PASTOREX STAPH-PLUS 5 x x Latexagglutinationstest Til Identifikation Af Staphylococcus Aureus

Transkript

1 PASTOREX STAPH-PLUS 5 x x Latexagglutinationstest Til Identifikation Af Staphylococcus Aureus /01 1- FORMÅL PASTOREX STAPH-PLUS er en hurtig agglutinationstest til simultan bestemmelse af fibrinogenaffinitet (agglutinationsfaktor), protein A og kapsulære polysaccharider i Staphylococcus aureus. 2- OVERSIGT OG FORKLARING Staphylococcus aureus er en af de hyppigst forekomne patogener i kliniske prøver. Den hurtige skelnen mellem denne og andre mindre virulente stafylokokarter er af stor betydning for korrekt patientbehandling. Testen til bestemmelse af fri koagulaseproduktion muliggør identifikation af Staphylococcus aureus (11, 12). Denne test tager imidlertid mellem 4 og 24 timer, og der kan være lot til lot variation af plasma, hvilket kan påvirke reaktionen (16). Der er udviklet agglutinationsreagenser, som giver en hurtigere og mere pålidelig konstatering af Staphylococcus aureus (3). Disse agglutinations test er baseret på fibrinogen- og IgG-sensibiliseret latex, til bestemmelse af agglutinationsfaktoren og protein A, som er de biokemiske egenskaber for S. aureus. Det er imidlertid forekommet, at visse stammer af Staphylococcus aureus (hovedsagelig de methicillinresistente stammer) ikke agglutineres ved disse agglutinationstest (15). En undersøgelse af disse stammer har vist, at de alle indeholder kapsulær polysaccharid (4). Det er derfor sandsynligt, at den polysaccharidkapsel, som omgiver bakterien i visse situationer (direkte prøver, dyrkningsisolat og bakterieklon), skjuler protein A og agglutinationsfaktoren og derved forhindrer agglutination af de latexpartikler, der kun er sensibiliseret med fibrinogen og IgG. 3- PRINCIP PASTOREX STAPH-PLUS er udviklet til simultan bestemmelse af følgende tre komponenter: 1) Fibrinogenaffinitetsfaktoren, også kaldet bundet koagulase eller "agglutinationsfaktor". 2) Protein A, som har en affinitet for det krystaliserbare fragment (Fc) i gamma-immunglobuliner (IgG). 3) Kapsulære polysaccharider i Staphylococcus aureus. Reagenset består af fibrinogen- og IgG-sensibiliserede og monoklonale antistoffer (Institut Pasteur patent), der er specifikke for kapsulære polysaccharider i Staphylococcus aureus (1, 5, 6, 8, 10). Kombinationen af fibrinogen, IgG og anti-kapsulære, monoklonale antistoffer i samme reagens gør det muligt både at genkende kraftigt indkapslede stammer af Staphylococcus aureus samt svagt indkapslede stammer. Ved kraftigt indkapslede stammer agglutineres bakterierne af anti-kapsulære polysaccharid-antistoffer. Ved stammer, der har mistet deres polysaccharidkapsel, agglutineres bakterierne af fibrinogen og IgG. Dyrkningsisolater af Staphylococcus aureus blandes med latexreagenset på en plade. Efter fuldstændig blanding, kontrolleres pladen visuelt for forekomst af agglutination, hvilket indikerer forekomst af Staphylococcus aureus-organismer. 4- KITTETS INDHOLD 1. PASTOREX STAPH-PLUS, 50-test kit, kode 56356: Latex test: 1 dråbeflaske med 1 ml rød latex sensibiliseret med bovin albuminopløsning, fibrinogen, IgG, og monoklonale antistoffer rettet mod kapsulære polysaccharider i Staphylococcus aureus. Konserveringsmiddel: <1,5 % ProClin 300. Negativ kontrol: 1 dråbeflaske med 1 ml negativ kontrolreagens bestående af rød latex, sensibiliseret med en bovin albuminopløsning. Konserveringsmiddel: <1,5 % ProClin engangskort til agglutination. 150 blandepinde. 2. PASTOREX STAPH-PLUS, 5 x 50-test kit, kode 56353: Latex test: testreagenser, 5 dråbeflasker (1 ml) Negativ kontrol : negativ kontrolreagens, 5 dråbeflasker (1 ml) Engangskort til agglutination, 4 x 16 Blandepinde, 3 x

2 5- OPBEVARING Alle reagenser er holdbare, indtil den udløbsdato, der er angivet på etiketten ved opbevaring ved 2-8 Ci områder, hvor bakteriel kontaminering ikke kan forekomme. Latex-flaskerne skal opbevares opretsående. LATEXREAGENSERNE MÅ IKKE NEDFRYSES. 6- NØDVENDIGT, IKKE-LEVERET MATERIALE Øjepodenåle til udtagning af bakteriekolonier Desinfektionskar eller autoklaverbare poser til bortskaffelse af brugte kort. 7- FORHOLDSREGLER Pastorex Staph-plus-kittet er kun beregnet til dyrkningsbekræftelsestest og må ikke anvendes på direkte kliniske prøver. Kvaliteten af resultaterne er afhængig af en nøje overholdelse af reglerne for god laboratoriepraksis. Alle reagenserne og prøvematerialet skal have opnået temperatur mellem 18 og 30 C før testen udføres. Undgå at røre ved reaktionsoverfladen på agglutinationskortene. Ryst flaskerne med latex før brug. Tør spidsen på dråbeflasken med reagens af, så dråberne er velkalibrerede. Hold flasken med reagens lodret når dråberne dispenseres. Brug de plastikrøreblandepinde, der leveres med kittet, til at blande latexreagenset og bakteriekolonierne. Brug ikke træblandepinde. Udskift blandepinden efter hver reaktion. Kasser alt benyttet engangsmateriale i en autoklaverbar affaldsbeholder eller et desinficerende bad. HYGIEJNE OG SIKKERHEDSINSTRUKTIONER Følg altid de nuværende teknikker og forholdsregler vedrørende beskyttelse mod mikrobiologiske risici. Advarsel: Disse reagenser indeholder ProClin 300 <1,5%. Se piktogrammet(merne), som er angivet på mærkaterne, og informationerne sidst i brugsanvisningen i forbindelse med farer og forholdsregler for kemiske komponenter i dette testsæt. Sikkerhedsdatabladet kan findes på 8- ANVENDELSESMETODE 1) PRØVEKLARGØRING Prøver, der anvendes sammen med dette kit, skal være rene og friske. Følgende medier, eller tilsvarende medier, anbefales: Agarmedier Trypto-kasein-sojaagar Columbia agar + fåreblod Columbia agar Blodagar Mannitol saltagar Baird-Parker-medier med additiver MRSASelect Udfør Gramfarvning og katalasetest på de dyrkede organismer. De kolonier, som testes med PASTOREX STAPH-PLUSreagenset, skal være Gram-positive, katalase-positive kokker. 2) AGGLUTINATIONSREAKTION Bland latexreagenserne grundigt ved at ryste dem. Om nødvendigt anvendes Vortex mikser. Dryp en dråbe af latextestreagenset på én af cirklerne på agglutinationskortet. Dryp en dråbe negativ latexkontrolreagens på en anden cirkel. Udtag mellem 1 og 3 Gram- og katalase-positive kolonier med en øjepodenål eller en plastikrørepind, og emulger dem i en dråbe latex i 10 sekunder. Gentag trin 4 for det negative kontrollatex. Homogeniser ved forsigtigt at rotere kortet. Resultater skal aflæses inden 30 sekunder efter påbegyndt rotation af kortet. Evaluer resultaterne i henhold til de følgende kriterier, og kasser derefter kortet i et desinfektionskar. Genbrug ikke kortet. 9- FORTOLKNING AF RESULTATER POSITIV REAKTION En positiv reaktion viser sig ved, at der kun dannes aggregater med testreagenset. Aggregaterne skal kunne ses med det blotte øje, i normalt lys og inden for 30 sekunder efter påbegyndt rotation af kortet. Aggregaterne af latexpartikler kan variere i størrelse og have en mere eller mindre grumset, lyserød baggrund. En langsom og svag agglutination kan evt. angive en ikke-specifik agglutination. 2

3 NEGATIV REAKTION I en negativ reaktion producerer opløsningen ikke aggregater, og dens mælkeagtige udseende bevares. RESULTATER, DER IKKE KAN FORTOLKES Et resultat, der ikke kan fortolkes, svarer til agglutination af opløsningen med den negative kontrollatex. I dette tilfælde skal identifikation ske ved anvendelse af en anden metode som f.eks. at teste for forekomst af fri koagulase og varmebestandig DNase. 10- KVALITETSKONTROL AF TESTEN Evaluer latexreagenset før brug ved at kontrollere, at der ikke forekommer agglutination, når der dryppes latex på kortet. Latex bør med jævne mellemrum testes med tidligere identificerede stammer af Staphylococcus aureus og Staphylococcus epidermidis. Latextestreagenset skal agglutinere med Staphylococcus aureus og må ikke agglutinere med Staphylococcus epidermidis. 11- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede og kommercialiserde reagenser er underlagt et komplet kvalitetssystem lige fra modtagelsen af råmaterialet til den endelige kommercialisering af produktet. Hvert parti sendes til kvalitetskontrol og frigives kun på markedet, når det overholder kravene for godkendelse. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for virksomheden. 12- YDEEVNE Ydeevnen for PASTOREX STAPH-PLUS er evalueret i flere forskellige laboratorier 2, 13, 14, 17. I alt blev 568 stammer af S. aureus og 225 stafylokokstammer, andre end S. aureus testet med kittet. Dyrkningsidentifikation blev udført med Gramfarvning, katalaseaktivitet samt koagulasetest i reagensglas. Ikke-samstemmende prøver blev efterfølgende testet ved en biokemisk analyse og med en kommercialiseret, alternativ hurtigtest. S. aureus-stammer blev også kontrolleret for deres følsomhed over for methicillin. Resultaterne af sensivitetsundersøgelserne på methicillinresistente S. aureus (MRSA) og methicillinfølsomme S. aureus (MSSA) samt de samlede resultater for alle Staphylococcus aureus er vist i tabel 1. Resultaterne for specificitetsundersøgelserne på stafylokokstammer ud over S. aureus-stammer er vist i tabel 2. Tabel 1 Ydeevne for PASTOREX STAPH-PLUS på MRSA- og MSSA-isolater I alt Positiv Negativ Relativ sensitivitet MRSA MRSA 217 * % % S. aureus i alt 439 * % * Et resultat, der ikke kunne fortolkes, blev udeladt Methicillinresistent S. aureus Som vist i tabel 1 blev 217 ud af 217 præcist definerede MRSA-isolater korrekt identificeret med PASTOREX STAPH-PLUSkittet. De tre ikke- samstemmende dyrkninger blev bekræftet som S. aureus-stammer. To stammer gav en negativ reaktion med en alternativ hurtigtest, og en stamme viste et ikke konkluderbart resultat med både PASTOREX STAPH- PLUS og med en alternativ hurtigtest. Sensitiviteten for PASTOREX STAPH-PLUS for MRSA blev anslået til 100%, eksklusive det resultat, der ikke kunne fortolkes, og som repræsenterer 0,4% af de analyserede stammer. Methicillinfølsomt S. aureus Alle de 222 dyrkede MSSA viste positivt resultat med PASTOREX STAPH-PLUS, som vist i tabel 1. Den opnåede sensitivitet for denne gruppe MSSA var 100%. Andre stafylokokker Tabel 2 Ydeevne for PASTOREX STAPH-PLUS på andre stafylokokstammer I alt Positiv Negativ Relativ specificitet Andre stafylokokstammer % 3

4 To hundrede og femogtyve (225) stafylokokisolater, andre end S. aureus, inklusive S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S.schleiferi, S. lugdunensis og andre arter, blev også analyseret med PASTOREX STAPH-PLUS og gav negativt resultat for 137 af de 138 stammer, som vist i tabel 2. De ikke-samstemmende resultater blev identificeret som en S. lugdunensis. De gav også positivt resultat med en alternativ hurtigtest. 13- PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Der er rapporteret tilfælde, hvor Staphylococcus lugdunensis og Staphylococcus schleiferi har en fibrinogenaffinitetsfaktor (7,9) og evt. kan reagere med testen til konstatering af agglutinationsfaktoren, alt afhængigt af stammerne og isolationsmediet. Da nogle stafylokokstammer er kendt for at give ikke-specifik aggregering af latexpartikler, især Staphylococcus saprophyticus, anbefales det, at det med kittet leverede kontrollatex anvendes med hver organisme, der testes. Staphylococcus intermediusog Staphylococcus hyicus, som findes i dyrepatologi, men som sjældent isoleres i mennesker, kan vise en positiv reaktion med de klassiske koagulasetest og kan derfor teoretisk set også reagere med test der bestemmer fibrinogenaffinitetsfaktor. Muligheden for krydsreaktioner må ikke glemmes. Nogle streptokokker indeholder et protein med affinitet for Fc-delene i immunglobuliner og kan derfor reagere med latexet. Der er ligeledes rapporteret tilfælde af ikke- specifikke reaktioner med latexteknikker for adskillige arter, inklusive Escherichia coli og Candida albicans (17). Det anbefales at udføre en Gramfarvning og katalasetest på de kolonier, der skal testes, før latextesten foretages. Fejlagtige negative reaktioner kan forekomme, hvis den isolerede Staphylococcus aureus ikke producerer den fibrinogenaffinitetsfaktor (agglutinationsfaktor), det protein A eller de kapsulære polysaccharider, som de specifikke monoklonale antistoffer blev rettet mod. Hvis bakterieopløsningen er fremstillet med et utilstrækkeligt antal kolonier, kan falske negative resultater forekomme. 14- LITTERATURLISTE 1. Boutonnier A., Nato F., Bouvet A., Lebrun L., Audurier A., Mazie J.C., and Fournier J.M. Direct testing of blood cultures for detection of the serotype 5 and 8 capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Davies S. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: the evaluation of rapid agglutination methods, Br. J. Biomed. Sci., 1997, 54: Esserts I., and Radebold K. Rapid and reliable identification of Staphylococcus aureus by a latex agglutination test. J. Clin. Microbiol Fournier J.M., Boutonnier A., and Bouvet A. Staphylococcus aureus strains which are not identified by rapid agglutination methods are of capsular serotype 5. J. Clin. Microbiol : Fournier J.M., Bouvet A., Boutonnier A., Audurier A., Goldstein F., Pierre J., Bure A., Lebrun L., and Hochkeppel H.K. Predominance of capsular polysaccharide type 5 among oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Fournier J.M., Hannon K., Moreau M., Karakawa W.W., and Vann W.F. Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus. Ann. Inst. Pasteur/Microbiol : Freney J., Brun Y., Bes M., Meugnier H., Grimont F., Grimont P.A.D., Nervi C., and Fleurette J. Staphylococcus lugdunensis sp. No. and Staphylococcus schleifer sp. Nov., two species form human clinical specimen. J. Clin. Microbiol : Hochkeppel H.K., Braun D.G., Vischer W., Imm A., Sutter S., Staeubli U., Guggenheim R., Kaplan E.L., Boutonnier A., and Fournier J.M. Serotyping and electron microscopy studies of Staphylococcus aureus clinical isolates with monoclonal antibodies to capsular polysaccharide types 5 and 8. J. Clin. Microbiol : Jean Pierre H., Darbas H., Jean-Roussenq A., and Boyer G. Pathogenicity in T cases of Staphylococcus schleiferi, a recently described species. 10. Karakawa W.W., Fournier J.M., Vann W.F., Arbeit R., Schneerson, R.S. and Robbins. J.B. Method for the serological typing of the capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22: Kloos W.E. and Lambe D.W. (1991). Staphylococcus Manual of Clinical Microbiology, 5th Ed. Edited by Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., and Shadomy J.J. American Society for Microbiology, Washington, D.C., Pages Kloos W.E., and Scleifer K.H. Staphylococcus Bergeyís manual of systematic bacteriology. 1986, vol. 2, Luijendijk AD., Alex van Belkum, Verbrugh H., and Kluytmans J. Comparison of Five Tests for Identification of Staphylococcus aureus from Clinical Samples. J. Clin. Microbiol., 1996, 34: Neher C., Allerberger F., Prodinger W. Dierich M.P., Evaluation of commercially available agglutination tests for methicillinresistant. 8 th ECCMID Congress, Lausanne, Ruane P.J., Morgan M.A., Citron D.M., and Mulligan M.E. Failure of rapid agglutination methods to detect oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol : Selepack S.T., and Witebsky F.G. Inoculum size and lot-to-lot variation as significant variables in the tube coagulase test for Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol., 1985, 22: Kronvall G. A Surface Component in Group A, C, and G Streptococci with Non-Immune Reactivity for Immunoglobulin G. J. Immunology., 1973, vol.11,

5 5

6 6

7 Distributed in the USA by Bio-Rad Laboratories Diagnostics Group th Avenue N.E. Redmond, WA For Customer Orders Call : BIORAD For Technical Service Call : BIORAD ( ) Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /01 Fax : +33 (0)