Capillarys 2 FlexPiercing

BIOANALYTIKERUDDANNELSEN UNIVERSITY COLLEGE LILLEBÆLT Capillarys 2 FlexPiercing En ny analysemetode til kvantificering af HbA1c Capillarys 2 FlexPiercing a new method for quantification of HbA1c Elektroferogram fra Capillarys 2 FlexPiercing for fænotype HbAA (1) Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen University College Lillebælt Trine Simone Mortensen Stud.nr.: 32109525 Hold: Sb510 11-12-13 Anslag: 81736 Teoretisk vejleder: Brit Naldahl Pourroy, bioanalytikeruddanelsen, University College Lillebælt Klinisk vejleder: Knud Erik Lynnerup, Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi, Odense Universitetshospital

Resume Baggrund På nuværende tidspunkt anvendes Tosoh HLC-723G8 (Tosoh) til kvantificering af HbA1c på Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi, Odense Universitetshospital. Tosoh analyserer vha. High-Performance Liquid-Chromatography, som er kendt for at være den metode, som påvirkes mest af interfererende faktorer. Apparatet Capillarys 2 FlexPiercing (Capillarys), som anvender kapillærelektroforese, burde blive mindre påvirket af interfererende faktorer, som især de hyppigste hæmoglobinvarianter. Formål Formålet med dette professionsbachelorprojekt er at afprøve Capillarys i forhold til Tosoh vha. et konkordansstudie og analyse af patientprøver indeholdende hæmoglobinvarianter. Materialer og metoder Til konkordansstudiet anvendes 64 patientprøver i form af EDTA-stabiliseret fuldblod. Til at undersøge konkordansen anvendes differensplot. Til analyse af hæmoglobinvarianter anvendes 29 patientprøver indsamlet i perioden fra d. 28/8-13 til d. 22/10-13, samt fem prøver med fænotyperne HbAS, -C, -D, -E og -A med forhøjet mængde føtal hæmoglobin (HbF), som blev udleveret af Sebia (Lisses, Frankrig). Resultater Konkordansstudiet viste, at de relative afvigelser på HbA1c-koncentrationen målt på hhv. Tosoh og Capillarys lå i intervallet -1,1% til 5,2% med undtagelse af én prøve, som afveg med 26%. Analyse af prøver med hæmoglobinvarianter viste at toppene fra disse, med undtagelse af HbF, er adskilte fra HbA1c- og HbA0-toppen på elektroferogrammerne. Konklusion Dette professionsbachelorprojekt viste, at der var fin konkordans mellem resultaterne opnået på hhv. Tosoh HLC-723G8 og Capillarys 2 FlexPiercing med undtagelse af én prøve. Analyse af prøverne med hæmoglobinvarianter viste at toppene herfra, undtagen HbF, var adskilte fra HbA1cog HbA0-toppene på elektroferogrammerne, og at der ikke sås nogen interferens herfra. Keywords: HbA1c, hæmoglobinvarianter Tosoh G8, Capillarys 2 FlexPiercing, HPLC, Kapillærelektroforese. Side 2 af 57

Forord Afprøvningen af Capillarys 2 FlexPiercing foregik i perioden fra den 07.10.2013 til den 08.11.2012 på Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi (KBF), Odense Universitetshospital. Først og fremmest vil jeg gerne takke KBF i Odense for at have givet os muligheden for at udføre denne afprøvning af Capillarys 2 FlexPiercing. Personalet på afdelingen har været yderst behjælpeligt i alle de situationer hvor vi har haft brug for hjælp og vejledning. Her skal der også gives et særligt tak til Lotte Foegt Poulsen, Faglig Specialist ved Hæmatologi og Sporstof for at være behjælpelig med svar på alle vores spørgsmål omkring Tosoh HLC-723G8. Derudover vil jeg gerne takke mine to vejledere Brit Naldahl Pourroy og Knud Erik Lynnerup for vejledning gennem hele projektperioden. Jeg vil gerne takke min bachelormakker Trine Lyberth Christensen for at have været en kæmpe hjælp og støtte under udarbejdelse af dette professionsbachelorprojekt. Tak til ILS Laboratories Scandinavia lån af apparatur, udlevering af reagens og fantastisk service, samt en særlig tak til Lars Bendixen, kundechef/crm og faglig specialist hos ILS Laboratories Scandinavia, for råd og vejledning. Ligeledes vil jeg gerne takke overlæge, Lars Melholt Rasmussen for svar på spørgsmål omkring HbA1c og diabetes mellitus. Desuden vil jeg gerne takke min familie, kæreste og de nærmeste venner for den store støtte, overbærenhed og opbakning. Trine Simone Mortensen Side 3 af 57

Indholdsfortegnelse Resume... 2 Baggrund... 2 Formål... 2 Materialer og metoder... 2 Resultater... 2 Konklusion... 2 Forord... 3 Introduktion... 6 Diabetes mellitus... 6 HbA1c-analysen... 6 Enheder... 7 Hæmoglobin... 8 Glykosylering... 8 Hæmoglobinopati... 9 HbA1c-analysen på Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi på Odense Universitetshospital...11 Problemformulering...12 Analyseprincipper...12 Tosoh...12 Capillarys...15 Metodiske overvejelser...17 Vurdering af data...18 Materialer...19 Apparatur...19 Reagenser...20 Kolonne...20 Kalibratorer og kontroller...20 Prøvemateriale og prøveantal...20 Metoder...21 Konkordansstudie af Tosoh og Capillarys...21 Holdbarhedsforsøg...21 Analyse af prøver med hæmoglobinvarianter...21 Statistiske redskaber...22 Side 4 af 57

Resultater...22 Konkordansstudie af Tosoh og Capillarys...22 Vurdering af dobbeltbestemmelser...22 Konkordansstudiet...23 Holdbarhedsforsøg...25 Påvirkning af HbA1c-koncentrationen...26 Ændring af elektroferogram...29 Analyse af prøver med hæmoglobinvarianter...29 Kvalitativ vurdering af elektroferogrammer og kromatogrammer...29 Diskussion...35 Konkordansstudie...35 Holdbarhedsforsøg...37 Analyse af prøver med hæmoglobinvarianter...39 Materialer og metoder...42 HbA1c-analysen på Capillarys i forhold til Tosoh...42 Antallet af indsamlede prøver...44 Opbevaring af prøver med ukendte hæmoglobinvarianter...45 Konklusion...45 Perspektivering...47 Referencer...48 Bilag 1 - A max...51 Bilag 2 - Friedmantest...52 Bilag 3 Elektroferogram fra prøve et i holdbarhedsforsøget...54 Bilag 4 Labquality kontroller...55 Bilag 5 Elektroferogram med acetyleret hæmoglobin...56 Bilag 6 Tro og love erklæring...57 Side 5 af 57

Introduktion Diabetes mellitus Diabetes mellitus er en sygdom, som giver hyperglykæmi, fordi kroppens celler ikke kan optage glukose, som så ophobes i blodet. Længerevarende hyperglykæmi kan have meget alvorlige konsekvenser for kroppen i form af bl.a. ødelæggelse af nethinden i øjet, koldbrand og ketoacidose. Sygdommen kan inddeles i type I og type II og menes begge at opstå på baggrund af en kombination af genetisk disponering og miljøfaktorer (2). Dog udvikles type I oftest meget hurtigere end type II, hvor der kan kan gå flere år før der opstår symptomer. Type I opstår når β- cellerne i de langerhanske øer i pancreas ødelægges. Dette skyldes oftest en autoimmunitet, men kan også skyldes endnu ukendte miljøfaktorer og vira. Da β-cellerne producerer insulin, vil ødelæggelsen resultere i insulinmangel, som vil påvirke glukosemetabolismen bl.a. ved at glukosen ikke kan transporteres ind i cellerne. Glukose er hydrofilt og er derfor ikke i stand til at kunne krydse cellernes lipidmembran, men skal transporteres ind i cellen ved at insulin bindes til insulinreceptorer på celleoverfladen. Denne binding giver signal til cellen, om at sende transporthormonet GLUT4, ud på overfladen af cellen. Herved kan glukose bindes til GLUT4, som transporteres ind i cellen. Ved type II ses et overskud af insulin, da cellerne ved type II er insulinresistente. Dette menes at skyldes ændringer i GLUT4 eller translokationen af GLUT4 til overfladen. Begge typer af diabetes mellitus resulterer derfor i hyperglykæmi, fordi glukosen ikke er i stand til at komme ind i cellerne. (2) Antallet af personer, der er diagnosticeret med type I diabetes, stiger med 3 % om året i Danmark. Dette betyder at der hvert år er ca. 750-800 personer, som får diagnosen diabetes mellitus type I. De præcise tal for antallet af personer med diabetes mellitus type II kendes ikke, men antallet stiger. I 1997 blev der registreret 15.000 nye tilfælde af diabetes mellitus type II i Danmark, men i 2006 var dette tal steget til 23.000 nye tilfælde. Denne stigning menes at afspejle stigningen af diabetes mellitus i hele den vestlige verden. (2) HbA1c-analysen HbA1c-analysen bruges til diagnosticering og monitorering af diabetes mellitus (3-5), og bygger på glykosyleringen af hæmoglobin A. Da middel HbA1c-koncentrationen er ligefrem proportional med koncentrationen af glukose i blodet (6,7), og da HbA1c-koncentrationen ikke påvirkes af de glukoseudsving, der sker i løbet af dagen, kan HbA1c-resultatet bruges til at estimere det Side 6 af 57

gennemsnitlige blodsukker over de forudgående 6-8 uger. Tidligere blev diabetes mellitus diagnosticeret vha. målingen af fasteblodsukker og oral glukosetolerancetest (OGTT), men i 2011 anbefalede WHO at analysen kunne anvendes til diagnosticering af diabetes mellitus (8). For at kunne diagnosticere diabetes mellitus vha. HbA1c-koncentrationen er der dog to krav, som skal opfyldes (8). Patienten skal hav en HbA1c-koncentration på 6,5% eller mere, og denne koncentration skal måles i to uafhængige målinger med et par måneders mellemrum (8). (2) Selve analysen, samt glykosyleringen af hæmoglobin, beskrives senere. Det stigende antal af patienter, der bliver diagnosticeret med diabetes, samt den øgede anvendelse af HbA1c-koncentrationen, har fået antallet af HbA1c-analyser til at stige (9). Dette øgede fokus på anvendelsen af HbA1c-koncentrationen har også skærpet kravene til de anvendte analysemetoder (8,10,11). Enheder Der findes tre internationale enheder til angivelse af HbA1c-koncentrationen. Det er hensigten at hele verden skal anvende de samme enheder, dette er dog ikke opnået endnu. (12,13) National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) NGSP var de første til at standardisere HbA1c-resultater, således at resultaterne fra forskellige laboratorier kunne sammenlignes med de værdier, der blev fundet i to af de største kliniske studier af effekten af intensiv behandling af diabetes mellitus. Disse studier var Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) og United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS). Den enhed som bruges i disse studier bliver kaldt DCCT-enheden og angives i %. (12,13) The International Federation for Clinical Chemistry (IFCC) IFCC udviklede senere en referencemetode for HbA1c-analysemetoder. Denne metode byggede på at adskille glukosedelen fra HbA1c vha. enzymer, og efterfølgende bestemte koncentrationen vha. kapillærelektroforese. Denne metode er mere specifik end andre anvendte metoder til måling af HbA1c-koncentrationen, hvilket også menes at skyldes at IFCC-resultater generelt er 1,5-2 % højere end DCCT-resultater. Hele ideen bag IFCC er at danne en fælles referencemetode, som apparaturfabrikanter og laboratorier kan kalibrere deres apparaturer efter. Den enhed som IFCC anvender kaldes IFCC-enheden og angives som mmol/mol. Der findes en master equation, som kan anvendes til at omregne DCCT-resultater i IFCC-enheden og omvendt. (12,13) Side 7 af 57

Estimated Average glucose (eag) Ud over at afgive HbA1c-resultater i IFCC- og DCCT-enhederne, er det blevet besluttet international, at HbA1c-resultater også skal angives i eag, som angives i mmol/l og beregnes vha. formler. Denne enhed er kommet til for at diabetespatienterne bedre skal kunne forstå deres HbA1cresultater. (12,13) Hæmoglobin Hæmoglobin er et iltbærende molekyle, som findes inde i erythrocytterne. Hvert hæmoglobin er opbygget af fire globinkæder, som hver er viklet omkring et hæm-molekyle. Det er dette hæmmolekyle, som vha. Fe 2+, er i stand til at transportere O 2 og CO 2. Globinkæderne er parvis identiske, og typen af kæderne afgør typen af hæmoglobin. Generne, som koder for globinkæderne findes på kromosom 11 og 16. På kromosom 11 findes generne for ε-, γ-, δ- og β-globin, og på kromosom 16 findes generne for ζ- og α-globin. Hæmoglobin A (HbA) er den dominerede type hæmoglobin hos voksne, og består af to α-globinkæder og to β-globinkæder. Ud over HbA er hæmoglobin A 2 (HbA 2 ) og hæmoglobin F (HbF) også normalt forekommende typer af hæmoglobiner. Disse findes dog i blodet i meget mindre mængde end HbA. HbA 2 består af to α-globinkæder og to δ- globinkæder, og HbF består af to α-globinkæder og to γ-globinkæder. I hele fosterstadiet og til fødslen er HbF den dominerende type af hæmoglobin, men i løbet af de første seks måneder efter fødslen ændres den dominerende type gradvist til HbA. HbA 2 vil også stige en meget lille smule de første seks måneder. (14) Glykosylering Når der er glukose til stede i blodet, vil dette bindes til bl.a. hæmoglobin, som efterfølgende betegnes HbA1c. Glykosyleringen af hæmoglobin til HbA1c er en langsom, irreversible proces, som sker i to trin ved en ikke-enzymatisk reaktion. Først bindes glukose til valin i N-terminalen på β-globin. Denne aldeminforbindelse, også kaldet Schiff-base, er en reversible binding, og HbA et kaldes derfor labil HbA1c (LA1c) efter dette trin. Senere omdannes aldeminforbindelsen til en stabil ketoamin vha. en Amadori -omlejring, som binder glukosen irreversibelt. Dette andet trin er langsomt og tager flere dage. Denne dannede ketoamin kaldes nu stabil HbA1c (SA1c). glykosyleringen er illustreret på figur 1. Denne proces foregår i hele erythrocyttens levetid, som er ca. 6-8 uger (15). Ud over HbA1c findes der også små mængder HbA, som er glykosyleret på en anden måde end HbA1c. Disse typer betegnes HbA1a og HbA1b. (15) Side 8 af 57

Figur 1 Glykosylering af hæmoglobin. Denne proces forløber i to trin. Først bindes glukose til valin i β-globinets N-terminal. Denne binding er reversibel. Derefter gøres forbindelsen stabil vha. en "Amadori" omlejring. (15,16) Hæmoglobinopati Ud over de nævnte hæmoglobinvarianter HbA, HbF og HbA 2, findes der mere end 1200 varianter, som er fremkommet pga. mutationer i globingenerne. Disse mutationer kan enten have en kvalitativ påvirkning på globingenet, som ændre globinets egenskaber i større eller mindre grad, eller en kvantitativ påvirkning på globingenet, som ændre mængden af det pågældende globin. (14) Hvis globingenet er påvirket kvantitativt, er der tale om mutationer, som sænker eller øger globinsyntesen. Ved α-thalassæmi og β-thalassæmi er syntesen af enten α- eller β-globin sænket, da dele eller hele genet/generne er deleterede. Dette forhindre korrekt transskription af genet/generne, og globinkæden kan derfor ikke translateres korrekt. Antallet af deleterede gener bestemmer graden af thalassæmien, som giver anæmi. Man har fire α-gener og to β-gener, og hvis største delen af disse deleteres, resultere det i svær anæmi. Ved mangel på β-gener vil kroppen kompensere ved at øge syntesen af HbF og HbA2. Ved sygdommen hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH) er der sket en gain-of-function mutation i γ-genet, som resulterer i at γ-genet ikke slukkes og at andelen af HbF derfor ikke falder efter fødslen, men forbliver høj. Normalvis mærker personen med HPFH ikke noget til sygdommen lige gyldig om mutationen er homozygot eller heterozygot, da HbF kun funktionsmæssigt adskiller sig fra HbA ved at have en større affinitet for O 2. (14) Side 9 af 57

Andre varianter som f.eks. hæmoglobin S (HbS), C (HbC), D (HbD) og E (HbE) er varianter, som er påvirket kvalitativt af aminosyresubstitutioner i β-genet. Disse aminosyresubstitutioner kan ændre globinets struktur og ladning, som vil påvirke dets funktion. HbS, -C, -D og -E giver ikke sygdom hvis mutationen er heterozygot og varianten kombineres med HbA. Dette skyldes at HbA fungere normalt, og kan opretholde normal funktion af hæmoglobinet. Findes mutationen dog homozygot eller hvis varianterne kombineres med hinanden, vil hæmoglobinet ikke fungere optimalt, og patienten vil få anæmi. Dette er f.eks. gældende ved seglcelleanæmi, som skyldes HbSS eller HbSC. HbE adskiller sig fra HbS, -C og -D, da dennes aminosyresubstitutioner, resultere i dannelsen af et nyt splice site. Dette giver en kvantitativ påvirkning af globinet, da det nye splice site anvendes 40% gangene hvor pre-mrna, skal omdannes til mrna inden translationen i ribosomerne. Dette resulterer i et ikke-funktionelt globin for 40% af det transskriberede pre-mrna, og et funktionelt HbE for de resterende 60%. (14) Det menes, at HbS, -C, -D og -E yder beskyttelse mod malaria, da de hyppigst forekommer i lande med øget risiko for at få en malariainfektion. HbC ses hyppigt i Vestafrika og HbE hyppigst i Sydøstasien. (14,17) Blandt de kvalitative varianter findes også tavse-varianter, som ikke vil have nogen større påvirkning på helbredet. De mutationer, som giver disse tavse-varianter, påvirker ikke det dannede globin så meget, at der sker en funktionsændring, og det kan derfor opretholde normal funktion. Alle hæmoglobinopatier kan potentielt have indflydelse på HbA1c-analysen, afhængigt af analysemetoden. De kvantitative varianter kan påvirke HbA1c-resultatet, ved at det enten ikke er muligt at måle HbA1c (α-thalassæmi) eller ved at mængden af HbA1c er nedsat (β-thalassæmi). De kvalitative varianter påvirker HbA1c-analysen ved at mutationerne ændre hæmoglobinets egenskaber, og ved homozygote mutationer er det slet ikke muligt at måle HbA1c, da der ikke findes HbA. Desuden kan varianterne nedsætte erythrocyt-levetiden, da ændringer i strukturen kan påvirke erythrocytternes fleksibilitet. De hyppigste kvalitative varianter verden over er HbS, -C, -D og -E, hvor HbS er den hyppigste (18). (19). Side 10 af 57

HbA1c-analysen på Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi på Odense Universitetshospital På afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi (KBF) på Odense Universitetshospital (OUH) anvendes der på nuværende tidspunkt High-Performance Liquid-Chromatography (HPLC) til analyse af HbA1c i prøver fra hele Fyn. Denne metode menes at være mest påvirket af interferens fra hæmoglobinvarianter (20), karbamyleret (chb) og acetyleret hæmaglobin (AcHb) (21,22). På KBF anvendes HPLC-apparatet Tosoh HLC-723G8 (Tosoh, Tokyo, Japan) (Tosoh) til HbA1canalysen. Tosoh menes ikke at være påvirket af chb (9) og toppe fra varianter, som ligger til højre for HbA0-toppen på kromatogrammet, påvirker heller ikke HbA1c-rasultatet, da arealet af disse fratrækkes det totale areal (18,23). Dog kan HbA1c-resultatet ikke afgives, hvis der ses interfererende toppe til venstre for HbA0-toppen, da Tosoh ikke er i stand til at fratrække disses areal. Det vil sige at bl.a. patienter med en HbE-variant, som er den anden hyppigste variant i verden (9), ikke kan få et validt analysesvar fra Tosoh. I takt med at der sker en større og større migration i verden, hvor flere og flere etniske grupper blandes, vil forekomsten af hæmoglobinvarianter stige (24). Samtidig vides det, at forekomsten af diabetes er større i disse etniske grupper (2). Dette sætter større og større krav til HbA1canalysemetoderne, og, for KBF vedkomne, for Tosoh. Det kunne derfor være interessant at foretage et konkordansstudie mellem Tosoh og en anden ny analysemetode, samt undersøge hvordan denne analysemetode påvirkes af de hyppigste hæmoglobinvarianter. Capillarys 2 FlexPiercing (Sebia, Lisses, Frankrig) (Capillarys) er et nyt apparat, som kom på markedet i 2012 (25). Capillarys anvender kapillærelektroforese, hvilket ikke før er anvendt til HbA1c-analyse. Teoretisk burde kapillærelektroforese give en bedre adskillelse af hæmoglobinfraktionerne end der ses ved HPLC, da bl.a. flowet holdes konstant på tværs af kapillæren vha. det elektroendoosmotiske flow (EOF) og fraktionerne adskilles på baggrund af to faktorer, størrelse og ladning. Flere studier (24-26) har vist at dette apparat klare sig godt både mht. linearitet, reproducerbarhed, korrelation og akkuratesse. Derud over viser studierne også at kun få faktorer interferer ved denne metode. Side 11 af 57

Problemformulering Hvad vil et konkordansstudie mellem Tosoh HLC-723G8 og Capillarys 2 FlexPiercing vise? Hvilken påvirkning har nedfrysning ved -20 C på HbA1c-koncentrationen i EDTA-stabiliseret fuldblod? Og hvilke evt. kvalitative ændringer ses på elektroferogrammerne, fra Sebias Capillarys 2 FlexPiercing, fra disse prøver? Hvordan adskiller separeringsprofilerne for prøver med hæmoglobinvarianter analyseret på disse to apparater sig fra en typisk separeringsprofil for prøver med fænotypen HbAA? Analyseprincipper Tosoh Tosoh kvantificere HbA1c vha. ionbytter HPLC. Dette analyseprincip bygger på eluering og separering af hæmoglobinfraktionerne på bagrund af deres ladning og højt tryk. Først blandes en lille del af prøven med hemolysis-wash buffer, som fortynder og hæmolyserer prøven. Herefter sluses prøveblandingen ind i systemet vha. en injektor uden at trykket ændres eller luft kommer ind i systemet. Prøveblandingen pumpes herefter igennem den nonporøse kationbytterkolonne, en TSKgel Glyco HSi kolonne, ved et tryk på 5-8 MPa, og videre ned igennem flowcellen, hvor absorbansen fra hæmoglobinfraktionerne måles. På figur 2 ses en illustration af et HPLC-system. (23,27,28) Side 12 af 57

Figur 2 Skematisk opbygning af HPLC-system. Pumpen pumper eluenten, samt prøven, igennem systemet vha. tryk. Injektoren sluser prøvematerialet ind i systemet, som efterfølgende transporteres, opløst i eluenten, igennem kolonnen, som tilbageholder komponenterne i prøven i forskellig tid og til sidst igennem detektoren, som detekterer de forskellige komponenter, når de passerer. Efter detekteringen ender eluenten og prøven i en spildbeholder. (29) Inde i kolonnen bindes hæmoglobinfraktionerne, som er positivt ladede pga. ph en i hæmolyseringsbufferen, til de negativt ladede resinkugler. Fraktioner elueres efterfølgende vha. en fire trins gradient eluering. Til dette anvendes tre ravsyrebuffere med samme ph, men med stigende ionstyrke. Den stigende ionstyrke under elueringen gør, at fraktionerne skubbes af i takt med at konkurrencen om bindingspladserne stiger. Dette gør at fraktionerne elueres i følgende rækkefølge, på baggrund af fraktionernes stigende ladning: HbA1a, HbA1b, HbF, LA1c, SA1c og HbA0. Fraktionerne elueres ca. til følgende retentionstider: HbA1a: 0.23 min., HbA1b: 0.31 min., HbF: 0.41 min., LA1c: 0.48 min., SA1c: 0.59 min. og HbA0: 0.9 min. Elueringen sker på baggrund af Le Chateliers princip om ligevægt. (23,27,28) Efter elueringen måles fraktionernes absorbans i flowcellen, hvis opbygning er illustreret på figur 3. Flowcellen er opbygget således, at der skabes mindst mulig turbulens, som vil kunne opblande fraktionerne igen, efter separeringen. Absorbansen måles igennem flowcellen ved bølgelængde 415 nm, som giver højst absorbans for oxyhæmoglobin, og 510 nm, som giver højst absorbans for deoxyhæmoglobin (4). Absorbansen omsættes herefter til toppe på et kromatogram, med deres procentvise størrelse i forhold til arealet af alle toppene til og med A0 som funktion af retentionstiden i minutter. På figur 4 ses et eksempel på et normalt kromatogram med separeringsprofilen for en prøve med fænotypen HbAA, som er blevet analyseret på Tosoh. (23,27,28) Koncentrationen af HbA1c måles ved at beregne forholdet mellem det totale areal af alle toppene til og med A0 og areal af SA1c. Denne procentsats, eller DCCT-enhed, sættes ind i Side 13 af 57

kalibreringsligningen, hvorved koncentrationen i IFCC-enhed beregnes. Efterfølgende omregnes koncentrationen til eag. DCCT-resultaterne beregnes med to decimaler, og IFCC-resultaterne beregnes med én decimal. (28) Figur 3 Skematisk opbygningen af en flowcelle. Eluenten, indeholdende de adskilte komponenter kommer ind i flowcellen i den ene ende, og forlader flowcellen i den anden ende. I hver ende af flowcellen findes en glasrude hvor igennem lys kan passere. Når lyset har passeret igennem flowcellen opfanges det af fotocellen og absorbansen måles. (29) Figur 4 Eksempel på normalt kromatogram med separeringsprofilen for fænotypen HbAA fra Tosoh. På kromatogrammet ses toppene fra de forskellige hæmoglobinfraktioner, som Tosoh er i stand til at adskille. Fraktionerne adskilles i følgende rækkefølge HbA1a, HbA1b, HbF, L-A1c, SA1c og HbA0. Y-aksen på kromatogrammet angiver den procentvise størrelse af toppen og X-aksen angiver retentionstiden i minutter. Toppene på kromatogrammet befinder sig ca. ved de samme retentionstider på kromatogrammerne. Disse retentionstider er ca.: HbA1a: 0.23 min., HbA1b: 0.31 min., HbF: 0.41 min., LA1c: 0.48 min., SA1c: 0.59 min. og HbA0: 0.9 min. Dette kromatogram er fra en tilfældig prøve, som er målt på Tosoh. Side 14 af 57

Capillarys Capillarys anvender kapillærelektroforese, som er et analyseprincip, som bygger på separering af hæmoglobinmolekylerne på baggrund af deres størrelse og ladning. Kapillærelektroforesesystemet er opbygget af to bufferkar, som er forbundet med en lang, tynd kapillær. I enden af kapillæren findes et fotometer, som ved en bølgelængde på 415 nm detekterer absorbansen fra hæmoglobinmolekylerne, når de passerer fotometeret. Dette system er tilsluttet strøm, som med spænding på 9400 V, løber fra anoden i det ene bufferkar, gennem kapillæren og over til katoden i det andet bufferkar. På figur 5 ses en illustration af kapillærelektroforesesystemets opbygning. (30,31) Figur 5 Skematisk opbygning af kapillærelektroforesesystemet. På tegningen ses hvordan bufferkarrene er forbundet af kapillæren og strømforsyningen. I starten af kapillæren (Source og sample Vial) findes anoden, og i slutningen af kapillæren (Destination Vial) findes katoden. Lige inden slutningen af kapillæren findes detektoren, som er forbundet til en computer. (32) Strømmen er i stand til at bevæge sig igennem kapillæren, da denne er lavet af silica, hvis overflade er negativt ladet, og bufferen indeholder positive ioner, som danner et lag af positive ioner på den negative overflade inde i kapillæren, som derved er i stand til at lede strømmen. Dette positive lag af ioner skaber et elektroendoosmotisk flow (EOF), som sikre at selv negativt ladede molekyler bevæges igennem kapillæren og at der ikke sker en ændring af flowet ud mod kapillærvæggen. På figur 6 ses en illustration af EOF i forhold til flowet ved HPLC. (30,31) Side 15 af 57

Figur 6 Illustration af flowet ved hhv. HPLC (venstre) og kapillærelektroforese (højre). Ved HPLC ses det at flowhastigheden sænkes mere ud mod kolonnevæggen, end den gør ved kapillærelektroforese (CE). Ved kapillærelektroforese ses der en langt mindre sænkning af flowhastigheden, end ved HPLC. Denne forskel i flow giver brede toppe på kromatogrammerne fra HPLC og smalle toppe fra elektroferogrammerne. (33) Kapillæren er indstøbt i en polyamidkappe, som beskytter kapillæren og, sammen med peltiermodulet, kontrollere temperaturen i og omkring kapillæren. Hvis temperaturen i og omkring kapillæren ændres for meget, ændre ladningen på molekylerne sig, og dermed også EOF. Hvis temperaturen ikke reguleres ordenligt vil migrationshastigheden ikke være ens på tværs af kapillæren, og de forskellige molekylerne vil blive detekteret i en mindre samlet flok. Enderne af kapillærene er ikke pakket ind, således at prøven kan injiceres og der sikres god kontakt med bufferkarrene. Under migrationen i kapillærene adskilles hæmoglobinmolekylerne efter ladning og størrelse, således at de mest positivt ladede og mindste molekyler kommer først igennem kapillæren. Inden outlettet på kapillæren sikre et lille vindue i den udvendige polyamidkappe at molekylernes absorbans kan detekteres af fotometeret. Dette sker vha. af absorbtionsfotometri, hvor den målte absorbans omsættes til toppe på et elektroferogram. (30,31) Capillarys er i stand til at identificere følgende hæmoglobinfraktioner, i følgende rækkefølge: HbA2, HbF, HbA0, other Hb A og HbA1c. Toppene på elektroferogrammerne læses fra højre mod venstre, hvilket er modsat af, hvordan toppene på kromatogrammerne aflæses. På figur 7 ses et eksempel på et elektroferogram med separeringsprofilen for fænotypen HbAA. Hvis der ses yderligere toppe på elektroferogrammer, vil disse betegnes med tal og elektroferogrammet betegnes af Capillarys som Atypical Profile, altså atypisk. HbA1c-koncentrationen beregnes først i DCCTenheden med én decimal, som HbA1c-toppens procentvise størrelse af det samlede arealet af HbA1c- og HbA0-toppen, og omregnes derefter til IFCC-enheden uden decimaler. (31) Skalaen i bunden af elektroferogrammerne symboliserer ikke retentionstiden, men er en arbitrær skala (34). Denne skala anvendes til at genfinde toppene på forskellige elektroferogrammer, da de vil ligge ved samme værdier (34). HbA2 ligger over værdien 240, HbA0 ligger fra 140-180, Other Hb A ligger Side 16 af 57

fra 100-140 og HbA1c ligger fra 60-80. Hvis der er HbF tilstede i prøven vil denne top ligge over 180, og være betegnet HbF or variant. Figur 7 Eksempel på normalt elektroferogram fra Capillarys. Elektroferogrammet læses fra højre mod venstre, og Capillarys er i stand til at adskille følgende hæmoglobinfraktioner i følgende rækkefølge HbA2, HbF, HbA0, other Hb A og HbA1c. HbA2 ligger over 240, HbA0 ligger fra 140-180, Other Hb A ligger fra 100-140 og HbA1c ligger fra 60-80. Hvis der er HbF tilstede ligger denne top over 180. Yderligere toppe vil blive betegnet med tal og elektroferogrammet vil af Capillarys blive betegnet som Atypical profile. (1) Metodiske overvejelser Konkordansstudiet Til konkordansstudiet ønskes et minimums prøveantal på 55 patientprøver. Dette antal er fundet ved at estimere stikprøvestørrelsen, som ved et prøve antal på 55 opnåede en teststyrke på 1. Ud over de 55 patientprøver, ønskes det at indsamle minimum fem ekstra prøver, for at undgå mangel på prøver pga. evt. frasortering pga. ikke valide data. Dette ville give et prøveantal på 60, hvilker ikke er deleligt med otte, som er det prøveantal hver rack til Capillarys kan indeholde. Det ønskes derfor at indsamle i alt 64 patientprøver. Patientprøverne ønskes indsamlet efter følgende kriterier: - De må maksimalt være opbevaret ved stuetemperatur i 10 timer, for at sikre at anbefalingen fra Sebia (Lisses, Frakrig), om at prøver maksimalt må opbevares ved stuetemperatur i 18 timer (31), kan overholdes. - Prøven skal minimum indeholde 2ml blod, for at sikre korrekt prøvemængde (28,31). - HbA1c-resultatet, samt analysesvar på evt. andre hæmatologiske analyser, skal være afgivet til rekvirenten, således at prøven er afsluttet og ikke længere skal bruges af afdelingen. - Tosoh må ikke have detekteret en hæmoglobinvariant i prøven. Side 17 af 57

Holdbarhedsforsøg Til holdbarhedsforsøget ønskes det, at indsamle minimum 20 patientprøver. I dette forsøg ønskes det også at have et prøveoverskud på minimum fem prøver. Dette giver 25 prøver, hvilket heller ikke er deleligt med otte, og det totale antal ønskede patientprøver er derfor 32. Prøverne ønskes indsamlet efter de samme kriterier, som ved konkordansstudiet. Ét indsamlingskriterium er dog ændret, da der ønskes en minimumsprøvemængden på 4ml til dette forsøg. Minimumsmængden på 4 ml sikre korrekt prøvemængde ift. at hver prøve skal deles i fire. Variantanalyser For at undersøge interferensen af hæmoglobinvarianter på analyseapparaterne, ønskes det at indsamle så mange patientprøver, som muligt. Disse patientprøver ønskes indsamlet efter følgende kriterium: prøven skal, ifølge Tosoh, indeholde en hæmoglobinvariant eller forhøjet mængde HbF. Desuden ønskes det at få udleveret prøver fra Sebia (Lisses, Frankrig) hvor hæmoglobinvarianten er opgivet. Der ønskes prøver med HbS, -C, -D, -E og H. Vurdering af data For konkordansstudiet og holdbarhedsforsøget anvendes kun DCCT-resultaterne, da det kun er muligt at finde CV-værdier fra DCCT-resultater for Tosoh. Dette er i øvrigt anbefalet af studiet bag den første evaluering af Capillarys (25). Konkordansstudie For at få et så præcist resultat, som muligt, ønskes det, at alle prøverne analyseres vha. dobbeltbestemmelser. Efter analyse ønskes det at vurdere hvor vidt dobbeltbestemmelserne stemmer over ens. Dette ønskes, at gøres ved at beregne den maximale tilladte afvigelse på dobbeltbestemmelserne (A max ) ved et konfidensinterval på 99%. Konkordansen af apparaterne ønskes vurderet vha. differensplots. Resultaterne fra Tosoh vil blive afrundet med én decimal for at opnå samme decimalantal, som der afgives fra Capillarys, og for at følge anbefalingen fra WHO mht. decimalantal og svarafgivelse (8). For at kunne vurdere størrelsen på differencerne i differensplottet ønskes det at anvende en ±A max konkordans-grænse, som er beregnet på baggrund af begge apparaters maximale intra-serielle CV og et konfidensinterval på 95 %. Desuden ønskes det at anvende en grænse på ±6% (±ADA-grænse), som er fastsat af American Diabetes Assosiation (ADA) og Collage of American Pathology (CAP) i Side 18 af 57

2013 (11). Denne ±ADA-grænse anvendes normalt til at angive den maximale afvigelse fra targetværdien, som laboratoriers resultater må have på ekstern kontrol prøver fra CAP (11). Holdbarhedsforsøg For at vurdere påvirkningen af hæmoglobinet ved nedfrysning ved -20 C ønskes det at anvende XY- og differensplots. Desuden ønskes det at undersøge evt. forskelle i HbA1c-koncentrationen over hhv. hele perioden og perioden hvor prøverne er nedfrosne vha. Friedmantest med et konfidensinterval på 95%. Friedmantesten ønskes anvendt da data sandsynligvis ikke er normalfordelt og Friedmantesten er en non-parametrisk test, som anvendes til at sammenligne mere end to stikprøver. Der ud over ønskes det at vurdere elektroferogrammerne for evt. ændringer, som skyldes nedfrysningen. Desuden ønskes det at anvende elektroferogrammer fra nedfrosne prøver, som reference for hvilke evt. toppe, der ses efter nedfrysningen. Variantanalyser For at kunne forsøge at identificere de ukendte hæmoglobinvarianter, som vil blive fundet vha. Tosoh, ønskes det at analysere prøverne fra Sebia (Lisses, Frankrig) med henblik på at få referencekroma- og referenceelektroferogrammer for HbS, -C, -D, -E og -H. Ud fra disse ønskes det at identificere hæmoglobinvarianterne fundet vha. Tosoh. Desuden ønskes det at vurdere om toppene fra varianterne er adskilt fra de øvrige toppe på elektroferogrammerne. Materialer Apparatur Til måling af HbA1c-koncentrationen anvendes Tosoh HLC-723G8 fra Tosoh (Tokyo, Japan) og Capillarys 2 FlexPiercing fra Sebia (Lisses, Frankrig). Capillarys 2 FlexPiercing, samt reagenser, blev udlånt og leveret af ILS Laboratories Scandinavia (Allerød, Danmark). Til fortynding af de kontroller, som anvendes på Tosoh HLC-723G8, anvendes Hamilton dilutor fra Microlab series (Reno, Nevada, USA). Side 19 af 57

Reagenser Til Capillarys 2 Flex-Piercing anvendes hæmolysevæske, vaskeopløsning og migrationsbuffer, som alle indgår i Capillarys HbA1c-kit, som produceres af Sebia (Lisses, Frankrig). Desuden anvendes ekstra filtreret demineraliseret vand i form af milli-q vand. Til analyse af prøverne fra Sebia (Lisses, Frankrig) anvendes Sebias kapillærprøvekit A1c/CE Capillary blood sample kit. Dette blev også leveret af ILS Laboratories Scandinavia (Allerød, Danmark). Til Tosoh HLC-723G8 anvendes Elution buffer His, No. 1 til 3 og Hemolysis-wash solution, som produceres af Tosoh (Tokyo, Japan). Til fortynding af kontrollerne til Tosoh anvendes Hemolysis-wash solution fra Tosoh (Tokyo, Japan). Kolonne Kolonnen, som anvendes på Tosoh HLC-723G8, er en TSKgel Glyco HSi fra Tosoh (Tokyo, Japan). Kalibratorer og kontroller Til kalibrering af Capillarys 2 FlexPiercing anvendes HbA1c Capillary Calibrator 1 og 2 fra Sebia (Lisses, Frankrig), og af kontroller anvendes HbA1c Capillary Control 1 og 2 fra Sebia (Lisses, Frankrig). Til kalibrering af Tosoh HLC-723G8 anvendes kalibratorer fra Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring for Laboratorier i Sundhedssektoren (DEKS) (Glostrup, Danmark), og af kontroller anvendes Diabetes Control level 1 (102) og 2 (107), som produceres af Biorad Lyphochek (Hercules, Californien, USA). Prøvemateriale og prøveantal Det anvendte prøvemateriale er EDTA-stabiliseret fuldblod fra patienter, samt prøver med hæmoglobinvarianter udleveret af Sebia (Lisses, Frankrig). Til konkordansstudiet er anvendt 64 patientprøver. Til holdbarhedsforsøget er anvendt 32 patientprøver. Til analyse af prøver med hæmoglobinvarianter er anvendt fem prøver med fænotyperne HbAS, HbAE, HbAC, HbAD og HbAA med forhøjet mængde HbF på 12,3%, som var udleveret af Sebia (Lisses, Frankrig) og 29 patientprøver med hæmoglobinvarianter. Side 20 af 57

Metoder Konkordansstudie af Tosoh og Capillarys Prøverne til konkordansstudiet blev indsamlet dagen før analyse på apparaterne og opbevaret ved 4 C indtil analyse. Først blev prøverne analyseret i dobbeltbestemmelser på Capillarys, hvor der før og efter analyse af patientprøverne blev analyseret først Control 1 og derefter Control 2. Efterfølgende blev patientprøverne analyseret i dobbeltbestemmelser på Tosoh med Control level 1 og Control level 2 før og efter analyse af patientprøverne. Capillarys og Capillarys HbA1c-kittet, samt kontroller og kalibratorer er anvendt ifølge producentens anvisninger. Analyse på Tosoh udføres ifølge KBF s gældende forskrifter. Holdbarhedsforsøg Prøverne til holdbarhedsforsøget blev indsamlet dagen før analyse på Capillarys og opbevaret ved 4 C indtil analyse. Før og efter analyse af patientprøverne blev Control 1 og 2 analyseret. Efter analyse af patientprøverne, blev hver prøve udportioneret i fire spidsglas. Spidsglas, samt tilhørende propper, er produceret af Sebia (Lisses, Frankrig) og er beregnet til brug ved analyse af kontroller. Prøverne blev herefter nedfrosset ved -20 C. Efter 7 dage blev det første hold prøver optøet ved stuetemperatur, og efterfølgende analyseret, på samme måde som på dag 0. Dette gentog sig efter 14, 21 og 28 dages nedfrysning. Capillarys, samt reagenser, kontroller og kalibratorer, blev anvendt ifølge producentens anvisninger, med undtagelse af opbevaringstemperaturen for holdbarhedsprøverne. Producenten anbefaler at prøver opbevares ved -80 C, og at opbevaring ved -20 C skal undgås og betegnes, som forkert opbevaring. Analyse af prøver med hæmoglobinvarianter Prøver med ukendte hæmoglobinvarianter er blevet indsamlet i perioden 28/8-13 til 22/10-13 og er blevet nedfrosset ved -20 C umiddelbart efter indsamling. Prøverne blev opbevaret ved -20 C indtil analyse d. 23/10-13, hvor de blev optøet ved stuetemperatur. Prøverne med hæmoglobinvarianter, som blev opgivet af Sebia (Lisses, Frankrig), blev sendt fra Sebia (Lisses, Frankrig). Under forsendelsen blev prøverne opbevaret på tøris, og efter modtagelse af prøverne blev de opbevaret ved -80 C indtil analyse. Disse prøverne blev også optøet ved stuetemperatur. Prøverne med hæmoglobinvarianter, inkl. Sebias prøver, blev analyseret i dobbeltbestemmelser med Control 1 og Side 21 af 57

2 før og efter analyse af prøverne. Prøverne fra Sebia (Lisses Frankrig) blev analyseret som mikroprøver (prøver med lille prøvevolumen) vha. A1c/CE Capillary blood sample kittet, som fortynder og lyserer prøven. Disse prøver analyseres ved manuelt at tilføje de lyserede, fortyndede prøver i hver sin brønd i fortyndingssegmentet, som efterfølgende analyseres vha. kontrol-racket, rack 0. Da antallet af prøver ikke var deleligt med otte, fyldtes de racks, som manglede prøver, op med spidsglas indeholdende demineraliseret vand. Det samme galt for de tre overskydende brønde ved analysen af Sebia-prøverne. Prøverne fra Sebia (Lisses, Frankrig) blev også analyseret én gang på Tosoh efter analyse på Capillarys. Prøverne blev på Tosoh, analyseret som mikroprøver og blev derfor fortyndet med Hemolysis-wash solution inden analyse. Før og efter at prøverne fra Sebia (Lisses, Frankrig) blev analyseret, blev Control level 1 og 2 analyseret. Capillarys, Capillarys HbA1c-kittet og A1c/CE Capillary blood sample kittet, samt kontroller er anvendt ifølge producentens anvisninger. Statistiske redskaber Excel er anvendt til beregninger, samt til fremstilling af diagrammer. Der ud over er der anvendt Friedmantest i forbindelse med holdbarhedsforsøget. Resultater Konkordansstudie af Tosoh og Capillarys Vurdering af dobbeltbestemmelser Ved konkordansstudiet anvendtes dobbeltbestemmelser ved analyse på både Tosoh og Capillarys, og afvigelserne af disse blev vurderet vha. A max, som beskriver den maksimale afvigelse. Beregningen af denne findes i bilag 1. Den relative afvigelse af hver dobbeltbestemmelse i forhold til middelværdien blev beregnet og indsat i et differensplot som funktion af gennemsnitskoncentrationen. På differensplottet blev ±A max indsat som grænser. Dette viste at der kun var en prøve, prøve 60, på Capillarys, hvor dobbeltbestemmelsen afveg mere end A max Capillarys. Dette er illustreret på figur 8. Denne prøve blev derfor ikke medtaget i den videre databehandling og giver derfor et totalt prøve antal på 63 patientprøver. Side 22 af 57

Figur 8 Vurdering for afvigelser på dobbeltbestemmelser på Capillarys. Det ses på differensplottet at én prøve ligger uden for +A max. X-aksen angiver den gennemsnitlige HbA1c-koncentration og y- aksen angiver den relative afvigelse mellem dobbeltbestemmelserne. Konkordansstudiet Den relative afvigelse af resultaterne fra Capillarys i forhold til resultaterne fra Tosoh blev beregnet og indsat i et differensplot med den relative afvigelse som funktion af gennemsnits-hba1ckoncentrationen målt på Tosoh. Dette plot viste at Tosoh i de fleste tilfælde måler en højere koncentration end Capillarys. 85,7% af afvigelserne var positiv, 12,7% negative og ved 1,6% var der ingen difference. Prøve 7 afveg mere end de andre med en afvigelse på 26%, da Capillarys målte en gennemsnits-hba1c-koncentration på 5,0% og Tosoh målte en gennemsnits-hba1ckoncentration på 6,80%. Afvigelserne af resultaterne fra Capillarys i forhold til Tosoh var i intervallet -1,1% til 5,2%, og afveg i gennemsnit 2,2% når prøve 7 var med i beregningen, og 1,8% hvis prøve 7 ikke blev medtaget i beregningen. Ved at indsætte grænser for ±A max konkordans (beregningen af denne findes i bilag 1) og ADA s grænse på ±6%, ses det at nogle af afvigelserne ligger over A max konkordans (25%) og kun prøve 7, ligger over ADA grænse. Dette illustreres på figur 9-10. Side 23 af 57

Figur 9 Differensplot over den relative afvigelse af DCCT-resultater fra Capillarys i forhold til DCCT-resultater fra Tosoh som funktion af HbA1c-koncentrationen i DCCT-enheden målt på Tosoh. På plottet ses det at de fleste differencer er positive, ca. 25% ligger uden for +A max og prøve 7 ligger over +ADA. X-aksen angiver den gennemsnitslige HbA1c-koncentration målt på Tosoh og y-aksen angiver den relative afvigelse mellem koncentrationen målt på Capillarys og Tosoh. Figur 10 Differensplot for DCCT-resultater uden prøve 7. Det er her tydeligere at de fleste differencer er positive og ingen prøver, undtagen prøve 7, ligger over ADA s grænse. X-aksen angiver den gennemsnitslige HbA1c-koncentration målt på Tosoh og y-aksen angiver den relative afvigelse mellem koncentrationen målt på Capillarys og Tosoh. På kromatogrammet fra prøve 7 ses ingen interferens, se figur 11. På elektroferogrammet fra prøve 7 ses det, at toppen Other Hb A er forlænget, se figur 12. Side 24 af 57

Figur 11 Kromatogram for prøve 7. På kromatogrammet ses de forventede toppe og umiddelbart ingen interferens fra andre fraktioner eller stoffer. Figur 12 Elektroferogram fra prøve 7. På elektroferogrammet ses de forventede toppe, men toppen Other Hb A er forlænget i forhold til et normalt elektroferogram for fænotypen HbAA, se evt. figur 7. Holdbarhedsforsøg Til at undersøge påvirkningen på HbA1c-koncentrationen ved nedfrysning og opbevaring ved - 20 C, måltes HbA1c-koncentrationen i dobbeltbestemmelse i 32 patientprøver med syv dages mellemrum over fire uger. Ved første måling dag 0 havde prøverne ikke været nedfrosset forud for analyse. Pga. problemer med Control 2 på dag 0 i kapillær fire, blev de fire prøver, som var blevet analyseret i kapillær fire frasorteret. Der ud over blev to øvrige prøver frasorteret grundet mangel på den ene dobbeltbestemmelse. Dette giver et totalt prøveantal på 26 prøver, hvis dobbeltbestemmelserne blev vurderet lige som ved konkordansstudiet. Kun en dobbeltbestemmelse for prøve 23 på dag 7 afveg mere end A max Capillarys, og dette resultat blev derfor ikke medtaget i den videre databehandling. Dette illustreres på figur 13. Side 25 af 57

Figur 13 Afvigelser på dobbeltbestemmelserne på dag 7. Dette differensplot viser at en prøve ligger over +Amax. Differensplottet viser den relative afvigelse mellem dobbeltbestemmelserne som funktion af middel-hba1c-koncentrationen. Påvirkning af HbA1c-koncentrationen Middelværdien af HbA1c-koncentrationen for hver prøve blev afbilledet i et XY-plot som funktion af antal dage fra forsøgsstart. På dette plot var det ikke tydeligt at se nogen tendenser blandt resultaterne. Det kan dog ses at koncentrationerne ændres, men ikke decideret op eller ned. Ændringen af koncentrationerne over tid er illustreret på figur 14. Figur 14 Holdbarhedsforsøg i DCCT-enhed. XY-plot hvor HbA1c-koncentrationen er plottet som funktion af antal dage fra forsøgsstart. Der ses ingen tydelige tendenser. Da der ikke ses nogen tendenser, lavedes et differensplot over den relative afvigelse af differencerne dag 0-7, 0-14, 0-21 og 0-28 i forhold til middelværdien af HbA1c-koncentrationen Side 26 af 57

målt dag 0. Disse plot viste at differencerne i de fleste tilfælde var negative. Dette illustreres på figur 15-18. Figur 15 Illustration af den relative afvigelse af differencerne mellem dag 0 og 7. Den relative afvigelse for resultaterne dag 7 i forhold til dag 0 er plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. Det ses at de fleste differencer er negative. Figur 16 Illustration af den relative afvigelse af differencerne mellem dag 0 og 14. Den relative afvigelse for resultaterne dag 14 i forhold til dag 0 er plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. Det ses at de fleste differencer er negative Side 27 af 57

Figur 17 Illustration af den relative afvigelse af differencerne mellem dag 0 og 21. Den relative afvigelse for resultaterne dag 21 i forhold til dag 0 er plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. Det ses at de fleste differencer er negative. Figur 18 Illustration af den relative afvigelse af differencerne mellem dag 0 og 28. Den relative afvigelse for resultaterne dag 28 i forhold til dag 0 er plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. Det ses at de fleste differencer er negative. Da de fleste differencer er negative, udføres der en Friedmantest for at undersøge om der er signifikant forskel på HbA1c-koncentrationen dag 0-28. Ved denne Friedmantest undersøges hypoteserne: H 0 : Der er ingen forskel på HbA1c-koncentrationerne målt på dag 0-28 og H 1 : Der er forskel på HbA1c-koncentrationerne målt på dag 0-28. Testen viste at H 0 blev forkastet, og at der dermed er signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne mellem dagene. Herefter blev der udført endnu en Friedmantest for at undersøge om der var forskel på HbA1c-koncentrationerne målt dag 7-28 og dermed om længden af opbevaringen ved -20 C har en betydning. Ved denne Friedmantest undersøges hypoteserne: H 0 : Der er ingen forskel på HbA1c-koncentrationerne målt på dag 7-28 og H 1 : Der er forskel på HbA1c-koncentrationerne målt på dag 7-28. Testen viste at H 0 kunne accepteres og at der derfor ikke er signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne målt dag 7-28. I begge Friedmantestene blev alle målte HbA1c-koncentrationer for prøve 23 ikke medtaget pga. det manglende resultat for dag syv. Beregningen af Friedmantestene ses på bilag 2. Side 28 af 57

Ændring af elektroferogram I forbindelse med holdbarhedsforsøget var det også muligt at undersøge elektroferogrammerne for ændringer i forbindelse med nedfrysningen. Det sås at der var en tendens til at der kom en ekstra top ca. beliggende ved 280, lidt før A2 og at Other Hb A blev forstørret. Denne ændring er eksemplarisk illustreret med elektroferogrammet fra prøve 1 fra analysen dag 7 på figur 19 og elektroferogrammerne for prøve 1 fra dag 14, 21 og 28 ses på bilag 3. Figur 19 Elektroferogram for prøve et fra holdbarhedsforsøget dag 7. På elektroferogrammet ses de forventede toppe: HbA2, HbA0, Other Hb og HbA1c, men også en top, som ligger før A2, her kaldt 5. Denne top ligger ved 280 på X-aksen. Desuden ses at Other Hb er forstørret i forhold til dag 0. Analyse af prøver med hæmoglobinvarianter Kvalitativ vurdering af elektroferogrammer og kromatogrammer Ved hjælp af referenceelektrofero- og kromatogrammerne fra de fem prøver fra Sebia (Lisses, Frankrig), som er illustreret på figur 20-24, var det muligt, at identificere hæmoglobinvarianter i 23 ud af de 29 prøver med ukendte hæmoglobinvarianter. Alle elektroferogrammerne for prøver med hæmoglobinvarianter blev betegnet som atypiske af Capillarys, og fik titlen Atipical profile. Det var også muligt at vurdere hvilke toppe på elektroferogrammet, der skyldes nedfrysning, vha. referenceelektroferogrammerne fra holdbarhedsforsøget, se evt. figur 19. Side 29 af 57

HbS Figur 20 Referenceelektroferogram (venstre) og referencekromatogram (højre) af HbAS-varianten. På referenceelektroferogrammet fra Capillarys ses toppen for HbS til venstre for 220 på X-aksen, og på kromatogrammet fra Tosoh ses tre toppe til højre for A0 til retentionstiderne 1.05 min., 1.17 min. og 1.35 min. På elektroferogrammet ses der også en top over 280. Denne skyldes nedfrysningen. På elektroferogrammerne fra Capillarys befandt toppen for HbS sig til venstre for 220 på X-aksen. Toppen over 280 skyldes nedfrysningen. På Kromatogrammet fra Tosoh ses tre toppe efter A0. Disse toppe befinder sig ved retentionstiderne 1.05 min., 1.17 min. og 1.35 min. Se figur 20. HbE Figur 21 Referenceelektroferogram (venstre) og referencekromatogram (højre) af HbAE-varianten. På referenceelektroferogrammet fra Capillarys ses toppen for HbE til højre for 220 på X-aksen, og på kromatogrammet fra Tosoh ses en top til venstre for A0 til retentionstiden ca. 0.71 min. På elektroferogrammet ses også en nedfrysnings-top over 280. For HbE kunne der ses en ekstra top til højre for 220 på elektroferogrammet, og på Tosoh lå HbE toppen mellem SA1c- og A0 toppen til retentionstiden 0-71 min. På elektroferogrammet sås en top over 280, som skyldes nedfrysningen. Se figur 21. Side 30 af 57

HbC Figur 22 Referenceelektroferogram (venstre) og referencekromatogram (højre) af HbAC-varianten. På referenceelektroferogrammet fra Capillarys ses toppen for HbC til venstre for 240 på X-aksen, og på kromatogrammet fra Tosoh ses to toppe til højre for A0 til retentionstiden 1.08 min. og 1.29 min. På elektroferogrammet ses desuden en top over 280 som skyldes nedfrysningen. HbC viste sig som en top til venstre for 240, oven på HbA2, på elektroferogrammet. Der ses også en top over 280, men denne skyldes nedfrysningen. På kromatogrammet ses to toppe til højre for A0 til retentionstiden 1.08 min og 1.29 min. Se figur 22. HbD HbS Figur 23 Referenceelektroferogram (venstre) og referencekromatogram (højre) af HbAD-varianten. På referenceelektroferogrammet fra Capillarys ses toppen for HbD lige over 200 på X-aksen, og på kromatogrammet fra Tosoh ses fire toppe til højre for A0 til retentionstiden 1.02 min., 1.19 min., 1.27 min. og 1.35 min.. På elektroferogrammet ses desuden en top over 280 som skyldes nedfrysningen. Toppen for HbD befinder sig lige over 200 på elektroferogrammet fra Capillarys. Desuden ses en nedfrysningstop over 280. På Tosoh resulterede HbD i fire ekstra toppe, som befandt sig ved retentionstiderne 1.02 min., 1.19 min., 1.27 min. og 1.35 min. Se figur 23. Side 31 af 57

HbF Figur 24 Referenceelektroferogram (venstre) og referencekromatogram (højre) af prøven med HbAA med en høj mængde HbF. På referenceelektroferogrammet fra Capillarys ses toppen for HbF til højre for Hb A0 ca. over 180 på X-aksen, og på kromatogrammet fra Tosoh ses toppe mellem A1b og LA1c til retentionstiden 0.4 min. Ved HbF ses dennes top på pladsen for HbF på både elektrofero- og kromatogrammerne. Se figur 24. 1 ud af de 29 prøver blev frasorteret da OD (Optisk Densitet) var for lavt. Ved 8 ud af de 29 prøver blev varianten identificeret som HbS på både elektrofero- og kromatogrammet, ved 7 ud af de 29 prøver blev varianten identificeret som HbE på både elektrofero- og kromatogrammet, ved 5 ud af de 29 prøver blev varianten blev identificeret som HbAA med en høj mængde HbF på både elektrofero- og kromatogrammet, ved 2 ud af de 29 prøver blev varianten identificeret som HbD på både elektrofero- og kromatogrammet og 1 ud af de 29 prøver blev varianten identificeret som HbC på både elektrofero- og kromatogrammet. Der ud over blev varianten ved 2 ud af de 29 prøver, prøve 3 og 24, identificeret som værende HbS på kromatogrammet, men på elektroferogrammet lignede varianten ikke nogen af referenceelektroferogrammerne, ved 2 ud af de 29 prøver, prøve 1 og 26, blev varianten ikke identificeret, da deres elektrofero- og kromatogrammer ikke lignede nogle af referenceelektrofero- eller kromatogrammerne, og ved 1 ud af de 29 prøver, prøve 25, blev varianten identificeret som HbAA på elektroferogrammet, men som ukendt hæmoglobinvariant på kromatogrammet, da kromatogrammet ikke lignede nogen af referencekromatogrammerne. De prøver hvor varianten ikke kunne identificeres på både elektrofero- og kromatogrammet er illustreret på figur 26-28. Fordelingen af de mulige varianter, som blev fundet i prøverne med ukendte hæmoglobinvarianter er vist i tabel 1. Side 32 af 57

variant variant Figur 25 Elektroferogram (venstre) og kromatogram (højre) for prøve 1. Varianten kan ikke identificeres på både elektroferogrammet og kromatogrammet. På Capillarys ses de normale toppe HbA2, HbA0 og Other HbA, men også en høj top over 180, samme sted som HbF ligger. Der ses også en lille top over 200. På Tosoh ses en top for A1a, HbF, en top med to spidser ved A0, og herefter tre toppe til retentionstiden 0.99 min., 1.06 min. og 1.19 min. Der ses ingen HbA1c på hverken Capillarys eller Tosoh. På elektroferogrammet fra prøve 1 ses to ekstra toppe, top 3 og 4. Top 3 ligger over 180 og top 4 ligger ved 200. Der ses ingen HbA1c-top. På kromatogrammet fra samme prøve ses en top for A1a, HbF og A0. Der ses ingen top for SA1c, men der ses tre ekstra toppe til højre for A0 til retentionstiderne 0.99 min., 1.06 min. og 1.19 min. Toppen for A0 har to spidser. Se figur 25. variant Hbs Figur 26 Elektroferogram (venstre) og kromatogram (højre) for prøve 3. Varianten kan ikke identificeres på elektroferogrammet, men kan identificeres som HbS på kromatogrammet vha. referencekromatogrammet for HbAS. Toppen på elektroferogrammet ligger lige over 220 på X-aksen. På elektroferogrammet ses, ud over de normale toppe, top 7, som ifølge nedfrysningsreferencen, se evt figur 19, skyldes nedfrysningen, top, 5 som ligger lige over 220 og top 4, som ligger mellem 180 og 200. Ekstra toppene på kromatogrammet ligger præcis hvor toppene ved HbS ligger. For prøve 3 ses tre ekstra toppe på elektroferogrammet, hvor af top 7, som er en nedfrysningstop, ligger ved 280, top 5 ligger over 220 og top 4 ligger mellem 180 og 200. På Tosoh ligger toppen ca. som på referencekromatogrammet for HbAS. Se figur 26. Side 33 af 57

variant HbS Figur 27 Elektroferogram (venstre) og kromatogram (højre) for prøve 24. Varianten kan ikke identificeres på elektroferogrammet, men kan identificeres som HbS på kromatogrammet vha. referencekromatogrammet for HbAS. Toppen på elektroferogrammet ligger lige over 220 på X-aksen. vha. referencekromatogrammet for HbAS. Toppen på ved 280 skyldes nedfrysningen. På elektroferogrammet for prøve 24 ses to ekstra toppe. Den ene top, top 6, ligger ved 280 og er en nedfrysningstop, og den anden, top 4, ligger lige over 220. Se figur 27. variant Figur 28 Elektroferogram (venstre) og kromatogram (højre) for prøve 25. Varianten kan identificeres som HbAA på elektroferogrammet, men kan ikke identificeres kromatogrammet. På Capillarys ses et normalt elektroferogram, men en lille top ved HbF or variant. På Tosoh ses en meget høj top ved retentionstiden 0.89 min. Desuden ses en lille top ca. over retentionstiden 0.48 min. På elektroferogrammet for prøve 25 ses de samme toppe, som ved et normalt elektroferogram, se evt. figur 7. På kromatogrammet ses der, ud over de forventelige toppe, en stor top mellem toppen for SA1c og A0 ved retentionen 0.89 min. Desuden ses en lille top ca. over retentionstiden 0.48 min. Se figur 28. Side 34 af 57

variant Variant Figur 29 Elektroferogram (venstre) og kromatogram (højre) for prøve 26. Varianten kan ikke identificeres på både elektroferogrammet og kromatogrammet. På Capillarys ser elektroferogrammet umiddelbart normalt ud, bortset fra at en top lige før HbA2 og HbA1c. På Tosoh ses et umiddelbart normalt kromatogram, som dog har en top over retentionstiden ca. 1.26 min., samt en front peak top (FP). På elektroferogrammet fra prøve 26 ses en ekstra top, top 7, til højre for HbA2 til højre for 240 og en ekstra top, top 2, til højre HbA1c-toppen til venstre for 280. På kromatogrammet ses en top ca. over retentionstiden 1.26 min. samt en front peak (FP). Se figur 29. Mulig variant Capillarys Mulig variant Tosoh Antal prøver (n=29) Er toppene adskilt fra A1c og A0- toppen (Capillarys) C C 1 Ja D D 2 Ja E E 7 Ja F F 5 Nej S S 8 Ja A? 1 Ja?? 2 Ja? S 2 Ja Tabel 1 Antallet af hver identificeret hæmoglobinvariant ud af de 29 prøver med ukendte varianter. I denne tabel kan antallet af hver variant ses og hvilken variant der blev identificeret på hvilket apparat, samt om toppen fra varianten var adskilt fra A1c- og A0-toppen på Capillarys. Diskussion Konkordansstudie Konkordansstudiet viste at Tosoh i de fleste tilfælde målte en højere HbA1c-koncentration end Capillarys målte. I gennemsnit var resultaterne fra Tosoh 2,2% højere end resultaterne for Capillarys. Der var dog én prøve som afveg betydelig mere end dette. Prøve 7 afveg med hele 26%, hvilket er så stor en afvigelse at det bør mistænkes at forskellen skyldes interferens fra evt. en hæmoglobinvariant eller et stof i blodet (35) og ikke blot analyseusikkerheden på apparaterne. Årsagen til den store difference diskuteres senere. Side 35 af 57

Ud fra grænserne for den maksimale afvigelse mellem resultaterne fra Capillarys og Tosoh (A max konkordans) kunne det ses at 25% af resultaterne lå uden for +A max konkordans. Disse 25% er altså signifikant højere på Tosoh end på Capillarys ved et signifikansniveau på 95%, og kan ikke forklares af analyseusikkerheden. Disse 25% signifikant for høje resultater kan dog evt. forklares af at KBF har oplevet at Tosoh målet for høje koncentrationer. Dette menes at skyldes problemer med kalibratorerne fra DEKS, som kan have en lavere koncentration end den opgivne koncentration (36). Dette vil gøre at de målte koncentrationer, bliver højere end hvad de reelt er. Denne påvirkning af koncentrationen ses tydeligt ved analysen af to Labquality kontroller, som KBF analyserede i august 2013 (37). Labquality kontrollernes resultater kan ses i bilag 4. Det at KBF s Tosoh er har målt en for høj HbA1c-koncentration i Labquality kontrollerne er dog ikke enestående for KBF, da KBF kun afviger med -0,4% og 0,0% i forhold til den gennemsnitlige koncentration målt i Tosoh-gruppen. Dette bekræfter derfor at problemet kan skyldes kalibratorene fra DEKS. Det kunne derfor tænkes, at en korrekt kalibrering af Tosoh ville give lavere afvigelser mellem Tosoh og Capillarys. Præcis hvilken påvirkning dette ville få på konkordansstudiet er ikke til at sige. På trods af at Tosoh evt. generelt måler for højt, er det kun prøve 7, som ligger uden for ADA s grænse for hvor stor afvigelse der må være mellem en metodes analyseresultat af en ADA/CAP kontrolprøve og prøvens korrekte værdi (targetværdi) opgivet af NGSP. Denne grænse virker måske lidt søgt at anvende, men argumentationen for at bruge denne er, at hvis analysen på Tosoh er godkendt til diagnosticering af diabetes mellitus, bør analyse af disse ADA/CAP kontroller ikke afvige mere end de ±6%. Dette vil så betyde, at hvis afvigelsen mellem Tosoh og Capillarys ikke er større end de ±6%, vil analyse af ADA/CAP kontrollerne på Capillarys muligvis heller ikke afvige mere end de ±6%. Vores konkordansstudie viste at afvigelserne mellem Tosoh s og Capillarys s resultater ikke oversteg 6% hvilket, som sagt, muligvis kan betyde at Capillarys vil kunne overholde ADA s krav om maksimal afvigelse. Konkordansstudiet viste altså at der var god overensstemmelse mellem resultaterne målt på de to apparater inden for ADA s grænse, med undtagelse af prøve 7. Denne prøve viser dog hvor stor betydning interferens fra et stof eller en variant kan have på HbA1c-koncentrationen. Årsagen til den store afvigelse ved prøve 7 skyldes sandsynligvis interferens fra AcHb, da Other Hb A - toppen på elektroferogrammet til forveksling ligner Other Hb A -toppen på et elektroferogram fra en prøve med en høj koncentration af AcHb (38). Elektroferogrammet fra prøven med en høj koncentration af AcHb kan ses i bilag 5. På kromatogrammet ses ingen ukendte toppe og da det er Side 36 af 57

kendt at både chb og AcHb kan interferere med HbA1c-koncentrationen på HPLC-apparater (9,21,22), er det sandsynligt at det er AcHb, som interferer. Grunden til at der ses interferens fra chb og AcHb er, at karbamy- og acetyleringen ikke ændre ladningen af chb og AcHb væsentligt fra HbA1c (38) og disse vil derfor elueres ca. samtidigt med HbA1c. Øgede mængder AcHb ses i forbindelse med graviditet, alkoholisme og behandling med medikamenter indeholdende acetylsalicylsyre (24). I Tosohs Technical report beskrives det dog at AcHb ikke interferer med HbA1c-toppen ved acetylsalicylsyre-koncentrationer under 50 mg/dl (23). Denne grænse er muligvis fundet ved at tilsætte acetylsalicylsyre til fuldblod, hvor efter HbA1c-koncentrationen er målt. Det er derfor uvist hvor stor en koncentration AcHb, denne grænse svar til, og om denne koncentration overstiger det forventelige ved graviditet, alkoholisme og behandling med acetylsalicylsyre. På Capillarys ses ingen interferens fra AcHb og chb, da disse fraktioner migrerer sammen med Other Hb A, og derfor adskilles fra A0 og HbA1c, som anvendes til beregningen af HbA1c-koncentrationen (24,25). Det at AcHb ikke interferer på Capillarys, samt at dette apparat netop måler en lavere HbA1c-koncentration i prøve 7, taler for at den store afvigelse skyldes interferens fra AcHb, og at HbA1c-koncentrationen målt på Tosoh ikke er korrekt. Havde der været tale om interferens fra en hæmoglobinvariant ville der sandsynligvis have været observeret en ekstra ukendt top på kromatogrammet og/eller elektroferogrammet. I dette tilfælde betyder det at patienten ifølge Capillarys ikke har diabetes, men ifølge Tosoh har diabetes, da værdien målt på Tosoh ligger over 6,5%. Det vides dog ikke om prøve 7 skulle anvendes til diagnosticering eller monitorering, men denne forskel var aldrig blevet opdaget hvis ikke prøven var blevet analyseret på begge apparater. Holdbarhedsforsøg Da prøverne med ukendte hæmoglobinvarianter, som var fundet på Tosoh, ifølge HbA1c-manualen fra Sebia (Lisses, Frankrig) var forkert opbevaret ved -20 C (31), skulle holdbarhedsforsøget bruges til at undersøge hvilken påvirkning nedfrysningen ved -20 C havde på hhv. HbA1c-koncentrationen og elektroferogrammerne. Friedmantestene viste at der ved et konfidensinterval på 95% var en statistisk signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne målt på dag 0, 7, 14, 21 og 28, men at der ikke var forskel på HbA1ckoncentrationerne målt på dag 7, 14, 21 og 28. Dette tyder på at det ikke er selve opbevaringen ved -20 C i op til fire uger, som påvirker HbA1c-koncentrationen, men at det er selve nedfrysningen, altså temperaturfaldet fra stuetemperatur til -20 C, som påvirker HbA1c-koncentrationen. På Side 37 af 57

differensplottene kunne det ses at differenserne for dag 0-7, 0-14, 0-21 og 0-28 i de fleste tilfælde var negative, hvilket betyder at HbA1c-koncentrationen generelt var højere på dag 0 end de øvrige analyse dage. Dette tyder også på at nedfrysningen påvirker og sænker HbA1c-koncentrationen i prøverne. Dette forsøg er dog kun forløbet over fire uger, og det kan derfor ikke siges hvilken påvirkning der evt. ville kunne ses ved længere tids opbevaring ved -20 C. Det er dog sandsynligt at længere tids opbevaring ved -20 C ville give en signifikant ændring af HbA1c-koncentrationen. I et studie af Luigi Liotta et al. fra 2012 sås det, at nedfrysning ved -80 C i et år gav en signifikant ændring af HbA1c-koncentrationen. I studiet så de at påvirkningen var større ved høje koncentrationer, og at påvirkningen derfor var koncentrationsbetinget. Studiet blev udført ved at sammenligne HbA1ckoncentrationen før nedfrysning og efter et års nedfrysning. Efter optøning og analyse af prøverne, der havde været nedfrosset i et år, nedfrøs de prøverne ved -80 C igen i seks måneder. Da prøverne blev optøet igen efter de seks måneder, sås at HbA1c-koncentrationen var påvirket ydereliger. (4) Det vides dog ikke om det var selve gennedfrysningen, som resulterede i yderligere påvirkning af HbA1c-koncentrationen, eller om det var de ekstra seks måneders nedfrysning. Luigi Liotta et al. s studie indikere dog at længere tids opbevaring ved -20 C ville have resulteret i en større påvirkning på HbA1c-koncentrationen. Luigi Liotta et al. kunne dog ikke sige hvad der præcist skyldes denne påvirkning af HbA1c-koncentrationen, men de mener ikke at det skyldes den lysering af erythrocytterne, som nedfrysningen vil resultere i (4). Det kunne dog tænkes at påvirkningen af HbA1c sker efter lyseringen, altså når cellernes bestanddele befinder sig i den ekstracellulære væske sammen med alle de andre proteiner, som findes i blodet. Nede i denne blanding kunne det tænkes at HbA1c nedbrydes eller evt. bare mister glukosegruppen, som så ændre dennes ladning. Da Friedmantestene viste at den største påvirkning sker mellem dag 0 og 7, tyder det på at HbA1c påvirkes mest lige efter lyseringen af cellerne, og at påvirkningen efter at prøven har nået en temperatur på -20 C mindskes. Nedfrysning bremser nemlig blot nedbrydningen af proteiner, så de ikke nedbrydes lige så hurtigt som ved stuetemperatur, og jo lavere temperatur prøven opbevares ved, des mere bremses nedbrydningen. Generelt anbefales det også i litteraturen at fuldblodsprøver nedfryses ved -70 C eller lavere ved længere tids opbevaring, da prøven påvirkes mindst ved denne opbevaringstemperatur (4,31,39). Ved den kvalitative vurdering af elektroferogrammerne fra prøverne i holdbarhedsforsøget, kunne det ses at nedfrysningen ikke kun have en påvirkning på HbA1c-koncentrationen, men også på Side 38 af 57

elektroferogrammerne. På disse sås en ekstra top før A2 ved 280 på X-aksen, samt at Other Hb A blev forstørret. Disse toppe kan evt. skyldes hæmoglobins nedbrydningsprodukter. Det eneste, der kan siges er dog, at disse ændringen kun blev set på elektroferogrammerne fra prøver, som havde været nedfrosset, og at disse ændringer derfor er sket pga. nedfrysningen. Dog påvirkede ændringerne umiddelbart ikke anvendeligheden af elektroferogrammerne, da ændringerne, den ekstra top og den forhøjede Other Hb A, stadig var adskilt fra A0- og A1c-toppen. Det var dog ikke på alle elektroferogrammerne at disse ændringer kunne ses, men største delen af elektroferogrammerne blev dog betegnet som Atypical Profile. Ved nogle af de elektroferogrammer, som ikke blev vurderet som atypiske, kunne den ekstra toppe før A2 dog ses, denne var blot ikke stor nok til at blive betegnet som en top af Capillarys, og elektroferogrammet blev derfor betragtet som værende normalt. Hvorfor der ikke sås denne nedfrysningstop på alle elektroferogrammerne vides ikke. Det blev dog observeret at nogle af prøverne ikke virkede lige så hæmolyserede, som de andre prøver, og var lysere i farven. Det blev dog i dette forsøg ikke noteret hvilke prøver, der så anderledes ud efter optøningen. Det kan derfor ikke vides om det er disse prøver, som fik normale kromatogrammer. Analyse af prøver med hæmoglobinvarianter Alle separeringsprofilerne for disse prøver blev betegnet som værende atypisk af Capillarys. For 23 ud af de 29 prøver, var det muligt at identificere hæmoglobinvarianten vha. referenceelektrofero- og kromatogrammerne fra prøverne med fænotyperne HbAS, HbAC, HbAD, HbAE og HbAA med forhøjet HbF fra Sebia (Lisses, Frankrig). Denne identifikation er selvfølgelig kun et bud på hvilken hæmoglobinvariant prøven indeholder, da der findes mere end 1200 forskellige varianter. Det kan derfor kun kan siges præcis hvilke varianter der findes i prøverne vha. en genotypering. For prøve 1 var der ingen HbA1c på hverken elektrofero- eller kromatogrammet, samt en nedsat mængde HbA0 og en høj mængde HbF. På elektroferogrammet var der en top for A2, som umiddelbart var af normal størrelse. Disse separeringsprofiler kunne tyde på at denne patient har β- thalassæmi, hvilket gør, at hæmoglobintetramerer indeholdende β-kæder vil være nedsat, samt at kroppen vil kompensere ved at øge mængden af HbF og nogle gange også HbA2 (34). Der kunne derfor ved denne prøve være tale om β-thalassæmi major, da mængden af HbF er så stor. For prøve 3 og 24 lå variant toppen på elektroferogrammerne i mellem den teoretiske placering af toppen fra HbE og toppen for HbS ifølge referenceelektroferogrammer. På kromatogrammerne for Side 39 af 57

prøverne lignede det dog at der var tale om en HbS ifølge referencekromatogrammerne. Dette kan evt. skyldes at der enten er tale om en variant, som ligner HbS meget, eller at det er en undertype af HbS. For prøve 25 afveg elektroferogrammet kun fra et normalt elektroferogram ved at der, til højre for A0-toppen, var en meget lille top, som Capillarys betegnede Hb F or variant. Denne top var dog så lille at Capillarys ikke kunne beregne størrelsen. Dog blev elektroferogrammet stadig betegnet som atypisk. På kromatogrammet var der en meget stor top lige til venstre for A0, som ifølge referencekromatogrammerne lå på HbE s plads. Tosoh beregnede dog toppen til at være 41,90% af det totale areal, og denne mængde ville HbE slet ikke findes i pga. mutationens kvantitative egenskaber. Det er derfor ikke en HbE-variant, som denne patient har, hvilket bekræftes af at der ikke ses nogen top for HbE på elektroferogrammet. Det kunne derfor tyde på at denne variant har samme ladning som HbE ved analyse på Tosoh, og derfor ligger på HbE s plads. Dog tyder det ikke på varianten har samme størrelse som HbE, da den ikke umiddelbart er at finde på elektroferogrammet. Den kunne evt. være meget lille og er derfor migreret igennem kapillæren, inden detektionen er startet, eller for stor og er derfor ikke kommet ud inden analysen blev afsluttet og kapillæren vasket. Der kunne også være tale om en variant, som ville lægge sig under HbA0- toppen på elektroferogrammet. Hvis dette er tilfældet kunne det overvejes om denne variant i så fald interferer med HbA1c-koncentrationsmålingen. Det vil dog kræve en genotypering at sige præcis hvilken variant, der er tale om. På elektroferogrammet for prøve 26 ses to HbA2-toppe og to HbA1c-toppe. På kromatogrammet ses en høj front peak (FP) og en top efter A0, som Tosoh ikke har identificeret, men ud over disse to toppe ser kromatogrammet normalt ud. Ud fra elektroferogrammet kunne det se ud som om patienten har en mutation i et eller flere af α-generne (34). Dette mistænkes, da et belgisk studie i 2009 analyserede 18 forskellige varianter på Sebias Capillarys II, som er forgængeren til Capillarys 2 FlexPiercing, vha. Sebias hæmoglobin kit (34). Blandt de 18 varianter var HbG Philadelphia og Hb Stanleyville, som begge skyldes mutationer i α-generne, og som begge giver to HbA2-toppe på elektroferogrammerne fra Capillarys II, grundet α-genmutationerne (34). Det kan dog ikke bestemmes ud fra elektroferogrammet fra prøve 26 om der er tale om HbG Philadelphia, Hb Stanleyville eller en helt tredje variant. Dette vil kun kunne bestemmes vha. genotypering. På alle elektroferogrammerne var det kun toppen Hb F or variant, som ikke var helt adskilt fra A0-toppen, da denne ligger i forlængelse af A0-toppen på dennes højre side. Sebia (Lisses, Side 40 af 57

Frankrig), samt flere studier (24-26), beskriver dog at denne top ikke interfererer med beregningen af HbA1c-koncentrationen før den udgør mere 15% af det samlede areal. En koncentration af HbF over de 15% sås kun på elektroferogrammet for prøve 1 med en koncentration på 60,1% og 10 med en koncentration på 24,7%, og HbF-toppen vil derfor i disse tilfælde påvirke HbA1c-beregningen. Den øgede mængde HbF menes dog, som tidligere nævnt, at skyldes at patienten har β-thalassæmi major, hvilket gør at HbA1c-koncentrationen ikke kan beregnes pga. nedsat mængde HbA. Den forhøjede HbF i prøve 10 kunne skyldes HPFH, og vil påvirke HbA1c-koncentrationen hos denne patient. På de andre elektroferogrammer hvor toppen HbF or variant var tilstede, oversteg dennes koncentration ikke 15%. På alle de øvrige elektroferogrammer var variant-toppen fuldstændig adskilt fra HbA0- og HbA1c-toppen, hvilket betyder at varianten sandsynligvis ikke påvirker målingen af HbA1c-koncentrationen. På elektroferogrammerne med HbC kunne det ses at HbCtoppen lå oven på A2-toppen. Dette påvirker dog ikke HbA1c-koncentrationen. På elektroferogrammerne for prøverne med varianter kunne det ses at der var en tendens til at mængden af HbF var øget nok til at være detekterbar eller endda forhøjet. For A2 var der en tendens til at mængden var forhøjet, over 3%. Dette skyldes at kroppen forsøger at kompensere for den nedsatte mængde HbA. Der blev ikke umiddelbart observeret nogen toppe fra glykerede hæmoglobinvarianter, som omtales i andre studier (24,25). Det ene studie, er studiet bag den første evaluering af Capillarys i 2012. I dette studie menes det at HbS og -D s glykerede fraktioner vandre med Other Hb A, at HbC s glykerede fraktion migreres lige før HbA0, hvilket giver en skulder på denne top, og at HbE s glykerede fraktion migrer sammen med HbA0, da toppen fra denne ikke kan ses (25). Studiet mener dog ikke at tilstedeværelsen påvirker HbA1c-koncentrationen. I det andet studie af Eloísa Urrechaga, som også er fra 2012, undersøges interferens fra hæmoglobinvarianter også (24). Urrechagas studie mener også at varianternes glykerede fraktioner ikke interferer med HbA1ckoncentrationen, men også at disse fraktioner er veladskilt fra HbA1c- og HbA0-toppen (24). Grunden til at disse glykerede varianter umiddelbart ikke blev observeret kan være, at de ændringer nedfrysningen ved -20 C resulterede i dækkede over f.eks. evt. ændringer af Other Hb A. Det var derfor ikke muligt at vide om ændringen skyldes en glykeret variant eller nedfrysningen. Side 41 af 57

Materialer og metoder HbA1c-analysen på Capillarys i forhold til Tosoh Capillarys er i stand til at adskille hæmoglobinfraktionerne på baggrund af både deres ladning og størrelse, og dette gøres med en højere opløsning end Tosoh kan præstere. Dette skyldes det EOF, som findes i kapillærene, som sikre at hver fraktion migrere med konstant hastighed. Dette giver den gode adskillelse og de spidse toppe på elektroferogrammet, hvilket især er Capillarys stærke side. Denne egenskab har HPLC ikke, hvilket giver bredere toppe og dårligere adskillelse. Dette er tydeligt at se når kromato- og elektroferogrammerne sammenlignes. Effekten af EOF ses tydeligt på normale elektroferogrammerne hvor toppene, med undtagelse af HbF, alle er adskilte og dermed alle når baseline inden der ses en ny top. Dette er ikke tilfældet ved Tosoh hvor toppene sjældent adskilles nede ved baseline, men i stedet adskilles hvor den ene top slutter og den anden top starter. Dette kan evt. betyde at Capillarys måler en mere præcis størrelse af toppene, men forskellen på toppenes størrelse, beregnet på hhv. Tosoh og Capillarys, vil sandsynligvis ikke den store betydning. Det ses dog i hhv. analysemanualen fra Capillarys og Technical report fra Tosoh, at Capillarys har en større analyseusikkerhed end Tosoh. For Capillarys er den inter-serielle analyseusikkerhed (CVkomb) på maksimal 2,6%, hvorimod den maksimalt er 0,70% på Tosoh. Disse CV er gælder for DCCT-resultater. CV erne fra Capillarys er fundet ved at analysere prøverne i forskellige kapillærer, på forskellige apparater, med forskellige reagenslotnumre og over flere dage, og beskriver derfor den totale analyseusikkerhed. CV erne for Tosoh er kun angivet som inter-assay og det vides derfor ikke om disse er opnået ved samme forhold som for Capillarys. Forskellige studier har dog afprøvet disse to apparaturer og er kommet frem til nogle lidt andre CV er. Tosoh er i 2010 blevet afprøvet i et hollandsk/belgisk multicenter studie. I dette studie blev Tosoh er i fire forskellige laboratorier sammenlignet, og der blev beregnet en maksimal inter-assay på maksimal 1,8% (9). Denne CV er højere end den der er opgivet i Technical report, hvilket muligvis skyldes forskelligheder i hvilke faktorer der spillede ind ved beregningerne. Capillarys har i det franske studie bag den første evaluering af apparatet i 2012 opnået en maksimal inter-assay CV på 1,45% for patientprøver (25), og i et italiensk multicenter studie i 2013, hvor Capillarys er i tre forskellige laboratorier blev sammenlignet, opnået en maksimal inter-assay CV på 2,0% (26). Disse CV er er lavere end dem Sebia har opgivet, men stadig højere end for Tosoh. Dog er forskellen mellem CV erne betydelig mindre hvis apparaternes CV er fra studierne sammenlignes. Grunden til Side 42 af 57

at CV erne for Capillarys er højere kan skyldes, at Capillarys består af otte separate kapillærer, som hver kan påvirke analyseusikkerheden (25), hvorimod Tosoh kun analysere med én kolonne. Cv erne for apparaterne kan anvendes til at vurdere om apparatet kan anvendes til diagnostik af diabetes mellitus. Samtidig med at WHO anbefalede HbA1c-analysen til diagnostik, kom WHO med nogle krav, som skulle sikre at de anvendte metoder kunne anvendes til netop dette formål. Disse krav er skrappere end de krav der var til analysen da den kun blev benyttet til monitorering (10). Kravene fra WHO er internationalt gældende, hvilket gjorde at Dansk Selvskab for Klinisk Biokemis (DSKB) Videnskabelig Udvalg for Kvalitetssikring (VUK) en række krav til analysekvaliteten, som på baggrund af WHO s krav, skulle gælde for analysemetoder til kvantificering af HbA1c i Danmark. VUK kom frem til fem krav, hvor af analysemetoden/laboratoriet anses for at have opfyldt alle fem krav, hvis metoden/laboratoriet er i stand til at overholde krav 1 eller krav 3+4. Kravene blev bestemt i forhold til hhv. IFCC- og DCCT-enheder, og de følgende beskrevne krav er gældende for DCCT-enheder. Krav 1 er, at den maksimale kombinerede relative standardusikkerhed (CVkomb) ikke må overstige 2,5%. Krav 3 er, at den maksimale relative bias ikke må overstige 1,8% fra referenceværdien fastsat af European Reference Laboratory for Glycehomoglobin (ERL). Krav 4 er, at den maksimale dag til dag CV ikke må overstige 1,8%. Hvis metoden/laboratoriet er i stand til at opfylde disse krav er metoden/laboratoriet i stand til at kunne analysere HbA1c-koncentrationen med henblik på diagnosticering, og dermed også monitorering. (10) På baggrund af krav 1 fra VUK kan det vurderes at Tosoh uden problemer ligger under grænsen på de 2,5% og kan derfor sagtens anvendes til diagnostik. Capillarys kan derimod lige præcis ikke anvendes til diagnostik ifølge den CVkomb, som Sebia (Lisses, Frankrig) har opgivet. Kigges der dog i stedet for på de CV er som studierne er kommet frem til, kan Capillarys godt anvendes til diagnostik i Danmark. Sebia bliver derfor nødt til at forbedre CVkomb, hvis den skal kunne anvendes til diagnostik i Danmark, men dette burde også være muligt når CV erne fra studierne var lavere. Yderlig fordel ved Capillarys Capillarys har en anvendelses fordel i forhold til Tosoh i form af kvantificering af HbA2. På nuværende tidspunkt er det ikke muligt at screene prøver for β-thalassæmi på Tosoh på KBF, da Tosoh ikke er i stand til at adskille HbA2. Dette vil dog blive en mulighed ved anvendelse af en anden kolonne, som øger retentionstiden og dermed antallet af toppe der fremkommer på Side 43 af 57

kromatogrammet (40). Dette kræver dog også anvendelse af andet reagens, end det der anvendes nu, men burde nedsætte påvirkningen fra interfererende faktorer pga. bedre separering (40). Dette er dog uden ændringer muligt med Capillarys, da denne allerede separer HbA2. Evnen til at kvantificere HbA2 blev også vurderet i Eloísa Urrechaga studie af Capillarys i 2012 (24). I denne del af studiet blev Capillarys s HbA1c-analysemetoden sammenlignet med Capillarys s hæmoglobin-analysemetoden (24). Hæmoglobin-analysemetoden på Capillarys II anvendes til at screene for hæmoglobinopatier, og der i blandt også β-thalassæmi (24). Denne sammenligning viste at Capillarys kunne anvendes til at screene for β-thalassæmi, da de målte HbA2-værdier med HbA1c-analysemetoden stemte over ens med de værdier der var målt med hæmoglobinanalysemetoden (24). Dette vil altså sige at Capillarys vha. HbA1c-analysemetoden kan anvendes både til kvantificering af HbA1c med henblik på diagnotisering og monitorering af diabetes mellitus og til kvantificering af HbA2 med henblik på β-thalassæmi-screening. Antallet af indsamlede prøver Til konkordansstudiet blev der, som tidligere nævnt, anvendt 63 prøver, men om dette antal er nok til at kunne konkludere ud fra resultaterne, er svært at vurdere. Det oprindelige antal prøver på 55 blev estimeret vha. et gæt på hvad den mindste difference måtte være, samt apparaternes analyseusikkerhed i form af spredningen. Grunden til at den mindste difference var et gæt, skyldes at det var svært at finde en værdi for dette. Desuden er teststørrelsen estimeret i forhold til at skulle anvendes i forbindelse med en t-test med to parrede stikprøver (41). Denne test er en parametrisk test og kan derfor ikke anvendes til konkordansstudie da data fra herfra ikke er normalfordelt. Derfor kan denne teststyrke ikke anvendes. Antallet af prøver der blev anvendt til holdbarhedsforsøget blev ikke estimeret, da disse prøver kun skulle anvendes til at give en ide om hvilken påvirkning nedfrysning og opbevaring ved -20 C havde på prøvernes HbA1c-koncentration og elektroferogrammer. Antallet blev derfor valgt ud fra hvad der umiddelbart virkede som en nogenlunde mængde. Skulle forsøget gentages ville det være en ide at estimere hvor mange prøver det burde anvendes. Antallet af indsamlede prøver med hæmoglobinvarianter kunne have været større, hvis indsamlingen var startet tidligere end d. 28/8-13. Havde der været indsamlet flere prøver havde chancen for at undersøge interferensen fra flere forskellige varianter. Med hensyn til de varianter vi bad om fra Sebia, blev alle varianterne, undtaget HbH udleveret. Til gengæld udleverede Sebia en prøve med forhøjet mængde HbF. Grunden til at det var HbS, -C, -D, -E og -H der blev bedt om Side 44 af 57

var, at det var de varianter, som vi umiddelbart lige kendte på daværende tidspunkt. Nu ved vi dog at HbH ikke kunne anvendes til at undersøge interferensen på HbA1c og HbA0, da HbH skyldes deletion af tre ud af de fire α-gener (14). Der ville derfor ikke kunne dannes HbA (14). Dette er sandsynligvis også grunden til at Sebia ikke sendte varianten til os. Opbevaring af prøver med ukendte hæmoglobinvarianter At opbevare prøverne med ukendte hæmoglobinvarianter ved -20 C var forkert opbevaring af prøvematerialet, men da indsamlingen af disse prøver startede kendte vi ikke til den korrekte temperatur for opbevaring af disse prøver. De blev derfor blot opbevaret ved -20 C. Da vi fandt ud af at dette var forkert opbevaring valgte vi ikke at ændre opbevaringstemperaturen for de prøver, som ville blive indsamlet efterfølgende. I stedet valgte vi at undersøge hvilken påvirkning opbevaring ved -20 C ville have på prøverne i form af holdbarhedsforsøget. Skulle forsøget gentages ville korrekt prøveopbevaring være en fordel, da opbevaring ved -80 C er den korrekte nedfrysningstemperatur og dermed påvirker prøven mindre. Prøverne kunne dog også analyseres på Capillarys umiddelbart efter at prøven var indsamlet, hvis dette er muligt. Konklusion Konkordansstudiet mellem Tosoh HLC-723G8 (Tosoh) og Capillarys 2 FlexPiercing (Capillarys) viste at der var god konkordans ved 62 ud af 63 prøver, da den relative afvigelse mellem disse prøvers resulter alle lå indenfor American Diabetes Assosiations grænse på ±6%, som er en grænse for hvor meget analysesvar må afvige fra targetværdien i forhold til College of American Pathologys referencesystem. Den ene prøve, som ikke viste god konkordans, blev ud fra elektroferogrammet fra Capillarys vurderet til at indeholde en forhøjet mængde acetyleret hæmoglobin, hvilket umiddelbart resulterede i en falsk forhøjet HbA1c-koncentration på Tosoh. Nedfrysning ved -20 C viste sig vha. Friedmantest med et konfidensinterval på 95% at give en signifikant ændring af HbA1c-koncentrationen. Ud fra differensplots kunne de vurderes at HbA1ckoncentrationen sænkes som følge af nedfrysningen. Dog viste det sig også vha. Friedmantest at opbevaring ved -20 C i op til fire uger ikke påvirker HbA1c-koncentrationen yderligere i forhold til den signifikante sænkning af HbA1c-koncentrationen, der sker i forbindelse med temperaturændringen fra stuetemperatur til -20 C. Der ud over kunne det ses på elektroferogrammerne fra disse prøver, at nedfrysningen gav en tendens til at der ses en ekstra top Side 45 af 57

til højre for HbA2-toppen på elektroferogrammet fra Capillarys, samt en øget mængde Other Hb A. Capillarys var i stand til at registrere en hæmoglobinvariant i 27 ud af de 28 analyserede patientprøver indeholdende hæmoglobinvarianter detekteret vha. Tosoh. Separeringsprofilerne på elektroferogrammerne fra disse 27 prøver adskilte sig fra prøver med fænotypen HbAA ved at der sås ukendte toppe og/eller forhøjede mængder HbF. På Tosoh adskilte alle 28 prøver sig fra den normale separeringsprofil ved tilstedeværelsen af ekstra toppe og/eller forhøjede mængder HbF. Vha. prøver, som var udleveret af Sebia (Lisses, Frankrig), med fænotyperne HbAS, -C, -D, -E og - A med forhøjet HbF, var det muligt at give et bud på hvilke hæmoglobinvarianter de indsamlede prøver indeholdte ved 23 ud af de 28 prøver. Det kunne på elektroferogrammerne fra Capillarys ses at toppen for HbS, -C, -D og -E ikke interfererede med beregningen af HbA1c-koncentrationen, da disse toppe var adskilt fra HbA1c- og HbA0-toppen. HbF-toppen derimod var ikke adskilt fra HbA0-toppen på elektroferogrammerne, men dette menes ikke for at påvirke beregningen af HbA1c-koncentrationen ved en HbF-koncentration under 15% (24,25,31). På kromatogrammerne fra Tosoh kunne det ses, at toppene fra HbS, -C og -D umiddelbar ikke interferer med beregningen af HbA1c-koncentrationen, da disse toppe ligger uden for det område, som af Tosoh betegner, som det totale areal. HbE derimod interferer med beregningen af HbA1c-koncentrationen, da denne top ligger inden for det totale areal. Det samme gælder for HbF-toppen, men denne menes ikke at interferer med beregningen af HbA1c-koncentrationen ved en koncentration af HbF under 5%. Ud over de prøver, hvor det var muligt at give et bud på fænotypen, var der fem prøver, som ikke kunne identificeret vha. referenceelektrofero- og kromatogrammerne fra prøverne med kendte fænotyper. Ved den ene af disse prøver registrerede Capillarys ikke nogen variant, men på kromatogrammet fra Tosoh, kunne der ses en stor top på pladsen for HbE. Denne top var dog for stor til at der kunne være tale om HbE. Ved to af de fem prøver kunne varianten ikke identificeres på elektroferogrammet, men kunne godt identificeres som HbS på kromatogrammet. En prøve ud af de fem kunne hverken identificeres på kromatogrammet eller elektroferogrammet. Den sidste prøve, hvor varianten ikke kunne identificeres vha. prøverne fra Sebia, kunne, med kendskab til β- thalassæmi, identificeres som værende en prøve fra en patient med β-thalassæmi. Side 46 af 57

Perspektivering Som følge af dette professionsbachelorprojekt kunne det være interessant at undersøge hvilke kvantitative påvirkninger tilstedeværelsen af hæmoglobinvarianter i heterozygot tilstand har på HbA1c-koncentrationen. Der kunne også være interessant at undersøge Capillarys s mulighed for at kunne anvendes til β-thalassæmi-screening nærmere. Der ud over kunne det være interessant at undersøge den mulige interferens fra acetyleret hæmoglobin på Tosoh, samt evt. andre interfererende faktorer. Side 47 af 57

Referencer (1) Christensen TL, Mortensen TS. Fra egne resultater, som er fundet i forbindelse med dette bachelorprojekt. 2013. (2) Hilsted J, Borch-Johnsen K, Sandahl Christiansen J. Diabetes: sygdom, behandling og organisation. 2011:403 sider, ill. (nogle i farver). (3) Lin CN, Emery TJ, Little RR, Hanson SE, Rohlfing CL, Jaisson S, et al. Effects of hemoglobin C, D, E, and S traits on measurements of HbA1c by six methods. Clin.Chim.Acta 2012 Apr 11;413(7-8):819-821. (4) Liotta L, Di Franco A, Pazzagli M, Luconi M. Glycated hemoglobin (HbA1c) measurement in frozen whole blood depends on baseline values of fresh samples. Anal.Bioanal Chem. 2013 Jan;405(1):429-434. (5) Little RR, Rohlfing CL, Hanson SE, Roberts WL. Effects of hemoglobin C and S traits on Tosoh G8 and Siemens Advia HbA1c assays. Clin.Chim.Acta 2010 May 2;411(9-10):779-780. (6) Shu I, Devaraj S, Hanson SE, Little RR, Wang P. Comparison of hemoglobin A1c measurements of samples with elevated fetal hemoglobin by three commercial assays. Clin.Chim.Acta 2012 Oct 9;413(19-20):1712-1713. (7) Kjærsgaard E, Jørgensen NB, Hippe E. Laboratorieundersøgelser: deres kemiske og kliniske betydning. 2005:152 sider, ill. (8) World Health Organisation. Use of Glycated Haemoglobin (HbA1c) int the Diagnosis of Diabetes Mellitus<br />Abbreviated Report of a WHO Consultation. 2011 http://www.dskb.dk/media/documents/report-hba1c_2011.pdf. (9) Chapelle JP, Teixeira J, Maisin D, Assink H, Barla G, Stroobants AK, et al. Multicentre evaluation of the Tosoh HbA1c G8 analyser. Clin.Chem.Lab.Med. 2010 Mar;48(3):365-371. (10) Felding P, Brandslund I, Plum I, Pedersen M, Ødum L, Gerdes U. DSKB VUKs analysekvalitetskrav til HbA1c ved brug til diagnostik og monitorering af diabetes. 2011 06.08.2011 http://dskb.dk/default.asp?id=241&toppage=131. (11) Milojkovic R. A heightened awareness: hemoglobin variants and HbA1c. MLO Med.Lab.Obs. 2013 May;45(5):50, 52, 54. (12) Sacks DB. Measurement of hemoglobin A(1c): a new twist on the path to harmony. Diabetes Care 2012 Dec;35(12):2674-2680. (13) Little RR, Sacks DB. HbA1c: how do we measure it and what does it mean? Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes. 2009 Apr;16(2):113-118. (14) Gelehrter TD, Collins FS, Ginsburg D,1920-. Principles of medical genetics. 2nd ed. Baltimore: Williams & Wilkins; 1998. Side 48 af 57

(15) Lyngbye J, Kjær A, Ladefoged SA, Nissen PH. Lyngbyes laboratoriemedicin. 2010:739 sider, ill. (nogle i farver). (16) Marchetti P. Advanced glycation end products (AGEs) and their receptors (RAGEs) in diabetic vascular disease. 2009; Available at: http://www.medicographia.com/2010/01/advancedglycation-end-products-ages-and-their-receptors-rages-in-diabetic-vascular-disease/. Accessed 29/10-13, 2013. (17) Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE. Essential haematology. 6. ed. ed. Malden, Mass.: Wiley- Blackwell; 2011. (18) Little RR, Rohlfing CL, Hanson S, Connolly S, Higgins T, Weykamp CW, et al. Effects of hemoglobin (Hb) E and HbD traits on measurements of glycated Hb (HbA1c) by 23 methods. Clin.Chem. 2008 Aug;54(8):1277-1282. (19) Little RR, Roberts WL. A review of variant hemoglobins interfering with hemoglobin A1c measurement. J.Diabetes Sci.Technol. 2009 May 1;3(3):446-451. (20) Chu CH, Lam HC, Lee JK, Wang MC, Lu CC, Sun CC, et al. Common hemoglobin variants in southern Taiwan and their effect on the determination of HbA1c by ion-exchange high-performance liquid chromatography. J.Chin.Med.Assoc. 2009 Jul;72(7):362-367. (21) Khuu HM, Robinson CA, Goolsby K, Hardy RW, Konrad RJ. Evaluation of a fully automated high-performance liquid chromatography assay for hemoglobin A1c. Arch.Pathol.Lab.Med. 1999 Sep;123(9):763-767. (22) Weykamp CW, Penders TJ, Siebelder CW, Muskiet FA, van der Slik W. Interference of carbamylated and acetylated hemoglobins in assays of glycohemoglobin by HPLC, electrophoresis, affinity chromatography, and enzyme immunoassay. Clin.Chem. 1993 Jan;39(1):138-142. (23) Tosoh. Tosoh automated glycohemoglobin analyser HLC-723 G8 - Technical report. (24) Urrechaga E. High-resolution HbA(1c) separation and hemoglobinopathy detection with capillary electrophoresis. Am.J.Clin.Pathol. 2012 Sep;138(3):448-456. (25) Jaisson S, Leroy N, Meurice J, Guillard E, Gillery P. First evaluation of Capillarys 2 Flex Piercing(R) (Sebia) as a new analyzer for HbA1c assay by capillary electrophoresis. Clin.Chem.Lab.Med. 2012 Oct 1;50(10):1769-1775. (26) Marinova M, Altinier S, Caldini A, Passerini G, Pizzagalli G, Brogi M, et al. Multicenter evaluation of hemoglobin A1c assay on capillary electrophoresis. Clin.Chim.Acta 2013 Sep 23;424:207-211. (27) Simonsen F, Jeppesen H, Bergsøe MN. Analyseteknik: instrumentering og metoder. 2010:384 sider, ill. (28) Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi,odense universitetshospital. Hb(Fe;B)- HæmoglobinA1c(Fe). D4 infonet: Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi. Side 49 af 57

(29) Mortensen TS. Illustration af HPLC-system. Figuren er stærk inspireret af ligende figur i bogen Analyseteknik: instrumentering og metoder af F. Simonsen, H. Jeppesen og MN. Bergsøe. 2013. (30) Wehr T, Rodríguez-Díaz R, Zhu M. Capillary electrophoresis of proteins. 1999:286 s., ill. (31) Sebia. CAPILLARYS Hb A1c<br />Ref. 2015. 2013. (32) UCDavis ChenWiki. http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/10647/capillaryelectrophoresis.gif?size=bestfit&width =592&height=275&revision=1. 2013; Available at: http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/10647/capillaryelectrophoresis.gif?size=bestfit&width =592&height=275&revision=1. Accessed 12/03, 2013. (33) UCDavis ChenWiki. http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/193/hplc%26ce_flow_profile.jpg?size=bestfit&wid th=373&height=148&revision=1. 2013; Available at: http://chemwiki.ucdavis.edu/@api/deki/files/193/hplc%26ce_flow_profile.jpg?size=bestfit&wid th=373&height=148&revision=1. Accessed 12/03, 2013. (34) Cotton F, Malaviolle X, Vertongen F, Gulbis B. Evaluation of an automated capillary electrophoresis system in the screening for hemoglobinopathies. Clin.Lab. 2009;55(5-6):217-221. (35) Behan KJ, Storey NM, Lee HK. Reporting variant hemoglobins discovered during hemoglobin A1c analysis - common practices in clinical laboratories. Clin.Chim.Acta 2009 Aug;406(1-2):124-128. (36) Lotte Foegt Poulsen, Faglig Specialist - Hæmatologi og Sporstof, Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi. (37) Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi,odense universitetshospital. HbA1c Labquality kontroller. 2013. (38) F. Catteau fra Sebia editor. HbA1c Sebia præsentation, powerpoint præsentation. Modificeret af Lars Bendixen, kundechef/crm, fagligspecialist, ILS Laboratories Scandinavia ed.; 2010. (39) Rohlfing CL, Hanson S, Tennill AL, Little RR. Effects of whole blood storage on hemoglobin a1c measurements with five current assay methods. Diabetes Technol.Ther. 2012 Mar;14(3):271-275. (40) Merono F, Agouti I, Bonello-Palot N, Paolasso C, Levy N, Badens C. Analytical evaluation of the Tosoh HLC-723 G8 automated HPLC analyzer for hemoglobin analysis in beta-thalassemia mode. Clin.Biochem. 2011 Apr;44(5-6):441-443. (41) Bendsen T. Beregning af teststyrke for to parrede stikprøver. 2013; Available at: http://statnoter.biolyt.dk/index.php?pageid=136. Accessed 8. december, 2013. Side 50 af 57

Bilag 1 - Amax Her ses beregningen af A max for hhv. Tosoh og Capillarys ved et konfidensinterval på 99%, samt A max konkordans ved et konfidensinterval på 95%. CV erne er udvalgt efter hvilken CV, der var højst, inden for kørslen, og er fundet i hhv. Capillarys Hb A1c-manual og Tosoh HLC-723G8 Technical Report. Capillarys Tosoh A max konkordans Side 51 af 57

Bilag 2 - Friedmantest Er der signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne mellem dag 0, 7, 14, 21 og 28? 1. Definer hypoteser: H0 Der er ingen forskel på HbA1c-koncentrationerne målt de forskellige dage H1 Der er forskel på HbA1c-koncentrationerne målt de forskellige dage 2. Definer signifikansniveau: 0,05 3. Beregn frihedsgrader: df k 1 4 k : antal stikprøver 4. Beslutningsgrundlag? (State decision rule) 2 Hvis 9, 48773 forkastes H 0 5. Friedmantesten Ranger data i rækker Tag summen af alle rangene for hver stikprøve/kolonne (R) Beregn teststørrelsen (X 2 ) %: 6. Resultat: 2 9, 48773 H forkastes. 0 Altså er der signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne mellem dag 0, 7, 14, 21 og 28. Side 52 af 57