En undersøgelse af hæmolytisk interferens på analyserne Folat, vitamin B12 og Lactat dehydrogenase på Architect fra Abbott.

Transkript

1 En undersøgelse af hæmolytisk interferens på analyserne Folat, vitamin B12 og Lactat dehydrogenase på Architect fra Abbott. Professionsbachelorprojekt Udarbejdet af: Maria Dam Jensen, Antal tegn: Vejledere: Turi Neubauer, Lektor ved VIA University College Bioanalytikeruddannelsen Anne Jaritz-Nielsen, Bioanalytiker underviser. Klinisk biokemisk afd. Holstebro sygehus

2 Indholdsfortegnelse Forord... 4 Resume... 5 Baggrund:... 5 Metode:... 5 Resultater:... 5 Konklusion:... 6 Introduktion... 7 Baggrund... 7 Formål... 9 Problemformulering... 9 Målformulering... 9 Teori Folat Vitamin B LD Hæmolyse Analyseprincip o Analysen folat: o Analysen for vitamin B12: o Måleprincippet: o Analysen for LD: o HIL-indeks: Materialer og metoder Materiale Metode Kalibrering og kontrol: Pilotforsøg: Fremgangsmåde: Indsamling: Plasmapools: Hæmolysat: Databearbejdning: Side 2 af 71

3 Etik: Litteratursøgning: Resultater Diskussion Folat Vitamin B LD Bestemmelse af grænserne Metode Hæmolyserække Hæmolysat Hæmolyse analysen Antal prøver med svar hæmolyse graf Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilag Side 3 af 71

4 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet på bioanalytikeruddannelsen i Århus, VIA University College og på klinisk biokemisk afdeling i Holstebro i perioden september 2013 til december Forsøget er udført på biokemisk afdeling i samarbejde med Connie, Sine og Sarah. Laboratoriegruppen skal have en stor tak for deres hjælpsomhed og et godt arbejdsmiljø. Desuden en tak til I-vejleder Turi Neubauer, Lektor ved VIA University College, Bioanalytikeruddannelsen og K-vejleder Anne Jaritz-Nielsen, Bioanalytiker underviser. Klinisk biokemisk afd. Holstebro sygehus skal også have tak, for deres vejledning, og deres professionelle faglige viden i forbindelse med udarbejdelse af dette projektforløb. Tak til øvrige personale og superbruger ved Architect på klinisk biokemisk afdeling, for deres hjælpsomhed med indsamling af materiale til projektet og deres tålmodighed. Derudover en tak til overlæge Kaj Ove Pedersen, overlæge på klinisk biokemisk afdeling Holstebro for en mundtlig dialog omkring vores valg af analyse niveauerne. Til sidst en tak til Anders Poulsen, Afd. Bioanalytiker for at give os statistiske data vedrørende de valgte analyser, samt en tak til kemikerne Linda Østervig Henriksen og Mette Fogh Møller for deres faglige ekspertise til vejledning og svar på vores spørgsmål. Underskrift: Side 4 af 71

5 Resume Baggrund: På KBA i Holstebro analyseres folat, vitamin B12 og LD på analyseudstyret Architect fra Abbott. De to analyseparametre, folat og LD er problematiske i forhold til hæmolyse, fordi hæmolyse kan medføre falsk forhøjede værdier, grundet erytrocytternes indhold af LD, folat. Hvor hæmolyse kan medføre et fald i vitamin B12 koncentrationen grundet bindings enzymer. Firmaet Abbott har oplyst i deres indlægssedler for B12 vitamin, folat og LD, at disse parametre ikke må analyseres når der er hæmolyse tilstede. Dette medfører at en del prøver bliver afvist, derfor valgte afdelingen selv at fastlægge en hæmolysegrænse på 0,2 g/l. På nuværende tidspunkt ved man ikke om den visuelt fastlagte hæmolysegrænse har haft en klinisk betydning for analyseresultaterne. En undersøgelse af hæmolysens betydning for analyserne B12 vitamin, folat og LD er vigtig, for at kunne vurdere om det er muligt at indføre en højere hæmolysegrænse end den nuværende. Metode: Forsøget er udført med udgangspunkt i det endelige pilotforsøg. Prøverne blev indsamlet efter bestemte værdier. Både normale og lave værdier for Folat og B12, samt normale værdier for LD. Prøvernes hæmolyseværdi blev tjekket, som skulle være under 0,04 g/l. Prøvernes plasma blev anbragt i hver sin pool. Der blev anbragt 1,5 ml plasma i glasrør fra plasmapoolene. Der var i alt 10 glas for hver analyseparameter og for hver af deres niveauer, hvor der blev tilsat et hæmolysat i forskellige mængder, for at opnå den bedste hæmolyserække i forskellige grader. Resultater: Ved folat analysen viste der for både den lave og den normal værdi en stigende koncentration som funktion af hæmolysen, men det var uden negativ klinisk relevant påvirkning. Den lave værdi viste en statistisk signifikant forskel. For vitamin B12 analysen for både den lave og normale værdi, ses der ingen statistisk signifikant forskel og ingen negativ klinisk relevant påvirkning på analyseresultatet. Der vises en faldende tendens, som viste næsten ingen lineær sammenhæng mellem vitamin B12 koncentrationen og den stigende hæmolysegrad. For LD analysen ses en statistisk signifikant forskel og en stigende analyse koncentartion som funktion af hæmolysen. Den udviste en negativ klinisk relevant påvirkning af analyseresultatet ved en hæmolysegrad på 0,26g/L. Side 5 af 71

6 Konklusion: Ud fra denne undersøgelse, kan man konkludere at hæmolysegrænsen for hver enkelt analyseparameter skal fastsættes med en anden værdi, i forholdt til den nuværende hæmolysegrænse på KBA under HeV. For folat viser resultaterne af denne undersøgelse, at hæmolysegrænsen ikke kan fastsættes, da resultatet var for usikkert. For vitamin B12 kan hæmolysegrænsen forhøjes op til 0,58 g/l, samt en udvidet undersøgelse vil lægge op til at hæve hæmolysegrænsen yderligere. For LD viser resultaterne, at hæmolysegrænsen burde nedsættes til at 0,14 g/l, for at undgå en negativ klinisk påvirkning på analyseresultatet. Side 6 af 71

7 Introduktion Baggrund På Klinisk biokemisk afdeling (KBA) under Hospitalsenheden Vest(HeV), analyseres vitamin B12(cobalamin), folat og Lactat dehydrogenase(ld) på analyseudstyret Architect fra Abbott. Analyse af disse analyseparametre løber årligt op i ca prøver (1). De to af analyseparametrene er problematiske i forhold til hæmolyse, da hæmolyse kan medføre falsk forhøjet værdier, grundet erytrocytternes indhold af LD og folat (2). Der er forsøg der tyder på at vitamin B12 kan forårsage et fald i koncentrationen, da løse komponenter fra erytrocytterne, kan krydsreagere med antistofferne der er i immunkomplekset, hvis det forekommer at de er mindre specifikke (3). Faldet forårsages af vitamin B12 bindende enzymer.(4). Især LD er følsom overfor hæmolyse, da erytrocytterne indeholder 150 gange højere LD-aktivitet end der normalt findes i plasma (5), samt folat hvor erytrocytterne indeholder 30 gange mere folat end i plasma (3) Vitamin B12 er bl.a. vigtig i forbindelse med cellernes DNA-syntese. Mangel på vitamin B12 ses ved perniciøs anæmi og absorptionsforstyrrelser i mavetarmregionen. Forhøjede værdier ses ved leverlidelse, visse myoloide sygdomme, især kronisk myoloid leukæmi, samt polycytæmi (2). Folat er også vigtig, da den indgår i cellernes DNA-syntese, og kan ikke optages i kroppens celler uden cobalamins tilstedeværelse. Cobalaminmangel medfører derfor folatmangel i cellerne. Folat indtages via kosten, og lave værdier skyldes fejlernæring, absorptionsforstyrrelser, øget forbrug fx ved leukæmi og hæmolytisk anæmi. Der kan ses forhøjede værdier ved vitamin B12 mangel (2). LD er et enzym og findes i cellerne i mange af kroppens væv. Forhøjede værdier ses f.eks. ved blodprop og celleskader i hjerte, nyre, lunge med videre, leverbetændelse, anæmier og maligne sygdomme(2). Vitamin B12 og folat analyseres på Architects I-modul ved en kemiluminiscensmikropartikelimmunanalyse (CMIA). LD analyseres på Architects C- modul ved fotometrisk måling (5,6,7)(bilag1). Firmaet Abbott har oplyst i deres indlægssedler for vitamin B12, folat og LD, at disse parametre ikke må analyseres når der er hæmolyse tilstede (5,6,7). Denne hæmolysegrænse har medvirket til at der i gennemsnit for de tre parametre månedligt er blevet afvist prøver (1), og disse prøver analyseres derfor ikke. Prøver der bliver afvist er især prøver, der er modtaget fra de praktiserende læger, eller prøver der er taget på sygehuse, Side 7 af 71

8 hvor prøvetagning har været problematisk, hvilket formodentligt kan skyldes patienter fra hæmatologisk og onkologisk afdeling. I en artikel der omhandler kliniske konsekvenser ved hæmolyseret blodprøver, nævnes der at hæmolyse kan opstå ved både patienters forskellige sygdomme, eller ved den præanalytiske fejlkilde, ved en prøvetagning med forkert kanylestørrelse, en traumatisk prøvetagning, stasens varighed eller forkert blodmængde i prøveglasset. Det viser sig, at en af de komponenter som påvirkes mest af hæmolyse, er LD-plasma. Derfor påpeger de vigtigheden af hvordan man bør håndtere hæmolyseret prøver, da de medfører i denne forbindelse ny prøvetagning og forsinkelse af igangsættelse af den korrekte behandling, samt forlænget indlæggelsestid(8). For at undgå dette, har afdelingen forsøgt at løse problemet med de afviste prøver, ved at fastsætte en ny hæmolysegrænse på 0,2 g/l. Denne hæmolysegrænse blev fastsat ved at vurdere en række prøver, som var hæmolyseret i forskellig grad. Grænsen for hvornår en prøve er hæmolyseret blev målt på Architect på en række patientprøver, som blev sat op i en rækkefølge efter hæmolysegrænsen, og blev derefter vurderet af nogle udvalgte personer, som kunne fastsætte hvornår hæmolysegrænsen var synlig. På dette grundlag blev hæmolysegrænsen hævet fra 0,04 g/l, som på afdelingen antages som hæmolysefri, til 0,2 g/l.(9) Det faktum at den nuværende hæmolysegrænse er blevet fastlagt, uden efterfølgende afprøvning af eventuel betydning for analysesvarene, er kvalitetsmæssigt problematisk, da det muligvis kan have en negativ klinisk relevans for patienten mht. den korrekte behandling. På nuværende tidspunkt, ved man ikke om den visuelt fastlagte hæmolysegrænse har haft en klinisk betydning for analyseresultaterne, og om firmaets forholdsregel om hæmolyseret prøver ikke må anvendes, er korrekt. Endvidere ved vi ikke om det eventuelt er muligt at hæve den nuværende hæmolysegrænse, uden at det får klinisk relevans for analyseresultaterne. Vi ved ligeledes ikke om hæmolysens indvirkning er niveaubestemt og derved afhængig af koncentrationen af de respektive analyseparametre. En undersøgelse af hæmolysens betydning for analyserne folat, vitamin B12 og LD er betydningsfuld, for at kunne vurdere om det er muligt at indføre en højere hæmolysegrænse end den nuværende, samt om den nuværende grænse har negativ klinisk relevans. En afprøvning er nødvendig, for at kunne stå inde for kvaliteten og troværdigheden af analysesvarene. Side 8 af 71

9 Formål Formålet med dette projekt, er at undersøge hæmolysegrænsen for KBA under HeV på analyseapparatet Architect, for analyserne vitamin B12, folat og LD, og at få den så højt som muligt, uden at den har en negativ klinisk konsekvens for patienten. Problemformulering Hvor højt kan hæmolysegrænserne fastsættes for analyserne vitamin B12, folat og LD uden negativ klinisk påvirkning, hvordan forholder det sig til den nuværende hæmolysegrænse på KBA under HeV og valget af hæmolesegrænser for andre afdelinger? Målformulering Vi vil undersøge og sammenligne hvor stor en andel af prøverne der blev kasseret ved hhv. nul tolerance og 0,2 g/l ved at kigge på afdelingens statistik for året Vi vil finde de niveauer, som er relevante at tage med i projektet for folat, vitamin B12 og LD. Vi vil undersøge om hæmolyse har indvirkning på analyseresultaterne, og om dette er niveauafhængig ved at analysere en fortyndingsrække med stigende hæmolysegrader i relevante niveauer for hver af de tre analyser. Vi vil undersøge om der er signifikant forskel ved hæmolysens analyse resultater, for at se om der er præanalytisk og analytisk indvirkning, ved at anvende tre hæmolysegrader som udregnes ved en t-test. Samt en udregnet interaseriel præcision og en grafisk afbildning af analysens variation. Vi vil undersøge, om der er signifikant forskel på analysesvarene folat, vitamin B12 og LD og den vedtaget sande værdi, ved de forskellige hæmolysegrader ved at anvende bias som cut-off værdi i grafisk afbildning. Vi vil finde ud af, ved hvilken hæmolysegrad analysesvarene får en negativ klinisk relevans for hver af de tre analyseparametre. Dette gøres ved at udregne den gennemsnitlige relative ændring af målingerne for hver analyse, som indsættes i et differensplot med 90%-konfidensinterval til hver enkelt gennemsnit med tilhørende udregnede grænse for tilladte totalfejl. Vi vil vurdere, om grænsen på 0,2 g/l har negativ klinisk relevant betydning, ved at vurdere den grafiske afbildning med den udregnede 90%-konfidensinterval og sammenholde disse resultater med cut-off grænserne, tilladte totalfejl og bias. Side 9 af 71

10 Teori Folat Folat kendes også som vitamin B9 eller folinsyre. Folater er beslægtet med en gruppe stoffer, som består af en fælles kemisk grundstruktur,(2) der kaldes peteroylglutaminsyre(pga)(7). Dette er koblet til en eller flere glutaminsyreenheder via. en cyklisk forbindelse(2). Folat findes i planter, som mikroorganismer og andre steder i naturen. Hovedsageligt findes det i vores madvarer som grøntsager, frugt, brød, lever, nyre og mælkeprodukter. Det findes op til 90 % som polymere bindinger, som spaltes til monomerer vha. tarmcellernes børstesøm der indeholder dekonjugerende enzymer, som methylerer folat til 5-methyl-tetrahydrofolat(5-methyl-THF), der cirkulerer rundt i plasma. 5-methyl-THF bliver absorberet af en protonkoblet højaffinitets folattransporter(pcft) i den øvre del af tyndtarmen. Hovedparten af 5-methyl-THF er løst bundet til albumin, hvor den resterende del er bundet til leukocytter ved hjælp af et specifikt protein. 5-methyl-THF bliver optaget af vævscellerne fra plasma gennem membranbundne folatbindende proteiner og folattransportere, der er afhængige af vitaminet cobalamin. Derfor ses der øget folat mængde i plasma ved cobalaminmangel, som dermed medfører folatmangel (2). Folater fungerer som cofaktor, idet den overfører et kulstof i en række forskellige metaboliske processer. Folater er nødvendige i nukleinsyre- og mitokondrieproteinsyntesen, samt aminosyremetabolisme (7). Idet 5-methyl-THF afgiver sin methylgruppe vha. Cobalamin, til homocystein ved dannelse af methionin, da THF indgår i syntese af thymin og puriner, som er nødvendig for syntesen DNA, RNA og aminosyremetabolismen. Ved Cobalamin mangel kan THF ikke afgive sin methylgruppe, som derfor bliver inaktiv (2). Folatmangel opstår hos personer med lavt indtagelse af fødevarer, malabsorptionstilstande der skyldes mave- og tarmlidelser, mangelfuld udnyttelse der er opstået af enzym mangel eller behandling med folatantagonister, medikamenter, alkoholikere og ved graviditet, som medfører et stort behov for folat. Mangel på folat under graviditet kan medføre en øget risiko for neuralrørdefekt hos fostret (5). Folatmangel og vitamin B12 mangel kan begge føre til en makrocytær anæmi. For at give den rigtige behandling, er det nødvendigt at få oplyst værdier for både vitamin B12 og folat. Ved folatmangel ses lave værdier i serum. Ved cobalaminmangel er folatværdier forhøjet i serum.(2) Side 10 af 71

11 Ved folat, skal man være opmærksom på prøver, der er taget af praktiserende lægeklinikker med et svar der er <7 nmol/l, da det kan være falsk for lav. Der anbefales ved sådanne tilfælde, at blodprøven skal tages om ved KBA s ambulatorium. Analysen er lysfølsom, og interfererende stoffer, kan give falsk forhøjede eller falsk nedsatte værdier. Prøver fra patienter, som har fået præparater, der har indeholdt musemonoklonale antistoffer, kan indeholde anti-mus antistoffer i kroppen, som kan interferere med selve analysen og give falsk forhøjede eller falsk nedsatte resultater (10). Referenceinterval for folat: 0 1 år nmol/l 1 18 år 6 35 nmol/l år >9 nmol/l Tabel 1. Referenceinterval for folat. (10) Vitamin B12 Cobalamin hører til corringruppen, som er en cofaktor både ved omdannelsen af methylmalonylcoenzymet-a(co-a) til succinyl-coa, samt ved syntesen af metionin ud fra homocystein, der indgår i dannelsen af myelin, hvor den indgår sammen med folat, er cobalamin nødvendig i DNA-syntesen. Vitaminet B12 absorberes fra kosten, idet der sker en binding til et protein der kaldes intrinsic faktor, som produceres i mavesækken(2,6). Cobalaminmangel kan inddeles i tre kategorier: Ernærings betinget mangel, Malabsorptionstilstande, samt andre gastrointestinale årsager, der kan forårsage megaloblastær anæmi, skader på nervesystemet og degeneration af rygmarven. Ved en mild cobalaminmangel kan der opstå skader på muelinskeden som beskytter nerverne, der kan føre til neuropati. Det kan i sidste ende medføre permanent skade, hvis symptomerne for den underliggende skade ikke bliver behandlet. Personer med defekte intrinsic faktorer, vil med tiden udvikle en megaloblastær anæmi i form af perniciøs anæmi, hvis de ikke bliver behandlet (6). Forekommer der et lavt vitamin B12 niveau i serum, som ligger under referenceområdet, er det tegn på at depoterne i vævet, er ved at være tomme. Ved et niveau i den lave ende af referenceområdet, betyder ikke at vitamin B12 niveauet er i orden, hvor patienter med symptomer skal undersøges for holotranscobalamin, homocystein og methylmalonsyre (6). Side 11 af 71

12 Et lavt niveau af vitamin B12 i serum, ses ved individer med jernmangel, graviditet, vegetarer, partiel gastrektomi/skade på ileum, cøliaki, orale kontraceptiva, parasitær konkurrence, pancreasinsufficiens, epilepsiterapi og ved ældre personer (6). Et lavt niveau af vitamin B12 i serum, ses lidelserne nyreinsufficiens, leversygdomme og myeloproliferative sygdomme (6). Interfererende stoffer som heterofile antistoffer og rheumafaktor, er en fejlkilde for analysen, og kan give falsk forhøjede eller falsk nedsatte værdier (11). Referanceinterval for B12: år pmol/l Tabel 2. Referanceinterval for B12. (11) LD Laktat dehydrogenase(ld) er et enzym som findes inde i cellerne, ved hjertet, leveren, nyrerne, musklerne ved skelettet, hjernen, de røde blodceller og lungerne. LD står for omdannelsen af muskellaktat til pyruvat, som er et vigtigt trin i produktionen af cellernes energi. LD består af fire peptidkæder, der yderligere består af to underenheder, som giver op til fem forskellige isoenzymer, der kan separeres og kvantiteres med elektroforese. Den totale LD aktivitet i plasma eller serum er ikke specifik og man kan derfor ikke skelne imellem hvilke vævstyper isoenzymkomponenterne stammer fra. LD kan anvendes til differentiel diagnosticering, af hæmolytisk anæmi og som tumormarkør ved nogle magliniteter, f.eks. kønscelletumorer. Den anvendes dog sammen med andre markører til diagnosticering og behandling, da den er en uspecifik markør. Forhøjede værdier af LD ses i forbindelse med hepatitis, glomerlus nefritis, pulmonær embolisme, muskelsygdomme og ved mange typer af leukæmi og lymfomer.(5) Lave værdier for LD har ikke klinisk betydning, men normale værdier kan ikke udelukke sygdom. Fejlkilder ved denne analyse, ses ved hårdt fysisk aktivitet de dage op til prøvetagning, som kan medføre let forhøjede værdier og opbevaring af prøven i køleskab giver falsk for lave værdier, da det er forkert opbevaring(12). Referanceinterval for LD: Side 12 af 71

13 Børn: 0-1 md U/L 1 md - 4 år U/L 4 16 år U/L år U/L Voksne: år U/L >70 år U/L Tabel 3. Referanceinterval for LD. (13) Hæmolyse Hæmolyse kan opstå ved en prøvetagning, in vitro, eller det kan opstå inde i patienten, in vivo. Hæmolyse er noget der opstår når erytrocytcellemembranen bliver beskadiget og hæmoglobinen bliver frigivet til plasma. Dette er en kendt fejlkilde, som ofte går ind og påvirker en række biokemiske analyser, så analyserne ikke kan udføres. Hæmolyse kan opstå ved patienters forskellige sygdomme f.eks. HELLP-syndrom eller hæmolytisk uræmisk syndrom, eller at patienterne fysisk kan beskadige erytrocytterne ved mekaniske hjerteklapper eller dissemineret intravaskulær koagulation. Den sidste grund kan skyldes den præanalytiske fejlkilde, ved en prøvetagning med forkert kanylestørrelse, en traumatisk prøvetagning, stasens varighed og forkert blodmængde i prøveglasset (8). Til vores undersøgelse kan in vitro resultater ikke stå inde for, hvad der vil ske in vivo. Fordi in vivo hæmolyse er mere komplicerede, end hvad der sker under in vitro hæmolyse. In vivo hæmolyse resulterer i, at alle de intracellulære komponenter bliver frigjort og kommer i omløb (14). Analyseprincip Analysen folat: CMIA er en detektions metode der måler og kvantificere analysekomponentkoncentrationen i plasma. CMIA er en metode til at bestemme forekomsten af antigener, antistoffer og analysekomponenter i prøver. Der anvendes paramagnetiske mikropartikler, der er coatet med et bindingsmolekyle, som er specifik til den analysekomponent der skal måles på, samt aridinmærket konjugat, prætriggeropløsning og triggeropløsning som er reaktanter i denne immunanalyse. En CMIA-reaktionssekvens er rækkefølgen af interaktioner mellem analysekomponenten i prøven og reaktanterne (bilag 1). Side 13 af 71

14 Prøven bliver forbehandlet før analyseproceduren. Forbehandlingen går ud på at skille folatbindingsproteinen (FBP) fra folat. Analyseprincippet til Folat, er en to-trins analyse der bestemmer kvantitativt folat mængden i humant serum, plasma og erytrocytter. Analysen foretages af en CMIA-metoden med fleksible analyseprotokoller, der kaldes Chemiflex, den kan tilpasses andre analyser som i dette eks. både folat og vitamin B12 samt mange andre analyser, alt efter hvad der skal måles på. Ved Pre-treatment trin 1, pipetteres patient plasmaet og blandes sammen med forbehandlingsreagens 2, dithiothreitol eller DTT og bliver derefter dispenseres ned i en reaktion-vessel celle (RV-celle). Blandingen inkuberes i 7 minutter. DTT spalter bindingen mellem folat og FBP hvor folat frigøres fra det endogene folatbindingsprotein(fbp). Ved pre-treatment trin 2, aspireres en mængde af forbehandlings trin 1 prøveblanding i en anden RV-celle. Forbehandlingsreagens 1, kaliumhydroxid eller KOH, bliver derefter tilsat. Blandingen Figur 1. Analysering af folat. Hvor der ses forbehandlings trin 1 og 2. (15) inkuberes i 7 minutter. Der sker en denaturering af FBP, som gør at prøvens FBP ikke længere kan binde sig med folat (7)(Bilag1). Efter forbehandlingen, kommer reaktions trin 1. Side 14 af 71

15 Figur 2. Reaktions trin1 for P-folat analyseprincippet(15). En mængde af den forbehandlede prøve, fra forbehandlings trin 2, bliver tilsat til en ny RV-celle. Derefter bliver der tilsat analysefortyndingsreagens og paramagnetiske mikropartikler der er coatet med FBP. Reagenset blandes og inkuberes i 18 minutter. Her dannes der et immunkomplex, hvor analysekomponenten, folat fra patienten, binder sig til mikropartiklen, der binder specifikt til folat. Derefter vil en magnet nær RV-cellen, tiltrække de mikropartikler som er bundet specifikt til analysekomponenten, folat, til indersiden af RV-cellen og de ubundne/overskydende mikropartikler bliver vasket væk. Efter reaktions trin 1, kommer reaktions trin 2. Figur 3. Reaktions trin 2 for P-folat analyseprincippet. (15) Derefter tilføjes der et reagens, som er et konjugat der er mærket med acridin med pteroisk syre, der binder sig til de frie pladser på FBP i immunkomplekset. Efter inkubationen bliver det ubundene materiale vasket væk, op til 3 gange med vaskebuffer. Side 15 af 71

16 Derefter tilsættes præ-trigger og trigger solution, der indeholder hydrogenperoxid, i RVcellen til immunkompleksblandingen (7). Analysen for vitamin B12: Analyseprincippet for vitamin B12 er også en to-trinsanalyse med en automatisk prøvebehandling, der bestemmer mængden af vitamin B12 i humant serum og plasma. Analysen er ligesom folat, baseret på CMIA-metoden. Prøven bliver forbehandlet før analyseproceduren. Forbehandlingen går ud på at skille vitamin B12 fra transcobalamin II og R proteiner. Prøven bliver blandet sammen med forbehandlingsreagens 1,2 og 3. Forbehandlingsreagens 1 indeholder natriumhydroxid med 0,005 % kaliumcyanid. Forbehandlings reagens 2 indeholder alfa-monothioglycerin og EDTA og forbehandlinge reagens 3 indeholder cobinamiddicyanid i boratbuffer med proteinstabillisatorer. Bindingen spaltes og B12 bliver fri gjort og non-physiologically aktiv cobinamid gør at den ikke længere kan binde sig til proteinet. Figur 4. Analysering af B12. Der ses forbehandling(15). Efter forbehandling kommer reaktions trin1. En bestemt mængde af det forbehandlede prøvemateriale aspireres og overføres til en ny RV-celle. Det forbehandlede prøvematerial bliver blandet sammen med analysefortyndingsopløsningen og paramagnetiske mikropartikler som er coatet med intrinsic factor. Den B12 der befinder sig i prøvematerialet vil binde sig til mikropartiklerne der er coatet med intrinsic factor. Side 16 af 71

17 Figur 5. Reaktions trin 1 af P-B12, analyseprincippet.(15) Efter reaktions trin 1 kommer reaktions trin2. I andet trin efter vask, tilsættes acridinmærket B12-konjugat. Derefter bliver der tilsat prætrigger og triggeropløsning til reaktionsblandingen. Til sidst måles kemiluminescerende reaktion i form af relativ lysenheder(rlu)(6). Figur 6. Reaktionstrin 2 af P-B12, analyseprincippet. (15) Måleprincippet: Der udføres en baggrundsmåling for folat og vitamin B12 af CMIA- systemets optik. Prætriggerens funktion sørger både for, at forhindre en for tidlig frigivelse af energi, ved at danne et syreholdigt miljø, samt at der ikke sker en sammenklumpning af mikropartiklerne, og at adskille acridin fra konjugatet, der er bundet til mikropartikelkomplekset, sådan at det lysemitterende stof acridin er frit til stede i opløsningen. Triggeropløsningen som er natriumhydroxid, tilsættes i reaktionsblandingen, hvor der sker en oxidation af acridin, idet øjeblik det udsættes for hydrogenperoxid og en alkalisk opløsning, som medfører en kemiluminescensreaktion (7). Når stoffet vender tilbage til sin gruntilstand, dannes der et ustabilt N-methylacridon, der henfalder ved at danne lys, der frigøres energi. Lyset bliver detekteret af det optiske system. Der måles kemiluminescensemissionen på CMIA- systemets optik. Det kemiluminescerede lys, som opstår under reaktion, måles som omvendt Side 17 af 71

18 proportionelt(bilag1). Til sidst måles kemiluminescensreaktion i form af relative lys enheder RelativeLysUnits(RLU). For at få det endelige resultat, anvendes der datareduktionsberegning, som sørger for at trække baggrundsmåling fra selve prøvemålingen. Mængden af folat i prøvematerialet samt mængden af RLU er som nævnt, omvendt proportionelt, som betyder at jo højere signal der bliver detekteret, jo lavere er folat og vitamin B12 koncentrationen.(7) Analysen for LD: Laktatdehydrogenase er et hydrogenoverførende enzym, der katalyserer oxideringen af L- laktat til pyruvat med NAD + som hydrogenacceptor. L-laktat + NAD + Pyruvat + H + Laktatdehydrogenase Figur 7. Her ses den kemiske reaktion for LD analysen. NADH (3) Dette er en kinetiske analyse, hvor reaktionen opnår en stabil aktivitet, hvor absorbansændringen er konstant mellem aflæsningerne. LD måles ved en fotometrisk metode, som er måling af den mængde lys prøven absorberer. Dette gøres ved at sende en lysstråle igennen prøven, hvor man måler styrken af det lys som detektoren opfanger og registrer hvor meget lys der er passeret igennem kuvetten. Forholdet mellem opløsningens absorbans og analysekomponentkoncentrationen bliver fastsat ved en matematisk udregning som foretages ud fra Beers lov.(13) Fotometri anvendes til at bestemme koncentrationen af farvede stoffer i en opløsning. Lambert-Beers lov fortæller at der er en lineær sammenhæng mellem absorbans og koncentartionen af det farvede stof. Opløsningsmidlet absorberer også lys, derfor skal spektrofotometeret nulstilles med en kuvette der kun indeholder opløsningsmidlet, den kaldes for referencekuvette. Lysintensiteten som registreres fra referencekuvetten betegnes I 0. Lysintensiteten der registreres fra selve prøven med analysekomponentkoncentrationen betegnes som I. Absorbansen, betegnes som den værdi spektrofotometeret giver som resultat, og er ifølge Lambert-Beers lov, (16) Side 18 af 71

19 Den lineære sammenhæng der vises ud fra Lambert-Beers lov, anvendes til at udføre den lineære regression til at fastlægge den matematiske sammenhæng mellem absorbans og koncentration (17). Der foretages en del aflæsninger imens systemet også beregner absorbansændringen pr. minut, hvorefter den anvender aflæsningerne til at beregne resultaterne. Systemet anvender den lineære mindste kvadraters metode, til at udregne absorbansændringen pr. minut, under hovedaflæsningstid. Denne beregning omfatter mindst tre fotometriske punkter (13) Målingerne foretages når reaktanten er opbrugt og reaktionen er stabil. Dette skal forståes som at målingen følger reduktionen af NAD + til NADH. Reduktionen viser oxideringen af laktat, som er et udtryk for LD koncentrationen. Der måles på NADH, som absorberes ved en bestemt bølgelængde (13). HIL-indeks: Hæmolyse koncentrationen til analyserne folat, vitamin B12 og LD, bliver målt vha. en måling af prøveinterferensindekser, som er en proces der anvendes til at måle både hæmolyse, ikterus og lipæmi. Det kaldes et HIL-indeks som udføres ved en direkte fotometrisk måling. Måling af hæmolyse er grundet absorbansmålingen af den røde farve fra hæmoglobin. Prøver der indeholder stoffer der interfererer, vil blive absorberet ved forskellige bølgelængder. For at måle hæmolyse, anvendes der fire bølgelængdepar, på 500nm/524nm, 572nm/604nm, 628nm/660nm og 524nm/804nm, og ved hjælp af de relevante fotometriske aflæsninger, anvendes der en matematisk beregning til at bestemme den relative interferenskoncentration, der udføres af et computersystem.(bilag1) Side 19 af 71

20 Figur 8. Der ses absorptionspekter for NADH og hæmolyserede, ikteriske og lipæmiske prøver.(bilag1) Materialer og metoder Materiale Apparatur: Architect c16000 fra Abbott Architect i2000sr fra Abbott Centrifuge, Eppendorf 5804R Centrifuge, Eppendorf 5810R Tabel 4. Oversigt over anvendte apparatur til forsøget med fulde navn. Reagenser: Folat: Architect folat reagent kit - lot nr: 27902UI00 B12: Architect B12 reagenst kit - lot nr: 28921UI00 LD: 2P56 Lactate Dehydrogenase reagent kit - lot nr: 50263UN13 (C1+C2) I-modul: Trigger - lot nr: 31281LF00 Pretrigger - lot nr: 31392LF00 Wash - lot nr: 32109LF00 Side 20 af 71

21 C-modul: vand fra Elix vandanlæg fra milipore Tabel 5. Oversigt over reagenser, der er anvendt i forsøget til analyseparametrene og tilhørende moduler på Architect og deres Lot nr. Utensiler: Hæmolyserede erytrocytter, til hæmolysat Plasma, fra lithium/heparin glas. Pipetter og spidser: Biohit m100, µl spidser fra Sartorius: Biohit optifit tip lot nr: PR Biohit proline, µl spidser fra Sartorius: Biohit optifit tip lot nr: PR Biohit m10, 0,5-10 µl spidser: Biohit safetyspade filter tip lot nr: PR Prøveglas Låg Magnet mikser Engangspipetter Målebæger, til plasma pool Køleskab Fryser, - 80 C Tabel 6. Oversigt over andet materiale der er blevet anvendt til forsøget, med tilhørende Lot nr. ved pipetter og spidser. Metode Kalibrering og kontrol: For at sikre at kontrolkravene til Architect overholdes, udføres der en gang daglig kontrol på Architect for analyserne folat, vitamin B12 og LD, og i forbindelse med kalibrering skal kontrollerne for analyserne analyseres, det samme gælder også ved vedligeholdelse på apparatet. Kontrolværdierne skal ligge inden for acceptkriterierne, der er defineret af Westgards regler. Laboratoriets kvalitetskontrolprogram anvender en godkendelseskontrol, Side 21 af 71

22 AKP, og en langtidskontrol, HK, til både folat, vitamin B12 og LD. AKP bliver testet med 40 målinger en gang dagligt og HK bliver testet mandag, onsdag og fredag med 40 målinger. HK bliver indsendt til DEKS en gang om måneden. Kontrollerne udføres for at fastsætte en ny targetværdi. Targetværdien kan justeres og må ændres til +/- 1SD i forhold til den opgivet targetværdi (6,7,18,19). Forekommer det at resultaterne for analysernes kvalitetskontrol ikke overholder laboratoriets fastlagte acceptgrænser, kan patientresultaterne være upålidelige og dermed ugyldige (5). Der udføres kalibrering for både folat, vitamin B12 og LD når der anvendes et reagenssæt med nyt lot nr. Derudover vurderes der, hvornår det er en nødvendighed at udføre kalibrering, ud fra Westgards regler. For LD der analyseres på C-modulet gælder det, at der udføres en kalibrering mindst en gang hver tredje måned (16). Kalibreringen for folat og vitamin B12 skal udføres med dobbeltbestemmelse for kalibratorerne A-F. Området for folat kalibrering er 0,0 20,0 ng/ml og for vitamin B12 er kalibreringsområdet pg/ml( pmol/l) (6,7). LD kalibres med vand eftersom analysen har en fast faktor. Kalibreringen bliver sammenlignet med den tidligere kalibrering, som maksimum må ligge 10 % i afvigelse. Efter kalibrering må AKP-kontrollen ikke ligge udenfor S2 ifølge Westgards reglen (19). Pilotforsøg: Undersøgelsen af hæmolysegrænsen er lavet med udgangspunkt fra dette pilotforsøg, som vi lavede inden det endelige forsøg. I pilotforsøget blev der udtaget 15 blodprøver i litiumheparin glas, disse blodprøver blev taget efter afdelingens forskrift for blodprøvetagning og efterfølgende korrekt håndtering (10,11,13,20). Vi foretog os nogle små forsøg, inden det endelige pilotforsøg gav gode og acceptable resultater. I det første forsøg vurderede vi at hæmolysegraderne var for høje, i forhold til den lille mængde hæmolysat der var tilføjet til plasmaet. I det andet forsøg, forsøgte vi at skabe en pæn fortyndingsrække. Ud fra målingerne kunne vi udregne via. fortyndingsformlen, hvilken plasma med angivet mængde hæmolyserede plasma, der egnede sig bedst som hæmolysat. Derefter viste det sig desværre, at disse mængder gav for store hæmolysegrader. Derfor lavede vi en lineær regression ud fra de målte værdier, som gjorde det muligt for os, at udregne hæmolysegraden ved 80 og 100 µl tilsat hæmolyserede erytrocytter. For at se de første forsøg som giver optakt til det endelige pilotforsøg se bilag 2. Side 22 af 71

23 Prøve nr. 4C 5C µl erytrocytter Hæmolysegrad(udregnet) g/l 14,42 18 Tabel 7. viser udregnet hæmolysegrad ved prøve 4C og 5C, der er udregnet ud fra lineærregression med tilhørende ligning. Ud fra fortyndingsformlen og ovenstående tabel 7, som viser de udregnede hæmolysegræder, kan der udregnes hvor mange µl der skal afpipeteres ved fortyndinger med hhv. 80 og 100µL hæmolyserede erytrocytter dette skal bruges til et hæmolysat som skal tilføjes i prøveglas med 1,5 ml plasma, med forskellige mængder, for at få forskellige hæmolysegrader(tabel 8). Ønsket hæmolyse 0,05 0,1 0,5 4C (udtaget µl) 5, ,8 5C (udtaget µl) 4,4 8,9 44 Tabel 8. Prøve 4C med 80 µl hæmolyserede erytrocytter med 1,5 ml plasma og 5C med 100 µl hæmolyserede erytrocytter med 1,5 ml plasma, hvor tabellen viser den tilhørende mængde for afpipetering for at få ønskede hæmolysegrad. Der blev vurderet, at den bedst anvendelige fortynding er et hæmolysat med 100µL tilsat hæmolyseret erytrocytter og 1,5 ml plasma. Ved brug af fortyndingsformlen udregnes, på baggrund af den beregnede hæmolysegrad, hvor mange µl der teoretisk skal tilsættes for at opnå den ønskede fortyndingsrække med de forskellige hæmolysegrader. De beregnede mængder blev afrundet til hele hundrede. Efterfølgende blev 7 glas med 1,5 ml plasma, tilføjet med anførte mængder, af det valgte hæmolysat. Hæmolysen blev målt(tabel 9). Det viste sig at det valgte hæmolysat, der anvendes til fortyndingerne blev målt til at være 19,6 g/l. Denne værdi ligger højere end det teoretisk udregnede(tabel 7), hvor det vurderes til, at denne usikkerhed forekommer, og derfor afrundes de beregnede mængder også til hele hundrede. Prøve nr. 1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D Ønsket 0,07 0,1 0,15 0,2 0,3 0,4 0,5 hæmolyse g/l Tilsat 6,22=6 8,89=9 13,33=13 17,78=18 26,67=27 35,56=36 44,44=44 Side 23 af 71

24 hæmolysat i ul Målt 0,13 0,16 0,21 0,28 0,38 0,49 0,61 hæmolyse g/l Tabel 9. Viser 7 prøveglas med 1,5 ml plasma med hver sin mængde hæmolysat, der bliver tilsat for at få de ønskede forskellige hæmolysegrader. Ud fra tabel 9, kan vi konkludere, at det er lykkedes os at finde en god fortyndingsrække. Til vores endelige forsøg, vil vi tilføje flere hæmolysegrader i det lave område, for at dække det bedst muligt. Det gøres ved at tilføje 2 ekstra prøveglas med 1,5 ml plasma med tilføjede 4µL og 5 µl hæmolysat. Fremgangsmåde: Forsøget blev foretaget, for at undersøge om hæmolyse har en negativ klinisk effekt på analysesvaret for folat, vitamin B12 og LD. Dette blev undersøgt ved forskellige hæmolysegrader. For at få et indblik i hvornår hæmolyse forekommer med en hæmolysegrad der har en klinisk effekt, som ville være kritisk for analyseresultatet, udarbejdede vi et pilotprojekt. Forsøget er udført med udgangspunkt i det endelige pilotforsøg. Der blev inden afpipetering af prøvematerialet, fastsat en ens afpipeterings metode, for at undgå præanalytisk fejlkilder. Prøverne blev håndteret ens og opbevaret efter forholdsreglerne (10,11,13). Indsamling: Først blev prøverne indsamlet ved, at der blev kigget efter de ønskede koncentration niveauer, der gælder for normale og lave værdier for folat, normale og lave værdier for vitamin B12 og normal værdi for LD. Valget af disse niveauer er bestemt ud fra referenceintervallerne, der gælder for voksne personer (10,11,13). Koncentrationsniveauerne for analyseparametrene, blev udvalgt efter en aftale med overlæge Kaj Over Pedersen (21). Derefter blev prøvernes hæmolyse værdi tjekket, som skulle være 0,04 g/l, da det antages som en prøve der er hæmolysefri. Plasmaet fra prøverne blev afpipeteret og anbragt i individuelle nye glas, mærket med nye prøvenummere, dato og koncentartionsværdierne for folat, vitamin B12 og LD. Holdbarheden for folat og vitamin B12 efter centrifugering og afpipettering, er 2 dage ved Side 24 af 71

25 stuetemperatur og 7 dage i køleskab ved 2-8 C og for LD efter centrifugering og afpipettering er 7 dage ved stuetemperatur og 4 dage i køleskab ved 2-8 C (10,11,13). Plasmapools: Efter en uge, havde vi indsamlet nok materiale til vores forsøg, og vi kunne foretage en korrekt opstilling af forsøget og foretage en analyse af prøverne. Det indsamlede plasma blev for hvert koncentrationsniveau og analyseparameter anbragt i en fælles plasmapool: Plasma pool for normal folat, plasma pool for lav folat, plasma pool for normal vitamin B12, plasma pool for lav vitamin B12, plasma pool for normal LD. Hæmolysat: Der blev lavet et hæmolysat til hver enkelt niveau og analyseparameter, ved at anbringe 1,5 ml plasma fra det pågældende plasmapool i et glas og tilføje 100 µl hæmolyseret erytrocytter, som også blev anvendt i pilotforsøget. Hvert enkelt plasmapool, blev fordelt ud i 10 glas, med 1,5 ml plasma, mærket med individuelle prøvenumre. Der blev tilsat 0µL, 4µL, 5µL, 6µL, 9µL, 13 µl, 18µL, 27µL, 36µL eller 44 µl hæmolysat til hver enkelt glas. Prøven uden hæmolysat, anvendes som 0-prøven med den vedtagne sandeværdi. Hæmolysegraden blev først målt og derefter blev der analyseret på analyseparametrenes koncentration med dobbeltbestemmelse. Resultaterne blev indskrevet og bearbejdet på en computer med efterfølgende udregninger for at se en grafisk afbildning med den maksimale tilladte totalfejl og den maksimale tilladte bias som cut-off værdi. Den maksimale tilladte totalfejl, viser hvornår hæmolyse får en klinisk relevant betydning. Dertil er der også udregnet et 90%-konfidensinterval til punkterne med den gennemsnitlige relativ ændring i procent af målingerne. Bias anvendes til at se den, statistiske signifikante forskel, mellem den gennemsnitlige måling og den vedtaget sande værdi. Vi udvalgte tre prøver fra LD forsøget, hvor der blev foretaget yderligere 10 målinger på hver af de tre prøver med forskellige hæmolysegrader, som blev antaget til at være, 0,02 g/l, 0,2g/L og 0,6 g/l. Prøverne blev anvendt som en kontrolprøve, der blev analyseret flere gange lige efter hinanden, på samme maskine, med samme operatør, samme reagens, samme kalibrering. Dette gøres for at udføre hver enkelt måling så identisk som det overhovedet er muligt. Der blev efterfølgende foretaget udregninger på hæmolyse resultaterne, for at se en mulig statistisk signifikant forskel mellem målingerne og den Side 25 af 71

26 sande værdi, samt en grafisk afbildning. Derudover foretages der udregning for interaseriel præcision, for denne analyse, for at vurdere den analytiske variation. Databearbejdning: Bias er defineret som forskellen mellem middelværdien af uendelig mange målinger og prøvens sande værdi. Bias er bestemt ved følgende formel: (17). Maksimale tilladte bias, Bias max, er defineret som analysens korrekthed, som viser hvor meget analyseresultatet må ændre sig, ved følge af den stigende hæmolysegrad. Den har ikke klinisk betydning og derfor har ændringen af analyseresultatet, på grund af den stigende hæmolysegrad, ingen klinisk betydning. Er ændringen signifikant mindre end den maksimale tilladte bias, vurderes prøvematerialet til at være anvendelig. Overskrides den, gives der udtryk for en systematisk variation (Bilag3). Kvalitetskravet til korrektheden for P-folat, P-B12 vitamin og P-LD, der definerer grænserne for den tilladte relative ændring indsættes i et differenseplot, de bliver valgt ud fra KBA s valideringsrapport for de respektive analyser. Bias max % for P-folat er sat til at være 19,2%, for P-B12 vitamin 17,7% og for P-LD er den 4,3% (22,23,24). Ud fra Westgards hjemmeside er maksimale tilladte bias udregnet ud fra intra- og inter- individuel biologisk variation (25). Der skal nu undersøges om den statistiske signifikante forskel Bias max, har en klinisk relevant betydning, som gøres ved at lave et differenseplot med de målte værdiers difference i %, med tilhørende stigende hæmolysegrader, ved at indtegne den maximale tilladte totalfejl. Den fortæller noget om hvor meget en måling må afvige fra den sande værdi, før det har en relevant klinisk betydning. Tilladte totalfejl indeholder værdien præcision, CV i %, som er en individuel værdi for hver analyse, samt analysens korrekthed, bias max %, der er udregnet ud fra den biologiske variation. Præcisionen, CV% max er valgt til analyseparametrene folat, vitamin B12 og LD,ud fra KBA under HeV, mål for analysekvalitet på Architect i2000 og c16000 (22,23,24). Side 26 af 71

27 Ved at tilføje et 90%- konfidensinterval, inddrages den analytiske usikkerhed. Ved at beregne 90%-konfidensinterval bliver signifikansniveauet for den enkelt test 5%. Der antages det at der er 95% sandsynlighed for at parameterens sande værdi ligger i konfidensintervallet. Det gør det muligt at udelukke, at det ikke er en tilfældighed, at den gennemsnitlige relative ændring, ligger inden for grænsene, som er defineret af den tilladte totalfejl og maksimale tilladte bias. Den er ens for hver enkelt analyse. 90%- konfidensintervallet tilføjes til den pågældende analyse, for hvert enkelt gennemsnitligepunkt. 90%-konfidensintervallet indebærer analyseusikkerheden, CV% ana, for hver enkelt analyseparameter. Den er den sammen CV værdi, som ved CV% max for folat, vitamin B12 og LD ved tilladt totalfejl udregning (22,23,24)(bilag3). Ved hæmolysens analyse, er der valgt at udregne en t-test med én stikprøve, da der er tale om normalfordeling. Formålet med denne test er, at man kan sammenligne middelværdien af én population med en kendt værdi. I dette tilfælde kan vi se om der er en signifikant variation af middelværdien af analyseresultaterne og prøvernes sande værdi. Frihedsgraden (f) bliver sat til at være 9 ud af 10 målinger, i det frihedsgraden er lig n-1 (17). Der opstilles en hypotese til hver hæmolysegrad(tabel 11). H 0 : Der er ikke signifikant variation på de H 1 : Der er signifikant variation på de målte målte værdier med tilsat 0µL hæmolysat værdier med tilsat 0 µl hæmolysat med med forventede hæmolysegrad på 0,02 g/l forventede hæmolysegrad på 0,02 g/l H 0 : Der er ikke signifikant variation på de H 1 : Der er signifikant variation på de målte målte værdier med tilsat 13 µl hæmolysat værdier med tilsat 13 µl hæmolysat med med forventede hæmolysegrad på 0,2 g/l forventede hæmolysegrad på 0,2 g/l H 0 : Der er ikke signifikant variation på de H 1 : Der er signifikant variation på de målte målte værdier med tilsat 44 µl hæmolysat værdier med tilsat 44 µl hæmolysat med med forventede hæmolysegrad på 0,6 g/l forventede hæmolysegrad på 0,6 g/l Tabel 10. Her ses en opstillede hypotese til hver hæmolysegrad på 0,02 g/l, 0,2 g/l og 0,6 g/l. Derudover laves der også en interaseriel præcision på hæmolyse målingen, da forsøget er foretaget indenfor et kort tidsinterval og indenfor samme måleserie. Interaseriel kan oversættes til repeterbarhed, som indebærer at præcisionen svare til den mindst mulige Side 27 af 71

28 analytiske variation der kan opnås. Ved at udregne dette, kan man udelukke mange kilder til variation som overhovedet mulig. Udregning af interaseriel peæcision anvendes variationskoefficient, der er defineret som: Det er spredningen der er delt med middelværdien. SD betegnes som standardafvigelse, der fortæller noget om hvor langt hver enkelt måling spreder sig fra middelværdien (17). Etik: Der var ingen etiske overvejelser, da vi ikke foretog prøvetagning af patienter for at indsamle prøvemateriale til vores forsøg. Vi målte på analyseparametre som i forvejen var blevet analyseret og afsluttet, derfor havde vores forsøg ingen etisk tilgang til patienterne, da vi selv efterfølgende tilføjede hæmolysat til plasmaprøverne. Litteratursøgning: Jeg har søgt materiale på googles søgemaskine, for at finde materiale der omhandlede basal viden omkring folat, vitamin B12 og LD. Her valgte jeg hjemmesiden, sundehed.dk og læste om analyseparametrene inde under lægehåndbogen, som indeholdte referencer fra faglige bøger og tidsskrifter og fagmedarbejdere som var læger. Derudover anvendte jeg også min gamle studie bog, Lyngbyes laboratoriemedicin, som er en pålidelig kilde, der indeholdte meget teori om folat og vitamin B12. Jeg søgte efter artikler på Bibliotek.dk og fandt en dansk artikel fra ugeskrift læger der var skrevet af en reservelæge og overlæge fra afdelingen KBA. Til sidst søgte jeg på Pubmed.dk, hvor jeg fandt et par videnskabelige engelske artikler, som kunne anvendes. Vi fik også tildelt en masse materiale fra personalet på KBA i Holstebro fra Abbot, der indeholdte en god teori til hver analyseparameter og hvordan Architect fungerede, samt en tilsendt PowerPoint med afbildning af analysernes kemiske reaktioner. Generelt har jeg haft et kritisk syn på de materialer jeg har fundet og valgt dem med omhu, eftersom internettet også kan indeholde ukorrekt informationer omkring dette emne. Jeg har kigget på hvem der var forfatter, hvilke referencer der var vedhæftede og om disse også var troværdige. Side 28 af 71

29 difference i % Resultater Bias viser ud fra differenseplottene, at der er statistisk signifikant forskel mellem den sande værdi og middelværdien, for lav folat og normal LD, hvor der ikke ses en statistisk signifikant forskel for lav vitamin B12, normal folat og lav folat. I de nedstående 5 differenceplots, vises der differensen for analyserne folat, vitamin B12 og LD, som er den relative ændring i procent, for normal og lav P-folat, normal og lav P- B12 og normal P-LD, der er under indvirkning af de 10 forskellige stigende hæmolysegrader, samt den tilhørende gennemsnitlige relative ændring i procent. Der er tilføjet et 90%-konfidensinterval for hvert gennemsnit, som er baseret på analyseusikkerheden for hver enkelt analyseparameter. Den udregnede maximale tilladte totalfejl er indtegnet med vandrette mørkegrønne streger og maksimale tilladte bias er indtegnet med gule vandrette streger, for hver enkelt analyseparameter. Samt en tilhørende bedste rette linje, for hver analyseparameter, for at se om der er en lineær sammenhæng mellem analyse koncentration og hæmolysegraderne. For at se rådata til udregnede differenceplots ved figur 9, 10,11, 12 og 13 se bilag Differenceplot for normal folat Måling y = 21,826x - 0,935 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Måling 2 Tilladte total fejl Maksimale tilladte bias gennemsnitlige relative ændring -60 Hæmolysegrad g/l Figur 9. Her ses den relative ændring for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2, samt gennemsnittet (n=2) af den relative ændring i procent for den normale folat koncentrationen, der er under indvirkning af den stigende hæmolyse koncentration, ved 10 forskellige hæmolysegrader. Der er indtegnet 90%- konfidensinterval for hvert gennemsnit. Den maksimale tilladte totalfejl er indtegnet med mørkegrønne vandrette streger og den maksimale tilladte bias er indtegnet med gule vandrette streger. Side 29 af 71

30 differencen i % Differencen i % 80 Differenceplot for lav folat y = 44,476x + 10,15 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Hæmolysegrad g/l Tilladte total fejl Maksimale tilladte bias Måling 1 Måling 2 Gennemsnitlige relative ændring Figur 10. Her ses den relative ændring for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2, samt gennemsnittet (n=2) af den relative ændring i procent for den lave folat koncentrationen, der er under indvirkning af den stigende hæmolyse koncentration, ved 10 forskellige hæmolysegrader. Der er indtegnet 90%- konfidensinterval for hvert gennemsnit. Den maksimale tilladte totalfejl er indtegnet med mørkegrønne vandrette streger og den maksimale tilladte bias er indtegnet med gule vandrette streger. 40 Differenceplot for normal vitamin B y = -10,146x - 3,5462 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Hæmolysegrad g/l Måling 1 Måling 2 Tilladte total fejl Maksimale tilladte bias Gennemsnitlige relative ændring Figur 11. Her ses den relative ændring for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2, samt gennemsnittet (n=2) af den relative ændring i procent for den normale vitamin B12 koncentrationen, der er under indvirkning af den stigende hæmolyse koncentration, ved 10 forskellige hæmolysegrader. Der er indtegnet Side 30 af 71

31 differencen i % 90%-konfidensinterval for hvert gennemsnit. Den maksimale tilladte totalfejl er indtegnet med mørkegrønne vandrette streger og den maksimale tilladte bias er indtegnet med gule vandrette streger. 40 Differenceplot for lav vitamin B y = -0,7351x - 0,8946 R² = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Måling 1 Måling 2 Tilladte total fejl Maksimale tilladte bias Gennemsnitlige relative ændring -40 Hæmolysegrad g/l Figur 12. Her ses den relative ændring for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2, samt gennemsnittet (n=2) af den relative ændring i procent for den lave vitamin B12 koncentrationen, der er under indvirkning af den stigende hæmolyse koncentration, ved 10 forskellige hæmolysegrader. Der er indtegnet 90%-konfidensinterval for hvert gennemsnit. Den maksimale tilladte totalfejl er indtegnet med mørkegrønne vandrette streger og den maksimale tilladte bias er indtegnet med gule vandrette streger. Side 31 af 71

32 differencen i % Differenceplot for normal LD y = 70,874x - 5,0243 R² = 0,9758 Måling 1 Måling ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Tilladte totalfejl Maksimale tilladte bias Gennemsnitlige relative ændring -20 Hæmolysegrad g/l Figur 13. Her ses den relative ændring for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2, samt gennemsnittet (n=2) af den relative ændring i procent i LD koncentrationen, der er under indvirkning af den stigende hæmolyse koncentration, ved 10 forskellige hæmolysegrader. Der er indtegnet 90%-konfidensinterval for hvert gennemsnit. Den maksimale tilladte totalfejl er indtegnet med mørkegrønne vandrette streger og den maksimale tilladte bias er indtegnet med gule vandrette streger. Ved undersøgelse af hæmolyse analysen, blev der udført en t-test, som viste for alle tre stigende hæmolysegrader, at der ikke ses en signifikant forskel mellem den sande værdi og middelværdien, se nedstående tabel 12. Prøve t-test H 0 hypotesen Nr LD med 0 µl hæmolysat (0- prøve) Nr LD med 13 µl hæmolysat Nr LD med 44 µl hæmolysat t<t-tabel t<t-tabel t<t-tabel H 0 hypotese accepteres H 0 hypotese accepteres H 0 hypotese accepteres Tabel 12. Viser resultater for udregnede t-test for de tre forskellige hæmolysegrader med 1,5 ml plasma med tilsat 0 µl hæmolysat, 1,5 ml plasma med tilsat 13 µl hæmolysat og 1,5 ml plasma med tilsat 44 µl hæmolysat, samt tilhørende hypotese resultat. For at se data til udregnede t-test se bilag 5. Side 32 af 71

33 Differencen i % 150 Differenceplot for Hæmolyse analysen Antal målinger LD med 0 µl hæmolysat LD med 13 µl hæmolysat LD med 44 µl hæmolysat Figur 14. Her ses differencen i % for hver enkelt måling, for de tre forskellige hæmolysegrader. For at se rådata til grafen se bilag 5. I nedstående tabel, vises interaseriel præcisionen for hæmolyse koncentrationen. Præcisionen falder kronologisk i procent fra 0-ptøven til 44 µl, og standardafvigelsen er tilnærmelsesvis ens. Prøve Middelværdi CV% SD ana Nr LD med 44 µl 0,601 1, , hæmolysat Nr LD med 13 µl 0,198 2, , hæmolysat Nr LD med 0 µl hæmolysat (0-prøve) 0,013 72, , Tabel 11. Her ses interaseriel præcision for hæmolyse målingen for 3 forskellige hæmolysegrader. For at se rådata til udregnede CV%, SD ana og middelværdi se bilag 5. Nedstående figur 15 viser statistik over prøver der blev kasseret med en hæmolysegrænse på 0,04 g/l for både folat, vitamin B12 og LD, hvor man tydeligt kan se at den er tæt på sit højeste antal kasserede prøver i marts måned. Herefter valgte afdelingen at sætte hæmolysegrænsen op til 0,1 g/l, hvor man ser at den først falder og derefter stiger. Den havde ingen effekt, ved ønsket om at færre prøver blev afvist. De valgte derfor at fastsætte en ny hæmolysegrænse, til at være 0,2 g/l i maj måned. Side 33 af 71

34 Antal prøver med hæmolyse i % Antal prøver med hæmolyse Antal prøver med svar "hæmolyse" år 2012 B12 Folat LD Periode Figur 15. Grafen viser statistik for analyseparametrene folat, B12 og LD i år 2012 med antal prøver, der ikke var muligt at foretage analyse på pga. hæmolyse. For at se data til graf se bilag 6. Nedstående figur 16, viser det samme som i figur 15, men grafen viser antal prøver i % og ikke i antal. 9,0% 8,0% Antal prøver med hæmolyse år ,0% 6,0% 5,0% 4,0% 3,0% 2,0% 1,0% 0,0% LD Folat B12 Figur 16. Grafen viser en statistisk oversigt over analyseparametrene folat, B12 vitamin og LD for året Der ses antal prøver i procent, der ikke blev analyseret, idet de blev erklæret unormal grundet hæmolyse. For at se data til udførelse af grafen, se bilag 6. Side 34 af 71

35 Diskussion Folat Der vises ingen statistisk signifikant forskel ved de målte værdier for normal folat (se figur 10), men derimod forekommer der en statistiske signifikant forskel der skyldes systematisk variation for de målte værdier for lav folat (se figur 11). Dette ses ved 0,08 g/l hæmolyse, der overskrider den maksimale tilladte bias. En vurdering af den bedste rette linje for normal folat viser, at der er en voksende lineær sammenhæng mellem folat koncentrationen og den stigende hæmolysegrad, hvor R 2 er 0,8227 og er tæt på 1, giver det udtryk for en lineær sammenhæng. Denne lineære sammenhæng er uden klinisk relevant betydning for analyseresultatet, idet ingen af punkterne med tilhørende 90%- konfidensinterval, falder uden for den maksimale tilladte totalfejl grænse, der er udregnet til at være 48,9 % for både øvre og nedre grænse. Derfor kan hæmolysegrænsen for lav folat fastsættes til at være 0,5 g/l. For lav folat ses dog tydeligt at målingen på de 10 prøver ikke viser et systematisk mønster og har stor variation, men ved at anvende bedste rette linje, ses der en voksende lineær sammenhæng mellem folat koncentrationen og den stigende hæmolysegrad. R 2 er 0,4086 og er et godt stykke væk fra 1, giver det udtryk for en svag lineær sammenhæng. Ingen af punkterne overskrider den øvre grænse men, den tilhørende 90%-konfidensinterval, overskrider den øvre grænse for tilladte totalfejl ved flere punkter, der kan derfor ikke udelukkes en negativ klinisk relevant betydning. Det er ikke muligt at fastlægge en hæmolysegrænse ud fra undersøgelsen af det lave niveau for folat, da målingen har for store variationer. Et mindre konfidensinterval havde været mere attraktivt, hvor vi burde havde foretaget flere målinger på 0-prøven for at sikre en mere korrekt måling og vi ville havde reduceret analyseusikkerheden. Dette var ikke muligt efter vores valg af dobbeltbestemmelse pr. prøve blev valgt ud fra økonomiske forhold (15). Der kan diskuteres om den lineære sammenhæng vil få en klinisk relevant betydning for normal folat, hvis der blev foretaget et lignende og udvidet forsøg, med større analysekoncentrationer og et større hæmolytisk område. Vitamin B12 Der vises ingen systematisk variation ved de målte værdier for normal og lav vitamin B12. En vurdering af differenceplottene (figur 11 og 12), viser at ingen af punkterne med tilhørende konfidensinterval, falder udenfor den maksimale tilladte totalfejl, der er valgt til at være 36,3 % for både øvre og nedre grænse. Derfor kan det konkluderes at analysen Side 35 af 71

36 vitamin B12 med normale og lave værdier, ikke bliver negativ klinisk påvirket af hæmolysen. Der ses dog en variation på op til 12% som stemmer godt overens med den valgte analytiske variation på 11,3% (23). Den udregnede 90%-konfidensinterval overskrider den maksimale tilladte bias i begge grafer, men idet at den er så bred, kan det ikke undgås. Ligesom ved folat, burde vi have stræbet efter et mindre konfidensinterval, ved at foretage langt flere målinger på 0-prøven. Målingerne virker til at være usystematiske, men ved at anvende bedste rette linje for normal vitamin B12, ses der en faldende lineær regression, efter som ligningen er og værdien a er -10,146. Y står for vitamin B12 koncentrationen og x værdien er hæmolysegraden i g/l. R 2 er 0,2151 og er tæt på 0, giver det tilnærmelsesvis et udtryk for, næsten ingen lineær sammenhæng mellem vitamin B12 koncentrationen og den stigende hæmolysegrad. Der ses ingen risiko for at hæmolysen har kliniske konsekvenser for patienterne i dette hæmolytiske område. Der kan visuelt vurderes ud fra differenseplottet, at hæmolysegrænsen umiddelbart kan fastsættes til 0,58 g/l for normale vitamin B12 værdier, og kan muligvis forhøjes, da værdien ligger langt fra at overskride grænserne. Det samme gælder for analysen vitamin B12 med lave værdier, ved at anvende bedste rette linje, ses en aftagende lineær sammenhæng, idet ligningen er og værdien a er -0,7351. For hver gang man skal lægge a værdien til y, for at gøre x én enhed større, vil y værdien blive mindre og mindre, derfor ses en aftagende sammenhæng. Y står for vitamin B12 koncentrationen og X er hæmolysegraden i g/l. Korrelationskoefficient, R 2 er 0,0018 og er tæt på 0, giver det udtryk for ingen lineær sammenhæng. Der ses derfor ingen risiko, for at hæmolysen har en negativ klinisk konsekvens for patienterne. Der kan visuelt vurderes ud fra differenceplottet, at hæmolysegrænsen umiddelbart kan fastsættes til 0,57 g/l, og kan hvis nødvendigt forhøjes, da værdien ligger langt fra at overskride grænserne. Målingerne af vitamin B12 med lave og normale værdier, er ikke særlige pæne, men kan anvendes og det er muligt at foretage en afgørelse ud fra disse målinger til forsøget. På KBA i Holstebro, er der blevet mundtligt fortalt, at vitamin B12 generelt ikke laver pæne målinger. Der blev foretaget et forsøg i Århus, Skejby hospital, som bekræftede at vitamin B12 målingerne varierede men at dette fænomen blev accepteret og der ses bort fra den analytiske variation(15). Vores forsøg viser også at denne variation, selv med stigende hæmolysegrader er acceptabel og at det ikke har en negativ klinisk relevant effekt på analyseresultatet. Side 36 af 71

37 LD Målingen er pæn og systematisk, og der vises en voksende lineære sammenhæng imellem LD koncentrationen og den stigende hæmolysegrad, eftersom ligningen er værdien a er 70,874. Y står for LD koncentrationen og x værdien er hæmolysegraden i g/l. R 2 er 0,9758 og er tæt på 1, giver det udtryk for en næsten perfekt lineær sammenhæng. Denne stigning stemmer godt over ens med teorien om erytrocytternes høje indhold af LD (5). Ud fra en vurdering af differenceplottet (se figur 13), vises en statistisk signifikant forskel ved de målte værdier for LD, ved hæmolyse graden på 0,12 g/l, i det den overskrider den maksimale bias. Den tilhørende 90%-konfidensinterval ligger kun lidt uden for den tilladte totalfejl grænse. Punktet med 0,14 g/l hæmolyse ligger derimod indenfor den maksimale tilladte bias og dens tilhørende 90%- konfidensinterval har ikke overskredet den øvre grænse, som er defineret af den maksimalt tilladte totalfejl, der er udregnet til at være 11,4 % for både øvre og nedre grænse. Derefter ses punktet med 0,2 g/l som ligger indenfor den øvre grænse, men 90%-konfidensintervallet ligger udenfor den øvre grænse og viser, at den kan have en relevant negativ klinisk påvirkning på analyseresultatet, og det kan være problematisk i forhold til afdelingens nuværende hæmolysegrænse. Punkterne med 0,26 g/l hæmolyse med tilhørende 90%- konfidensinterval falder udenfor den øvre grænse. Den hæmolysegrad har en relativ negativ klinisk påvirkning på analysen LD, ved normale værdier. Det er dog først i punktet med 0,39 g/l hæmolyse at hele 90%-konfidensintervallet ligger udenfor den øvre grænse, og at den har med 100% sikkerhed en relevant negativ klinisk påvirkning. Der kan visuelt vurderes ud fra differenceplottet, at hæmolysegrænsen umiddelbart på nuværende tidspunkt, kan fastsættes til at være 0,14 g/l for LD analysen, eftersom det antages at punktet inden, med 0,12 g/l hæmolyse, der overskrider den øvre grænse med sit konfidensintervallet er en analytisk usikkerhed (17), og punktet med 0,14 g/l hæmolyse overskrider ikke tilladte totalfejl grænse med 90%-konfidensintervallet. Afdeling for klinisk biokemisk ved Odense Universitetshospital, anvender ifølge deres validering og QC i AMS, for Architect, hæmolysegrænsen for analysen folat til at være 1,2 g/l, analysen vitamin B12 til at være 4 g/l og analysen LD til at være 0,2 g/l (26). Hæmolysegrænsen for folat og vitamin B12 ligger højere end ved KBA under HeV der er på 0,2 g/l, det kan understøtte vores undersøgelse af folat og vitamin B12, at deres grænser muligvis kan hæves. Derfor bør man undersøge hæmolysegrænsen for folat og vitamin B12 ved et højere hæmolytisk område, end medtaget i vores forsøg. For analysen og Side 37 af 71

38 LD er hæmolysegrænsen ens for Odense Universitetshospital og KBA under HeV, som generelt blev fast lagt for alle tre analyser, ud fra en visuel vurdering (9). I forhold til vores undersøgelse af LD, burde den ligge lavere, men for at beholde nuværende grænse, skal der foretages yderligere undersøgelse, for at udelukke den mulige negative kliniske relevans, der forekommer ud fra 90%-konfidensintervallet. Ved Odense Universitetshospital vides det ikke, hvordan de har fastlagt deres hæmolysegrænser (26). Bestemmelse af grænserne Ved udregningen af tilladte totalfejl, blev der anvendt afdelingens CV%, som bestemmes til at være mere velegnet end westgards værdier, eftersom præcisionen er tilpasset efter Architets analytiske usikkerhed ud fra en valideringsrapport (22, 23, 24). Ved anvendelse af westgards værdier til udregning af tilladte totalfejl, for analyserne folat og vitamin B12, ville grænsen havde været langt lavere, som ville være forkert at anvende (25). Afdelingen har anvendt westgards værdi for maksimale tilladte bias, der er mål for analysens korrekthed, som er bestemt ud fra den biologiske variation (22,23,24). For LD har afdelingen anvendt westgards værdier for CV% og maksimale tilladte bias (25), eftersom afdelingen ikke har foretaget beregninger for Architect ci16200 ved udskiftning af apparatur (24). Metode Niveauerne for folat og vitamin B12 er valgt, fordi vi er interesseret i at se om værdier inden for normalområdet kan påvirkes i en negativ klinisk retning. dvs. at der er risiko for at værdierne bliver fejltolket, og patienterne anses som syge, som er et falsk positivt svar. Den lave værdi for folat kan påvirkes i en retning, sådan at den bliver fejltolket, og patienten anses som rask, som er et falsk negativt svar. Niveauet for LD, er valgt, fordi det kun er interessant at kigge på det ene niveau, som er normale værdier for LD, der ligger indenfor referenceintervallet. Da en lav værdi ikke har nogen indflydelse på helbredet. Det er kun en normal værdi for LD som kan påvirkes i en negativ klinisk retning, sådan at den bliver fejltolket og anses for at være syg, som er et falsk positivt svar. Det gælder for alle tre analyser, at der er fravalgt et højt niveau, da det ikke giver mening at kigge på syge patienter, idet vi er interesseret i at se om hæmolyse garden påvirker de raske til at blive fejltolket til at være syg. Derfor er vi ikke interesseret i vores forsøg, at Side 38 af 71

39 kigge på syge patienter, som bliver gjort mere syg. Det har ikke den negative kliniske påvirkning som vi er interesseret i at undersøge for. Vores niveauvalg er blevet diskuteret og valgt i samarbejde med overlæge kaj Ove Pedersen (21). Det kan diskuteres om hæmolysegraden for hver enkelt analyseparameter skal fastsættes med hver sin hæmolysegrænse, eller om der skal fastsættes én overordnet hæmolysegrænse, der gælder for alle tre analyser. Denne undersøgelse har vist, at hæmolyse kan have en negativ klinisk påvirkning på analyseresultatet. Idet koncentrationen af analyseparametrene har en indflydelse på hvornår hæmolyse har en klinisk relevans og det ses tydeligt at interferensen er niveaubestemt. Derfor har det været vigtigt at afprøve det i forskellige niveauer for analyseparametrene, samt at medtage mange forskellige hæmolysegrader. Dette ses tydeligt ved folat målingen, ved værdier der er indenfor referenceintervallet, hvor hæmolysens indvirkning er kraftig og omvendt ses det ved værdier der er under referenceintervallet, hvor lille effekt hæmolyse har på analyseresultatet (figur 9 og 10). Men det er dog også et spørgsmål om, hvor meget hæmolyse der skal til prøver med folat der er under reference intervallet og i normalområdet, før det også får en negativ klinisk relevans for analyseresultatet, da vores resultater viser en voksende lineær sammenhæng og en svag lineær sammenhæng. Det er muligt i dette tilfælde, at hæmolysen skal være ekstrem og meget tydelig, før man ser hvornår hæmolysen får en klinisk relevant betydning for folat koncentrationen, at det ikke er sikkert at man på klinisk biokemisk afdeling vil opleve dette. Derimod ved målingerne for vitamin B12, ses der ingen tegn på at hæmolyse har en negativ klinisk relevans ved værdier der er under eller indenfor referenceintervallet på analyseresultatet, også selvom vores resultater viser en faldende lineær regression for vitamin B12 ved lav værdier, som er uden sammenhæng mellem analyse koncentrationen og hæmolysegraden (figur 11 og 12). Det ses tydeligt ved LD målingerne, at hæmolyse får en negativ klinisk relevans ved værdier der er indenfor normalområdet i referenceintervallet (figur 13). Denne observering giver grundlaget for, at hver analyseparameter skal have hver sin hæmolysegrænse på klinisk biokemisk afdeling og det vil absolut være det nemmeste og mest korrekte valg for afdelingen, at fastsætte en ny hæmolysegrænse for hver af de tre analyseparametre. Jeg er efterfølgende ikke enig med overlæge Kaj Ove Pedersen (21), om vores aftale med det valgte niveau til analysen vitamin B12, eftersom indledningen og teorien om vitamin Side 39 af 71

40 B12, fortæller at koncentrationen flader ved hæmolyse som er grundet vitaminets bindende enzymer (3,4). Derfor burde vi have taget et niveau med en høj vitamin B12 koncentration i stedet for det lave niveau, da man formentlig i sådan en situation, vil se en faldende lineær sammenhæng, mellem analyse koncentrationen og den stigende hæmolysegrad. Ud fra vores forsøg i graf (se figur 8) med en normal vitamin B12 koncentration, ses der en svagt faldende tendens ved gennemsnittet af målingerne, men ikke en lineær sammenhæng. Ved et højt niveau, vil jeg forvente at se en kraftigere faldende lineær regression, som ikke ses så tydeligt ved den normale vitamin B12 koncentration. I den situation vil der være risiko for at fejltolke svarresultatet, da vitamin B12 koncentrationen kan falde så langt, at den vil være indenfor normalområdet. Derudover vil jeg tilføje en hæmolyserække med en langt højere hæmolysegrad end den nuværende i forsøget, som vil kunne frembringe den lineære sammenhæng mellem analysekoncentrationen og den stigende hæmolysegrad, for netop at se en kraftigere faldende lineær regression, ved valget om at undersøge vitamin B12 med en høj koncentration, ses ud fra en anden undersøgelse af hæmolytisk interferens, hvor der anvendes et langt højere niveau af vitamin B12 koncentration end antaget i vores forsøg og fordi vitamin B12 har en tendens til at være niveauafhængig, hvor der ses en negativ bias i takt med den stigende hæmolyse koncentration. Der anvendes en vitamin B12 koncentration på 639,5 pmol/ml og der ses et fald på 20 % ved tilstedeværelsen af 0,385 g/dl hæmolyse (4). Hæmolyserække Derudover har vi i sammenråd med kemiker Mette F. Møller valgt vores hæmolyserække med varierende hæmolysegrader, sådan at vi fik afdækket det lave område ved at tilføje to ekstra plasmaportioner med 4 og 5 µl hæmolysat (27). Vores hæmolyserække virkede til at være indenfor et acceptabelt område, for at afdække den lave og høje ende af hæmolyse. Dog syntes jeg at det lave område er i orden, men derimod er det høje område ikke tilstrækkeligt fyldestgørende i dette forsøg. Hvis man skal sammenligne forsøget med andre lignende forsøg og virkeligheden, får vi kun et indblik i hvad mindre hæmolysegrader gør ved patientprøverne og deres svar resultat. Vores største hæmolysegrad når op på 0,6 g/l og det er generelt i den lave ende af skalaen, i forhold til den mængde de anvender i forsøget, hvor deres højeste hæmolysegrad går op til 3,2g/L og den midterste hæmolysegrad på 0,57 g/l svare til vores højeste hæmolysegrad (28). Det samme gælder ved en anden undersøgelse af hæmolytisk interferens, hvor de anvender en hæmolyserække der er kategoriseret fra 1-5, hvor nr.5 er den højeste hæmolysegrad, som Side 40 af 71

41 indeholder maksimum 4,5 g/l hæmoglobin, og deres lave ende der står for lidt eller mildt hæmolyseret med en hæmolysegrad på 2-3, der indeholder (0,10-0,50 g/l) og (0,51-1,00 g/l) hæmoglobin, er tilnærmelsesvis det samme som vores højeste hæmolysegrad (29). Jeg syntes, at vi burde havde valgt en hæmolysegrad, der ville ligge i den oprigtige høje ende af skalaen, når man kigger tilbage på vores forsøg og sammenligner den med andres undersøgelser om hæmolytisk interferens. Det ville have givet et mere realistisk forsøg med et mere brugbart resultat. Hvis man kigger på resultaterne, ses det at LD overskrider grænsen for hvornår der er en relevant klinisk betydning, og dermed er området for LD ved hæmolysegraden blevet afdækket. Derimod viser vitamin B12 og folat ikke, hvornår de overskrider grænsen, når det har en relativ klinisk betydning, og derfor må de to analyser undersøges ved højere hæmolysegrader, samt højere analyse niveauer som tidligere nævnt. Hæmolysat Vores hæmolysat er fremstillet ved at nedfryse erytrocytter, og er efter afdelingens forskrift blevet vasket, for at undgå andre interfererende stoffer, som kunne være med til at påvirke forsøget, udover selve hæmoglobinet. Vi er kun interesseret i et hæmolysat der er fremstillet in vitro, da det relatere til den hæmolyse der opstår i den præanalytiske del ved en blodprøvetagning. Andres lignende forsøg med hæmolytisk interferens, ses der en variation af forskellige måder at fremstille et hæmolysat. Der anvendes den osmotiske chok metode, til at fremstille et hæmolysat, hvor de anvendte heparin fuldblod. Det blev centrifugeret i 10 min, hvor plasmaet blev kasseret og erytrocytterne blev vasket i 0,9 % saltvand. Efter centrifugering i 10 min blev de overskydende rester i overfladen kasseret, denne proces blev gentaget to gange mere. De vaskede erytrocytter blev blandet op med type I ddh 2 O, som blev nedfrosset natten over ved -20 C. Efter optøning blev prøven bragt til stue temperatur og centrifugeret i yderligere 30 min for at eliminere mulige cellerester. Bundfaldet af hæmolysatet blev anbragt i et rent rør (4). Ved en anden undersøgelse, fik de fremkaldt hæmolyse lige som ved en mislykket blodprøvetagningen, ved at trække blodprøverne gennem nålen på en sprøjte for at hæmolysere cellerne ved en mekanisk metode, der skulle opnås hæmolyseret blodprøver med de respektive hæmolyseniveauer, en mild, en moderatet og en alvorlig hæmolyse (29). En tredje måde at fremstille et hæmolysat, gøres ved at separere erytrocytterne via centrifugering, derefter foretages der vask af tre omgange med isotonisk saltvand. Erytrocytterne blev lyseret ved at tilsætte en lige stor mængde af de-ioniseret vand og 2,0 mg natrium saponin pr. ml. slut volumen. Hæmolysatet blev undersøgt mikroskopisk for at sikre, at alle erytrocytterne var Side 41 af 71

42 blevet lyseret (28). Disse metoder er ikke ens, men de tre eksempler viser hvor varierende fremstillingen af et hæmolysat kan være. Vores hæmolysat minder lidt om de tre nævnte, men vi ved ikke om vores hæmolysat er godt eller dårligt, det er svær at svare på. Teoretisk vil jeg mene, at det hovedsageligt er godt nok til vores forsøg, i det vi havde fjernet plasmaet og nedfrosset erytrocytterne og derefter foretaget en vask af tre omgange efter en forskrift. Det er generelt det grundlæggende i en fremstilling af et hæmolysat. Vi kunne godt have forbedret vores hæmolysat, ved at mikroskopere det, for at sikre at alle erytrocytterne var ødelagt, samt at tilføje destilleret vand for at få en lavere viskositet, det havde gjort det nemmere for os at afpipettere det, når der skulle fremstilles et hæmolysat med 1,5 ml plasma og 100µL hæmolyseret erytrocytter. Vores metode til at lysere erytrocytterne, mener jeg er god og pålidelig, men i forhold til det eksempel, hvor de anvender en sprøjte og suger prøven igennem nålen, for at hæmolysere erytrocytterne, genskabes der en in vitro hæmolyse, som er den form for hæmolyse vi ville anvende. Hæmolyse analysen Hæmolysegradernes analyse, viser ved en udregnet t-test til hver analyse grad, at der ikke vises en statistisk signifikant variation mellem målingerne på hæmolysegraderne og den tilhørende sandeværdi, H 0 hypotesen, for de tre prøveglas med 1,5 ml plasma med tilsat 0 µl, 13 µl og 44 µl hæmolysat, bliver accepteret (tabel 12). Ud fra grafen (se figur 14), kan man se differencen i % for hver enkelt måling, kan man visuelt vurdere at prøverne med 13 og 44 µl hæmolysat, ikke har en stor variation mellem målingerne af hæmolysegraden iforhold til den antaget sande værdi. Derimod viser 0-prøven, at der er en forskel fra en af målingerne, op til 200 %, og 5 andre målinger viser at der er 100 % forskel fra den sandeværdi, hvor dette umiddelbart ikke er godt. Ud fra tabel 14, ses de udregnede værdier, for interaseriel præcision for hæmolyse analysen, som fortæller at denne analyse indgår i mindst mulige analytiske variation, i det CV% for prøven med13µl hæmolysat er 2,2% og CV% for prøven med 44 µl hæmolysat er 1,3%. Dette er en god analyseapparat til måling af hæmolysegraden ved de pågældende to hæmolyseniveauer, da sammenligningen af deres udregnede SD ana stemmer overens med den udregnede middelværdi som ikke må være tæt på samme værdi. For 0-prøven med ingen tilføjelse af hæmolysat, er CV% værdien 72,9% og er ummidelbart dårligt, men de små variationer af de målte hæmolysegrader, ved så små mængder, vil generelt udgøre voldsomme store variationer. Dette stemmer også overens med grafen i figur 14, som viser de enorme forskelle i % for målingerne. Dens udregnede SD ana er næsten ens med middelværdien, Side 42 af 71

43 som viser en uacceptabel præcision, som kan skyltes præanalytisk og analytisk indvirkning. Selve udregningen for interaseriel præcision, understøtter, at den analytiske variation ikke har nogen indflydelse på de målte hæmolysegrader, idet CV% værdierne for de to prøver er acceptable, imens 0-prøvens CV% er høj, men det giver god meningen iforhold til den meget lave værdi Jeg vil vurdere at denne analyse er tilfredsstillede. Desuden har vi kun udført 10 målinger og burde i så små niveauer have foretaget langt flere målinger, for at reducere analyseusikkerheden. Hvade vi foretaget flere målinger på 0-prøven, vil vi havde nærmet os den sande værdi, endnu mere end ved de 10 målinger. Der kan diskuteres om vores tilfældige valg at de tre glas, fra LD forsøget skulle have været udvidet med tre glas fra forsøget med folat og vitamin B12, for at se om de også gav samme gode resultater for hæmolyse målingen. Selvom den præanalytiske prøvegang og den ens afpipetering bude gå igen ved forsøget for alle tre analyseparametre, kan man aldrig undgå med 100% en forskel. Førhen foretog afdelingen en visuel vurdering af prøvernes hæmolyseniveau, ud fra en plakat, hvor der med sikkerhed ville blive foretaget en individuel vurdering ( se bilag 7). I dag er de som skrevet, gået over til en analytisk metode, til at måle hæmolyseniveauet, som med garanti har forbedret analyseparametrenes kvalitet. Ud fra vores vurdering af hæmolysekoncentartion analysen, er den god og præcis og der skal ikke være bekymringer omkring denne måling. Antal prøver med svar hæmolyse graf Der ses ud fra grafen (figur 15), at ændringen af hæmolysegraden, gik fra 0,04 g/l til 0,2 g/l, som førte til et fald i afviste prøver med hæmolyse. Dette har uden tvivl gavnet afdelingen både økonomisk, idet der skulle tages færre blodprøver og personalet skulle ikke bruge ekstra tid, både ved patienten og ved Architect, idet analysen ville forløbe som den skulle. Selvom der sker et fald i afviste prøver med hæmolyse, er der tale om små procenter, men en lille ændring er betydeligt bedre end ingen (figur 16). Grafen viser uden tvivl, at en højere hæmolysegrænse, resulterer i færre afviste prøver. Ud fra forsøget kan man diskutere hvordan hæmolysegrænserne i vores forsøg forholder sig til den nuværende hæmolysegrænse på 0,2 g/l, og hvordan det påvirker afdelingens prøvegang for analyseparametrene folat, B12 og LD. Det er ikke helt muligt at fastsætte en ny grænse for folat, da målingen ved folat er usystematisk og viser en stigende analysekoncentration som funktion af den stigende hæmolysegrad. Hvis der bliver valgt en højere grænse for folat, vil det betyde at afdelingen får færre afviste prøver, dette vil betyde en mulig positiv effekt på afdelingens økonomi. Den nuværende hæmolysegrænse på 0,2 g/l stemmer godt overens Side 43 af 71

44 med analysen vitamin B12, idet der ikke ses en negativ klinisk påvirkning af analyseresultatet, og grænsen kan forhøjes, hvis afdelingen ønsker dette og de kan undgå flere prøver bliver afvist, og de kan muligvis opnå, at der overhovedet ikke bliver afvist nogen prøver pga. den forhøjede hæmolysegrænse. Ved sådan en mulighed kan afdelingen får en positiv effekt på økonomien. For analysen LD, viser det sig at afdelingens nuværende hæmolysegrænse ikke stemmeroverens med vores forsøg, og at denne grænse er fastsat for højt. Der vil derfor blive afvist flere prøver idet den anbefalede nye hæmolysegrænse, med mere korrekt klinisk relevans burde være betydeligt mindre end den nuværende. Dette vil åbenlyst have en negativ effekt på økonomien. Man kan håbe, at de færre omtaget blodprøver ved analysen folat og vitamin B12 går lige op med de formodede ekstra, omtaget blodprøver ved analysen LD, også selvom det er tale om små procenter, idet antallet af prøver er nemmere at overskue i procenter og virker mindre voldsom (figur 16). Konklusion Ud fra denne undersøgelse kan man konkludere at hæmolysegrænsen for hver enkelt analyseparameter, skal fastsættes med en anden værdi, i forholdt til den nuværende hæmolysegrænse på KBA under HeV. For folat viser resultaterne af denne undersøgelse, at hæmolysegrænsen ikke kan fastsættes, da resultatet var for usikker grundet den store variation og det manglende høje hæmolytiske område. For vitamin B12 kan hæmolysegrænsen forhøjes op til 0,58 g/l samt en udvidet undersøgelse vil lægge op til at hæve hæmolysegrænsen yderligere. For LD viser resultaterne, at hæmolysegrænsen burde nedsættes til at 0,14 g/l, for at undgå en negativ klinisk påvirkning på analyseresultatet. Den nuværende hæmolysegrænse på KBA som er 0,2 g/l, er tilnærmelses vis ukorrekt at anvende, ifølge vores undersøgelse for analysen LD. Derfor bør de ændre den, sådan at den er tilpasset, for at undgå en negativ klinisk påvirkning på analyseresultatet. Det handler om kvalitet og ikke kvantitet, idet den nuværende grænse sørger for færre afviste prøver, er den klinisk ukorrekt at anvende for LD. Hvorimod vores resultater tyder på, at den nye anbefalede grænse for LD, muligvis vil forhøje antallet af afviste prøver, og den er kliniske korrekte at anvende. For folat og vitamin B12 vil grænsen kunne forhøjes og medføre et fald i afviste prøver. Odense universitetshospitals hæmolysegrænser er fastsat langt højere i forhold til KBA under HeV for folat og vitamin B12, men den stemmer godt overnes for analysen LD. I forhold til vores undersøgelse, giver Odense Universitetshospilat grundlag Side 44 af 71

45 for, at grænserne for folat og vitamin B12 kan forhøjes yderligere som antaget. Derimod skal analysen LD undersøges yderligere, hvis der er ønske om at beholde den nuværende grænse på 0,2 g/l. KBA kan anvende denne undersøgelse af hæmolysegrænsen med troværdighed, efter som der er anvendt grænser der indikere, hvornår der er en klinisk relevant påvirkning, med tilhørende 90%-konfidensinterval og hvornår der ses en statistisk variation.. Side 45 af 71

46 Perspektivering Denne undersøgelse har vist, at hæmolyse kan have en negativ klinisk påvirkning på analyseresultatet. Med denne viden er det muligt for afdelingen, at de kan foretage sig en vurdering af vores forsøgs resultater og derefter lade sig inspirrere sig til at foretage samme undersøgelse. Afdelingen kan foretage et forsøg, der er taget med udgangs punkt i vores forsøg, som de har forbedret, efter som der kan være mangler og fejl. Forsøget skal have henblik på den hæmolytisk interferens på analyseparametrene folat og vitamin B12 med større analysekoncentartion og højere måle område til hæmolyserækken. Side 46 af 71

47 Referenceliste 1. Anders Poulsen, Afd. Bioanalytiker på klinisk biokemisk afdeling, Holstebro. 2. J. Lyngbye, A. Kjær, S. Ladefoged, P. H. Nissen. Lyngbyes laboratoriemedicin. Nyt nordisk forlag Arnold Busck: Walter de Gruyter. Haemolysis: an overview of the leading cause of unsuitable specimens in clinical laboratories. Clin Chem Lab Med 2008;46(6): J.A. Snyder, M.W. Rogers, M.S. King, J.C. Phillips, J.F. Chapman, C.A Hammett- Stabler: The impact of hemolysis on Ortho-Clinical diagnostic s ECi and Roche s elecsys immunoassay systems.clinica Chimica Acta 2004;348: LD fra Abbott, (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: 6. B12 fra Abbott, (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: 7. Folat fra Abbott, (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: 8. M. Nybo, H. R. Nielsen, A. B. Hansen: Kliniske konsekvenser ved hæmolyserede blodprøver? Ugeskrift læger 2006, 14 August. 168/ Lone Broe Nees, Afd. Bioanalytiker på klinisk biokemisk afdeling, Holstebro. 10. Laboratoriehåndbogen for P-folat, (set 2013 december). Tilgængelig fra:?opendocument 11. E-dok, Laboratoriehåndbogen for P-cobalamin(B12), (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: 50E89?OpenDocument 12. E-dok, Lægehåndbogen,(set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: URL: E-dok, Laboratoriehåndbogen for P-Lactatdehydrogenase(LDH), (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: ument Side 47 af 71

48 14. J. Z. Ji, Q. H. Meng: Evaluation of the interference of hemoglobin, bilirubin, and lipids on Roche Cobas 6000 assays. Clinica Chimica Acta 2011(412): Hanne Lilleøre Levring, personale på klinisk biokemisk afdeling, Holstebro. 16. Lambert beers lov, (set 2014 febuar). Tilgængelig fra:url: Statnoter, (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: E-dok, Kontrolvejledning. Under kemi kalibrerings og kontrolvejledninger, kontrolvejledning Architect c og i modul, (set 2014 feburar). Tilgængelig fra: URL: E-dok , kalibreringevejledning. Under kemi- kalibrerings og kontrolvejledninger, (set 2014 febuar). Tilgængelig fra: URL: E-dok Blodprøvetagningsteknik, (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: 1E50057F2D4 21. Kaj Ove Pedersen, overlæge på klinisk biokemisk afdeling, Holstebro. 22. E-dok , Hospitalsenheden Vest, KBA- kvalitetsvaliderings rapport for analysen folat. (set 2014 febuar ). Tilgængelig fra: URL: E-dok , Hospitalsenheden Vest, KBA- kvalitetsvaliderings rapport for analysen vitamin B12. (set 2014 febuar). Tilgængelig fra:url: E-dok , Hospitalsenheden Vest, KBA- kvalitetsvalideringsrapport for analysen LD. (set 2014 febuar). Tilgængelig fra: URL: Westagrds værdier til grænser, der er defineret til maksimal tilladte totalfejl, (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: Odense Universitetshospital, afdeling for klinisk biokemisk og Farmakologivalidering og QC i AMS, (set 2013 december). Tilgængelig fra: URL: ering%20og%20qc%20i%20ams_2.doc 27. Mette. F. Møller, kemiker på klinisk biokemisk afdeling, Holstebro. Side 48 af 71

49 28. Joseph J, Frank, Edward W, Bermes, Margaret J, Blckel, Bruce F.W: Effect of in vitro hemolysis on chemical values for serum. CLIN. CHEM. 24/11, (1978). 29. M. Koseoglu, A. Hur, A. Atay, S. Cuhadar: Effects of hemolysis interference on routine biochemistry parameters. Biochemia Medica 2011;21(1): Bilag Side 49 af 71

50 Bilag 1. Betjeningsprincipper for c-systemet- brugermanual til Architect systemet kapitel 3, Maj Side 50 af 71

51 Side 51 af 71

52 Side 52 af 71

53 Side 53 af 71

54 Side 54 af 71

55 Side 55 af 71

56 Side 56 af 71

57 Side 57 af 71

58 Side 58 af 71

59 Bilag 2. De første forsøg der blev foretaget i pilotforsøget, der lægger op til det endelige pilotforsøg gav gode og acceptable resultater. Blodprøverne blev taget på Maria Dam. Blodprøverne blev centrifugeret og plasmaet blev afpipetteret der fra og delt ud i glas med 1,5 ml plasma. Et glas med fuldblod afpipetteres Side 59 af 71

60 1.5 ml plasma, hvor det resterende erytrocytter bliver blandet og nedfrosset. Erytrocytterne centrifugeres efter optøning på 3000G i 15 min. Det hæmolyserede plasma tilføjes i glassene med 1,5 ml plasma i forskellige koncentrationer, det fungerer som et hæmolysat. Det var dog svært at skelne grænse imellem erytrocytter og hæmolyserede plasma. Hæmolysegraden på prøverne blev målt på Architect(tabel 6). Prøve nr. 1A 2A 3A µl hæm plasma Hæmolyse grad 0,21 0,37 0,5 Tabel 12 Der blev vurderet, at hæmolysegraderne er for høje i forhold til den lille mængde der er blevet tilføjet af hæmolysatet. Derfor fortsatte vi pilotforsøget. For at skabe hæmolyse i forskellige niveauer, blev et glas med fuldblod afpipetteret 1,5 ml plasma, erytrocytterne blev vasket tre gange i saltvand og derefter anbragt i en -80 grader C fryser i 15 minitter, indtil det var helt frosset. Derefter blev tre glas med 1,5 ml plasma tilsat forskellig mængde hæmolysat(tabel 7). Prøve nr. 1C 2C 3C ul erytrocytter Hæmolyse grad g/l 1,96 5,39 9,11 Tabel 13 Hæmolyse graden blev målt. Ud fra fortyndingsformlen, blev der udregnet hvilken plasma med hæmolyse, der egner sig bedst som hæmolysat i vores forsøg(tabel 8). Vudt = (Cfort * Vfort) / Cstam Ønsket hæmolyser 0,05 0,1 0,5 1C (udtaget ul) 38, ,2 2C (udtaget ul) 14,2 28, C (udtaget ul) 8, ,1 Tabel 14 Der blev vurderet at de ovenstående mængder til at få ønskede hæmolysegrader, var for stor i tabel 8. Derfor blev der lavet en lineær regression fra værdierne i tabel 7. Dette gør det muligt at udregne hvad hæmolysegraden bliver ved 80 og 100 µl tilsat hæmolyseret erytrocytter i 1,5 µl plasma. Ligning: y=0,17875*x+0,124167, r=0,9997 Side 60 af 71

61 Bilag 3. Note om holdbarheds forsøg Side 61 af 71

62 Side 62 af 71

63 Side 63 af 71

64 Side 64 af 71

65 Side 65 af 71

66 Bilag 4. Resultater af måling på hæmolysegraden ved analyserne folat, B12 og LD med forskellige hæmolysegrader. P-Folat normal: Den gennemsnitlige relative ændring i procent. Den relative ændring i procent for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2. Side 66 af 71

67 P-Folat lav: Den gennemsnitlige relative ændring i procent. Den relative ændring i procent for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2. P-B12 normal: Den gennemsnitlige relative ændring i procent. Den relative ændring i procent for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2. Side 67 af 71

68 P-B12 lav: Den gennemsnitlige relative ændring i procent. Den relative ændring i procent for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2. P-LD normal: Den gennemsnitlige relative ændring i procent. Side 68 af 71

69 Den relative ændring i procent for hver af de 10 prøver for måling 1 og 2. Bilag 5. Måling af tre forskellige hæmolysegrader med udregnede t-værdi, CV%, middelværdi og SD. Der ses værdier for udregnede differens i procent Måling: Målt hæmolysegrad t0,05 (9)= 2,228 1,5 ml plasma med tilsat 0µL 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 hæmolysat t=2, ,5 ml plasma med tilsat 13 µl 0,1 0,1 hæmolysat 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 9 0,2 9 0,2 0,2 t=1, ,5 ml plasma med tilsat 44 µl hæmolysat 0,6 1 0,6 0,6 1 0,5 9 0,6 0,6 0,6 0,6 0,5 9 0,6 1 t= 0, Side 69 af 71

70 Foretaget på glas nr af LD med 0 µl hæmolysat Middelværdi = 0,013 sandvær. 0,02 SD 0, Bias% 47,43416 CV% 72,97564 Foretaget på glas nr af LD med 13 µl hæmolysat Middelværdi= 0,198 sandvær. 0,2 SD 0, Bias% 2, CV% 2,12948 Foretaget på glas nr på LD med 44 µl hæmolysat Middelværdi = 0,601 sandvær. 0,6 SD 0, Bias% 0, CV% 1, Side 70 af 71

71 Bilag 6. Antal prøver med svar hæmolyse i perioden Bilag 7. Skema for visuelvurdering af hæmolyse niveau g/l. Side 71 af 71