absolut koncentration(19,30,35). M-komponentens koncentration pr. døgn kan, ved analyse af korrekt opsamlet døgnurin med angivet diurese, beregnes som følger: M komp. konc. pr. døgn ( g g ) = M komp. fraktion (%) proteinkonc. pr. døgn ( 24h 24h ) (formel 2) hvor proteinkoncentrationen pr. døgn beregnes ved: proteinkonc. pr. døgn ( g ) = proteinkonc. 24h (g L ) diurese ( ) (formel 3) L 24h Typebestemmelse af M-komponenten Særligt M-komponenter med lav koncentration kan være vanskelige at genfinde i elektroferogrammet. Her kan en typebestemmelse af M-komponenten ofte hjælpe til at afgøre om der er en M-komponent i prøven og evt. hjælpe til vurdering af hvilken top den udgør. Typebestemmelse af M-komponenten er dermed ofte en nødvendighed for korrekt kvantitering. Typebestemmelsen kan foretages ved immunsubstraktion (IS) på Capillarys2 eller ved immunfixation (IF) på Hydrasys2(19,20). Ved IS på Capillarys2 analyseres én prøve ad gangen. Analyse foretages på dialysat (som anvendt ved CZ), som af apparaturet overføres til 6 brønde i et fortyndingssegment, hvoraf 5 brønde indeholder specifikke antistoffer. Efter inkubering foretages CZ. De anvendte antistoffer er: anti-igg, anti-iga, anti-igm, anti-kappa (fri og bundet) og anti-lambda (fri og bundet). I den brønd, hvor antistoffet 20

25 absorbans absorbans absorbans absorbans absorbans absorbans Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt er rettet mod M-komponent typen vil antistof og M-komponent agglutinere og komplekserne sedimenteres. M-komponenten vil dermed ikke detekteres og toppen vil mangle i elektroferogrammet. M-komponent typen kan dermed bestemmes ud fra sammenligning af elektroferogrammerne (fig. 8) (20). tid tid tid tid tid tid Fig. 8: Resultat af immunsubstraktion og kapillærelektroforese på urin med M-komponent af fri lambda type. Referencekurve (sort) lægges over andre elektroferogrammer fremkommet ved CZ af prøve tilsat antistoffer (blå). M-komponenttypen kan bestemmes til M-komponent af fri lambda type, idet toppen (blå) forsvinder ved tilsætning af anti-lambda (L), mens M-komponent toppen (blå) stadig ses ved tilsætning af anti-kappa (K), anti-igg (IgG), anti-iga (IgA) og anti IgM (IgM) (F6). 21

26 Ved IF på Hydrays2 udføres AGE, som tidligere beskrevet. Dog analyseres maximalt fire prøver pr. gel ved anvendelse af to applikatorkamme. Den samme prøve påsættes i 6 på hinanden følgende brønde og migrationsprogram 2/4 BJ-up SM/SM vælges. Efter migration og tørring af gelen og inden farvning, lægges en applikatorskabelon på gelen, og antisera påføres, hvorefter det vil fordeles i migrationsbanen. På bane 1 påsættes fixativ uden antistof, mens de resterende 5 baner påsættes ét antistof hver. Anvendte antistoffer er: blanding af anti-igg, -A og -M; anti-kappa (frit og bundet), anti-lambda (frit og bundet), anti-kappa (frit) og anti-lambda (frit). Antistofferne inkuberer i 10 min., hvorefter overskydende antisera opsuges med en filterpapirskam. Antistoffer rettet mod M-komponenten danner komplekser med proteinet, som sedimenteres i gelen. Der lægges filterpapir på gelen, og ubundet protein blottes til papiret. Gelens første bane virker som kontrol, idet denne er behandlet med fixativ, og alle proteiner dermed vil være bundet i gelen. I de resterende baner vil der dannes bånd i de baner der har tilsat antistof rettet mod M-komponenten. Efter tørring og farvning med Acid Violet fremgår M-komponent-typen af båndene i gelen (fig. 9)(20). Fig. 9: Resultat af IF og AGE af urin med M- komponent af fri kappa type. ELP: reference tilsat buffer; GAM: tilsat anti-g, - A, -M; K: tilsat anit-kappa (frit og bundet); L: tilsat anti-lambda (frit og bundet); K 1: tilsat anti-kappa (frit); L 1: tilsat anti-lambda (frit). (Eksempel fra projektets resultater) 22

27 2. Materialer og metode I dette afsnit beskrives projektets design, kriterier for valg af prøvemateriale til projektet gennemgås og prøvematerialets indsamling og opbevaring beskrives. Anvendte apparaturer, utensilier og reagenser oplistes og de anvendte metoder beskrives Design Projektet består af en metodesammenligning af M-komponent kvantitering på Hydrasys2 Scan og Capillarys2. Analysearbejdet er udført på Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus i perioden til og består af 5 delforsøg: 1) Analyse af internt kontrolmateriale Til vurdering af repeterbarhed foretages gentagen analyse af Vejle urinkontrol på Hydrasys2. Resultaterne sammenlignes med afdelingens resultater for kontrolmåling på Capillarys2. 2) Analyse af patientprøver Metodernes analysekvaliteten vurderes ved parallelanalyse af 21 patientprøver. Der medtages 19 prøver med kendt M-komponent og 2 negative prøver. Analyser foretages i dobbeltbestemmelse. 3) Dialyseforsøg I forbindelse med analyse af patientprøverne undersøges dialysebehandlingens effekt på analysekvaliteten ved at dialysatet analyseres på begge apparaturer. 23

28 4) Fortyndingsforsøg I forbindelse med vurdering af behandlingseffekten er det vigtigt at kunne detektere M-komponenter på hhv. 0,1 og 0,2 g/døgn og en reduktion i M- komponentkoncentration på 90%, idet disse grænser anvendes til beskrivelse af partiel respons og god partiel respons(2) (se afsnit behandling ). For at afgøre om metoderne kan detektere M-komponenter ved nævnte koncentrationer foretages fortyndingsforsøg. En prøve med en M-komponent med høj koncentration fortyndes med en prøve uden M-komponent. Der fremstilles en 90% fortynding, en fortynding på 0,1 g/døgn og en på 0,2 g/døgn. Fortyndingerne analyseres med begge metoder. 5) Analyse af eksternt prøvemateriale Idet der ikke fremstilles eksternt kontrolmateriale til kvantitering af M- komponenter i urin(24), anvendes to patientprøver, der er kvantiteret på Roskilde Sygehus, som ekstern kontrol. Prøverne analysere med begge metoder Materialer Prøvemateriale Til tre af delforsøgene er anvendt prøvemateriale indsamlet blandt patientprøver på Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus. Prøverne er modtaget til kvantitering af M- komponenter i perioden fra den til den Prøver til projektet er udvalgt ved hjælp af følgende diskriminationskriterier: Prøven skal være korrekt opsamlet døgnurin, med angivelse af opsamlingstid og diurese. 24

29 Der skal være foretaget kvantitering og typebestemmelse af M-komponenten. Prøven skal være færdiganalyseret, og der skal være afgivet svar til rekvirenten. Restmateriale efter analyse til diagnostik skal være minimum 4,5 ml. 20 af de indsamlede prøver med kvantiterbar M-komponent overholdt diskriminationskriterierne og er dermed inkluderet i projektet. Derudover er anvendt 3 prøver uden M-komponent. Til analyse af patientprøver er 19 positive og 2 negative prøver anvendt. Prøverne stammer fra patienter i alderen år (x 65 år) og fordeler sig næsten ligeligt mellem kvinder (n=10) og mænd (n=11). Til fortyndingsforsøget er prøven med den højeste M-komponent-koncentration (0,7 g/24h) og en negativ prøve anvendt. Samtlige prøver er indsamlet af bioanalytikere i Palme-afsnittet på Biokemisk Afdeling og er efter analyse til diagnostik opbevaret ved -80 C o. Inden anvendelse i projektet er prøverne optøet ved 4 C o. Til analyse af eksternt prøvemateriale er anvendt 2 døgnuriner, modtaget og analyseret på Biokemisk Afdeling, Roskilde Sygehus. Prøverne er sendt med posten til Vejle Sygehus, og efter modtagelse opbevaret ved 4C o i to døgn inden analyse. Til analyse af kontrolmateriale er anvendt en intern kontrol i form af Vejle urinkontrol. Kontrollen er fremstillet på Vejle Sygehus, ved fortynding og udfraktionering af en patientprøve. 25

30 2.2.2 Apparatur, reagenser og utensilier Prøvematerialet er analyseret på Hydrasys2 Scan og Capillarys2, begge produceret af Sebia. Til analyse på Hydrasys2 er anvendt Hydragel HR 15 kit til kvantitering og Hydragel Bence Jones kit (Sebia), samt antisera og fixativer til immunfiksation (Sebia). Kvantificering er foretaget med softwaren Phoresis vers Endeligt er der foretaget totalproteinmåling på Cobas En komplet oversigt over anvendt apparatur og utensilier kan ses i tabel 1, mens anvendte reagenser, geler og kontroller kan ses i tabel 2. Tabel 1: Oversigt over anvendt apparatur og utensilier Apparatur Utensilier Hydrasys 2 scan (Sebia) Capillarys 2 PC med Phoresis software Cobas 8000 Centrifuge Rotixa 50RS (Hettich Zentrifugen) MS1 minishaker (Bie & Berntsen AS) Dialysesystem med MWCO PES membran(sebia) lot /01 Filterpapercomb (Sebia) Capillarys filter lot. 1776A Dilution segments (Sebia) prøveglas hang-in cups automatpipetter (Thermo Scientific) & pipettespidser Hitachi-cups 26

31 Tabel 2 : Oversigt over anvendte reagenser, geler og kontrolmateriale Reagenser og geler Anvendt med Hydrasys2 Scan Kit: Hydragel 15 HR (Sebia) lot /01 Indeholder: Hydragel 15 HR gel Hydragel bufferstrips applikatorkam filterpapir HR Acid Violet opl: 75 ml ml milliporevand Kit: Hydragel 2 Bence Jones (Sebia) lot /01 Indeholder: Hydragel Bence Jones 2/4 gel Hydragel Immunfixation bufferstrips applikatorkam filterpapir Antisera and fixative (GAM,k,l) Immunfixation (Sebia) lot /01 Indeholder: Fixative solution Ig anti-human IgGAM Ig anti-human kappa Ig anti-human lambda Antisera K/L free light chains immunofixation (Sebia) lot /01 Indeholder: Ig anti-human kappa free Ig anti-human lambda free Destaining Solution (Sebia) lot /01 opl.: 5 ml destain + 5 L milliporevand Capillarys/minicap Wash solution (Sebia) lot /01 opl.: 5ml Wash solution + 5 L milliporevand Milliporevand Anvendt med Capillarys2 Capillarys Protein(e)6 buffer lot /01 Capillarys/minicap Wash solution (Sebia) lot /01 opl.: 1 ml Wash solution + 1 L milliporevand Capillarys/minicap urine Dialysis buffer (Sebia) lot /03 opl. 480 ml dialysebuffer ml milliporevand Millipore vand Anvendt til fremstilling af fortyndinger Bovine Serum Albumin A3059 (Sigma) lot. SLBP1123V Milliporevand Kontrolmateriale Normalkontrol (Sebia) lot /01 fortyndes 1:40 med NACL + 0,9% Vejle urinkontrol lot

32 2.3. Juridiske og etiske overvejelser Forud for projektet er mulige etiske og juridiske problemstillinger overvejet. Relevante problematikker opstår især i forhold til anvendelse og opbevaring af patientmateriale og indhentning af personfølsomme oplysninger. Idet der anvendes patientprøver, skal der tages hensyn til, at resultater til diagnostik ikke påvirkes af projektet. Af den grund er der udelukkende anvendt restmateriale af færdiganalyserede prøver hvor svar til rekvirenten er afgivet. Analysearbejdet er foretaget på tidspunkter hvor afdelingen ikke anvender apparaturet, så den daglige drift ikke forstyrres, og svar på patientprøver ikke forsinkes unødigt. Da der udelukkende anvendes prøver, som er analyseret for forekomst af en M- komponent og projektets analyser kun kan resultere i fund af M-komponenter, er der ingen risiko for tilfældighedsfund. Hvis projektets kvantitering af M-komponenten viser andre resultater end den oprindelige kvantitering til diagnostik, vil det ikke føre til handling, da projektets resultater kan være fejlbehæftede s.f.a. prøveopbevaring. Ved indsamling og opbevaring af prøver er der i dette tilfælde ikke tale om oprettelse af en biobank, idet opbevaring ikke sker ud over perioden der kræves til indsamling og analyse, og prøverne destrueres umiddelbart efter endt analyse. Lovgivning om oprettelse og anmeldepligt for biobanker skal derfor ikke overholdes (36). I forbindelse med projektet er oplysninger om patienternes alder og køn og tidligere analyseresultater indhentet. Der er desuden indhentet oplysninger i blodbankens database ( Prosang ), om registrering af behandling med lægemidlet 28

33 Daratumumab. Derudover gælder opbevaring og analyse af biologisk materiale også som indhentning af oplysninger og omfattes dermed af persondataloven. Persondatalovens 5 siger at oplysninger skal behandles i overensstemmelse med god data-behandlingsskik (37) og beskriver i stk. 2. at: "Indsamling af oplysninger skal ske til udtrykkeligt angivne og saglige formål, og senere behandling må ikke være uforenelig med disse formål. Senere behandling af oplysninger, der alene sker i historisk, statistisk eller videnskabeligt øjemed, anses ikke for uforenelig med de formål, hvortil oplysningerne er indsamlet. (37) Idet vi anvender oplysningerne i videnskabeligt øjemed er indsamling af oplysninger dermed tillad,t i forhold til persondatalovens 5.stk2. I 5 stk. 3 begrænses denne tilladelse til at oplysningerne ikke må omfatte mere end hvad der kræves for at opfylde formålet for deres indsamling(37). Idet der udelukkende indhentes oplysninger om forhold der er nødvendige for at opfylde projektets formål, overholdes 5 stk. 3 ligeledes. Persondataloven beskriver også krav til anonymisering af prøvematerialet. Ifølge 5 stk. 5. må indsamlede oplysninger ikke opbevares på en måde, der giver mulighed for at identificere den registrerede i et længere tidsrum end det, der er nødvendigt af hensyn til de formål, hvortil oplysningerne behandles. (37) Prøverne skal dermed anonymiseres, så snart det er muligt. For at overholde dette krav er prøvernes glasnummer slettet umiddelbart efter analyse af prøverne er afsluttet, og nødvendige informationer om patienten er indhentet. Prøverne er i stedet tildelt et projektnummer, som ikke kan føres tilbage til patienten. 29

34 Projektet er ikke meldt til videnskabsetisk komitétilsyn. Anmeldelse vurderes ikke at være nødvendig, idet den Nationale Videnskabsetiske Komité angiver at kvalitetsudviklingsprojekter eller kvalitetskontrol og projekter der anvender anonymiserede prøver, ikke skal anmeldes(38,39) Metode Dette afsnit beskriver indsamling af data, anvendte metoder og praktisk udførsel af projektet. Projektet består af flere undersøgelser, hvori forbehandling af prøver og anvendelse af apparatur gentages. Derfor indledes med en generel beskrivelse af fremgangsmåde ved analyse på hhv. Hydrasys2 og Capillarys2, hvorefter de enkelte undersøgelser gennemgås Dataindsamling i BCC, Phoresis og kontrolskema Resultater for patientprøvernes proteinkoncentration (P-U) målt på Cobas 8000 og beregnede proteinkoncentration pr. døgn (P-DU) er fundet ved opslag af glasnummeret i BCC (program anvendt på KIBA til prøverekvirering og svarafgivelse). Oplysninger om P-U er anvendt til prøveforberedelse ved analyse på Capillarys2 og til fortyndingsforsøg, mens oplysninger om P-DU er anvendt ved kvantitering. De oprindelige elektroferogrammer, kvantiteringer og typebestemmelser er fundet ved opslag i Phoresis og er anvendt til vurdering af hvordan arealet under kurven bør markeres ved kvantitering af M-komponenterne i projektet. Oplysninger om Vejle urin kontrol og resultater af kontrolanalyse på Capillarys2 er indhentet fra afdelingens kontrolskema og anvendes til sammenligningsgrundlag ved analyse af kontrolmateriale på Hydrasys2. 30

35 Hydrasys2 analyse, kvantitering og kvalitetssikring Alle analyser foretaget på Hydrasys2 er udført som beskrevet i instruksen: Hydrasys2 (Hydragel 15 HR); Urin M-komponent, betjeningsvejledning (21). Prøve- og kontrolmateriale blev blandet grundigt med vortexmixer og 10 µl prøveeller kontrolmateriale blev afpippeteret til hver af de 15 brønde på applikatorkammen. Applikatorkammen blev placeret i fugtkammer i 5 min. 200 µl milliporevand blev påført bundpladen i migrationsmodulet. Efter aftørring af overskydende fugt på agarosegelen (Hydragel 15HR), blev denne rullet ud i migrationskammeret. Applikatorkammen blev placeret i applikatorholderens position 5 og migration foretaget ved 225 V og 20 C o i 10 min. Herefter blev gelen tørret i 20 min ved 60 C o og efterfølgende farvet med Acid Violet, affarvet og tørret. Gelen blev scannet i Hydrasys2 scanning-modul og elektroferogrammet kvantiteret i Phoresis (21). Til kvalitetssikringsformål blev på hver gel medtaget en positiv kontrol i form af Vejle urinkontrol Capillarys analyse, kvantitering og kvalitetssikring Alle analyser foretaget på Capillarys2 er udført som beskrevet i Capillarys betjeningsvejledning (19). Prøve- og kontrolmateriale blev blandet grundigt med vortexmixer og efterfølgende centrifugeret i 10 min. ved 4300 g og 20 C o. Herefter blev 2 ml prøvemateriale og 18 ml milliporevand afpippeteret til et dialysesystem, blandet og centrifugeret i 40 min. ved 4000 g. Prøvematerialet i dialysesystemets brønd blev efter centrifugering suppleret med milliporevand til et volumen på 0,5 ml og opløsningen blandet ved at 31

36 vippe dialysesystemet fra side til side. Herefter blev suppleret til 20 ml med dialysebuffer og dialysesystemet centrifugeret i 40 min. ved 4000 g uden forudgående blanding. Efter centrifugering blev 400 ml fortyndet dialysebuffer tilsat i brønden og opløsningen blandet ved at vippe dialysesystemet. Prøven blev afpippeteret til hangin cups, placeret i afpippeteringsrør, mærket med barcode (prøvenummer). Prøverne henstod i 15 min og blev herefter analyseret på Capillarys2. Migration blev foretaget ved 5000 V og 35,5 o C (ved anvendelse af URIN -programmet) (19,24). Resultatet blev overført til Phoresis. Forud for analyse blev alle 8 kapillærer kontrolleret ved analyse af normalkontrol (Sebia) og visuel vurdering af elektroferogrammernes ensartethed. I hver analyseserie blev medtaget positiv kontrol i form af Vejle urinkontrol Analyse af intern kontrol I delforsøget analyse af intern kontrol er Vejle urinkontrol analyseret på Hydrasys2. Vejle urinkontrol og normal kontrol (Sebia) er optøet natten over ved 4C o og blandet grundigt med vortexmixer. Vejle urinkontrol er overført til applikatorkammens brønd 1-14 og normalkontrol til brønd 15. Kontrollerne er analyseret på Hydrasys2 og kvantitering foretaget af begge bioanalytikerstuderende, uafhængigt af hinanden Analyse af patientprøver 21 patientprøver, heraf 19 med og 2 uden M-komponent, er analyseret på både Hydrasys2 og Capillarys2. Analysearbejdet er foretaget over 2 dage, idet prøve 1-7 er analyseret én dag og prøve 8-21 på anden dagen. Patientprøverne og Vejle urinkontrol er optøet natten over ved 4 C o og blandet med vortexmixer. 32

37 På Hydrasys2 er prøverne analyseret i dobeltbestemmelse, ved afpippetering af samme prøve til to på hinanden følgende brønde på applikatorkammen. Patientprøverne er påsat i brønd 1-14, mens der er afpippeteret Vejle urinkontrol til brønd 15. Det resterende prøve- og kontrolmateriale er efterfølgende centrifugeret og dialysebehandlet. Ved analyse på Capillarys2 er dobbeltbestemmelser foretaget ved to separate dialysebehandlinger og analyser pr. prøve. Som positiv kontrol er Vejle urinkontrol ligeledes dialysebehandlet og analyseret på Capillarys2. For at sikre ensartet bedømmelse er kvantitering af samtlige elektroferogrammer udført af den samme bioanalytikerstuderende, godkendt af den anden studerende og af bioanalytiker Conny L. Duborg. Ved kvantitering af prøverne 13, 15, 20 og 21 opstod tvivl om korrekt tolkning af elektroferogrammet. For at opklare hvilken top der skal kvantiteres, er der på disse prøver foretaget IF på Hydrasys2, som beskrevet i instruksen: Hydrasys 2 (Bence Jones; Immunfix urin), betjeningsvejledning (20) Dialyseforsøg I forbindelse med analyse af patientprøverne er der foretaget yderligere forsøg med analyse af dialysat på Hydrasys2. Efter endt dialysebehandling og inden afpippetering af dialysat til analyse på Capillarys2 er der afpippeteret dialysat af prøverne 1-7 og Vejle urinkontrol til en applikatorkam. Dialysaterne er analyseret i dobbeltbestemmelse på Hydrasys2. Der er ikke udført kvantitering grundet gelens dårlig farvekvalitet. 33

38 Fortyndingsforsøg Fortyndingsforsøget er foretaget ved at fortynde en positiv prøve med en negativ døgnurin. Grundet tidligere beskrevne kriterier for vurdering af behandlingseffekt er tilstræbt fremstilling af 90% fortynding, samt fortynding til hhv. 0,1 g/24h og 0,2 g/24h. Ved de oprindelige målinger til diagnostisk formål har den positive prøve en proteinkoncentration (P-U) på 0,60 g/l og proteinkoncentrationen pr. døgn (P-DU) på 0,90 g/24h. M-komponenten udgør 78,1%, svarende til 0,7 g/24h. For at fortynding ikke fører til ændret forhold mellem proteinkoncentration og M- komponent, skal den negative urin have en P-U på 0,13 g/l. Beregnet ved: P-U negativ urin = (100% - 78,1%) * 0,60 g/l = 0,13 g/l Den negative urinprøve med et proteinindhold nærmest dette krav er en prøve med TP 0,08 g/l og volumen på 7 ml. Dermed er proteinindholdet for lavt og prøvevolumen utilstrækkeligt. For at øge proteinindhold og volumen er der fremstillet en opløsning af milliporevand tilsat bovint serum albumin, hvis proteinkoncentation er bestemt til 5,89 g/l på Cobas Anvendelsen af bovint serum albumin forventes ikke at påvirke resultatet, da proteinerne bør migrere sammen med humant serum albumin, idet de har omtrent samme molekylvægt (bovint: 67 kd; humant: 66 kd)(7,40) og ens pi (pi=5.1)(28). Albumin-opløsningen er gradvist tilsat til den negative urinprøve til et proteinindhold på 0,13 g/l er opnået (bestemt på Cobas 8000). Den negative prøve til fortynding består dermed af 7 ml urin og 3 ml albuminopløsning. 34

39 Herefter er fortyndinger af den positive prøve fremstillet som følger: 90% fortynding: 0,3 ml positiv prøve + 2,7 ml negativ prøve Fortynding til 0,1 g/24h: 0,3 ml positiv prøve + 1,8 ml negativ prøve Fortynding til 0,2 g/24h: 1 ml positiv prøve + 2,5 ml negativ prøve Anvendte voluminer til fortynding er beregnet ved: C før V før = C efter V efter (formel 4) Den ufortyndede positive prøve og de tre fortyndinger er analyseret på Hydrasys2 og Capillarys2. Kvantitering er foretaget af én studerende og godkendt af den anden studerende Analyse af ekstern prøve To patientprøver, kvantiteret på Biokemisk Afdeling Roskilde Sygehus, er analyseret i enkeltbestemmelse på Hydrasys2 og Capillarys2. I begge metoder er medtaget Vejle urinkontrol som positiv kontrol. Kvantitering er foretaget som ved analyse af patientprøver (afsnit 2.4.5) Databearbejdning De fremkomne elektroferogrammer og geler er vurderet visuelt og data fra Phoresis bearbejdet ved anvendelse af Microsoft Excel Resultaterne er sammenlignet ved anvendelse af beregnede værdier, grafisk præsentation og direkte sammenligning af analyseresultater. Ved analyse af kontrolmateriale præsenteres resultater i form af beregnede middelværdier, spredninger og variationskoefficienter, samt grafisk fremstilling i form af kontrolkort. Præsentation af resultater fra analyse af patientprøver sker ved 35

40 grafisk fremstilling i Bland-Altman plot samt x-y plot med anvendelse af lineær regression. Udarbejdelse af qq-plot viste, at data ikke er normalfordelt, hvorfor fundenes statistiske signifikans er vurderet ved anvendelse af Wilcoxon-test. Til beregning af p-værdien er regnemaskine på statnoter.dk (40) anvendt. Dialyseforsøgets resultater præsenteres vha. billeder af gel og elektroferogrammer, mens fortyndingsforsøgets resultater præsenteres ved angivelse af opnåede og forventede måleresultater. Analyseresultater for analyse af eksternt prøvemateriale præsenteres og sammenlignes direkte med analyseresultater oplyst fra Roskilde Sygehus. Variationen imellem resultaterne demonstreres ved angivelse af variationskoefficienter Litteratursøgning Litteratursøgning er indledt med fritekstsøgning på dansk, ved anvendelse af søgemaskinen Google. Søgningerne omfattede begreber som: M-komponent, myelomatose, myelom-celler, patientforening myelomatose, myelomatose forekomst og M-komponent betydning. De fundne oplysninger er udelukkende anvendt til at opnå baggrundsviden om myelomatosens forekomst, ætiologi og patogenese, samt diagnostiske og behandlingsmæssige muligheder. Den opnåede baggrundsviden er anvendt til at lette forståelsen ved tolkning af videnskabelige artikler, samt til at finde oplysninger om patientforeninger og andre organisationer med fokus på sygdommen. Til baggrunds- og teoriafsnit er informationer om myelomatose og M-komponenter indhentet ved søgning på anerkendte danske og internationale patientforeningers hjemmesider. Der er anvendt informationer og artikler fra Dansk 36

41 Myelomatoseforening og International Myeloma Working Group, samt søgt efter relevante oplysninger og referencer på hjemmesiderne fra Kræftens Bekæmpelse og International Myeloma Foundation. Informationer om sygdoms-statistik er indhentet ved opslag i databasen NORDCAN ( Association of the Nordic Cancer Registries ). Oplysninger om retningslinjer for diagnostik og behandling af myelomatose i Danmark er søgt på hjemmesider for Sundhedsstyrelsen, Dansk Myelomatose Studiegruppe og Dansk Selskab for Klinisk Biokemi. Derudover er resultater for prøverundsendelse udført af Dansk Selskab for Klinisk Biokemi og Dansk Myelomatose Studiegruppe indhentet igennem Biokemiker Erik D. Lund fra KIBA, Vejle Sygehus. Oplysninger om nyeste behandlingstilbud indhentet fra Onkologisk tidskskrift og Hæmatologisk tidsskrift og informationer om lægemidlerne fundet i indlægssedler, der er tilgængelige på producenternes hjemmesider. Informationer om apparatur, metoder og analyseprincipper er indhentet i metodeblade og betjeningsvejledninger for apparaturet, samt på Sebia s hjemmeside. Oplysninger om anvendelse af Capillarys2 er fundet på Region Lillebælts infonet, mens oplysninger om anvendelse af Hydrasys2 endnu ikke er frigivet til brug, og derfor er fundet som print i palmeafsnittet på KIBA, Vejle Sygehus. Diverse oplysninger om prøveopbevaring, metodernes præcision og mulig interferens er indhentet i kit-insert for Hydrasys 15HR og Capillarys dialysesystemer. Informationer om analyseapparatur og metoder, der ikke kunne findes i forskrifter og kit-insert er indhentet ved personlig forespørgsel hos Conny Duborg, Bioanalytiker på KIBA Vejle Sygehus og Lars Bendixen, Videnchef hos ILS Danmark. Derudover 37

42 er oplysninger om afdelingens kontrolmålinger på Capillarys2 indhentet fra afdelingens kontrolkort (vedlagt som bilag 1). Litteratur til anvendelse i afsnittet om juridiske og etiske overvejelser er indhentet i Lov om behandling af personoplysninger (fundet på retsinformation.dk) og ved søgning i hjemmesider for Datatilsynet og Den Nationale Videnskabsetiske Komité. Derudover er informationer anvendt i forbindelse med beregninger og statistik indhentet på statnoter.dk. Mens enkelte oplysninger om immunglobuliner, M- komponenter og albumin er fundet i bøger anvendt på Bioanalytikeruddannelsen. Til diskussionsafsnittets behandling af økonomiske aspekter er, via korrespondance, indhentet analysepriser fra Odense Universitetshospital og Aalborg Universitetshospital. Derudover er fundet analysepriser i laboratorievejledningen fra Roskilde Sygehus, samt i intern prisliste fra Vejle Sygehus. Til anvendelse i såvel teoriafsnit, diskussion og perspektivering er anvendt videnskabelige artikler fundet ved søgning i databasen Pubmed. Søgning er foretaget på engelsk, i perioden fra den til den Anvendte artikler fundet på Pubmed eller patientforeningers hjemmesider, er udvalgt efter følgende diskriminationskriterier: Artiklen skal være publiceret på engelsk, dansk, svensk, norsk eller tysk. Hele artiklen skal være tilgængelig (dog er ét abstract anvendt). 38

43 Der medtages primært publikationer fra 1999 eller nyere, da der er sket stor udvikling på området i nyeste tid. CZ har desuden først fundet anvendelse i analyse af urin efter år Ældre artikler accepteres til indhentning af oplysninger om gelelektroforese, da det viser sig vanskeligt, at finde nyere publikationer om emnet og metoden er af ældre dato. Artikler omhandlende M-komponent analyse i urin foretrækkes frem for artikler om analyse af serum. Artikler skal indeholde informationer om analysemetoder, der minder om projektets metoder. Artikler om lignende metoder men foretaget ved anvendelse af andet apparatur eller farvemetode inkluderes. Artikler om gelelektroforese skal omhandle metoder baseret på agarose-gel. Artikler fundet på hjemmesider fra patientforeninger inkluderes kun hvis skribent og/eller redaktion består af fagfolk inden for området, og der er tale om generelt anerkendte patientforeninger. En oversigt over udførte søgninger foretaget i Pubmed, ses i tabel 3: 39

44 Tabel 3: Oversigt over søgninger, foretaget "pubmed" Søgning hits relevante artikler ("Bence Jones Protein/urine"[Mesh]) AND compa* 87 2 ((Bence Jones protein) AND compar*) 19 1 (interference) AND (capillary zone electrophoresis) AND (urine) interfering urine electrophoresis kædesøgning via pubmed forslag dialysis urine electrophoresis (((((analytic sample preparation methods[mesh Terms]) AND capillary zone electrophoresis[mesh Terms]) OR capillary electrophoresis[mesh Terms]) AND urine)) AND Bence Jones protein 8 0 (bence jones protein[mesh Terms]) AND dye 33 0 kædesøgning via pubmed forslag 2 electrophoretic analysis Bence Jones 51 2 (bence jones protein[mesh Terms]) AND dye 33 0 (((elecrophoresis) AND gel) AND acid dye*) AND protein 3 0 (electrophoresis) AND acid violet ((proteinelectrophoresis) AND compar*) AND acid violet 34 1 (acid violet) AND urine 58 0 daratumumab interference electrophoresis 5 0 daratumumab urine interference 0 0 daratumumab urine

45 3. Resultater I dette afsnit præsenteres resultaterne af de udførte forsøg i form af beregnede værdier, tabeller og grafer. Rådata kan ses i bilag Resultater ved analyse af intern kontrol Tabel 4 viser resultater ved gentagen måling af Vejle urinkontrol med target 11,6% (±1,2). Tabel 4: Resultater ved analyse af "Vejle urinkontrol " vurderet af analyseret middelværdi af n over antal SD (%) CV% fraktioner (%) dage Hydrasys2 Mette 15,2 0,5 3, Line 15,3 0,4 2,9 Line ,5 1,0 6,3 Capillarys2 Conny ,7 1,2 11,1 target 11,6 1,2 10,0 Af tabellen fremgår resultater for 14 gentagne målinger i samme serie foretaget i delforsøget analyse af intern kontrol. Peak-integration er foretaget af begge studerende (Line og Mette), uafhængigt af hinanden. Kontrollens værdi bestemmes derved på Hydrasys2 til hhv. 15,2% (±0,5) og 15,3% (±0,4) og analysevariationen (CV) for Hydrasys2 til hhv. 3,3% og 2,9%, afhængigt af hvilken bioanalytiker-studerende der foretager peak-integrationen. Derudover vises seks dages kontrolresultater, fra kontrolanalyse på Hydrasys2 i forbindelse med udførsel af delprojekterne. Her beregnes variationen (CV) til 6,3%. 41

46 M-komponent (peak %) Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Til vurdering af analysevariationen for Capillarys2 er anvendt 20 resultater fra afdelingens ugentlige kontrolmålinger (i perioden ). Alle er kvantiteret af samme bioanalytiker (Conny). Middelværdien af kontrolmålinger på Capillarys2 er 10,7 % (±1,2) og analysevariationen (CV) 11,1%. I fig. 10 vises kontrolresultaterne for analyse af Vejle urinkontrol i et kontrolkort. M-komponent fraktionen ses som funktion af prøvenummer (for Capillarys2 er de seneste 14 kontrolresultater anvendt) og kontrollens target (11,6%), samt ±1SD, ±2SD og ±3SD grænser er vist. I plottet ses at fraktioner målt på Hydrasys2 afviger systematisk og med 2-3 SD fra kontrollens target. Der fremkommer endvidere systematisk højere peak % ved analyse på Hydrasys2 end ved analyse på Capillarys Kontrolkort "Vejle urinkontrol" analyseret på Hydrasys2 og Capillarys Hydrasys2 Capillarys måling nr. Fig. 10: Kontrolkort med M-komponentfraktionen som funktion af antal målinger. Kontrollens target på 11,6% (grå linje) og SD grænser (stiplede linjer) er markeret i plottet. 42

47 peak % værdi Hydrasys2 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Analyseresultater af patientprøver Sammenligning af de ved analyse af patientprøver målte peak % værdier ses i fig. 11. Plottet viser resultater fra Hydrasys2 som funktion af resultater fra Capillarys2. Overensstemmelse mellem Hydrasys2 og Capillarys2 ved analyse af patientprøver y = 0,9603x + 7,4064 R² = 0, peak % værdi Capillarys2 Fig. 11: X-Y plot med peak % værdier af patientprøver målt på Hydrasys2 som funktion af peak % værdier målt på Capillarys2. Det fremgår at der er dårlig overensstemmelse mellem de to metoder (R 2 =0,895) og at Hydrasys2 måler systematisk højere end Capillarys2 (y-intercept=7,406). Ved lineær regression ses en dårlig overensstemmelse mellem metoderne (R 2 = 0,895), samt en systematisk afvigelse, idet peak % værdier målt på Hydrasys2 er systematisk højere end på Capillarys2 (y-intercept = 7,406). Nedenstående Bland-Altman plot (fig. 12) viser differencer mellem måle-resultater ved analyse af patientprøver på Hydrasys2 og Capillarys2. Differencer og middelværdier af målte M-komponenter er beregnet ud fra gennemsnit af de enkelte prøvers dobbeltbestemmelser. 43

48 difference mellem målt peak % Hydrasys2 - Capillarys2 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt I Bland-Altman plottet over differencer af målte peak % (fig. 12) ses at den systematiske afvigelse er op til ca. 30% (peak%) Bland-Altman plot over målte peak % værdier Hydrasys2 vs.capillarys middelværdi af peak % Fig. 12: Bland-Altman plot der viser differencer af målt peak % plottet som funktion af peak %. Det ses at peak % værdien er systematisk højere på Hydrasys2 end på Capillarys2. Forskellen mellem metoderne er vurderet ved anvendelse af Wilcoxon-testen (signifikansniveau: α=0,05) (hypoteser: H0: mediancapillarys2 = medianhydrasys2; H1: mediancapillarys2 medianhydrasys2). Testen viser at forskellen mellem metoderne er statistisk signifikant (p=0,00). Da der ved anvendelse af Wilcoxon ikke må forekomme ties, er 3 prøver med differencer på 0,0 % ikke medtaget i beregningen. To af prøverne er de negative patientprøver og kan derfor naturligt udelades. Den tredje prøve kan slettes, da få ties ifølge statnoter.dk må udelades af beregningen(41). 44

49 difference mellem peak % værdier Hydrasys2-Capillarys2 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Ved at plotte de påviste differencer mellem M-komponentfraktionerne som funktion af prøvernes proteinkoncentration (P-U) ses i fig. 13 at differencerne mellem metoderne er størst ved prøver med lave proteinkoncentrationer. differencer af målte peak % værdier (Hydrasys2-Capillarys2) som funktion af proteinkoncentration (P-U) 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0-5,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9-10,0-15,0-20,0-25,0-30,0-35,0 proteinkoncentration P-U (g/l) Fig. 13: Differencerne mellem peak % værdier, bestemt ved analyse på hhv. Hydrasys2 og Capillarys2, som funktion af prøvernes proteinkoncentration (P-U) Resultater af dialyseforsøg Efter gelelektroforese af dialysat på Hydrasys2 ses ingen tydelige bånd på den færdige gel (fig. 14 tv.) Prøvematerialet ser ud til at være flydt sammen på tværs af sporene i gelen. Ved sammenligning af elektroferogrammet af Vejle urinkontrol, analyseret i dialyseforsøget (fig. 14A) med Vejle urinkontrol analyseret i forbindelse med delforsøget analyse af intern kontrol (Fig. 14B) ses tydeligt ændret kurveforløb, med lavere albumintop, ekstra topdannelse i alpha-/beta- fraktionen og bredere top i gammafraktionen. Da kontrollen ikke kan godkendes og det ved visuel vurdering af 45

50 gelen tyder på at prøverne er blevet blandet, er elektroferogrammerne ikke kvantiteret. absorbans absorbans A B tid tid Fig 14: Tv.: gel efter AGE af dialysat på Hydrasys2. Det ses at båndende flyder ud, og prøverne flyder på tværs af gelens baner. Th.: elektroferogram ved AGE af dialysat af Vejle urinkontrol på Hydrasys2 (A) og normalt elektroferogram ved analyse af Vejle urinkontrol på Hydrasys2 (B). Der ses tydeligt ændret elektroferogram ved analyse af dialysat og kontrollen kan dermed ikke godkendes. (billeder af resultater) 46

51 3.4. Resultater af fortyndingsforsøg Resultaterne af fortyndingsforsøget fremgår af tabel 5. Tabel 5: Resultater ved analyse af fortyndinger på Cobas 8000, Hydrasys2 og Capillarys2 oprindelig pos. prøve 90% fortynding 0,1 g/24h 0,2 g/24h Cobas 8000 Hydrasys2 Capillarys2 Forventet P-U 0,6 0,3 0,2 0,4 P-DU 0,9 0,4 0,3 0,5 fraktion (%) 22,8 33,0 47,2 koncentration (g/24h) 0,1 0,1 0,2 fraktion (%) 78,1 13,4 20,1 36,1 koncentration (g/24h) 0,7 0,1 0,1 0,2 koncentration (g/24h) 0,1 0,1 0,2 Af tabellen fremgår fortyndingernes protein- og M-komponentkoncentrationer, samt oprindelige resultater for kvantiteringen af den positive prøve der fortyndes (oprindelig pos. prøve). Endvidere angives forventede kvantiteter for de tre fortyndinger. M-komponenten i fortyndingerne kvantiteres ved begge metoder til hhv. 0,1 g/24h, 0,1 g/24h og 0,2 g/24h. Fortyndingernes forventede koncentrationer på hhv. 0,1 g/24h 90% fortynding af 0,7g/24h), 0,1 g/24h og 0,2 g/24h kvantiteres dermed korrekt af begge metoder Resultater ved analyse af ekstern prøve Ved analyse af eksternt prøvemateriale kvantiteres M-komponenterne i prøven som vist i tabel 6. Ved analyse på Hydrasys2 i Vejle opnås de største kvantiteter på hhv. 0,040 g/24h og 0,079 g/24h mens analyse på Hydrays2 i Roskilde opnår de mindste kvantiteter på hhv. 0,026 g/24h og 0,050 g/24h. Variationen (CV) mellem resultaterne fra Roskilde og resultater fra Vejle er beregnet til 8,5-15% ved anvendelse af 47

52 Capillarys2 og 30-32% ved anvendelse af Hydrasys2. Da svar til rekvirenten, ifølge BCC afgives med én decimal vil projektets analysesvar frigives som hhv. 0,0 g/24h og 0,1 g/24 uanset anvendt metode og laboratorie. Tabel 6: Resultater af M-komponent kvantitering i Roskilde og Vejle Roskilde Vejle prøve M-komponent Hydrasys2 Hydrasys2 Capillarys2 1 fraktion (%) 9,1 7,3 konc. (g/24 h) 0,026 0,040 0,032 svar til rekvirent (g/24h) * 0,0 0,0 0,0 2 fraktion (%) 13,2 9,4 konc. (g/24 h) 0,050 0,079 0,056 svar til rekvirent (g/24h) * 0,1 0,1 0,1 *Svar afgives ifølge BCC med 1 decimal 4. Diskussion I dette afsnit diskuteres projektets resultater med henblik på at afdække forskelle i metodernes analysekvalitet, samt vurdere hvilken betydning deres anvendelse har for organisatoriske og økonomiske forhold. Endeligt diskuteres metodernes forskelle med fokus på, hvilken konsekvens deres anvendelsen har for patienterne Vurdering af analysekvaliteten Sammenligning af analysekvaliteten for Hydrasys2 og Capillarys2 foretages ved analyse og fortolkning af projektets resultater. I dette afsnit diskuteres resultaterne, deres validitet vurderes, og projektets fund sammenlignes med resultater fra andre undersøgelser. 48

53 Fortolkning af projektets resultater og vurdering af intern validitet Systematisk variation En vurdering af metodernes systematiske variation (korrekthed) kræver beregning af bias på baggrund af analyse af kontrolmateriale med kendt koncentration. Kontrolmaterialets target skal i den forbindelse være bestemt ved anvendelse af en referencemetode, og helst ved anvendelse af en guldstandard(42,43). Pga. M-komponenternes forskelligartede opbygning vil analyse af kontrolmateriale udelukkende beskrive variationen ved kvantitering af lige netop denne éne M- komponent. Den bestemte variation vil dermed ikke være alment gyldig. Af denne årsag produceres der ikke kontrolmateriale med kendt M-komponent kvantitet. Eksternt kontrolmateriale der kan anvendes til bestemmelse af den systematiske variation eksisterer dermed ikke(24). Analyse af eksternt prøvemateriale I projektet er to prøver, tilsendt fra Roskilde, tiltænkt som en form for ekstern kontrol. Der er imidlertid flere problemer ved anvendelse af Roskilde-prøverne som kontrolmateriale. Dels er target (resultatet fra Roskilde) bestemt ved anvendelse af Hydrasys2 og ikke ved en (tredje) referencemetode. Target bør desuden bestemmes ved flere gentagne målinger for at minimere betydningen af metodens tilfældige variation. Når almindeligt prøvemateriale anvendes i eksterne kontrol-programmer anses middelværdierne af alle laboratoriers målinger, som bedste bud på target. Idet der i dette projekt kun deltager to laboratorier kan target ikke bestemmes ved denne fremgangsmåde. Analyse af eksternt prøvemateriale kan dermed ikke anvendes til at bestemme metodernes systematiske variation. 49

54 Ved delforsøgene analyse af intern kontrol og analyse af patientprøver er dog, i hhv. kontrolkort (fig. 10) og differensplot (fig. 12) påvist systematisk forskel mellem metoderne, idet Hydrasys2 måler systematisk højere end Capillarys2. Den systematiske forskel kan skyldes forskelle i apparatur og detektionsmetode eller kan være forårsaget af proteintab ved dialysebehandling. Præcision Metodernes tilfældige variation er undersøgt ved delforsøgene analyse af eksternt prøvemateriale, analyse af intern kontrol og analyse af patientprøver. Analyse af eksternt prøvemateriale Ved anvendelse af resultaterne fra analyse af eksternt prøvemateriale kan reproducerbarheden ved kvantitering med AGE på Hydrasys2 vurderes. Ved sammenligning af analyseresultaterne for hhv. Roskilde og Vejle kan den interlaboratorielle analysevariation (CV) beregnes til hhv. 30% og 32%. Variationen mellem laboratorierne er dermed forholdsvis høj, hvilket tyder på at metoden har en dårlig reproducerbarhed. Til sammenligning er variationen (CV) mellem Roskildes resultater og Vejles resultater ved anvendelse af Capillarys2 hhv. 8,5% og 15,2%. Resultatet er overraskende, idet den interlaboratorielle variation forventes at være mindst ved anvendelse af samme apparatur. Variationen (CV) på 8,5% mellem Capillarys2 og Roskilde, er dog med stor sandsynlighed fejlbehæftet. Ved afpippetering af prøven til dialysesystemet er der sandsynligvis medtaget bundfald, hvilket føre til støj i elektroferogrammet. Korrekt peak-integration er dermed vanskeliggjort. Selv om analyseresultater fra prøve 2 50

55 absorbans absorbans Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt skulle være fejlbehæftede, viser sammenligning af prøve 1 stadig en dobbelt så stor variation imellem Roskilde og Hydrasys2 som mellem Roskilde og Capillarys2. Forskellene mellem kvantitering på Hydrasys2 i Vejle og i Roskilde kan være forårsaget af forskelle i peak-integrationen. Selv om analyse af intern kontrol ikke viste betydende forskel mellem peak-integration udført af to forskellige personer, vil forskellen på peak-integrationen ved analyse af eksternt prøvemateriale sandsynligvis være betydeligt større, idet bioanalytikerne i hhv. Roskilde og Vejle er oplært forskelligt. Det er endvidere muligt at der anvendes forskellige metoder til peak-integration. I Vejle anvendes tangent-skimming hvor toppen integreres fra dal til dal. En anden anvendt metode er perpendicular-drop hvor toppen integreres til bundlinjen (fig. 15)(6,30). Metoden anvendt til peak-integration i Roskilde kendes imidlertid ikke. tid tid Fig. 15: Der kan anvendes forskellige metoder til peakintegration: tangent skimming (tv.) og perpendicular-drop (th.). (eksempel fra resultaterne, egen redigering) De i forsøget anvendte prøver har en forholdsvis lav proteinkoncentration. Små forskelle i peak-integrationerne fører dermed til store ændringer i målt peak %, mens den beregnede M-komponentkoncentration ændres forholdsvis lidt. Derfor vil der trods variationer på op til 32% mellem Vejle og Roskilde afgives samme svar på de to 51

56 prøver. De fundne variationer imellem laboratorierne er dermed ikke klinisk relevante. Hvorfor reproducerbarheden for Hydrasys2 er acceptabel. Reproducerbarhed for kvantitering ved anvendelse af Capillarys2 er ikke undersøgt i dette projekt. Analyse af intern kontrol Ved analysen af den interne kontrol kan repeterbarheden for analyse på Hydrasys2 vurderes. Ved beregning af analyseusikkerheden for gentagen analyse af samme kontrol på samme gel ses en intraseriel variation (CV) på 2,9-3,3%. Metoden har dermed en god repeterbarhed. Den beregnede variation gælder dog kun for bestemmelsen af peak % og ikke for bestemmelse af M-komponentkoncentrationen. Ved beregning af M-komponentkoncentrationen ville variationen øges betragteligt, idet usikkerheden på bestemmelse af P-U på Cobas 8000, usikkerhed på diuresen og opsamlingstid ville indgå i usikkerhedsbudgettet. Repeterbarheden for Hydrasys2 er af Sebia oplyst til (CV) 0,6-7,7%, med stigende usikkerhed ved analyse af M-komponenter med lav peak %. Den i projektet bestemte usikkerhed ved analyse af kontrolmaterialet (med M-komponent på ca. 15%) kan bedst sammenlignes med den af Sebia oplyste usikkerhed ved analyse af en M- komponent med en størrelse på ca. 9,0%. Her opnår Sebia en CV på 7,7%,hvilket er lidt højere end projektets resultat (2,9-3,3%)(32). Idet M-komponenten i projektet er lidt større, er det forventeligt at den i projektet fundne repeterbarhed er bedre. Resultaterne stemmer dermed godt overens med producentens oplysninger. Repeterbarheden er i projektet ikke undersøgt på Capillarys2, men producenten oplyser en intraseriel repeterbarhed på 1,5-3,8%. 52

57 Ved analyse af intern kontrol er kontrolmålingerne for Capillarys2 foretaget over flere dage. Den bestemte præcision (CV) på 11,1% er dermed et udtryk for metodens intermediære præcision. Ved anvendelse af projektets kontrolmålinger på Hydrasys2, målt over 6 dage, bestemmes den intermediære præcision (CV) til 6,3%. Årsagen til, at Hydrasys2 udviser en bedre præcision end Capillarys2, kan sandsynligvis findes i øget usikkerhed ved prøveforbehandlingen og bidrag fra lot. til lot. variation ved Capillarys2. Usikkerhedsbidraget for forskelle i peak-integration er forsøgt udlignet, ved kun at medtage kontrolmålinger foretaget af Conny. Ved sammenligning af usikkerheden for peak-integration foretaget af Mette og Line ses at to personer, efter ens oplæring og ved anvendelse af tangent skimming, har sammenlignelige usikkerheder på peak-integrationen (CV% hhv. 2,9 & 3,3). Betydningen af forskelle på usikkerheden ved peak-integration kan derfor, i dette forsøg, negligeres. Det kan dermed antages at den intermediære præcision ved anvendelse af Hydrasys2 er bedre (CV 6,3%) end ved anvendelse af Capillarys2 (11,1%). Forskellen skyldes formentlig til dels øget usikkerhed på Capillarys2 pga. dialysebehandlingen. Til sammenligning oplyser Sebia en variation på Capillarys2 på 1,1-4,4% imellem forskellige dialysebehandlinger og på 0,4-8,5% ved anvendelse af forskellige geler på Hydrasys2. Projektet finder således en lignende variation på Hydrasys2, men større variation på Capillarys2. 53

58 Analyse af patientprøver Ved analyse af kontrolmateriale er den intermediære præcision kun bestemt for én type M-komponent med én bestemt koncentration. For at vurdere den intermediære præcision for metoderne i flere niveauer, er 21 patientprøver analyseret på begge apparaturer. Ved lineær regression (fig. 11), foretaget på målte peak % værdier, efter analyse med begge metoder, ses en dårlig overensstemmelse (R 2 = 0,89) og en systematisk afvigelse (y-intercept = 7,40) mellem metoderne, idet Hydrasys2 måler højere end Capillarys2. Den systematiske afvigelse fremgår ligeledes af Bland-Altman plottet (fig. 12), hvori der ses differencer på op til 30 peak %. Af plottet fremgår ingen tydelig koncentrationsafhængighed, hvorfor M-komponentens procentuelle størrelse ikke ser ud til at være afgørende for metodernes grad af overensstemmelse. I plottet (fig. 13) over differencerne mellem målte peak % som funktion af P-U ses derimod en tydelig koncentrationsafhængighed. Plottet viser at differencerne mellem metoderne er størst ved analyse af urin med lav proteinkoncentration (<0,2 g/l). For at vurdere om differencerne beskriver en reel forskel på metoderne eller om de kan være forårsaget af tilfældig variation vurderes deres statistiske signifikans ved anvendelse af Wilcoxon-test. Testen viser, at den beskrevne forskel er statistisk signifikant (p= 0,00). Wilcoxon-testen, som anvendes da data ikke er normalfordelt, er en forholdsvis svag test og dens konklusion er mindre valid end konklusionen ved anvendelse af en t-test. 54

59 difference mellem målt peak % Hydrasys2 - Capillarys2 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt De påviste differencer vurderes derfor også ved sammenligning med metodernes analytiske usikkerhed. Ud fra de af producenten angivne analyseusikkerheder(25,32) for hhv. Capillarys2 (CV 4,4%) og Hydrasys2 (CV 8,5%) kan den samlede analyseusikkerhed (CV) for begge metoder beregnes til maximalt 12,9%. Ved at beregne den samlede maximale spredning (SD) kan ±1SD, ±2SD og ±3SD grænserne for metodernes samlede analyseusikkerhed plottes i Bland-Altman plottet over målte peak % værdier (fig. 16) Bland-Altman plot over målte peak % værdier Hydrasys2 vs.capillarys middelværdi af peak % Fig. 16: Plot over differencer mellem målte peak % som funktion af peak %. I plottet er grænserne ±1SD, ±2SD og ±3SD for begge metoders samlede analyseusikkerhed angivet (CV angivet af Sebia). Hvis analyseresultaterne udelukkende er påvirket af metodernes tilfældig variation vil 95% af resultater, ved gentagen analyse af den samme prøve, befinde sig inden for ±2SD, mens 99% vil være inden for ±3SD. Forudsat at producentens oplysninger om analysevariationen er valide, gælder dermed at differencerne med 95% 55

60 sandsynlighed vil ligge inden for ±2SD og med 99% sandsynlighed inden for ±3SD, hvis de udelukkende opstår sfa. metodernes tilfældige variation. I plottet ses at de fleste differencer for M-komponenter med peak <38 % overskrider 3SD grænsen. Differencerne kan dermed ikke forklares ved metodernes analyseusikkerheder, men afspejler en reel forskel imellem metoderne. Usikkerhedsbidrag fra andre usikkerheder, som dag til dag variationer og forskelle i peak integration, er elimineret ved projektets udformning. En problematik ved analyse af patientprøverne er prøvernes holdbarhed. Holdbarheden er, ved opbevaring ved -80 o C, af Sebia angivet til mindst 1 måned(24,31). Mange af projektets prøver er imidlertid opbevaret i over 1 måned og nogle i op til 4 måneder. Den lange opbevaring kan have ført til denaturering af proteiner(24). Projektets resultater bør imidlertid ikke være påvirket, idet alle prøver er reanalyseret på begge apparaturer, hvorfor alle resultater påvirkes af en evt. proteinnedbrydning. Det kan dog overvejes om påvirkningen af resultatet er ens ved anvendelse af AGE og CZ. Ved vurderingen af dobbeltbestemmelsernes overensstemmelse, kan differencerne på dobbeltbestemmelserne ved anvendelse af Hydrasys2 bestemmes til 0,00-33,6%, mens de på Capillarys2 er 0,00-50,0%. Ved analyse på Hydrasys2 har 7 ud af de 21 dobbeltbestemmelser en difference på >10%, mens det for Capillarys2 gælder for 10 af de 21 prøver. En årsag til de dårlige overensstemmelser kan være dårlig blanding af prøven. Afpippetering fra en dårlig blandet prøve vil føre til afpippteringer med forskellige forhold mellem prøvens proteiner. Årsagen til at differencerne mellem dobbeltbestemmelserne er størst på Capillarys2, kan være begrundet i forsøgets 56

61 design. Ved analyse af prøverne på Hydrasys2 er dobbeltbestemmelserne foretaget på samme gel, og dermed påvirket ens af analysevariationen. Ved analyse på Capillarys2 er dobbeltbestemmelser foretaget i samme analyseserie og på samme rack. Dette fører til at den enkelte prøve analyseres i forskellige kapillærer, hvorfor dobbeltbestemmelserne vil være behæftet med to forskellige analyseusikkerheder. En anden årsag kan være dårlig blanding af de op-koncentrerede proteiner og den tilsatte buffer i sidste trin af dialysebehandlingen. Opløsningen, på ca. 400 µl, blandes i dialysesystemets brønd ved at vippe dialysesystemet fra side til side. Denne metode til blanding af opløsningen kan formodentlig være utilstrækkelig hvis systemet ikke vippes længe nok. I så fald vil forholdet mellem M-komponenten og andre proteiner ændres og M-komponentens peak % enten under- eller overvurderes. Sensitivitet Metodernes sensitivitet undersøges ved undersøgelse af metodernes evne til at detektere klinisk relevante forskelle. Som tidligere beskrevet omfatter responskriterierne krav om urin M-komponent kvantiteter på hhv. 0,1 og 0,2 g/døgn og 90% reduktion af M-komponenten. Ved fortyndingsforsøget undersøges om begge metoder kan detektere M-komponenter ved disse koncentrationer, og om en 90% reduktion af M-komponenten kan detekteres. Fortyndingsforsøg Fortyndingsforsøgets resultater viser at begge metoder kan detektere den fortyndede M-komponent og beregner kvantiteten korrekt, i forhold til fortyndingernes forventede koncentration. Der er imidlertid fejl i forsøgsdesignet der gør at resultaterne ikke er valide. 57

62 Den største fejl er at alle fortyndinger er beregnet ud fra resultatet af den oprindelige kvantitering på Capillarys2. Prøverne er inden analyse opbevaret ved -80 o C i 3 måneder. Proteinerne i prøven kan efter optøning være delvist nedbrudt, idet prøvernes holdbarhed kun er garanteret i 1 måned(25,32). Nedbrydning af proteiner kan føre til enten øget eller nedsat M-komponent-andel i prøven. Dermed vil beregnede fortyndinger være fejlbehæftet. En anden problematik er at voluminer til fortyndingerne er beregnet ud fra koncentrationer målt på Capillarys2. Idet projektet har vist at Hydrasys2 måler systematisk højere end Capillarys2, vil fortyndinger beregnet på Capillarys2 koncentrationer sandsynligvis blive vurderet højere end forventet ved analyse på Hydrasys2. Når dette ikke er tilfældet, skyldes det formentligt afrunding af de beregnede koncentrationer til 1 decimal, idet vurderingen af peak % værdierne viser højere værdier på Hydrasys2 end på Capillarys2. Interferens Én af fordelene ved anvendelse af Capillarys2 er muligheden for, ved dialysebehandlingen, at rense prøven for interfererende stoffer. Formålet ved dialyseforsøget er at afklare hvordan dialysen påvirker analysekvaliteten. Spørgsmålet er om dialysebehandlingen øger eller forringer analysekvaliteten. Det er muligt at interfererende stoffer, som lægemidler og elektrolytter fjernes, så analysekvaliteten forbedres. Men der er ligeledes risiko for at proteiner tilbageholdes i filteret eller dialysesystemets brønd, så proteinsammensætningen i prøven ændres og analysekvaliteten forringes. Ved forsøg på at analysere dialysat på Hydrasys2 opstår imidlertid forskellige problematikker. Dels ændres overfladespændingen af 58

63 prøven ved blanding med dialysebuffer, hvilket besværliggør afpippeteringen til applikatorkammen. Endvidere absorberes prøven ikke fuldstændigt i kammen, så prøvemateriale løber ud af brønden, da kammen vendes lodret. Prøven absorberes endvidere ikke ligeligt i applikatorkammens tænder. Efter migration og farvning af gelen ses at prøverne ikke er migreret i egne spor på gelen, men er løbet på tværs af gelen, så forskellige prøver sandsynligvis er blevet blandet. Ved sammenligning af elektroferogram for Vejle urinkontrol med og uden dialysebehandling, ses et tydeligt ændret elektroferogram efter dialysebehandling. M-komponent toppen er blevet fladere og breder og albumin toppen er blevet betydeligt mindre. Derudover er der dannet en ekstra top mellem albumin og M-komponentens top. Kontrollen kan dermed ikke godkendes. Grundet mistanke om blanding af prøver og manglende godkendelse af kontrollen er elektroferogrammerne ikke kvantiteret. Årsagen til den mislykkede elektroforese er sandsynligvis blandingen af dialysebuffer med bufferen i gelen. Forsøget kan evt. gentages ved at undlade dialysebuffer i dialysebehandlingen og i stedet udelukkende anvende vand til fortynding ved dialyse. Da proteinerne i dialysesystemet udelukkende tilbageholdes af PESmembranen pga. deres størrelse, bør dialysebufferen ikke være nødvendig for dialysebehandlingen. Proteinernes ladning til migrationen kan sikres af bufferen i gelen. Det vides dog ikke. om PES membranens ringe affinitet for proteiner(26) er afhængig af deres ladning, i så fald vil nogle proteiner evt. kunne tilbageholdes af dialysesystemet. hvis de opløses ved lavere ph, hvilket vil føre til ændret M- komponent/protein-ratio, som kan føre til falske analyseresultater. 59

64 Ekstern validitet Reproducerbarhed Den i baggrundsafsnittet omtalte rundsending af prøver(3), finder interlaboratorielle variationer på 21-62% ved sammenligning af resultater for peak %, målt på 4 laboratorier, der anvender AGE eller CZ og foretager peak integration (dog svarer ikke alle laboratorier på alle prøver). Resultaterne fra de 3 laboratorier, der anvender AGE og scanning, viser en rimelig overensstemmelse, med CV på 18-33%, mens laboratoriet der anvender CZ opnår lavere resultater(3). Dette er i overensstemmelse med projektets resultater ved analyse af eksternt prøvemateriale, der resulterer i en interlaboratoriel variation på 30-32% ved anvendelse af AGE. Den i rundsendingen fundne tendens til lavere resultater ved anvendelse af CZ, stemmer ligeledes overens med projektets fund af systematisk høje AGE resultater (og dermed lave CZ resultater). Bekræftelse af at tendensen med høje AGE resultater kan genfindes ved sammenligning med andre laboratorier, tyder på, at den fundne systematiske forskel ikke kun er et lokalt fænomen, men en generel tendens. Fortyndingsforsøget I prøverundsendelsen ses betydeligt større interlaboratorielle variationer ved sammenligning af M-komponentens koncentration, end ved sammenligning af peak %. Årsagen kan findes i, at førstnævnte variation indeholder variationer på bestemmelsen af P-U, hvilke ifølge NEQUAS eksterne kontrolsystemer kan være op til 80%(3). Et dansk studie af Salomon M. Gimsing P. og Nielsen L. B.(4) undersøger muligheden for at undgå, at M-komponent analysens variation øges af P-U bestemmelse. Som led 60

65 i deres undersøgelse fremstiller de fortyndingsrækker af hhv. humant plasma albumin og bovint serum albumin. Fortyndingerne analyseres derefter ved AGE på Hydrasys, ved anvendelse af samme gel og farvning, som anvendt i dette projekt. Densiometrisk scanning af gelen foretages dog ved en anden bølgelængde (570 nm). Artiklen beskriver at opløsningen af bovint serum albumin binder 20% mere farve end humant albumin, hvormed albumin indholdet i fortyndingen overvurderes. Ved fortyndingsforsøget udført i dette projekt er der således risiko for at albuminmængden i fortyndinger målt på Hydrasys2 er overvurderet. Ved peakintegration af albumin-toppene i elektroferogrammerne ses 9-29% højere peak % værdier, ved analyse på Hydrasys2 end ved Capillarys2 (tabel 7). Tabel 7: peak % værdier af albumintoppe i fortyndingsforsøg fortynding Hydrasys2 Capillarys2 % difference ufortyndet 1,1 1,2 9 0,1 g/24h 35,8 40, %-fortynding 37,6 47,8 27 0,2 g/24h 20,0 25,7 29 Ved analyse af den ufortyndede urin ses kun en mindre difference på 9%, mens differencen mellem albumintoppene stiger med stigende fortyndingsgrad. Konsekvensen af den overvurderede albumin-fraktion er, at integralet under den samlede kurve overvurderes, hvorfor integralet under M-komponent toppen undervurderes. Dermed er den beregnede M-komponent koncentration falsk lav ved analyse på Hydrasys2. Analyse på Capillarys2 vil ikke være påvirket af albumins farvbarhed, idet detektion foregår direkte. Det er dog for begge metoder afgørende at 61

66 bovint serum albumin migrerer sammen med humant albumin og dermed ikke giver anledning til dannelse af toppe der kan fejlfortolkes. Ved visuel inspektion af gelen ses, som vist i fig. 17 et svagt albumin-bånd i den ufortyndede prøve. Ved fortynding dannes et kraftigere bånd af bovint serumalbumin. Idet alle albuminbåndene ligger i lige linje på gelen, er bovint serum albumin migreret sammen med humant albumin. Resultaterne ved anvendelse af Capillarys2 er således ikke påvirket af anvendelsen af bovint serum albumin i fortyndingerne Fig. 17: Færdig gel efter AGE af fortyndinger. Der ses et svagt albumin-bånd i den ufortyndede prøve (1), mens fortyndingerne på hhv. 90% (2), 0,1 g/24h (3) og 0,2 g/24h (4) visere kraftigere albuminbånd grundet tilsætning af bovint albumin. Gelen viser at bovint albumin migrerer sammen med humant albumin. (eksempel fra resultater) Mulige problematikker ved farvning i AGE Generelt opstår ekstra usikkerheder, ved anvendelse af farvetrin i analysemetoden. Attaelmannan M. og Levinson S.S. (9)beskriver at der ved IF på urin med høj andel af BJP er risiko for antigen exces. Et lignende problem kan evt. opstå ved farvning af proteiner i forbindelse med AGE. I prøver med meget høj protein og / eller M- komponent koncentrationer, kan det tænkes at der opstår underskud af farvemolekyler, hvorved ikke alle proteiner farves, og M-komponent fejlvurderes. I undersøgelsen foretaget af Salomon M. Gimsing P. og Nielsen L. B. (4) analyseres to fortyndinger, dannet ved opløsning af >96% rene monoklonale kappa og lambda 62

67 kæder i phosphat-bufferet NaCl (ph=7,5). Der udføres AGE ved anvendelse af Hydragel HR15 og Acid Violet -farvning. Gelen scannes og der foretages peakintegration af BJP-toppen. Ud fra en fortyndingsrække fremstillet ved fortynding af humant albumin, hvis koncentration er bestemt ved analyse på Hitachi 917 og albumintoppene integreret efter AGE og Acid Violet farvning, dannes en referencekurve over sammenhængen, mellem koncentration og peak % værdi. Ved hjælp af referencekurven, kan peak % værdierne, af de i kappa- og lambdaopløsninger integrerede toppe, konverteres til en koncentration. Letkædeopløsningernes totale proteinkoncentration (hvilket svarer til BJP-koncentration) bestemmes også på Hitachi 917. Ved sammenligning, af de ved AGE målte BJPkoncentrationer med de på Hitachi 917 målte koncentrationer, sås ved analyse af opløsningen med kappa-kæder, en 5% lavere koncentration ved AGE end ved totalprotein-bestemmelse (875 ±43 mg/l ved AGE vs. 921 ±18 mg/l ved Hitachi 917). Opløsningen af lambda-kæder viste 16% lavere koncentrationer ved totalproteinmåling (616 ±43 mg/l ved AGE vs. 533 ±17 mg/l ved Hitachi 917). Undersøgelsen antyder dermed, at BJP s evne til at binde Acid Violet, afhænger af kæde-typen. Dog er resultatet muligvis påvirket af, at usikkerheden ved totalproteinmåling er forskellig for forskellige letkæde-typer. Den af Salomon M. Gimsing P. og Nielsen L. B.(4) omtalte forskel i farvningen af BJP kan have påvirket projektets resultater. Sammenligning af resultater for intern kontrol er foretaget med én type M-komponent, hvorfor resultaterne ikke er alment gyldige. Ved analyse af patientprøver består stikprøven primært af BJP af typen frie lambda kæder. Dette BJP s kvantitet overvurderes, ifølge Salomon M. Gimsing P. og 63

68 Nielsen L. B.(4), muligvis ved AGE. I projektet kan den valgte stikprøve, som primært består af prøver med M-komponenter af fri lambda type, dermed have ført til en større difference mellem metoderne, end hvis stikprøven bestod af flere forskellige M-komponenter. Betydning af prøvens proteinkoncentration I projektet ses sammenhæng mellem P-U og metodernes differencer. Idet differencen øges ved lav P-U. I to studier, fra hhv. Falcone M.(44) og Mussap M. et.al., beskrives at peak-integration ved anvendelse af CZ vanskeliggøres i prøver med lav P-U(5). Studiernes resultater tyder dermed på, at den fundne koncentrationsafhængighed skyldes øget usikkerhed, ved anvendelse af CZ til analyse af prøver med lav P-U. Det skal dog påpeges, at der i undersøgelserne foretages anderledes oprensning af prøven til CZ, som ikke fører til opkoncentration. Hvorfor sensitivteten i studiet vil være mindre end i dette projekt. Problematikker ved op-koncentrering af urin til CZ Ifølge Marshall T. og Williams K.(11) kan op-koncentrering af urin føre til proteintab og risiko for polymerisering og aggregering af BJP. Den i projektet fundne systematiske forskel mellem metoderne, kan dermed muligvis være forårsaget af proteintab ved dialysebehandlingen, eller ved aggregatdannelse og sedimentering af BJP, inden prøvens injektion i kapillæret på Capillarys Organisatoriske elementer Tidsforbrug og arbejdsgange Den samlede analysetid, fra prøveklargøring påbegyndes, til elektroferogrammer foreligger, er ca. 70 min. ved AGE, mod ca. 2 timer og 20 min. ved CZ. Der opnås 64

69 således en tidsbesparelse på over 1 time, ved anvendelse af AGE. Ved CZ anvendes meget tid til prøveforbehandling, mens selve analysetiden på apparaturet er <1 min. AGE kræver ingen prøveforbehandling, men analysetiden er omtrent en time. Ved anvendelse af AGE optages bioanalytikeren kun kortvarigt af manuelt arbejde, og er derfor ledig til andre arbejdsopgaver. Den anvendte arbejdstid skønnes til ca. 8 min. Ved anvendelse af CZ optages Bioanalytikeren i høj grad af prøveforbehandlingen, dog med mulighed for at udføre andet arbejde under centrifugeringstrinnene. Tidsforbruget til effektivt manuelt arbejde ved CZ skønnes til ca. 20 min. Der anvendes således væsentlig mere tid til prøvehåndtering og apparaturklargøring ved CZ end ved AGE Kvantitering i kombination med typebestemmelse Ved behov for typebestemmelse af M-komponenten i urinen har Capillarys2 en klar fordel i, at det samme dialysat, som er anvendt til analyse med henblik på kvantitering, blot skal placeres i et rack med et antisera-segment og sættes på apparaturet, hvorefter inkubering med antistoffer og buffer er automatiseret(19). Ved behov for typebestemmelse på Hydrasys2 foretages fornyet prøve-afpippetering, AGE, og flere manuelle arbejdsgange, ved tilsætning og opsugning af antistoffer(20). Proceduren er tidskrævende og omstændelig. Ved tolkning af resultaterne, har IS på Capillarys2 den fordel, at elektroferogrammerne kan hjælpe til at vurdere hvordan M-komponenten bør integreres Bioanalytikerens arbejdsmiljø Begge metoder omfatter risiko for kontakt med biologisk materiale, hvorfor der ved begge bør anvendes handsker. Anvendelse af CZ udgør dog en større belastning for 65

70 arbejdsmiljøet end AGE, idet der anvendes flere reagenser, som har sundhedsskadelig effekt ved indånding og hudkontakt. Endeligt vil den omfattende prøveforbehandling kræve længerevarende handskebrug og øget risiko for indånding af dampe fra bufferen. I begge metoder anvendes kemikalier der skal bortskaffes i kemikaliesug(19,21) Konsekvenser for patienter Selv om det er vist at den fundne forskel mellem analyseresultaterne fra de to metoder er statistisk signifikant, og at differencerne afspejler en reel forskel i målt peak %, er det ikke ensbetydende med, at forskellen er klinisk relevant. For patientsikkerheden er det væsentligt vigtigere, om der ved anvendelse af de to metoder fremkommer forskelle, der vil føre til forskellige vurderinger af patientens tilstand, og dermed kan føre til forskelle i diagnose eller behandling. Ved kvantiteringen af M-komponenter afgives svar til klinikeren med 1 decimal, ved prøver med P-U <10 g/l, og uden decimaler, ved prøver med P-U >10 g/l. Idet patientprøver i dette projekt har P-U <10 g/l, skal svar afleveres med 1 decimal. Ved analyse af patientprøver vil svaret til rekvirenten i 7 af de 21 analyserede patientprøver variere afhængigt af anvendt metode. Svarafgivelsen fra de to metoder vises i tabel 8. Tabel 8: Oversigt over forskelle i svarafgivelse på patientprøver svar Capillarys2 svar Hydrasys2 antal prøver (g/24h) (g/24h) 4 0,0 0,1 1 0,1 0,2 1 0,7 0,8 1 1,0 1,1 66

71 I alle 7 tilfælde er svaret ved AGE 0,1 g/24h højere end ved CZ. I to af tilfældene er M-komponentens koncentration så høj (0,7-0,8 og 1,0-1,1 g/24h), at forskellen i svarafgivelsen formentlig ikke vil have klinisk betydning. Idet et tilstrækkeligt respons på behandlingen sandsynligvis skal udvise en større ændring. Differencen mellem metodernes kvantitering af M-komponenter med lav koncentration er straks mere problematisk, idet respons vurderes ud fra kriterier om M-komponentkoncentrationer <0,2 g/24h eller <0,1 g/24h. Ved svarafgivelse fra CZ vil fire patienter således opfylde ét af kravene for den gode partielle respons mens de vil AGE kun opfylder kravet for partiel respons. Én patient vil endvidere opfylde kravet til partiel respons ved AGE, men ikke ved CZ(2). Årsagen til forskellen mellem svarafgivelse ved de to metoder kan muligvis forklares i dialysebehandlingens evne til at eliminere interferens fra lægemidler. Som tidligere omtalt, er nogle af de nyeste lægemidler til behandling af myelomatose baseret på monoklonale antistoffer. Lægemidlerne vides at interferere på serum IF og serum-age, hvorfor det er oplagt at undersøge om denne type lægemidler ligeledes kan interferere ved urin-age. Idet Daratumumab og Elotuzumab kan interferere på blodtypeserologiske analyser(45,46), oplyses blodbanken om patienters behandling med Daratumumab og lignende lægemidler. Ved søgning i blodbankens database Prosang, er det undersøgt, om projektets prøver stammer fra patienter i behandling med disse produkter. Det viser sig, at det i 6 af de 7 tilfælde med ændret analysesvar, drejer sig om prøver fra patienter i Daratumumab -behandling. Ved markering af de berørte prøver i Bland-Altman plottet over peak % differencer plottet som funktion af peak % 67

72 difference mellem målt peak % Hydrasys -Capillarys Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt (fig.18) ses at fem prøver, med værdier over tidligere omtalte ±3SD grænse, stammer fra patienter i Daratumumab -behandling. Det er endvidere bemærkelsesværdigt at de fire prøver, hvor differencen mellem metodernes resultater er størst, stammer fra patienter i nævnte behandling. Bland-Altman plot over målte peak% værdier Hydrasys2 vs.capillarys2 Ikke i Daratumumab behandling I Daratumumab behandling middelværdi af peak % Fig. 18: Bland-Altman plot med differencer mellem målte peak % plottet som funktion af peak %. Den stiplede linje angiver ±3SD for den samlede tilfældige variation for begge metoder. I plottet ses at størstedelen af de differencer der er større end 3SD af metodernes samlede usikkerhed udgøres af prøver fra patienter der er i behandling med Daratumumab (rød prik). Ved fjernelse af Daratumumab patienternes prøver fra plottet over målt peak % værdi på Hydrasys2, som funktion af målinger på Capillarys2, ses i fig. 19, efter lineær regression en meget god overensstemmelse mellem metoderne (R 2 =0,9896), i forhold til tidligere plot (R 2 =0,8947). 68

73 peak % værdi Hydrasys2 Bioanalytikeruddannelsen Bachelorprojekt Overenstemmelse mellem Hydrasys2 og Capillarys2 ved analyse af patientprøver efter fjernelse af resultater fra patienter i behandling med Daratumumab y = 1,0345x + 1,3537 R² = 0, peak % værdi Capillarys2 Fig. 19: Plot over måleresultater ved analyse af patientprøver på Hydrasys2 plottet som funktion af resultater fra Capillarys2, efter fjernelse af prøver der kan være påvirket af behandling med Daratumumab. Lineær regression viser god overensstemmelse mellem prøvens resultater (R 2 =0,9896). Resultaterne tyder dermed på at Daratumumab interferer i analysen, ved anvendelse af AGE, men at lægemidlet fjernes ved dialysebehandling, og derfor ikke interfererer i CZ. Denne antagelse gøres dog med visse forbehold. Dels vides det ikke om lægemidlet udskilles i urinen i tilstrækkelige kvantiteter, til at detektion er muligt. Ved litteratursøgning på området, er udelukkende fundet oplysninger om interferens ved analyse af serum. Der er ikke fundet artikler, der nævner problematikker ved urinanalyse. Hvis lægemidlet udskilles i urin, vides det ikke, om koncentrationer på analysetidspunktet er tilstrækkelige til detektion, idet dato for sidste behandling, samt lægemidlernes halveringstider ikke kendes(45,46). Dialysebehandlingens evne til at eliminere denne type lægemidler kan dog betvivles. Hvis lægemidlet udelukkende består af IgG kappa, bør det tilbageholdes i PESmembranen. For at prøven skal renses for lægemidlet ved dialyse kræves at 69

74 antistoffet er mindre end BJP, hvilket virker usandsynligt. Idet udviklingen af lægemidler bestående af monoklonale antistoffer syntes at være fremtiden inden for behandling af myelomatose, er det dog væsentligt at undersøge problematikken nærmere Økonomiske aspekter Ved sammenligning af omkostninger, forbundet med anvendelse af metoderne, skal den største forskel formentlig findes i udgifter til reagenser og diverse forbrugsmaterialer, samt lønudgifter til bioanalytikeren. Ved anvendelse af Hydrasys2 er udgifter til forbrugsmaterialer og reagenser ca. 275 kr. pr. analyse(47), mens det for Capillarys2 er ca. 160 kr.(47,48). Da Capillarys2, som tidligere beskrevet, optager væsentlig mere af bioanalytikerens arbejdstid, er lønudgifterne ved denne metode højere. Den samlede analysepris er således nærmest identisk for de to metoder, idet prisen pr. analyse (ekstern pris med 30% fortjeneste) er 450 kr. pr. analyse på Hydrasys2(49) og ca. 445 kr. pr. analyse på Capillarys2(50). Indkøbspriser for apparaturerne er ikke indhentet, men forskellen må formodes at kunne negligeres ved flere års anvendelse. Dog er der ved anvendelse af Capillarys2 en problematik i at afdelingen skal have mulighed for at udføre IF og AGE for at kunne opfylde krav til vurdering af CR. Ved anvendelse af Capillarys2 vil der således være meromkostninger, ved ligeledes at skulle indkøbe udstyr til IF og AGE. Medtages et samfundsøkonomisk aspekt i vurderingen, vil anvendelse af CZ, frem for AGE, muligvis kunne føre til en samfundsøkonomisk besparelse. Ved AGE vil prøver formentlig, af økonomiske årsager, samles sammen, indtil der er tilstrækkeligt antal til at fylde en hel gel. Idet der ved CZ kan analyseres enkelte eller få prøver uden 70

75 meromkostning, kan analyse i princippet foretages flere gange ugentligt, hvorved ventetiden på analyseresultater forkortes. Derved opnås hurtigere behandlingsopstart eller -justering, hvormed borgeren sandsynligvis oplever færre symptomer, færre bivirkninger til unødig/uvirksom behandling, og færre følgesygdomme. Dette må formodes at føre til reducerede udgifter til indlæggelser og behandling Forslag til metodeforbedring For at projektets resultater bliver valide skal flere forsøg ændres. Repeterbarheden bør undersøges på begge apparaturer, ved analyse af flere forskellige prøver, med forskellige M-komponenter (forskellig type og koncentration), og ved forskellig P-U. Endvidere skal repeterbarheden bestemmes ved analyse i samme kapillær på Capillarys2. Den intermediære præcision bør ligeledes bestemmes ved gentagen analyse, i flere niveauer (både for M-komponent koncentration og P-U) og på flere forskellige prøver, med forskellige M-komponenter. Ved at øge antallet af målinger på den enkelte prøve, minimeres betydningen af tilfældig variation, så der fås et bedre bud på den intermediære præcision. Endvidere vil middelværdierne af mange målinger bedre kunne sammenlignes for at synliggøre differencer imellem metoderne. Men selv ved en sådan opsætning vil resultatet pga. M-komponentens unikke opbygning ikke nødvendigvis være alment gyldig. Hvis fortyndingsforsøget skal anvendes til at påvise, at metoderne kan detektere forskellen på prøver med koncentrationer på 0,1 og 0,2 g/24h, skal forsøget ændres væsentligt. Idet der ikke kendes en sand værdi af prøven, kan metoderne 71

76 udelukkende vurderes ud fra den relative ændring i resultatet. Dermed skal fortyndingerne beregnes ud fra resultater fra begge metoder. Så fortyndingsforhold til analyse ved AGE, beregnes på baggrund af koncentration, bestemt på AGE. På samme måde skal fortyndingen til CZ, beregnes på baggrund af CZ målinger. For at minimere usikkerhedsbidraget fra P-U bestemmelsen, skal P-U på den oprindelige prøve og på fortyndingerne, bestemmes ved gentagne målinger. Selv om fremgangsmåden ved anvendelse af en negativ urin, spiket med albumin, ikke er set i artikler med lignende forsøg, bør fremgangsmåden, som sådan, være korrekt. Ved at bibeholde P-U i fortyndingerne sikres, at M-komponentens koncentration falder, og proteinfordelingen dermed ændres, som den vil gøre i en patient ved behandlingseffekt. Hvis en egnet negativ prøve ikke kan findes, bør det tilsatte albumin dog være af human type, for at ændret farvning ikke påvirker kvantiteringen. Dialyseforsøget er ikke anvendeligt i den nuværende form, idet prøvens blanding i dialysebuffer fører til problematikker. Hvis dialyseforsøget skal udføres, kan dialysebehandling forsøges gentaget ved udelukkende at blande prøven med vand. Det vil endvidere være relevant, at undersøge om dialysebehandlingen fører til proteintab eller aggregering og sedimentering af BJP. Et sådant forsøg kan i princippet udføres, ved at analysere forskellige prøvers P-U, før og efter dialysebehandling. Samtlige målinger bør foretages gentagne gange, for at minimere bidrag fra den analytiske variation på P-U bestemmelsen. Denne opsætning vil muligvis kunne afklare, om de systematisk højere værdier fundet i projektet, skyldes tab af protein ved dialysebehandlingen. Et proteintab under dialysen, vil endvidere 72

77 give en mulig forklaring på de dårlige overensstemmelser af dobbeltbestemmelserne i projektet. 5. Konklusion Kvalitetssikring af metoder til kvantitering af M-komponenter i urin har vist sig at være meget vanskeligt. Pga. M-komponenternes forskellighed kan et acceptabelt kontrolmateriale ikke fremstilles. Ved analyse medtages migrationskontrol, og evt. positiv kontrol, men en egentlig kontrol af resultatet er ikke muligt. Selv om der kan argumenteres for, at det generelt er problematisk, at en metode uden reel kvalitetskontrol anvendes til diagnostik, er dette forhold ens for både AGE og CZ. Vurdering af analysekvaliteten vanskeliggøres af samme årsag. Beregnede usikkerheder ved analysen vil, pga. M-komponenternes forskellige opbygning, altid kun gælde for de undersøgte M-komponenter, og ikke være alment gyldige. Med forbehold for dette, viser projektets resultater systematisk højere peak % værdier ved anvendelse af AGE, end ved anvendelse af CZ, hvilket bekræftes af DSMG/DSKB s prøverundsendelse(3). Projektets undersøgelser viser en god repeterbarhed (CV) for AGE på 2,9-3,3%, hvilket stemmer overens med oplysninger fra apparaturets producent (Sebia). Repeterbarheden er i projektet ikke undersøgt for CZ, men oplyses af Sebia til 1,5-3,8%. I projektet udviser AGE en bedre intermediær præcision (CV 6,3%) end CZ (CV 11,1%), resultaterne modsiges dog af Sebia, der angiver en bedre intermediær præcision ved anvendelse af CZ(25,32). 73

78 Metoderne har begge kvalitetsmæssige udfordringer, i form af usikkerheder, ved hhv. lave totalprotein-koncentrationer og dialysebehandling for CZ, og ved farvning af gelen ved AGE. I projektet ses således, at differencen mellem metoderne er størst ved prøver med lavt proteinindhold. Andre studier (5,44) peger på, at årsagen er øget usikkerhed for CZ, ved anvendelse af prøver med lavt proteinindhold. Analyseusikkerheden ved CZ øges endvidere ved dialysebehandlingen. Marshal og Williams (11) beskriver, at op koncentreringen af urin kan føre til proteintab og BJPaggregering, hvilket vil øge usikkerheden. Ved anvendelse af AGE risikeres fejlkvanitetering pga. BJP s forskellige binding af farven, mens højt proteinindhold i prøver kan føre til en form for antigen exces, med utilstrækkelig farvning og fejlkvantitering til følge. Det kan derfor konkluderes, at anvendelsen af hhv. kapillærelektroforese og gelelektroforese ikke medfører væsentlige forskelle i analysekvaliteten. Metodernes repeterbarhed er sammenlignelig, mens den intermediære præcision muligvis er lidt højere ved anvendelse af kapillærelektroforese, men dog inden for et acceptabelt niveau. Begge metoder udviser desuden mulige fejlkilder, der vil føre til øget analyseusikkerhed. AGE kan påvirkes af problemer ved forskelle i Bence Jones Proteiners farvbarhed, og ved en form for antigen-exces, med ufuldstændig farvning af proteiner i prøver med højt proteinindhold. CZ påvirkes af dialysebehandlingen, hvor op-koncentrering kan føre til proteintab og BJP-aggregering. Ved begge metoder kan fejlkilderne føre til fejl i kvantitering. Ved sammenligning af priser for analyserne er der ingen forskel på de to metoder. Til gengæld opnås, ved analyse af 14 prøver en tidsbesparelse på over 1 time, ved 74

79 anvendelse af AGE. Bioanalytikeren optages væsentligt længere af manuel prøveforbehandling ved anvendelse af CZ, end ved AGE. Ved samtidig typebestemmelse af M-komponenten, er anvendelse af CZ i kombination med IS dog fordelagtigt, idet dialysatet kan genanvendes og analysen dermed, til forskel for AGE og IF, foregår fuldautomatisk. Projektets resultater viser, at der i analysesvar til 4 ud af 21 patientprøver ses klinisk relevante forskelle, som kan få betydning for behandlingsvurderingen. Endvidere antyder projektet at der ved anvendelse af CZ kan elimineres interferens fra lægemidler, som Daratumumab, hvilket ikke er muligt i AGE. 6. Perspektivering Idet Myelomatosepatienter behandles med mange forskellige lægemidler, og der hele tiden støder nye til(15), er der stor risiko for interferens. Særligt lægemidler bestående af antistoffer viser gode resultater, og der vil formodentlig produceres stadig flere af denne type lægemidler i fremtiden(15). Det er derfor væsentligt, at en metode til kvantitering af M-komponenter ikke påvirkes af lægemidler, inklusive antistof-baserede produkter. Projektet antyder, at CZ måske kan eliminere interferens fra lægemidlet Daratumumab. Evnen til, ved dialysebehandlingen, at eliminere interferens fra lægemidler, er en af de væsentlige fordele ved anvendelsen af CZ. Prøveforbehandlingen er dog ligeledes metodens største ulempe, idet dialysebehandlingen er omstændelig og optager en stor del af bioanalytikerens tid. For at optimere anvendelsen af CZ til kvantitering af M- komponenter i urin, bør det undersøges, om en anden og hurtigere metode til dialysebehandling kan anvendes. 75

80 I en artikel fra 2014 beskriver Falcone M. en hurtigt oprensningsprocedure til oprensning af urinprøver, forud for M-komponent kvantitering i urin. I studiet udvikles en metode til oprensning af urinprøver for interfererende stoffer, som urea, kreatinin og elektrolytter. 20 døgnuriner oprenses, ved blanding af urin med NaOH (1M) eller buffer med høj ph og granuleret aktivt kul. Efterfølgende centrifugeres blandingen i 5 min., i micro-centrifuge. Herefter udføres CZ direkte på supernatanten. Artiklen finder ingen tab af protein ved oprensningsproceduren, og god intra- og inter-seriel præcision (hhv. CV 5,0% og 3,6%), til detektering af proteiner i gammazonen. Problemet ved metoden er, at prøven ikke, som ved dialysebehandlingen, op-koncentreres, hvorfor CZ efter denne procedure, kun bør anvendes til uriner med P-U >0,5 g/l. Idet proceduren kan udføres på 15 min., og der ikke ses tegn på proteintab, kunne metoden i princippet fjerne ulempen, ved stort tidsforbrug til prøveforbehandling, ved CZ. Aktivt kul anvendes til andre analyser i urin (oxalsyre-måling) (44), er ugiftigt og i stand til at absorbere lægemidler. Det eneste problem ved denne metode er den manglende op-koncentrering af prøven, hvilket fører til forringet sensitivitet af CZ. En videreudvikling af metoden, hvor oprensningen kombineres med en hurtig op- koncentreringsmetode, vil dog være en interessant mulighed for at øge fordelene ved anvendelse af CZ. 76

81 7. Referenceliste 1. Engholm G, Ferlay J, Christensen N, Kejs A, Hertzum-Larsen R, Johannesen T, m.fl. NORDCAN: Cancer Incidence, Mortality, Prevalence and Survival in the Nordic Countries, Version 7.3 [Internet]. Association of the Nordic Cancer Registries. Danish Cancer Society; 2016 [henvist 11. august 2016]. Tilgængelig hos: 2. Dansk Myelomatose Studiegruppe (DMSG). Diagnostik og behandling af myelomatose, retningslinje 2015 [Internet]. DMSG; 2015 [henvist 10. august 2016]. Tilgængelig hos: 3. Dansk Selskab for Klinisk Biokemi (DSKB), Dansk Myelomatose Studiegruppe (DMSG). DMSG/DSKB rundsending af prøver til sammenligning af M-komponent analyser i Danmark - Sammenligning af serum M-komponent og urin M-komponent analyserne på danske sygehuse. DSKB/DMSG; Salomo M, Gimsing P, Nielsen LB. Simple Method for Quantification of Bence Jones Proteins. Clin Chem. 1. december 2002;48(12): Mussap M, Ponchia S, Zaninotto M, Varagnolo M, Plebani M. Evaluation of a new capillary zone electrophoresis system for the identification and typing of Bence Jones Protein. Clin Biochem. februar 2006;39(2): Dansk Selskab for Klinisk Biokemi (DSKB), Dansk Myelomatose Studiegruppe (DMSG). Dansk retningslinje for M-komponent analyser, guidelines DSKB/DMSG 2012 [Internet]. DSKB/DMSG; 2012 [henvist 8. oktober 2016]. Tilgængelig hos: Lyngbye J, Kjær A, Ladefoged SA, Nissen PH. Lyngbyes laboratoriemedicin. 2. Kbh.: Nyt Nordisk Forlag; Agger R. Immunologi. 1th udg. Kbh.: Munksgaard Danmark; Attaelmannan M, Levinson SS. Understanding and Identifying Monoclonal Gammopathies. Clin Chem. 1. august 2000;46(8): Abildgaard N. M-komponenten ved myelomatose. Dan Myeolomatose Foren [Internet]. 20. august 2015 [henvist 8. oktober 2016]; Tilgængelig hos: Marshall T, Williams KM. Electrophoretic analysis of Bence Jones proteinuria. ELECTROPHORESIS. 1. juni 1999;20(7): Myelomatose - Lægehåndbogen på sundhed.dk [Internet]. [henvist 2. december 2016]. Tilgængelig hos: Sundhedsstyrelsen. Pakkeforløb for myelomatose. Version 3.1. Kbh.;

82 14. International Myeloma Working Group [Internet]. International Myeloma Working Group. [henvist 13. december 2016]. Tilgængelig hos: Behandlinger og behandlingsformer [Internet]. Dansk Myelomatose Forening. [henvist 4. december 2016]. Tilgængelig hos: Nyt behandlingstilbud til myelomatose-patienter [Internet]. [henvist 4. december 2016]. Tilgængelig hos: Elotuzumab forbedrer behandling af myelomatose markant [Internet]. [henvist 20. december 2016]. Tilgængelig hos: Abildgaard N. Opfølgning og kontrol af myelomatose fra 2015 det nye nationale program for kontrol og opfølgning af myelomatose. Dan Myeolomatose Foren [Internet]. 20. august 2015 [henvist 8. oktober 2016]; Tilgængelig hos: det-nye-nationale-program-for-kontrol-og-opfoelgning-af-myelomatose/ 19. Andersen V. Capillarys, DokumentID 80838/l , version 8.4. Klinisk Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus; Duborg CL. Hydrasys 2 (Bence Jones; Immunfix urin) betjeningsvejledning, DokumentID /l , version D. Klinisk Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus; 21. Duborg CL. Hydrasys 2 (Hydragel 15 HR; Urin M-komponent) betjeningsvejledning, DokumentID /l , version C. Klinisk Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus; 22. Laursen LB. M-komponent (døgnurin); Pt(U), metodeblad, DokumentID /I version 1. Klinisk Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus; Petersen JR, Okorodudu AO, Mohammad A, Payne DA. Capillary electrophoresis and its application in the clinical laboratory. Clin Chim Acta. april 2003;330(1 2): Personlig korrespondance, Bendixen L. Videnchef ILS Danmark Sebia Inc. Kitinsert CAPILLARYS / MINICAP URINE Ref Sebia Inc.; Polyethersulfon-Membran (hydrophil) [Internet]. [henvist 13. december 2016]. Tilgængelig hos: Prince Technologies :: Introduction to Capillary Electrophoresis [Internet]. [henvist 4. december 2016]. Tilgængelig hos: Jachimska B, Wasilewska M, Adamczyk Z. Characterization of globular protein solutions by dynamic light scattering, electrophoretic mobility, and viscosity measurements (Abstract). Langmuir ACS J Surf Colloids. 1. juni 2008;24(13):

83 29. Wind T, Bendsen T, Simonsen JT. Mikroskopi og fotometri, noter modul 1 og Århus: VIA University College Bioanalytikeruddannelsen; Personlig korrespondance, Conny Laurberg Duborg, Bioanalytiker KIBA Vejle Sygehus Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus. Kontrolskema Capillarys Sebia Inc. Kitinsert HYDRAGEL 15 HR Violet Acide / Acid Violet Ref Sebia Inc.; Jelsbak V, Hallager K. Farvning af celler og væv, noter, Modul Århus: VIA University College Bioanalytikeruddannelsen; Densitometry - LabCE.com, Laboratory Continuing Education [Internet]. [henvist 13. december 2016]. Tilgængelig hos: Sebia Inc. Capillarys training manual, version 5.20 [Internet]. Sebia Inc.; 2005 [henvist 25. november 2016]. Tilgængelig hos: %20AU%20SOL/SEBIA%20-%20CAPILLARYS%202/MANUAL%201.pdf 36. Datatilsynet: Forskningsbiobanker [Internet]. [henvist 6. december 2016]. Tilgængelig hos: Lov om behandling af personoplysninger [Internet]. Par. 5 maj 31, Tilgængelig hos: Forskning, der omhandler biologisk materiale - dnvk.dk [Internet]. [henvist 6. december 2016]. Tilgængelig hos: Kvalitetssikring - dnvk.dk [Internet]. [henvist 6. december 2016]. Tilgængelig hos: Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. 6th ed. New York: W.H. Freeman and Company; s. 41. Bendsen T. Noter i statistik, 8.3 Wilcoxon-testen [Internet] [henvist 9. december 2016]. Tilgængelig hos: Bendsen T. Noter i statistik, 4.5 Systematisk variation [Internet] [henvist 15. december 2016]. Tilgængelig hos: Bendsen T. Noter i statistik, 11.7 Ekstern kvalitetskontrol [Internet] [henvist 15. december 2016]. Tilgængelig hos: Falcone M. Attempt to run urinary protein electrophoresis using capillary technique. ELECTROPHORESIS. 1. oktober 2014;35(20):

84 45. EMPLICITI TM (elotuzumab) [Internet]. [henvist 19. december 2016]. Tilgængelig hos: FDA Approved DARZALEX (daratumumab) [Internet]. DARZALEX (daratumumab). [henvist 19. december 2016]. Tilgængelig hos: Personlig korrespondance, Liselotte B. Laursen, Afdelingsbioanalytiker Palmeafsnittet, Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus Personlig korrespondance, Lykkeboe S., Kemiker Aalborg Sygehus Klinisk Biokemisk Afdeling, Roskilde Sygehus. Laboratoriemedicinske Vejledninger Klinisk Biokemi, Mkomponent;U, KBA. Klinisk Biokemisk Afdeling, Roskilde Sygehus; Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling. Samlet prisoversigt Vejle Sygehus, Sygehus Lillebælt; Referenceliste figurer Forside: Egne fotos, F1. Egen produktion,, efter: Agger R. Immunologi. 1th udg. Kbh.: Munksgaard Danmark; F2. Eget foto, F3. Egen produktion,, efter: Prince Technologies :: Introduction to Capillary Electrophoresis [Internet]. [henvist 4. december 2016]. Tilgængelig hos: F4. Eget foto, F5. Eget foto, F6. Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling, Vejle Sygheus, eksempel fra Phoresis. F7. Eget foto, 80

85 8. Bilagsoversigt Bilag 1. Kontrolskema Capillarys2, Klinisk Biokemisk Afdeling, Vejle Sygehus Bilag 2. Rådata 81

86 Bilag 1. Kontrolresultater Capillarys2, KIBA, Vejle Sygehus

87

88

89