Anbefalinger for molekylærpatologisk analyse af mikrosatellit instabilitet (MSI) i kolorektal cancer, version 2. Udarbejdet af: Anbefalingerne er udarbejdet som samarbejde mellem Dansk Molekylær Patologi Gruppe (DMPG) og Udvalg for Molekylær Patologi (UMP) under Dansk Patologiselskab (DPAS). Baggrund/targeteret behandling Kolorektal cancer er karakteriseret ved genetiske og epigenetiske forandringer som influerer onkogener og DNA mismatch repair (MMR) systemet. Mikrosatellitter er repeterede nukleotidsekvenser bestående af 1-6 basepar gentaget op til 100 gange. I disse repeterede nukleotidsekvenser kan der under DNA replikationen opstå fejl, deletioner/duplikationer, som normalt vil blive repareret af MMR systemet. Ved defekt MMR repareres fejlene ikke med en ændring af længden af mikrosatellitter til følge. Dette betegnes som mikrosatellit instabilitet (MSI). MSI påvises i Lynch syndrom (tidligere hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC), som har en autosomal dominant arvegang og skyldes en defekt i et af MMR generne. Syndromet er karakteriseret ved at forårsage kolorektale karcinomer, endometrie karcinomer samt andre karcinomer. MSI analysen bruges evt. sammen med IHC analyse af MMR proteinerne, methylerings- og BRAF gen-analyse til at identificere patienter, som skal have udført genetisk undersøgelse af MMR generne. MSI findes derudover i ca. 15% af de sporadiske kolorektal cancer tilfælde, hvor MSI hovedsageligt skyldes methylering af MLH1 genets promotorregion. Se evt. DCCG s nationale retningslinje for Mismatch Repair defekt (dmmr). Kolorektale karcinomer med et højt niveau af MSI (MSI-H) har en bedre prognose end karcinomer med lavt niveau af MSI (MSI-L) og MSS (1,2). MSI status anvendes til at vurdere hvorvidt patienter med stadie II kolorektal karcinomer skal tilbydes adjuverende kemoterapi. Derudover har MSI status, i tidlige studier, vist sig at være en vigtig prædiktiv markør for en bestemt type immunterapi (3). Se evt. DCCG s nationale retningslinje for Indikationer for adjuverende kemoterapi til patienter med kolon eller rektumcancer i UICC stadium II. Analysemetoder 1. Promega kit Udvælgelse af analysemateriale: Paraffinblok med hhv. tumor væv og normalt væv. Alternativt til normalt væv bruges kontrolprøve som medfølger Promega kit. Information om % tumorvæv og evt. nekrotisk væv angives. Metode: MSI Analysis System Version 1.2 (Promega) bygger på fragmentanalyse ved brug af kapillærelektroforese (4). Med kittet analyseres fem mononukleotid markører (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og MONO-27) og to pentanukleotid markører (Penta C og Penta D). Med mononukleotid markørerne undersøges graden af MSI og pentanukleotid markørerne er kontroller for kontaminering/ombytning af prøverne. Til analysen anbefales ABI PRISM 310 eller 3100 eller Applied Biosystems 3130, 3130xl eller 3500, hvor den efterfølgende databehandling kan udføres i GeneMapper software (Applied Biosystems). Ved analyse af prøverne analyseres DNA fra tumorvæv overfor DNA oprenset fra normalt væv hos patienten eller alternativt den i kittet medfølgende kontrolprøve.
Fortolkning af resultat: Forskellene mellem normalt og tumor DNA ved mononukleotid markørerne ses tydeligt, mens pentanukleotid markørerne skal være ens i de to prøver (hvis tumorvæv og normalvæv er fra samme patient). På figuren ovenfor ses øverst normalt DNA og nederst tumor DNA fra samme patient: prøver hvor mindst to, eller op til alle fem, af de fem mikrosatellit-regioner har en ændret fragmentlængde i forhold til normalprøven defineres som MSI-H. prøver med længdeændring i kun én enkelt region (20%), i forhold til normalprøven, klassificeres som MSI-L. væv der i alle 5 regioner har samme fragmentlængde som normalvævet klassificeres som mikrosatellit stabil (MSS). Detektionsgrænsen i dette MSI assay er bestemt til ca. 1 celle ud af 10-100 celler (10 %). 2. In-house PCR Udvælgelse af analysemateriale: Der udvælges paraffinblokke, der indeholder tumor- og/eller normalt væv. vævet makrodissekeres. celleprocenten angives. Metode: Der anvendes in-house PCR til analyse af mikrosatellitinstabilitet (MSI). Analysen er baseret på Bethesda panelet, som består af mono- og dinukleotid markører. I panelet indgår følgende markører; BAT25 (mono-), BAT26 (mono-), D2S123 (di-), D5S346 (di-) og D17S250 (di-) (5). Dinukleotiderne er endvidere kontroller for, at prøvere ikke er ombyttede (6). PCR analysen køres i simplex. Efterfølgende udføres fragmentanalyse vha. kapillærelektroforese ved anvendelse af f.eks. 3500 Genetic Analyzer (Thermofisher). For andre mulige instrumenter, se ovenfor. Ved behov for yderligere oplysninger ang. primersekvenser, PCR betingelser mm. kan Mariann Guldmann-Christensen, Molekylærbiolog ved Patologisk Institut, Århus Universitetshospital kontaktes.
Fortolkning af resultat: Den efterfølgende databehandling udføres i GeneMapper softwaren (Thermofisher). Data fra tumor DNA og normalt DNA sammenlignes for ændringer i fragmentlængderne. Resultaterne tolkes som tidligere beskrevet. Eksempler ses nedenfor. BAT 25 BAT 26 D2S123 BAT 25 BAT 26 D2S123 D5S346 D17S250 Pilene angiver, hvor der er MSI D5S346 Svarafgivelse bør indeholde. 1. Titel på analysen D17S250
2. Prøvemodtagelsesdato 3. Prøvenummer Svarafgivelse bør indeholde 1. Titel på analysen 2. Prøvemodtagelsesdato 3. Prøvenummer 4. Rekvirent 5. Indikation for analysen 6. Prøvemateriale 7. Procent andel af tumorcellekerner i materialet 8. Anvendt metode og følsomhed af denne 9. Oplysning om metoden er akkrediteret (ISO15189) 10. Oplysning om hvilke markører der kan detekteres ved den anvendte metode 11. Markører med MSI 12. Fortolkning af resultatet 13. Svardato 14. Signatur 15. Unik ID på hver side 16. Angivelse af totalt antal sider 17. Kodning med SNOMED koder (Appendiks A) Bemærkninger/kvalitetskontrol Metoden til oprensning af DNA skal være valideret og kvaliteten af det oprensede DNA skal være i en kvalitet og mængde passende til den anvendte analysemetode. Analysemetoden skal være valideret ved prøveudveksling med andet laboratorium eller ved deltagelse i eksternt kvalitetsprogram (for eksempel: UKNEQAS Micorsatellite instability molecular testing (http://www.ukneqas-molgen.org.uk/schemes)). Det er ønskværdigt at oprensningsmetoden og analysemetoden er akkrediteret efter ISO15189 Svartiden for analysen bør være afstemt med klinikerne for videre udredning af patienter/planlægning af behandling. Snomed kodning FE2002 Mikrosatellit-instabil (MSI) FE2001 Mikrosatellit stabil (MSS) FE2003 Mikrosatellit-instabil, lav grad (MSI-L) FE2004 Mikrosatellit-instabil, høj grad (MSI-H) Revidering af anbefalingerne Anbefalingerne revideres ved behov dog senest efter to år. Seneste revision udført februar 2018. Anbefalingerne er revideret af Karin de Stricker, RH Linea Melchior, RH
Louise Klarskov, Herlev (kontaktperson UMP) Mariann Guldmann-Christensen, AUH Wojciech Skovrider-Ruminski, Herlev Referencer. 1.Saridaki Z et al. Prognostic and predictive significance of MSI in stages II/III coloncancer. World J Gastroenterology 2014Jun 14;20 (22):6809-6814 2.Sargent DJ, Marsoni S, Monges G, et al. Defective mismatch repair as a predictive marker for lack of efficacy of fluorouracil-based adjuvant therapy in colon cancer. J Clin Oncol. 2010;28(20):3219-3226 3.Le DT et al. PD-1 Blockade in s with Mismatch-Repair Deficiency. N Engl J Med. 2015 Jun 25;372(26):2509-20 4.https://dk.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/0/msi-analysis-system-version-12- protocol/ 5.Boland C.R, Thibodeau S.N., Hamilton, S.R. et al. A national cancer institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: Development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Research. 1998 November (58): 52-48-5257 6.Asad U, Boland C.R, Terdiman P. et al. Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J. Natl. Cancer Inst. 2004 February 18:96(4): 261-268