2014 Professionshøjskolen Metropol

2014 Professionshøjskolen Metropol Udarbejdet af: Diana Maarouf 020388-2920 Studienr: 60080560 Bachelorperioden : 17/03/14-20/06/14 Vejledere: Henriette Lorenzen Lektor Bioanaltikeruddannelsen København Birgith Nowak afdelingsbioanalytiker for Immunologisk afdeling Hvidovre Antal anslag: 42,370 [SCREENING AF THROMBOCYTANTIGENER VED METODESAMMENLIGNING] Metodesammenligning af Capture-P metoden og Platelet HPA1a Typing Assay

1

Resume Da man på nuværende tidspunkt har HPA-1a negative donorer nok til behandling af patienter der er immuniseret med HPA-1a antigenet, har Nordsjællands Hospital Hillerød besluttet ikke længere at udføre donorscreeningen rutinemæssigt ved brug af Platelet HPA1a Typing Assay pga. de høje omkostninger. I dette projekt vil der metodesammenlignes på Capture-P metoden og Platelet HPA1a Typing Assay. Capture-P metoden udføres ikke Danmark som en rutinemæssig screening af HPA-1a antigenet, men firmaet TRIOLAB har henvist til den metode. Metoden undersøges i form af driftsomkostninger, herunder arbejdstid for en bioanalytiker, og der undersøges en diagnostisk sensitivitet og specificitet. Prøvematerialet i dette projekt er 120 donorblodprøver, 12 af disse er konfirmatorisk testet negativ ved PCR metoden. Her vil der ses om Capture-P metoden kan erstatte Platelet HPA-1a Typing Assay. Hvis den kan det, vil det måske være muligt at indføre Capture-P metoden som en rutinemæssig analyse til screening af gravide for HPA-1a antigenet, og dermed er man bedre forberedt på en behandling hos NAIT fostre/børn. Forord Dette projekt er udført på Klinisk Immunologisk Afdeling på Herlev Hospital. Jeg vil gerne takke de ansatte på afdelingen, samt et særlig tak til Vibeke Juul Ljørring for hendes hjælp med indsamling af prøver fra donor og en lynkursus på apparatet NEO. Derudover en tak til vores hovedvejledere Henriette Lorenzen og Birgith Nowak for god vejledning. I projektet forsøger man at få indført en billig metode til screening af gravide for thrombocyt antigener, derfor henvender dette undersøgelse sig til bioanalytikere og læger. 2

Indholdsfortegnelse RESUME... 2 FORORD... 2 1.0 INTRODUKTION... 4 1.1 BAGGRUND... 4 1.2 FORMÅL... 5 1.3 MÅL... 5 1.4 PROBLEMFORMULERING... 5 1.5 TEORI... 5 1.5.1 Thrombocyttens dannelse og funktion... 6 1.5.2 Human platelet antigen... 6 1.5.3 Neonatal Alloimmun thrombocytopeni... 6 1.5.4 Konfirmatorisk test... 7 1.5.5 Analyseprincip SPAT: Solid Phase Anti-Humanglobulin Teknik... 7 1.5.6 Analyseprincip Enzyme linked immunosorbent assay... 8 1.6 METODEVALG OG AFGRÆNSNINGER... 10 1.6.1 Metodevalg... 10 1.6.2 Forsøgsdesign... 10 1.6.5 Afgrænsning... 14 1.6.6 Etiske overvejelser... 14 2.0 MATERIALER OG METODE... 14 2.1 MATERIALER... 14 2.2 METODER... 16 3.0 RESULTATER... 18 4.0 DISKUSSION... 27 5.0 KONKLUSION... 35 6.0 PERPEKTIVERING... 35 REFERENCER... 36 3

1.0 Introduktion 1.1 Baggrund Igennem de sidste mange år er der udviklet en analyse der gør det muligt at forebygge dannelsen af anti-d hos gravide RhD negative kvinder og dermed har elimineret langt de fleste alvorlige tilfælde, af komplikationer der i denne forbindelse kan optræde hos fosteret og nyfødte. De samme komplikationer som ved RhD gør sig gældende ved uforligelighed mellem thrombocyt antigener hos barnet og thrombocyt antistoffer fra moderen(12). Dette kan medføre neonatal alloimmun thrombocytopeni (NAIT) og forekommer 1 af 2000-5000 fødsler(1). Thrombocytopenien opstår hos fostret eller det nyfødte barn. Det ses som blødninger på barnets hud, men der kan også være blødninger fra slimhinder og organer. Hvis barnet ikke bliver behandlet vil ca. 20% kunne få hjerneblødning og i værste tilfælde dø(17). I modsætning til RhD immunisering forekommer sygdommen hyppigt i forbindelse med første graviditet, ca. 50% af tilfældene(1). Med dette projekt ønskes det at udføre en metodesammenligning mellem Capture P metoden og den valideret Platelet HPA-1a Typing Assay som er en direkte non-kompetitiv ELISA metode. I dette projekt vil metoden fremover kaldes for Platelet HPA-1a Typing Assay. Klinisk Immunologisk Afdeling på Nordsjællands Hospital Hillerød har tidligere brugt Platelet HPA1a Typing Assay metode til at klarlægge donors fænotype for HPA-1a antigenet. Metoden koster afdelingen mange resurser i form af arbejdstid og personale og kittets omkostninger. Da man på nuværende tidspunkt har HPA-1a negative donorer nok til behandling af pateinter der har dannet anti-hpa-1a, har afdelingen vurderet ikke længere at udføre analysen rutinemæssigt. Firmaet TRIOLAB henviser til Capture- P metoden, der er mere automatiseret. I den forbindelse undersøges i projektet om Capture-P metoden er ligeså effektiv til at detektere HPA-1a antigenet. Dette vurderes med diagnostisk sensitivitet og specificitet. Derudover undersøges om analysen er hurtigere og billigere at udføre. 4

1.2 Formål På nuværende tidspunkt screener man ikke gravide kvinder rutinemæssigt, for HPA-1a antigenet på thrombocytterne. Dermed er man ikke forberedt på, at denne tilstand kan opstå i forbindelse med graviditet hos de kvinder der muligvis danner anti-hpa-1a. Capture- P metoden bliver ikke brugt i Danmark til at detektere HPA-1a antigenet. Det forventes at være en hurtigere og billiger metode. Hvis forventningerne bliver indfriet, kunne projektet måske gøre, at det blev taget op til overvejelse, om analysen kunne anvendes til screening af gravide kvinder, så man kunne behandle fostre/nyfødte med NAIT tidligere i forløbet. 1.3 Mål Der ønskes at undersøge om Capture-P metoden kan erstatte den valideret Platelet HPA-1a Typing Assay. Dette vil blive undersøgt med diagnostisk sensitivitet og specificitet. Målet er også at undersøge, om den ene metode er billigere end den anden. Dette undersøges ved at beregne udgifterne på kit, reagenser og arbejdskraft der bruges til projektet. 1.4 Problemformulering Hvordan vil diagnostisk sensitivitet og specificitet samt driftsomkostninger kunne influere på muligheden for screening af gravide for HPA-1a antigenet, hvis Capture-P metoden ved en metodesammenligning kan erstatte den valideret Platelet HPA1a Typing Assay? 1.5 Teori Dette afsnit indeholder en kort beskrivelse af thrombocyttens dannelse og funktion og om HPA antigen på thrombocytterne, samt hvordan NAIT opstår hos fosteret /den nyfødte. Til sidst gennemgås analyseprincipperne for en non- kompetitiv ELISA metode og Capture- P som er Solid Phase Anti-Humanglobulin Teknik. 5

1.5.1 Thrombocyttens dannelse og funktion Knoglemarven danner megakaryocytter, som senere modnes til thrombocytter. De har en gennemsnitlig levetid på 10 dage, hvorefter de fagocytteres af makrofager(11). Thrombocytten er en vigtig brik i at hele en karskade, da den spiller en væsentlig rolle i standsning af blødning (hæmostasen). Normal thrombocytkoncentration for en nyfødt er 150-300 x 10 9 /L(10). Ved en normal thrombedannelse adhærer thrombocytterne sig til karvæggen når der er et blotlagt kar. Thrombocytterne udsender stoffer, der øger adhæsionen. 1.5.2 Human platelet antigen Der findes genetiske forskelle i glykoproteinerne på thrombocytmembranen, og det er disse forskelle, der afgør hvilke antigener der er på membranen (1). Human platelet antigens (HPA) findes på thrombocytten og der er 24 forskellige slags HPA antigener. 12 af disse er inddelt i 6 grupper; HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4, HPA-5 HPA-15. De resterende 12 HPA antigener er ikke videre undersøgt (2,8). Det hyppigste forekommende antigen i hvert system benævnes a og det sjældnere forekommende antigen b(2). Ca. 2% af den danske befolkning er HPA-1a negative og dermed i stand til at danne anti-hpa-1a ved en immunisering(1). 1.5.3 Neonatal Alloimmun thrombocytopeni Nyfødte kan udvikle sygdomme neonatale alloimmun thrombocytopeni (NAIT). Årsagen er tilstedeværelsen af anti-hpa-1a i moderens plasma. Anti-HPA-1a er af IgG karakter og kan derfor passere placenta og sensibilisere fosters HPA-1a positive thrombocytter(15), der derefter destrueres i fostertilstanden og i timerne fødslen. Derved opstår thrombocytopenien hos barnet (Thrompocytkoncentrationen er < 20 x 10 9 /L), og medfører blødningstendens (1). Ca.10% af gravide kvinder med HPA-1b1b antigen, vil danne anti-hpa-1a mod et positivt foster, her af vil ca. 2% af fostre/nyfødte udvikle alvorlig NAIT(16). Kvinder der tidligere har født et barn med NAIT, kan få udtaget en moderkagebiopsi for at bestemme fosters thrombocyt-genotype. Dette giver mulighed for prænatal behandling, eller evt. abort inden 12.graviditetsuge. En prænatal 6

behandling er en intravenøst immuglobulin (ivigg). Denne behandlingsform har vist en positiv effekt på fostret thrombocytkoncentrationen hos barnet, dette ses ca. et døgn efter. Nogle gange behandler man de gravide i uge 22. Moderkagebiopsi indebærer en risiko for abort(17). 1.5.4 Konfirmatorisk test I forbindelse med en konfirmatorisk test benyttes sekvens-specifikke primersæt (SSP)-PCR. Denne metode udføres på moderen der har tidligere dannnet antistoffer mod forstret/barnets HPA antigener. Metoden udføres også på donorer hvor de typebestemmes, hvis blod skal bruges til en transfusion(7). 1.5.5 Analyseprincip SPAT: Solid Phase Anti-Humanglobulin Teknik SPAT ( Solid Phase Anti-Humanglobulin Teknik) metoden anvendes til detektering af antistoffer og antigener(14). Metoden er let og hurtig(13). figur 1 viser analyseprincippet for Capture-P metoden Til metoden anvendes mikrotiterplader, der er fremstillet af polystyren(14). De indeholder som standard 96 brønde. Mikrotiterpladerne er fra firmaets side coatet med antistoffer, der er rettet mod et antigen der sidder på alle thrombocytter. Dette fremmer adhæsionen af thrombocytterne som aktiveres via vask i apparatet(bilag 9 s. 55). Der anvendes thrombocytrigt donorplasma. 7

Figur 1 viser fremgangsmåden i Capture-P metoden. Der afpippeteres donor thrombocytrigt plasma i de respektive brønde, hvor der ønskes at detektere tilstedeværelsen af HPA-1a antigen. De overskydende thrombocytter vaskes væk med PBS. Der tilsættes et kendt antistof Capture P positive control serum (Weak) som er kendt anti-hpa-1a rettet mod thrombocytternes HPA-1a antigen, hvis det er tilstede. Der tilsættes lav ionstyrke saltvand (LISS). LISS reducerer positive og negative ioner så antistoffet lettere kan trænge ind til thrombocytantigenet(14). Dette betyder, at sensibiliseringshastigheden øges og dermed bliver inkubationenstiden kortere. Under dette trin ses der et farveskift til lilla. Her er man sikret at apparatet har tilsat LISS. Farveskiftet ses under kameraaflæsning i apparatet. Brøndene vaskes igen med PBS for at fjerne de overskydende antistoffer. Trinnet er vigtigt da man ønsker at undgå falsk positive reaktioner. For at synliggøre reaktionen i brøndene tilsættes Capture-R indicator Red Cells, da Capture-P iindicator Red Cells ikke findes i Europa. TRIOLAB har forslået at benytte Capture-R indicator Red Cells. Firmaet Immucor anbefaler at bruge bromelin, hvis der anvendes Capture-R indikator celler til Capture-P analyser(bilag 12 s. 61). Kamerareaderen i apparatet tager et billede af bunden på mikrotiterpladen, som derefter beregner et resultat (se bilag 5 s.49). Ved aflæsning gradueres resultatet. Er reaktionen stærk positiv fordeles indicator Red Cells i hele brønden. Der vises en jævn fordelt rødlig farve. Er reaktionen negativ bundfælder indicator Red Cells og ved en svagere reaktion ses både bundfæld af indicator Red Cells og en jævn rød farve af bunde indicator Red Cells (se bilag 4 s. 48). IMMUCOREs cut off- værdi for Capture-P metoden: 0-20 = negativ 20-30 = gråzone (?) 30-100 = positiv: ( bilag 6 s. 50 ) 1.5.6 Analyseprincip Enzyme linked immunosorbent assay 8

Figur 2 viser analyseprincip for direkte non-kompetitiv ELISA ELISA metoden er en forkortelse for Enzyme linked immunosorbent assay hvor reaktionen forgår på en fast fase. Reaktioner der forekommer på overfladen af en fast fase betegnes heterogene. Brøndene er coatet med antistof og er blokeret med blokeringsmiddel. Dette er fremstillet fra firmaet BIO-RAD(Bilag 8 s.53). Princippet ved direkte ELISA er, at der anvendes direkte sandwich metode. En non-kompetitiv ELISA metode er, at der et overskud af bindingsplader for analyt (antigenet) og et overskud af antistoffet. Figur 2 viser fremgangsmåden i direkte non-kompetitiv ELISA metoden. Der tilsættes anti-hpa-1a HRP( horseradish peroxidase), som er et enzymkonjugeret antistof. Derefter afpippeteres fuldblod hvor thrombocytterne binder sig til coatningantistoffet. Hvis HPA-1a er til stede, vil anti-hpa-1a binde sig til antigenet. Reaktionerne sker under inkubation i stuetemperatur. Efter dette trin vaskes øvrige uønsket materiale og overskydende anti-hpa-1a HRP væk for at undgå en falsk positiv reaktion. Herefter tilsættes substrat, som udvikles til et farvestof fra gul til blå ved en positiv reaktion. Farvens intensitet er et mål for det bundne enzymkonjugerede antistof og dermed thrombocytter. TMB ( Tetramethyl-benzidin-hydrochlorid), giver den gule farve(4). Dernæst inkuberes reaktionen endnu en gang i stuetemperatur. Under denne inkubation forgår enzymsubstratreaktionen, Hvis HPA-1a antigen er til stede i prøven vil der fremkomme en blå farve som indikerer, at prøven er positiv. Hvis der ikke findes HPA-1a antigen i prøven vil der ikke ske en farvereaktion. 9

Derefter er pladen klar til aflæsning og måles spektrofotometrisk ved 630 nm(bilag 7 s. 51). Tolkning af resultater sker ved målte absorbanser. Absorbans er ligefrem proportional med koncentrationen ifølge Lamert Beers lov(3). Bio-RAD har beregnet en Cut-off værdi, hvor OD værdierne målt på 630nm vurderes ved en negativ resultat er 0,3 og en positiv 0,5 samt en gråzone >0,3 - <0,5 (?) 1.6 Metodevalg og afgrænsninger 1.6.1 Metodevalg I de følgende afsnit gennemgås, fremgangsmåden for metodesammenligningen af Capture-P metoden og Platelet HPA1a Typing Assay. Herunder beskrives det anvendte prøvemateriale, opbevaring af dette og hvilke statistiske beregninger der benyttes. 1.6.2 Forsøgsdesign Gruppeopdeling Projektet gennemføres af fire studerende der arbejder sammen to og to : Gruppe A : To udfører donorscreening af HPA-1a antigenet på Platelet HPA1a Typing Assay på Klinisk Immunologisk Afdeling på Nordsjællands Hospital i Hillerød. Metoden udføres ved manuelt opdrypning af blodprøven og reagenser, dog anvendes der en pladevasker Wellwash og en fotometrisk aflæser Multiskan. Apparaterne er fra firmaet Thermo Scientific. Gruppe B : En medstuderende og jeg udfører donorscreening ved Capture-P metoden på apparatet NEO fra IMMUCOR GAMMA på Klinisk Immunologisk Afdeling på Herlev Hospital. Den praktiske udførelse strækker sig over 3 uger i modul 14. Udførelsen af donorscreening sker hver dag i de 3 uger, da apparatet også benyttes af andre bachelorstuderende aftales tidpunkter for gennemførsel af egen praktiske del. 1.6.3 Prøvemateriale og forsøgsgang 10

I fællesskab udformes et oplæg til hvordan sekretærerne skulle præsentere vores projekt for de HPA-1a negative donorer der var tappebarer, så de fik lyst til at dukke op til tapning (bilag 1 s.37). Der blev taget to blodprøver på hver donor. De blev tappet henholdsvis på Nordsjællands Hospital i Hillerød, i Frederiksund og på Rigshospitalet. På de negative donorer er der også udført en konfirmatorisk test ved PCR metoden på Rigshospitalet for at sikre sig, at genotypebestemmelsen er negativ. Der er en begrænset mængde Capture-P Postive Control Serum (weak). Derfor benyttes 3 mikrotiterplader, hver mikrotiterplade består af 96 brønde. Ved Capture-P metoden laves der dobbeltbestemmelse fordi der kendes ikke til metodens evne til at bestemme HPA-1a antigenet. Desuden er der nok resultater til at beregne CV % på. Mikrotiterpladerne benyttes til dobbeltbestemmelse af HPA-1a antigenet på hver donor. De HPA- 1a negative donorers prøver afpippeteres i brøndene, og de resterende brønde bliver fyldt med HPA-1a ukendte. Der analyseres i alt 120 prøver. Da det er en metodesammenligning bruger begge hold blodprøver fra de samme donorer, så man bedst muligt kan sammenligne resultaterne fra de to metoder. Da hvert hold kun kommer til at udfører det praktiske arbejde på ét af apparaterne, overværer begge hold det andet holds praktiske udførelse. Prøvemateriale for Capture-P metoden Capure-P IMMUCOR GAMMA beskriver, at efter let centrifugering får man et thrombocytrigt plasma. Dette opnås ved 200 x G i 10min. Blodprøverne skal analyseres indenfor 48 timer og opbevares ved stuetemperatur 20-25 C(bilag 9 s. 55). Capture-P metoden udføres ikke i Danmark, og er ikke en valideret metode. Da Capture-P indikator celler ikke er tilgængelig i Europa har TRIOLAB anbefalet at bruge Capture-R indikator celler. TRIOLAB skriver også at IMMUCOR GAMMA anbefaler at tilsætte bromelin, for at undgå uspecifikke bindinger (bilag 12 s. 61) Der medtages ingen kontroller i Capture-P metoden, da de kendt negative HPA-1a donorer er konfirmatorisk testet og bekræfter resultatet. 11

Prøvemateriale for Platelet HPA1a Typing Assay BioRad beskriver, at der til analysen anvendes fuldblod taget i EDTA-glas(bilag 8 s.53). Ved Platelet HPA-1a Typing Assay metoden skal analysen ske indenfor 5 dage, og blodprøverne skal opbevares ved 2-6 C. I Platelet HPA1a Typing Assay kittet findes der 2 mikrotitetplader, derfor var der ikke nok brønde til at dobbeltbestemme de 120 blodprøver. Der var kun plads til at dobbeltbestemme 48 prøver til udregning af CV %. Der medtages en positiv og en negativ kontrol for hver mikrotiterplade. I de sidste tre plader gav den positive kontrol et negativ resultat, da den var under Cut-off værdien.( 0,3). Det blev besluttet at medtage en ekstra positiv kontrol ved de sidste analyser(se bilag 3 s. 47). Den ekstra positive blodprøve var konfirmatorisk testet på Rigshospitalet. 1.6.4 Databehandling Metodesammenligning Ved en metodesammenligning vælges at undersøge sensitivitet og specificitet for Capture-P metoden og Platelet HPA1a Typing Assay. Analyserne udføres på 12 konfirmatorisk testet HPA-1a negative donorer og 108 ukendte donorer. Ligeledes sammenlignes driftsomkostningerne ved de to metoder. Priserne på reagenserne for Capture P metoden er tilsendt fra TRIOLAB. For Platelet HPA-1a Typing Assay er priserne oplyst fra Klinisk Immunologisk Afdeling Nordsjælland Hospital Hillerød. Der udregnes for begge metoder hvor meget en række koster og hvor meget en enkelt prøve koster. Der udregnes ligeledes en løn for en bioanalytiker. Priserne og lønnen giver et overblik over metodernes driftsomkostninger. For at kunne danne sig et overblik opstilles der et cirkeldiagram for at vise analysesvarenes resultater. Derudover udregnes CV % på dobbeltbestemmelserne for de sidste 48 prøver som er dobbeltbestemte ved både Capture-P metoden og Platelet HPA-1a Typing Assay. Dette gøres for at undersøge hvilken metode, der har den største spredning på dobbeltbestemmelserne. Disse udregninger indsættes i en graf. For Capture-P metoden blev der udregnet CV % på hver dobbeltbestemmelse. CV % er udregnet således: 12

Ved at udregne diagnostisk sensitivitet og specificitet(9 og 10) for de to metoder, vurderes om Capture-P metoden kan erstatte Platelet HPA-1a Typing Assay. Da prøvematerialet er blodprøver fra donorer, er en høj sensitivitet vigtig, da man vil undgå falsk negative resultater. I relation til screening af gravide er en høj specificitet vigtig, da man vil undgå falsk positive resultater. Sensitivitet fortæller hvor følsom og god metoden er til at identificere donerer med positive resultater. Dette udregnes ved formlen nedenfor. Sensitivitet = sandt positive sandt positive falsk negative Specificitet fortæller hvor specifik metoden er, og ligeledes hvor god den er til at identificere donorer med negative resultater. Se formlen nedenfor. Specificitet = sandt negative sandt negative falsk positive Figur 1 HPA-1a positiv Positiv prøve Sandt positiv Negativ Falsk negativ prøve HPA-1a negativ Falsk positiv Sandt negativt Som der ses i figur 1 kan et analysesvar give et positivt resultat. Det kan være sandt positivt, hvis donoren virkelig er positiv for HPA-1a, men det kan også være falsk positivt, hvis donoren ikke er det. Ligeledes kan et negativt svar være sandt negativt, hvis donoren er negativ for HPA-1a, men også være falsk negativ, hvis donor har antigenet. Firmaet TRIOLAB har bestemt, hvornår en blodprøve er positiv eller negativ ved at udforme en cutoff værdi(bilag 6 s.50). 13

1.6.5 Afgrænsning Da størstedelen af befolkningen er HPA-1a positive, giver det en begrænsning i at skaffe mange HPA-1a negative donorer. Man kan ikke dræne lageret, da der kan opstå et behov HPA-1a negative thrombocytter. Det var kun muligt at fremskaffe 12 kendte HPA-1a negative donorer. Resten af de 3 plader fyldes med ukendte donorer. Derudover var der en begrænset mængde Capture-P Positive Control Serum (weak) til rådighed, dermed begrænses antallet af blodprøver der kunne analyseres. 1.6.6 Etiske overvejelser I projektet anvendes der kun allerede eksisterende donorer, der allerede er kendte i systemet. Derfor skal der ifølge Videnskabsetisk Komité ikke sendes nogen yderligere ansøgning om brugen af prøvemateriale i forbindelse med projektet. Donorene er i forvejen anonyme og prøverne vil i stedet få tildelt numre som relaterer til vores projekt. Når forsøgene afsluttes bortskaffes resten af prøvematerialet. 2.0 Materialer og metode 2.1 Materialer 2.1.1 CAPTURE-P IMMUCORE GAMMA Forsøgsmaterialet er thrombocyt rigt plasma i EDTA-glas. Apparatur: NEO Rotina 48s Centrifuge Reagenser: 14

CAPTURE-P Solid phase Microplates (IMM/0066251) 2014-3-25 Capture-P LISS (IMM/0006420)2014-08-22 Capture P positive control serum (Weak) (IMM/0066248) 2015-01-24 Capture R Indicatore Red Cells (IMM/0006428)2014-03-27 Bromelin (IMM/0004120) 2014-10-31 PBS (artikelnr. 3059) 2017-04 2.1.2 Platelet HPA-1a Typing Assay Forsøgsmaterialet er fuldblod i EDTA-glas. Apparatur Pladevasker (Wellwash) RH-nr. 230786 Fotometrisk aflæser (Multiskan) RH-nr. 230785 Vortex mixer RH-nr. 226179 Reagenser HPA1a typing assay wash buffer (Biorad) o artikelnr 14220.3L0027 udløbsdato: 2015-05-30 HPA1a typing assay reaction buffer (Biorad) o artikelnr. 14210.3L0027 o Udløbsdato: 2015-05-30 HPA1a typing assay HPR TMB Substrate (Biorad) o artikelnr. 14230.3L0030 o Udløbsdato: 2016-03-30 HPA1a typing assay HRP conjugate concentrated (Biorad) o artikelnr. 14240.3L0031 o Udløbsdato: 2015-05-30 HPA1a typing assay positive control(biorad) o artikelnr. 14250.3L0022 o Udløbsdato: 2015-05-30 HPA1a typing assay negative control (Biorad) o artikelnr. 14260.3L0025 15

o Udløbsdato: 2015-05-30 HPA1a microplate (Biorad) o artikelnr. 60500.3J0038 o 2015-02-15 2.2 Metoder 2.2.1 Capture - P Forberedelse: 1. Reagenserne skal have stuetemperatur. 2. Blodprøverne centrifugeres ved 200 G i 10minutter. 3. Mikrotiterpladen sættes i en ramme med de antal brønde, der skal bruges. Pladen sættes i apparatet og barkoden skannes. 4. Blodprøver og reagenser sættes i apparatet og barkoderne bliver skannet, registreret i computeren. Analysen: 1. Mikrotitterpladen vaskes for at aktivere de coatede antistoffer 2. Afpipetter 200 µl PBS i brøndene + 10 µl plasma. Herfra afpipetteres 160 µl så der kun er 50 µl tilbage brøndene. 3. Pladen centrifugeres 4. Pladen vaskes med PBS i brøndene, så ubundene thrombocytter fjernes 5. Afpipetter 25 µl Capture P Positive control serum (weak) I brøndene 6. Afpipetter 50 µl Capture- P LISS 7. Pladen aflæses af Kamerareader 8. Pladen inkuberes ved 39 grader I 30 minutter 9. Overskydende antistoffer vaskes væk med PBS 10. Tilsæt 50 µl Bromelin 11. Der tilsættes 60 µl Capture R indicator Red Cells 12. Centrifuger pladen 13. Brøndene aflæses af et kamerareader i apparatet ( bilag 10 s. 58). 16

2.2.2 Platelet HPA-1a Typing Assay Forberedelse: 1. Reagenserne og blodprøver skal have stuetemperatur. Blodprøverne rystes på vortexmixer. 2. Til et nyt kit fremstilles en ny vaskebuffer blandes HPA-1a Typing Assay wash buffer med 900 ml destilleret vand, flasken sættes på Thermo Scientific wellwash. 3. Konjugat fremstilles, HPA1a Typing Assay HRP conjugate concentrated blandes med HPA1a typing assay reaction buffer. Vejledningen angiver mængde, alt efter hvor mange rækker der skal analysere. Analysen: 1. Det ønskede antal strips udtages af rammen og sættes i ny ramme 2. Tilsæt 80 µl af det fremstillet konjugat med enkelt kanal pipette 3. Tilsæt 20 µl blodprøve og kontrol(hpa-1a positiv og negativ kontrol). Blodprøverne vendes inden opdrypning. 4. Pladen rystes i 10 sekunder i wellwash apparatet 5. Pladen pakkes forsigtigt ind i stanniol og inkuberes ved stuetemperatur i 30minutter (18-25 grader) 6. Efter inkubation, vaskes pladen i wellwash 7 gange med HPA-vaskebuffer 7. Når vasken er færdig fjernes pladen og bankes efter vask af mod et stykke papir for at sikre overskydende vaskebuffer er væk 8. Tilsæt 100 µl HPA-1a HRP TMB substrat. Pladen pakkes ind i stanniol og ligges i mørke i 10 minutter ved stuetemperatur (18-25grader) 9. Efter inkubation aflæses brøndene i ELISA reader ved 630nm (i apparatet Multiskan) vurdering af resultatet sker ved de målte absorbanser kopieres ind i excel. (bilag 7 s.51) 17

3.0 Resultater I resultatafsnittet er der opstillet et cirkeldiagram for hver metode, således, at det giver et overblik over de to metoders evne til at detektere HPA-1a antigenet på thrombocyttens overflade. Derudover er der beregnet CV % på de 48 prøver hvor der er udført dobbeltbestemmelser ved begge analyser. Disse beregninger er opstillet i en graf. Derudover ses en udregning af CV % på alle 120 prøver der er dobbeltbestemt ved Capture-P metoden. Resultaterne for disse er opstillet i tabeller heraf ses hvor mange dobbeltbestemmelser der spreder 0-90% for begge metoder. Der er beregnet en diagnostisk sensitivitet og specificitet og sammenlignet for hver metode. Mængden af anvendte reagenser er opstillet i en tabel for begge metoder. Ud fra disse mængder er der bergnet en pris for reagenser, og kit for begge metoder. Desuden er der opstillet en tabel over, hvor tidsforbruget og omkostninger i forbindelse med arbejdstid også er inkluderet i tabellen. I cirkeldiagrammerne figur 3 og 4 vises fordelingen mellem antal af HPA-1a positive, antal kendt HPA-1a negative og antal af prøver der er fundet negative blandt de ukendte ved hver metode og antal i gråzonen. 18

12 kendt HPA-1a negativ, dvs. 10 % Capture-P 3 ukendt HPA-1a negativ, dvs. 2,5 % 105 HPA-1a positiv, dvs. 87,5 % Figur 3: Cirkeldiagram over Capture P metoden. 12 kendt HPA-1a negativ, dvs. 10 % ud af totale antal prøver 1 ukendt HPA-1a negativ, dvs. 1 % ud af totale antal prøver 1 prøve i gråzone dvs. 1 % ud af totale antal prøver 106 HPA-1a positiv, dvs. 88 % af totale antal prøver Platelet HPA1a Typing Assay Figur 4: Cirkeldiagram over fordelingen af prøver ved Platelet HPA1a Typing Assay. For at få et overblik over spredningen mellem dobbeltbestemmelserne, er der bergenet CV% for begge metoder Tabel 1: Udregning af CV % for Capture-P metoden og Platelet HPA1a Typing Assay 19

CV % Capture-P metoden Platelet HPA1a Typing Assay 0-5 % 11 9 5-10 % 17 7 10-20 % 11 10 20-40 % 7 12 40-90 % 2 10 Ved Platelet HPA-1a Typing Assay ses stor spredning mellem dobbeltbestemmelserne. Til sammenligning ses ved Capture-P metoden størst antal prøver i den lave ende af CV %. ( bilag 2a s.43). CV % beregnet for Capture-P metodens dobbeltbestemmelser. I tabel 2 ser man spredningen for Capture-P metoden, hvor det størst antal af prøver ligger i den lave ende af CV %( bilag 2a s. 43) Tabel 2: udregning af CV % for 120 dobbeltbestemmelser ved Capture-P metoden CV % Capture-P metoden 0-5 % 36 5-10 % 36 10-20 % 28 20-40 % 17 40-90 % 3 I projektet er der vurderet hvilke prøver der har størst spredning. Prøve 108,111 og 18 ved Capture-P, og ved Platelet HPA1a typing Assay prøve 108. Tabel 3: 3 bemærkelsesværdig spredninger mellem dobbeltbestemmelserne ved udregning af CV% Prøvenr. Capture-P værdi Capture-P CV % Platelet HPA-1a Typing Assay OD-værdi Platelet HPA-1a Typing Assay CV % 108 Kendt 10/4 60,61 % 0,0583/0,0930 32,43 % negativ 111 12/3 84,85 % 0,1983/0,2186 6,89 % Kendt negativ 18 9/5 40,41 % 0,2672-20

Platelet HPA-1a Typing Assay Diana Maarouf Spredningen på de 48 dobbeltbestemte prøver er indsat i en graf (figur 5) Sammenhæng mellem CV % for begge metoder 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% Capture-P metoden Figur: 5 viser en graf over hvor stor en spredning der er på de 48 prøvers dobbeltbestemmelser mellem metoderne i grafen. Ad X-aksen ses spredningen for resultaterne ved Capture-P metoden og ad Y-aksen vises spredningen for resultaterne ved Platelet HPA1a Typing Assay. Hver enkelt prøve er indsat som et punkt. Jo mere lineært disse punkter ligger, desto bedre sammenhæng findes mellem spredningen. Ved vurdering af Capture-P metoden sås flere steder spørgsmålstegn dvs. resultater der ligger I gråzonen ved både første og anden bestemmelse, se tabel 4(uddrag fra bilag 2 s. 39) endvidere har den ikke afgivet et klar svar på en kendt negativ prøve. Tabel 4: Resultater ligger i gråzonen for Capture-P metoden Prøvenr Capture-P Cv % Platelet HPA1a Typing Assay 51 27/39?/+ 25,71% 1,3154 + 57 28/36?/+ 17,68% 2,3856 + 61 29/37?/+ 5,05% 2,5068 + 69 28/30?/+ 4,88% 1,4893 + Cv % Kendt neg 20/21?/? 3,45% 0,0551/0,1033 -/- 43,03% 21

88 89 31/28 +/? 7,19% 1,6966/1,7005 +/+ 0,16% 105 29/28?/? 2,48 2,2839/1,6434 +/+ 23,06% 3 prøver i de 2 metoder afviger bemærkelsesværdigt fra hinanden, se tabel 5. I Capture-P metoden ligger den første bestemmelse på prøve 10 i gråzonen og anden bestemmelsen er positiv. Prøve 4 er bestemt tydligt som positiv. Prøve 65 er negativ ved begge bestemmelser, hvor Platelet HPA-1a Typing Assay har givet et positivt resultat for den samme prøve (uddrag fra bilag 2 s.39). Tabel 5: Capture-P og Platelet HPA1a Typing Assay afviger meget fra hinanden Prøvenr. Capture-P CV% Platelet HPA1a Typing Assay 4 31/33 +/+ 4,42% 2,1274 + 10 29/34?/+ 11,22% 2,2004 + 65 9/15 -/- 35,35% 1,0022 + Tabel 6 viser resultater for 3 prøver, hvor første og anden bestemmelsen afviger ved Platelet HPA1a Typing Assay. Alle 3 prøvers førstebestemmelse ligger i gråzonen og anden bestemmelse konkluderes dermed positiv fordi bestemmelserne er over cut-off værdien. Prøve 3 ligger i gråzonen den er ikke dobbeltbestemt da der ikke var nok plader til dobbeltbestemme( uddrag fra bilag 2s.39). Tabel 6: Platelet typing Assay. på hver sin side af cut- off værdien Prøvenr. Capture-P CV% Platelet CV % HPA1a Typing Assay 80 76/77 +/+ 0,92% 0,4968/0,6227?/+ 15,9% 92 37/38 +/+ 1,89% 0,4610/0,7302?/+ 31,96% 101 40/70 +/+ 38,57% 0,4580/1,7311?/+ 82,25% 22

3 7/12 -/- 0,4059? Udregning af Diagnostisk sensitivitet og specificitet Platelet HPA1a Typing Assay bestemte en prøve som positiv, som Capture-P metoden har bestemt negativ. Platelet HPA1a Typing Assay er en valideret metode og derfor betragtes resultaterne herfra som sande svar. Derfor betragtes Capture-P metodens bestemmelse på prøven som falsk negativ. Capture-P metoden: 105 prøver er bestemt positiv ved metoden og en falsk negativ, da Platelet HPA-1a Typing Assay bestemte denne prøve positiv. Sensitivitet = = 99,05 % Specificiteten er udregnet ved de 12 sandt negative konfirmatorisk testede prøver. Specificitet = = Capture-P metoden har bestemt en falsk negativ prøve derfor betragtes Platelet HPA1a typing Assay 1 prøve som negative da metoden er valideret og dermed bestemmer de sande svar. Derfor med de 12 konfirmatorisk testet giver det samlet 13 sandt negative. Specificitet 12 kendt HPA-1a + 1 ukendt HPA-1a = = 23

Platelet HPA1a typing Assay: Metoden har bestemt 106 postive prøver, og ingen falsk negative. Platelet HPA-1a Typing Assay bestemte 1 prøve positiv, som Capture-P metoden bestemte negativ. Derfor giver det 106 positive prøver. Sensitivitet = = 100 % Specificitet = = Økonomi Anvendt mængder af reagenser og mikrotiterplader for Capture-P metoden og Platelet HPA1a Typing Assay er udregnet i tabel 7 og 8. tabel 9 viser økonomien over reagenser. Priserne sammenlignes mellem metoderne i tabel 10. Prisen på Capture-P metoden er oplyst fra firmaet TRIOLAB. For Platelet HPA1a Typing Assay er prisen for kittet oplyst af afdelingen. Anvendt mængde af reagenser og antal af brønde er ikke den samme for begge metoder. Platelet HPA1a Typing Assay benytter 2 mikrotiterplader, mens der benyttes 3 ved Capture-P metoden. For Capture-P metoden er der ikke brugt kontroller, mens disse er medregnet i økonomien for Platelet HPA1a Typing Assay. Tabel 7: Anvendt mængde pr. brønd (bilag 10) er bergnet ved brug af 3 plader med hver 96 brønde dvs. 288 brønde. Capture-P postiv serum control 25µL* 288= 7,20ML Capture-P LISS 50 µl* 288= 14,40ML Bromelin 50 µl* 288= 14,40ML Indicator red cells 60 µl* 288= 24

17,28ML Tabel 8: Platelet HPA-1a Typing Assay anvendte mængder ved brug af 2 plader Mængder udregnet efter vejledningen(bilag 7 s. 51). Konjugat 90 µl *2plader= 180µL Positiv kontrol 20 µl*2brønde=40 µl Negative kontrol 20 µl*2brønde= 40 µl substrat 100 µl*192brønde= 19,20ML reaktionsbuffer 9000 µl*2plader= 18,00ML Økonomi over reagenser brugt ved de to metoder. Tabel 9 vises summen af udgifter for hver metode i tabel 9. For Platelet HPA1a typing Assay kittet er prisen 6000,60 kr. inklusiv kontroller. I dette kit kan der udføres 192 blodprøver inklusiv kontroller med en forudsætning af at alle 188 prøver plus 4 kontroller skal udføres samtidig, da der skal køres 2 kontroller på hver plade. Tabel 9: Økonomi over reagenser for begge metoder Capture-P Microplates 5 stk. 8.699,00kr Capture P positive Serum Kontrol (weak) Før pris: 906kr Capture- P LISS før pris: (10x11,5ml)1032kr Bromelin Capture P indicator Redcells før pris: (10x11,5ml) 795kr 3 stk. CAPTURE-P Solid phase Microplates 2174,40 kr Platelet HPA1a Typing Assay kittet: 2x96 brønde inkl. Reagens 5.333,90 129,22 kr Kontroller (pos+neg) 666,70 kr. 190,71 kr 119,46kr 5,219,40 kr I ALT 7,833,19 kr. I alt 6000,60 kr. 25

Tabel 10 viser en sammenligning på økonomien mellem Capture-P metoden og Platelet HPA-1a Typing Assay. Der er beregnet pris på hvad en mikrotitterplade koster, hvad en række koster og hvad en enkeltbestemmelse koster. Tabel 10: Sammenligning af de to metoder Capture-P teknikken Platelet HPA-1a Typing Assay I alt for dette projekt 7.833,19 kr. 6.000,60 kr. 1 mikrotiterplade 2.611,00 kr. 3.000,30 kr. 1 række 217,58 kr. 250,00 kr. 1 prøve (enkeltbestemt) 27,20 kr. 31,25 kr. Tabel 11 viser omkostninger i forbindelse med arbejdstid ved at udføre en enkeltbestemmelse og en dobbeltbestemmelse ved Capture-P metoden. Til sammenligning ses en udregning ved enkeltbestemmelse ved Platelet HPA-1a Typing Assay. Tabel 11:Capture-P metoden er ca. 1 time om at udfører en analyse. Og for Platelet HPA-1a Typing Assay tager analysen 1,5time(90min). Capture-P metoden Enkeltbestemt: 120 prøver= 2plader Analysetid= 120min Bioanalytikertid 3*centrifugering af blodprøver = 30min Betjening af apparat = 5min Aflæsning af resultat = 5min I alt= 40min bioanalytikertid Timeløn pr. min= Dobbeltbestemt. 2x120 prøver =4plader Arbejdstiden =240min. Bioanalytiker tid 3* centrifugering af blodprøver =30min Betjening af apparat =10min Aflæsning af resultat =10min I alt = 60min 26

Timeløn pr.min Løn til bioanalytiker = 40min*2,45 kr. pr. min= 98kr. Løn til bioanalytiker 50 min *2,45 kr. pr. min= 122,50kr. Platelet Hpa1a Typing Assay Enkeltbestemt: 120prøver=2plader Analysetid=90min Bioanalytikeretid= afpippetering/fremstilling af konjugat =35min Betjening af apparat=10min Aflæsning af resultat= 5min I alt = 50min Løn pr. min Løn til bioanalytiker = 50Min *2,45kr pr. min =122,50 Konfirmatorisk test Enkeltbestemmelse 2000kr. En bioanalytiker får 147kr. i timen uden tillæg (18). Hvis der skal udføres en dobbeltbestemmelse ved Capture-P metoden skal det ske i en anden plade, da apparatet ikke kan dobbeltbestemme den samme prøve i en plade. Derfor er der udregnet 4 plader til dobbeltbestemmelserne. Tabel 11 viser hvad en enkeltbestemmelse koster ved Platelet HPA-1a Typing Assay, da dette var tilfældet i rutinen på afdelingen. Til sidst vises hvad en konfirmatorisk test koster (7). 4.0 Diskussion 27

Til dette projekt blev der anvendt 120 blodprøver fra donorer til detektering af HPA-1a antigen. Heraf var12 konfirmatorisk testede HPA-1a negative og 108 var ukendte donorer. Blandt de ukendte donorer bestemte Capture- P metoden 3 af dem som HPA-1a negative, hvorimod Platelet HPA1a Typing Assay kun bestemte 1 af disse som HPA-1a negativ. Dog var det de samme som ved Capture-P metoden. Alle 120 prøver blev dobbeltbestemte af Capture-P metoden, da den ikke var valideret til at detektere HPA-1a antigenet. Ved Platelet HPA1a Typing Assay blev kun 48 prøver dobbeltbestemte, da der ikke var brønde nok til at dobbeltbestemme alle 120 prøver. Resultater for begge metoder Da Capture-P metoden ikke er en valideret metode i Danmark, var opmærksomheden rettet mod de 12 konfirmatorisk testede HPA-1a negative donorer. Capture-P metoden afgav et sandt negativt svar på de 12 kendte HPA-1a negative donorer. Disse prøver udgør 10 % af det samlet antal prøver. Ud af de 108 ukendte donorer bestemte Capture-P metoden de 105 positive, dvs. i alt 87,5 %, og bestemte 3 af dem negative dvs. 2,5 %. Ud fra de samme prøver bestemte Platelet HPA1a Typing Assay de 106 positive, dvs. 88 %. De 12 konfirmatorisk testede HPA-1a negative er tidligere bestemt ved denne metode, så forventet at de blev bestemt som negative dvs. i alt 10 % ligesom Capture-P metoden. Der blev blandt de ukendte fundet 1 svarende til 1 %. Og 1 prøve i gråzonen dvs. 1% ud af det totale. Disse resultater er opstillet i et cirkeldiagram se figur 3 og 4 i resultatafsnittet. Resultaterne viser at Capture-P metoden har bestemt prøve 65 negativ, både ved første og anden bestemmelse, se i tabel 5, hvorimod Platelet HPA1a Typing Assay afgiver et tydeligt positivt resultat på 1,0022. Dette resultat er bemærkelsesværdigt, da denne donor efterfølgende er, slået op i blodflödet som er bestemt positivt ved Platelet HPA1a Typing Assay. Dvs. Capture-P metoden har afgivet et falskt negativt svar. Uddrag af tabel 5 Capture-P og Platelet HPA1a typing Assay afviger meget fra hinanden Prøvenr: Capture-p Cv % Platelet Cv % HPA1a Typing assay 65 9/15 -/- 35,35% 1,0022 28,28% Tabel 12 viser resultaterne for Capture-P metoden giver en sensitivitet på 99,05 %. 28

Den diagnostisk sensitivitet er vigtig i relation til donorer, da man vil undgå falske negative resultater på typebestemmelsen, til de patienter der har dannet anti-hpa-1a som skal have transfusion. Derfor tilstræbes en høj sensitivitet. Dette er opnået ved begge metoder. Tabel 12 viser hvor udregningen for sensitivitet og specificitet Platelet HPA1a Typing Assay Capture-P metoden Diagnostisk sensitivitet Diagnostisk sensitivitet 100 % 99,05 % Diagnostisk specificitet Diagnostisk specificitet 100 % 100 % I relation til en eventuel screening af gravide er det vigtigt at have en høj specificitet, da man vil undgå falske positive resultater, da man ikke ønsker at immunisere fostret. Den høje specificitet vil gør en forskel på fostre/nyfødte med NAIT så man er forberedt på en behandling. Et studie fortaget af Carol D. Jones et al. (1989) havde til formål at detektere thrombocyt igg antistoffer i forbindelse med sygdommen Immune Thrombocytpeni Purpura. De har brugt SPAT metoden også fra IMMUCOR. Proceduren er det samme som Capture-P metoden, bortset fra at der anvendes serum i stedet for plasma, og der bruges ikke bromelin. Der er beregnet en sensitivitet på 65 % og en specificitet på 100 %(6). Specificiteten er høj ligesom i projektet. En god sensitivitet og specificitet er opnået både ved Platelet HPA1a Typing Assay og ved Capture-P metoden, se i tabel 12 ovenfor. Da Capture-P metoden ikke er en valideret metode vil resultaterne fra Platelet HPA-1a Typing Assay i dette projekt betragtes som værende sandt positive og negative. I valideringsrapporten af Klinisk Immunologisk Afdeling Nordsjællands Hospital Hillerød vurderes af resultaterne fra Platelet HPA-1a Typing Assay står at der maksimalt må være 25 % falsk negative resultater. På baggrund af donorblodprøver blev der bestemt 112 prøver til at være HPA-1a negative, og blev konfirmatorisk testet. Ved denne test blev der bestemt 11 HPA-1a positive dvs. hele 9,8 % er blevet bestemt som falsk negative af Platelet HPA-1a Typing Assay (Bilag 11 s.59). 29

Ved vurdering af resultaterne for Capture-P metoden sås flere steder spørgsmålstegn dvs. at apparatet ikke kunne bestemme hvorvidt resultaterne var negative eller positive se i tabel 4. Uddrag af tabel 4 Resultater ligger i gråzonen for Capture-P metoden Prøvenr. Capture-p CV % Platelet CV% hpa1a typing assay Kendt neg 88 20/21?/? 3,45% 0,0551/0,1033 -/- 43,03% Prøve 88 se tabel 4 er en kendt negativ konfirmatorisk testet donor. Her lå både første og anden bestemmelse i gråzonen (negativ < 20) efterfølgende blev denne prøve visuelt vurderet som negativ. Prøve 88 har Platelet HPA-1a Typing Assay bestemt begge bestemmelser som værende negative. En overvejelse blev taget under vurdering af Capture-P metodens resultater med spørgsmålstegn. Når der fremkommer et spørgsmålstegn ved første og anden bestemmelse, kan en fejl ske under apparatets afpippetering af thrombocytter. En overvejelse kan være at thrombocytterne er bundfældet efter prøven har stået længe i apparatet og dermed måske bliver koncentration lavere i plasmaet. At resultaterne lå på gråzonen for Capture-P metoden forekom 7,5 % af tilfældene (i alt 9 prøver)(tabel 4) her kræves at visuel vurdere resultaterne for at kunne afgive et svar. Platelet HPA1a typing assay er en valideret metode, på trods af det lå 4 resultater i gråzonen se i tabel 6. Tabel 6 Platelet HPA1a typing Assay på hver sin side af cut- off Prøvenr. Capture-P Platelet HPA1a Typing Assay 80 76/77 +/+ 0,4968/0,6227?/+ 92 37/38 +/+ 0,4610/0,7302?/+ 101 40/70 +/+ 0,4580/1,7311?/+ 3 7/12 -/- 0,4059? 30

Capture-P metoden bestemte alle 3 prøver positive, men prøve 3 som negativ. Da metoden ikke er valideret vides ikke om det er den sande værdi. Hvis de 4 resultater fra Platelet HPA1a Typing Assay angives med en decimal dvs. rundes op, som metodens cut-off værdi tolkes, bliver disse resultater positive (positiv 0,5)(bilag 7 s. 51). Hvis dette er tilfældet, er der ingen uoverensstemmelse mellem resultaterne fra metoderne undtagen prøve 3, i virkeligheden skal alle prøver til en konfirmatorisk test, da man i rutinen ikke vil afgive et resultat i gråzonen som et endeligt svar. I tabel 1 i resultatafsnittet ses en inddeling af hvor meget dobbeltbestemmelserne spreder sig fra hinanden for begge metoder. Figur 5 viser spredningerne for de 48 prøvers dobbeltbestemmelser. Heraf ses at spredningen af dobbeltbestemmelserne ved Capture-P metoden ligger i den lave ende. Jo flere prøver der ligger i den lav ende desto bedre er præcisionen for metoden. Derudover ses spredningen over dobbeltbestemmelserne fra Platelet HPA1a Typing Assay ligger 45 % i den høje ende dvs. en lavere præcision. Endvidere står der også i indlægsseddel for Platelet HPA1a Typing Assay, at hvis differencen er over 20 % laves analysen om (bilag 8 s.53). I tabel 2 er der udregnet CV % på alle 120 dobbeltbestemmelser for Capture-P metoden heraf ser man at spredning ligger i den lave ende hvilket er godt, da man ikke ønsker at der skal være en stor spredning mellem dobbeltbestemmelserne. Men der er dog 3 prøver der ligger i den høje ende. Tabel 2: udregning af CV % for 120 dobbeltbestemmelser ved Capture-P metoden CV % Capture-P metoden 0-5 % 36 5-10 % 36 10-20 % 28 20-40 % 17 40-90 % 3 I projektet er der vurderet hvilke prøver der har en størst spredning fra hinanden altså 0-90 %. disse ses i tabel 3. 31

Tabel 3: 3 bemærkelsesværdig spredning mellem dobbeltbestemmelserne ved udregning af CV % Prøvenr. Capture-P værdi Capture-P CV % Platelet HPA-1a Typing Assay OD-værdi Platelet HPA-1a Typing Assay CV % 108 Kendt 10/4 60,61% 0,0583/0,0930 32,43 % negativ 111 12/3 84,85% 0,1983/0,2186 6,89 % Kendt negativ 18 9/5 40,41% 0,2672 - Tabel 3 viser at Capture-P metoden har vurderet den konfirmatorisk testet prøve 108 til at være negativ, men spredningen er stor mellem bestemmelserne hele 60,61 % dette gælder prøve 18 også med en spredning på 40,41 %. Prøve 111 er spredningen hele på 84,85%, hvor for Platelet HPA1a Typing Assay har en spredning på 32,43 %. Ved prøve 108 og 111 er spredningen kun på 6,89%. Ud fra indlægssedlen prøve 108 køres om da differencen er over 20 %(bilag 8 s.53). Da prøve 108 bliver testet som negativ bliver de sendt til konfirmatorisk test. Under en rutine ved udførsel af Capture-P metoden er det en fordel at have en acceptgrænse som fortæller om dobbeltbestemmelserne hvor langt de må sprede. Ulempen ved dobbeltbestemmelser er økonomien da det koster ekstra tabel 11. Prøvematerialeholdbarhed fordele og ulemper ved begge metoder I dette projekt er der ikke undersøgt holdbarheden for prøvematerialet med dette siges at der vides ikke om opbevaring af prøvematerialet har en påvirkning på resultaterne. I vejledningen for Capture-P metoden henvises til anvendelse af thrombocytrigt plasma fra donorer, der står også at analysen skal udføres inden for 48 timer(bilag 9s.55). Fordelen ved Platelet HPA1a Typing Assay er at prøvemateriale er brugen af fuldblod, centrifugering af blodprøverne udelades og prøven skal analyseres indenfor 5 dage kan indtil da opbevares i køleskabet. I denne test er det muligt at anvende thrombecytrigt plasma 32

I et studie fortaget af Garner et al. (1999) fortælles om brugen af thrombocytrigt plasma eller fuldblod, om man bruger det ene eller det andet har ingen betydning for resultaterne (19). En ulempe ved apparatet NEO er, at det ikke kan bestemme samme prøve 2 gange i en plade. Derfor var det nødvendigt at udføre den første bestemmelse i en plade og anden bestemmelse i en anden plade. Fordelen kunne være, hvis der opstår fejl i den ene plade vil det forhåbentligt ikke ske ved begge bestemmelse. Screening Hver uge modtager immunologisk afdeling på Rigshospitalet 600 Blodprøver fra gravide. Det er prøver fra hele regionen, der sendes ind til typebestemmelse og screentest (5). Hvis man kunne forestille sig at Capture-P metoden blev indført rutinemæssigt kunne disse gravide bestemmes for HPA-1a antigenet på samme tidspunkt, man kunne evt. tage 2 blodprøver, og sende den ene til Klinisk Immunologisk Afdeling på Herlev Hospital. Hvis man deler de 600 prøver over 5 dage pr. uge. Vil det give 120 prøver pr. dag. En monitorering af de gravide kvinder vil kunne give en bedre behandling af NAIT. Der kan overvejes nødvendigheden af en konfirmatorisk test på de HPA-1a negative gravide kvinder. En konfirmatorisk test vil være mere relevant på et positivt resultat da der ikke ønskes et falskt positivt svar, og man vil overse en risiko for udvikling af NAIT hos fostre/barn. En konfirmatorisk test koster 2000kr pr. blodprøve. Hvis hvert enkelt prøve skal til en konfirmatorisk test vil analysen være dyr, da størstedelen af befolkningen er positiv. Derfor et alternativ kunne være at dobbeltbestemme prøverne. Økonomi For Capture-P metoden kan man se i tabel 11 i resultatafsnittet at analysetiden er 60 min for dobbeltbestemme de 120 blodprøver. Økonomien bliver udregnet for 4 plader, hvis det ønskes er der plads til kontroller til disse prøver. Capture-P metoden er en automatiseret analyse, bortset fra at bioanalytikeren skal centrifugere blodprøverne for at opnå thrompocytrigt plasma, og dette tager 30min centrifugen kun kan centrifugere 48 blodprøver ad gangen, hvorimod der til Platelet HPA1a Typing Assay bruges fuldblod. Mens prøverne analyseres på apparatet kan bioanalytikeren udføre andet arbejde. For Platelet HPA1a Typing Assay er analysetiden 90min og bioanalytikeren kan ikke udføre andet arbejde da metoden er semi-automatiseret og kræver bioanalytikers 33

tilstedeværelse. For Platelet HPA1a Typing Assay udføres kun enkeltbestemmelse da dette var tilfældet i rutinemæssigt. I tabel 11 ser man at det kræver mere arbejdstid for at lave dobbeltbestemmelse end enkeltbestemmelse, for Capture-P metoden. Derudover skal løn omkostninger inddrages. I tabellerne kan man se at lønnen for dobbeltbestemmelse ved Capture-P metoden er ens for Platelet HPA1a Typing Assay, dvs. selvom Capture-P metoden er en automatiseret metode er den stadig dyr i løn omkostninger for dobbeltbestemmelser, men let at udføre som nævnt fordi den er automatiseret. I et studie fortaget af Carol D. Jones et al. (1989) Forfatteren fortæller om at Capture-P metodens udførsel er nem og hurtig(6). I tabel 9 fremgår prisen over begge metoder Capture-P metoden og Platelet HPA1a typing Assay, her ser man at 3 plader plus reagens koster for hele Capture-P metoden 7,833,19. dvs. for at screene de 120 gravide pr. dag, med dobbeltbestemmelser kræves det at have 4 plader da metoden ikke analyserer samme prøve i en plade dvs. de 7833,19kr. divideres med 3. Det giver 2611kr for en plade ses denne pris i tabel 10. dvs. 2611 gange 4 = 10,444kr. pr. dag vil det koste at screene de gravide. Hvis lønnen skal medregnes vil det koste 10566,50kr. For Platelet HPA1a Typing Assay koster det 6000,60kr. for screening af de 120 gravide da der ikke udføres dobbeltbestemmelser ved denne metode(tabel 11 og 9). Med løn koster det 6123,10. Samlet Som nævnt viste prøve 88 ved Capture-P metoden ikke et klart svar det var en konfirmatorisk testede prøve som viste spørgsmålstegn ved bestemmelserne da den var under cut-off værdien, derfor blev den visuelt bestemt. Den blev bestemt som negativ. Med dette siges at metoden har bestemt alle de 12 HPA-1a konfirmatorisk testede negative prøver til at være sandt negative dette ses i resultaterne i figur 3. Muligvis er det ikke nødvendigt at udføre den konfirmatorisk test, med disse resultater behøves det ikke i forhold til gravide se i figur 3 under resultatafsnittet. I forhold til donorer er det vigtigt at der udføres en konfirmatorisk test, som nævnt at man vil undgå falsk negative resultater. Svagheden ved dette projekt er, at der ikke var nok konfirmatorisk testede prøver til at gøre Capture-P metoden valid. Hvis projektet havde haft flere konfirmatorsik testede HPA-1a negative donorer, var der flere resultater at arbejde med. Disse resultater kunne give et tydeligere svar på om der behøves at lave dobbeltbestemmelser på hver prøve, eller om man kunne nøjes med at enkeltbestemme og dermed indføre Capture-P metoden som en rutinemæssig analyse til screening af gravide. 34

Kritik over projekt Under forsøget kunne man godt have brugt flere konfirmatorisk testede HPA-1a negative donorer, da det er disse donorer der er relevant for projektet. For Platelet HPA1a Typing assay var der ikke nok plader til at udføre dobbeltbestemmelser. Det var en konsekvens for udførsel af databehandling. Fordi der kunne ikke regnes en spredning på alle prøver. Måske handlede det om samarbejdet mellem gruppe A var dårligt. I projektet formodes at Platelet HPA1a Typing Assay er de sande værdier, men da ikke alle prøver var konfirmatorisk testet, så er det ikke sikkert at den giver de sande svar. 5.0 Konklusion Ved en metodesammenligning mellem Capture-P metoden og Platelet HPA1a typing Assay viser dette projekt at Capture-P metoden har både en høj sensitivitet på 99,05 % og en høj specificitet på 100 %. På denne bagrund vurderes at Capture-P metoden umiddelbart godt kan erstatte den validerede Platelet HPA1a Typing Assay. Den høje specificitet har en betydning i relation til screening af gravide for HPA-1a antigen. Hvis man som i dette projekt udfører dobbeltbestemmelse ved Capture-P metoden kontra enkelt bestemmelse ved Platelet HPA1a typing Assay ligger driftsomkostningerne meget tæt op af hinanden. Der ses lavere driftsomkostninger ved brug af enkeltbestemmelse. Projektet er baseret på dobbeltbestemmelse, så på den baggrund virker det ikke realistisk at indfører analysen rutinemæssigt til at detektere HPA-1a antigen hos de gravide. 6.0 Perpektivering Havde projektet forløbet over længere tid, kunne der være inddraget flere prøver, og dermed være flere resultater at arbejde med. Disse resultater kunne give et mere realistisk billede af validiteten for Capture-P metoden. Samtidig ville det give et mere klart resultat på, om metoden eventuelt kunne nøjes med at enkeltbestemme de gravide, og dermed gøre driftsomkostningerne mindre. Hvis moren bestemmes negativ for HPA-1a antigenet, ville det være hensigtsmæssigt ligeledes at 35

bestemme om faren har HPA-1a antigenet, for dermed at se sandsynligheden for om barnet er negativ eller positiv. En ulempe ved at bestemme faren kunne være at han ikke er faren til barnet. hvis det blev muligt at indfører en sådan screening, skal man til at undersøge hvordan man bedst kan behandle disse kvinder. Skal man til at behandle disse kvinder på samme måde som man gør med kvinder der før har født et barn med NAIT, og har det nogen konsekvenser på land sigt. Det er et nyt projekt at finde ud af det. Men det kunne være fantastisk hvis man kunne redde disse børn/fostrer for disse komplikationer. Referencer (1) Taaning, E: (2009) Trombocytter og antistoffer Rigshospital Klinisk Immunologisk Afdeling (2) Dickmeiss. E. Dzeigiel, M. H & Taaning E.(2008) Kompendium til Transfusionsmedicin og graviditetens immunologi Rigshospital Klinisk Immunologisk Afdeling (3) Jensen IB., Schou G, og Petersen La Cour M(2010) Fotometri. Kompendium generelle analyseprincipper. (4) Andersen, H. Sørensen U. B. & Thomsen E. (2008) Immunkemiske metoder teori og praksis. (1. Udgave) Århus; Nucleus Forlag Aps. (5) Birgit Christensen afdelings bioanalytikere immunologisk afdeling Rigshospital (6) Carol D. Jones, Lynn M, Gould, & Stephen LEE.(1989)An Evaluation of solid phase Red Cell Adherence test for Detecting platelet Associated IgG in immune Thrombocytopenia. Deparmment of pathology and laboratory Medicine, Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, Califonia 552-554 (7) Instrukstitel; HPA gentypebestemmelse med SSP Rigshospital 36

(8) Hillyer, C.; SilbersteinL.; Ness, P. ; Andersen K. ; Roback, J. (2007) Blood Banking and transfusion Medicine.( 2. udgave) Churchill livingstone elsevier (9) Vejledning til udarbejdelse af rapporter og projekter på Bioanalytikeruddannelsen. Version E07 Bioanalytikeruddannelsen København Fælledvej 12 2200 København N (10) Lyngbye, J. et al. (2010). Lyngbyes Laboratoriemedicin (2. udg.). København K: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck (11) Sand, O. et al. (2006) Menneskets anatomi og fysiologi (2.udgave) Gads forlag (12) Jersild C. (1998) Transfusionsmedicin og intravenøs væsketerapi(2.udgave): Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck (13) Rachel JM et al. (1988)Use of a solid Phase Red Blood Cell Adherence Method for Pretransfusion Platelet Compatibility testing. Community Blood center of Greater Kanses City. 63-67 (14) Jensen TB; (2012)Erytrocytseriologiske Teknikker Og Metoder (1. udgave) på Bioanalytikeruddannelsen (15) Bessos, H. et al. (2008) Direct comparison between two quantitative assays in the measurement of maternal anti-hpa-1a antibody in neonatal alloimmune thrombocytopenia (NAIT). ScienceDirect; 221-226 (16) Besos, H. et al. (1999) an international Trial Demonstrates suitability of Newly Develoed Whole-Blood ELISA Kit for Multicenre Platelet HPA-1 Phenotyping. Vox sanguinis; 103-105 (17) Taaning, E(2010) Immunologi og transfusionsmedicin. (3. udgave) Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck (18) Danske bioanalytiker (dbio) (19) S. F. Garner. (1999)A rapid one-stage whole-blood HPA-1a Phenotyping assay using a Recombinant monoclonal IgG1 anti-hpa-1a; british journal of Haematology 200, 108. 440-447 (20) Instrukstitel; HPA gentypebestemmelse med SSP Rigshospital (21) Birgit Christensen afdelings bioanalytikere immunologisk afdeling Rigshospital 37

Bilag 1 note til sekretærene ang. indkaldelse af HPA-1a negative bloddonorer Vi kan se du skal tappes i næste måned. Derfor ville vi høre om du vil komme ind til tapning uge 12, 13 eller 14, da vi har nogle bachelorstuderende, som skal lave et forsøg i disse uger. Du er tidligere blevet bestemt med blodtype HPA-1a negativ, og det er jer, de studerende skal bruge til forsøget. Vi har derfor brug din hjælp. Det kommer til at foregå som en helt normal tapning, men der vil bare blive taget to ekstra blodprøveglas til forsøget. Resultaterne fra disse blodprøver vil forblive anonyme gennem hele projektet, og I vil ikke få oplyst svarene på analyserne, da svarene allerede er kendt af blodbanken. En evt. uddybelse omkring vores forsøg: Det drejer sig om at finde en billigere metode til at få typebestemt alle regionenes donorer, fordi man meget gerne vil vide hvilke donorer der er HPA-1a negative. Der bruges blodplader fra HPA- 1a negative donorer til b. la. nyfødte børn. Bilag 2 38

Rådata over metodernes resultater Capture- P værdi Bestemmelse r første og anden på Capture-P konklusionen Visuel vurderin g af Capture- P HPA1a Platelet typing Assy OD-Værdi Kvalitativ resultat 1 60/60 +/+ 2,7048 + 2 57/63 +/+ 2,6740 + 3 7/12 -/- 0,4059-4 31/33 +/+ 2,1274 + 5 56/42 +/+ 2,4603 + 6 65/69 +/+ 2,0443 + 7 77/58 +/+ 1,6340 + 8 79/80 +/+ 2,5100 + 9 63/63 +/+ 2,2245 + 10 29/34?/+ +/+ 2,2004 + 11 58/62 +/+ 2,0236 + 12 60/62 +/+ 2,3533 + 13 36/40 +/+ 1,7810 + 14 71/70 +/+ 2,5902 + 15 75/73 +/+ 2,5630 + 16 79/82 +/+ 2,6726 + Kendt 6/5 -/- 0,1044 - neg 17 Kendt 9/5 -/- 0,2672 - neg 18 19 40/34 +/+ 1,8926 + 20 65/59 +/+ 2,3963 + 21 62/60 +/+ 2,6247 + 22 69/61 +/+ 2,5353 + 23 63/80 +/+ 1,5582 + 24 71/75 +/+ 2,7307 + 25 62/73 +/+ 3,0648 + 26 54/33 +/+ 2,2514 + 27 67/77 +/+ 2,4099 + 28 65/59 +/+ 2,5457 + 29 84/78 +/+ 1,6619 + 30 84/89 +/+ 1,7421 + 31 92/89 +/+ 2,7771 + 32 99/99 +/+ 2,2795 + 33 59/78 +/+ 2,6579 + 34 32/56 +/+ 2,0374 + 39

35 33/58 +/+ 2,0668 + 36 62/78 +/+ 2,9037 + 37 65/71 +/+ 1,7243 + 38 81/86 +/+ 1,8590 + 39 85/85 +/+ 2,8555 + 40 81/85 +/+ 2,7276 + 41 52/69 +/+ 2,5000 + 42 31/34 +/+ 2,1150 + 43 35/34 +/+ 1,8488 + 44 25/33?/+ +/+ 2,1857 + 45 65/67 +/+ 2,0677 + 46 83/84 +/+ 3,1835 + 47 87/85 +/+ 2,3193 + Kendt 7/9 -/- 0,2429 - neg 48 49 32/56 +/+ 2,3856 + 50 49/64 +/+ 3,0783 + 51 27/39?/+ +/+ 1,3154 + 52 51/60 +/+ 2,4001 + 53 53/61 +/+ 1,6438 + 54 62/67 +/+ 2,8433 + 55 86/79 +/+ 2,6576 + 56 81/80 +/+ 2,9902 + 57 28/36?/+ +/+ 2,3856 + 58 33/36 +/+ 1,3009 + 59 34/57 +/+ 2,5196 + 60 30/34 +/+ 1,6575 + 61 29/37?/+ +/+ 2,5068 + 62 58/65 +/+ 2,0653 + 63 80/81 +/+ 2,5641 + 64 80/80 +/+ 3,0615 + 65 9/15 -/- 1,0022 + 66 52/63 +/+ 1,6385 + 67 31/38 +/+ 2,1821 + 68 32/36 +/+ 2,2950 + 69 28/30?/+ +/+ 1,4893 + 70 52/62 +/+ 2,8683 + Kendt 9/7 -/- 0,1619 - neg 71 Kendt 7/5 -/- 0,0986 - neg 72 73 36/36 +/+ 1,8788/1,8929 +/+ 74 51/41 +/+ 2,2021/1,2643 +/+ 75 32/38 +/+ 0,5242/0,9295 +/+ Kendt 19/15 -/- 0,0955/0,0795 -/- 40

neg 76 77 39/41 +/+ 0,5483/0,6740 +/+ 78 61/67 +/+ 1,7122/1,9246 +/+ 79 62/67 +/+ 1,4315/1,3457 +/+ 80 76/77 +/+ 0,4968/0,6227 -/+ 81 39/31 +/+ 0,8021/1,0890 +/+ 82 35/49 +/+ 1,7081/0,6838 +/+ 83 37/40 +/+ 1,6846/1,8753 +/+ 84 38/53 +/+ 0,9099/0,9841 +/+ 85 41/32 +/+ 0,6596/1,8539 +/+ 86 38/61 +/+ 0,7333/0,5421 +/+ 87 72/65 +/+ 1,2718/0,6245 +/+ Kendt 20/21?/? -/- 0,0551/0,1033 -/- neg 88 89 31/28 +/? +/+ 1,6966/1,7005 +/+ 90 41/36 +/+ 1,3305/1,6923 +/+ 91 39/42 +/+ 2,2916/1,4332 +/+ 92 37/38 +/+ 0,4610/0,7302 -/+ 93 43/55 +/+ 2,2395/0,6767 +/+ 94 37/39 +/+ 1,6319/0,6845 +/+ 95 58/78 +/+ 1,9688/1,7085 +/+ 96 41/58 +/+ 1,6329/1,9991 +/+ 97 50/41 +/+ 2,2038/2,1539 +/+ Kendt 7/8 -/- 0,1090/0,0829 -/- neg 98 99 54/61 +/+ 2,4410/2,0539 +/+ 100 68/61 +/+ 0,6137/1,4237 +/+ 101 40/70 +/+ 0,4580/1,7311 -/+ 102 56/68 +/+ 0,5489/1,1555 +/+ 103 68/74 +/+ 1,4542/1,3128 +/+ 104 76/81 +/+ 0,6557/1,6313 +/+ 105 29/28?/? +/+ 2,2839/1,6434 +/+ 106 56/51 +/+ 2,5047/1,7531 +/+ 107 60/52 +/+ 1,5659/1,7315 +/+ Kendt 10/4 -/- 0,0583/0,0930 -/- neg 108 109 76/63 +/+ 2,2952/2,3329 +/+ 110 76/84 +/+ 1,6646/2,2002 +/+ Ukendt 12/3 -/- 0,1983/0,2186 -/- neg 111 112 72/85 +/+ 2,0105/2,3748 +/+ 113 37/36 +/+ 2,3747/2,3792 +/+ 114 52/57 +/+ 1,7692/1,1573 +/+ 115 31/34 +/+ 1,8219/1,8653 +/+ 116 54/50 +/+ 1,5731/2,2960 +/+ 41

Kendt 10/14 -/- 0,2308/0,2108 -/- neg 117 Kendt 5/5 -/- 0,1010/0,0969 -/- neg 118 Kendt 7/8 -/- 0,0874/0,0878 -/- neg 119 120 89/89 +/+ 1,5356/2,2905 +/+ Beregning af CV% skema 2a Prøvenr. Capture-P værdi Capture-P CV % Platelet HPA- 1a Typing Assay OD-værdi 1 60/60 0,00 % 2,7048 2 57/63 7,07 % 2,6740 3 7/12 37,22 % 0,4059 4 31/33 4,42 % 2,1274 5 56/42 20,20 % 2,4603 6 65/69 4,22 % 2,0443 7 77/58 19,90 % 1,6340 8 79/80 0,90 % 2,5100 Platelet HPA-1a Typing Assay CV % 42

9 63/63 0,00 % 2,2245 10 29/34 11,22 % 2,2004 11 58/52 7,71 % 2,0236 12 60/62 2,38 % 2,3533 13 36/40 7,44 % 1,7810 14 71/70 1,00 % 2,5902 15 75/73 1,91 % 2,5630 16 79/82 2,64 % 2,6726 17 Kendt 6/5 12,86 % 0,1044 negativ 18 Kendt 9/5 40,41 % 0,2672 negativ 19 40/34 11,47 % 1,8926 20 65/59 6,84 % 2,3963 21 62/60 2,32 % 2,6247 22 69/61 8,70 % 2,5353 23 63/80 16,81 % 1,5582 24 71/75 3,87 % 2,7307 25 62/73 11,52 % 3,0648 26 54/33 34,14 % 2,2514 27 67/77 9,82 % 2,4099 28 65/59 6,84 % 2,5457 29 84/78 5,24 % 1,6619 30 84/89 4,09 % 1,7421 31 92/89 2,34 % 2,7771 32 99/99 0,00 % 2,2795 33 59/78 19,61 % 2,6579 34 32/56 38,57 % 2,0374 35 33/58 38,85 % 2,0668 36 62/78 16,16 % 2,9037 37 65/71 6,24 % 1,7243 38 81/86 4,23 % 1,8590 39 85/85 0,00 % 2,8555 40 81/85 3,41 % 2,7276 41 52/59 8,92 % 2,5000 42 31/34 6,52 % 2,1150 43 35/34 2,05 % 1,8488 44 25/33 19,51 % 2,1857 45 65/67 2,14 % 2,0677 46 83/84 0,85 % 3,1835 47 87/85 1,64 % 2,3193 48 Kendt negativ 7/9 17,68 % 0,2429 43

49 32/56 38,57 % 2,3856 50 49/64 18,77 % 3,0783 51 27/39 25,71 % 1,3154 52 51/60 11,47 % 2,4001 53 53/61 9,92 % 1,6438 54 62/67 5,48 % 2,8433 55 86/79 6,00 % 2,6576 56 81/80 0,88 % 2,9902 57 28/36 17,68 % 2,3856 58 33/36 6,15 % 1,3009 59 34/57 35,74 % 2,5196 60 30/34 8,84 % 1,6575 61 29/27 5,05 % 2,5068 62 58/65 8,05 % 2,0653 63 80/81 0,88 % 2,5641 64 80/80 0,00 % 3,0615 65 9/15 35,35 % 1,0022 66 52/63 13,53% 1,6385 67 31/38 14,35 % 2,1821 68 32/36 8,32 % 2,2950 69 28/30 4,88 % 1,4893 70 52/62 12,41 % 2,8683 71 Kendt 9/7 17,68 % 0,1619 negativ 72 Kendt 7/5 23,57 % 0,0986 negativ 73 36/36 0,00 % 1,8788/1,89 0,53 % 29 74 51/41 15,37 % 2,2021/1,26 38,26 % 43 75 32/38 12,12 % 0,5242/0,92 39,43 % 95 76 Kendt 19/15 16,64 % 0,0955/0,07 12,93 % negativ 95 77 39/41 3,54 % 0,5483/0,67 14,54 % 40 78 61/67 6,63 % 1,7122/1,92 8,26 % 46 79 62/67 5,48 % 1,4315/1,34 4,37 % 57 80 76/77 0,92 % 0,4968/0,62 15,90 % 27 81 39/31 16,16 % 0,8021/1,08 21,46 % 90 82 35/49 23,57 % 1,7081/0,68 60,56 % 38 83 37/40 5,51 % 1,6846/1,87 7,58 % 44

53 84 38/63 35,01 % 0,9099/0,98 41 85 41/32 17,44 % 0,6596/1,85 39 86 38/61 32,86 % 0,7333/0,54 21 87 72/65 7,23 % 1,2718/0,62 45 88 Kendt 20/21 3,45 % 0,0551/0,10 negativ 33 89 31/28 7,19 % 1,6966/1,70 05 90 41/36 9,18 % 1,3305/1,69 23 91 39/42 5,24 % 2,2916/1,43 32 92 37/38 1,89 % 0,4610/0,73 02 93 43/55 17,32 % 2,2395/0,67 67 94 37/39 3,72 % 1,6319/0,68 45 95 58/78 20,80 % 1,9688/1,70 85 96 41/58 24,28 % 1,6329/1,99 91 97 50/41 13,99 % 2,2038/2,15 39 98 Kendt 7/8 9,43 % 0,1090/0,08 negativ 29 99 54/61 8,61 % 2,4410/2,05 39 100 68/61 7,67 % 0,6137/1,42 37 101 40/70 38,57 % 0,4580/1,73 11 102 56/68 13,69 % 0,5489/1,15 55 103 68/74 5,98 % 1,4542/1,31 28 104 76/81 4,50 % 0,6557/1,63 13 105 29/28 2,48 % 2,2839/1,64 34 106 56/51 6,61 % 2,5047/1,75 31 107 60/52 10,10 % 1,5659/1,73 108 Kendt negativ 15 10/4 60,61 % 0,0583/0,09 30 5,54 % 67,20 % 21,20 % 48,27 % 43,03 % 0,16 % 16,93 % 32,59 % 31,96 % 75,79 % 57,84 % 10,01 % 14,26 % 1,62 % 19,23 % 12,18 % 56,22 % 82,25 % 50,33 % 7,23 % 60,33 % 23,06 % 24,96 % 7,10 % 32,43 % 45

109 76/63 13,23 % 2,2952/2,33 29 110 76/84 7,07 % 1,6646/2,20 02 111 12/3 84,85 % 0,1983/0,21 86 112 72/85 11,71 % 2,0105/2,37 48 113 37/36 1,94 % 2,3747/2,37 92 114 52/57 6,49 % 1,7692/1,15 73 115 31/34 6,53 % 1,8219/1,86 53 116 54/50 5,44 % 1,5731/2,29 60 117 Kendt 10/14 23,57 % 0,2308/0,21 negativ 08 118 Kendt 5/5 0,00 % 0,1010/0,09 negativ 69 119 Kendt 7/8 9,43 % 0,0874/0,08 negativ 78 120 89/89 0,00 % 1,5356/2,29 05 1,15 % 19,60 % 6,89 % 11,75 % 0,13 % 29,57 % 1,66 % 26,42 % 6,40 % 2,93 % 0,32 % 27,90 % Bilag 3 Kontrollernes resultater for Platelet HPA1a Typing Assay 46

DAG 1 DAG 2 DAG 3 DAG 4 positiv kontrol: 0,2273 positiv kontrol; 0,1734 positiv kontrol: 0,5020 positiv kontrol: 0,0821 Negativ kontrol: 0,0352 positiv kontrol 1 ekstra positive kontrol (donor blodprøve Konfirmatorisk testet positiv) første bestemmelse: 1,5534 anden bestemmelse: 1,4320 positive kontrol 1 ekstra positiv kontrol (donor blodprøve Konfirmatorisk testet positiv) første bestemmelse : 2,4957 anden bestemmelse: 2,5806 positiv kontrol 1 ekstra positive kontrol (donor blodprøve Konfirmatorisk testet positiv) første bestemmelse: 2,6953 anden bestemmelse: 2,1835 negativ kontrol: 0,0412 negativ kontrol: 0,0493 negativ kontrol: 0,0402 Bilag 4 Figur 1(3) skal der reference på ja eller nej? 47

48

Bilag 5 49

Bilag 6 Capture-P Cutt-off værdi. Kvalitativt resultat Cut off lav Cut off high Negativ (-) 0 20 Gråzone (?) 20 30 Positiv (+) 30 45 Positiv (+) 45 65 Positiv (+) 65 90 Positiv (+) 90 100 50

Bilag 7 Vejledning til HPA-1a screening af donorer fra Nordsjællands hospital Hillerød 51

52

Bilag 8 Indlægsseddel fra Platelet HPA-1a Typing Assay BIO-RAD 53

54

BILAG 9 INDLÆGSSEDEL FOR Capture--P 55