OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6.

Transkript

1 OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6. Bachelorprojekt Udarbejdet af Sandra Reinholt Nielsen Projektperiode: 6. April 9.juni 2009 Vejledere: Søren Jensen, Lektor, Professionshøjskolen Metropol Mogens Fenger, Overlæge, Klinisk Biokemisk Afd. HH Helle Frederikson, Bioanalytikerunderviser, Klinisk Biokemisk Afd. HH Pernille Munck, Bioanalytikerunderviser, Klinisk Biokemisk Afd. HH

2 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Resumé Projektets fokus ligger på optimeringen af en PCR-analyse til amplifikation af de 10 exons i genet CerS6 med udgangspunkt i en standardprotokol på KBA Forskningsafdeling, Hvidovre Hospital, som ikke er optimeret i forhold til amplifikation af de 10 exons i CerS6-genet. Optimeringen af PCRreaktionerne har til formål at sikre en succesfuld amplificering af de ønskede DNA-sekvenser, således at en ønsket mængde PCR-produkt opnås og derefter kan anvendes til sekventering. Sekventeringen skal anvendes til at detektere eventuelle kendte eller ukendte mutationer i ovenstående gen, CerS6. Til optimeringen af PCR-reaktionerne anvendes et kit fra Qiagen indeholdende de reagenser, som er nødvendige for at kunne udføre forsøget. På baggrund af en skiftevis ændring i koncentrationerne af prøvemateriale, Taq polymerase, MgCl 2 og en udskiftning af Taq polymerase med et nyt enzym, AmpliTaq Gold, blev optimeringen af PCR-reaktionerne foretaget. En succesfuld amplificering af de 10 exons i CerS6-genet blev opnået i 72 % af prøverne med de tilhørende 10 exons. Der kan ikke gives et entydigt svar på hvilke analysebetingelser der er de optimale for hver af de 10 exons i CerS6- genet. Forord Udførelsen af forsøgene i dette projekt er foregået på Klinisk Biokemisk Afdelings Forskningsafdeling, Hvidovre Hospital. Jeg retter hermed en tak til afdelingen for at have ladet dette projekt optage plads, arbejdstid og økonomi. Jeg har følt mig privilegeret over, at måtte optage plads på kontoret og i arbejdslommerne på afdelingen. Dette har været med til at skabe et godt fundament for at kunne arbejde intensivt med projektet. Den praktiske vejledning har været uundværlig under hele projektets tilblivelse. En stor tak til Forskningsbioanalytiker Bente Madsen for at bistå med råd og vejledning til det praktiske arbejde. En tak til vejlederne Pernille Munck, Helle Frederikson og Søren Jensen for teoretisk råd og vejledning til selve rapportens tilblivelse. En særlig tak til Overlæge Mogens Fenger for at udbyde dette projekt. Jeg håber at have bidraget med brugbare resultater, som fremover kan anvendes som basis for tilblivelsen af andre projekter. Dette projekt har for mig udvidet min horisont indenfor arbejdet med genetiske analyser, således at jeg har en stor viden om dette område med i bagagen fremover. Projektet er på tegn ekskl. indholdsfortegnelse, litteraturliste og bilag. Hvidovre Hospital, juni 2009 Sandra Reinholt Nielsen

3 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Indholdsfortegnelse Resumé... 1 Forord... 1 Introduktion... 6 Indledning... 6 Formål... 7 Mål... 8 Problemformulering... 8 Begrebsdefinitioner... 8 Etiske overvejelser... 8 Teori... 9 Deoxyribonukleinsyre (DNA)... 9 CerS6-genet... 9 Polymerase Chain Reaction (PCR) Temperaturprofilen Plateaufasen Gelelektroforese Primer design Primer-dimer Hot star Taq-polymerasen og AmpliTaq Gold Forberedelse af DNA-template til sekventering Sekventering Sanger Princippet Metodevalg og afgrænsning Den anvendte metode

4 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Nyt primersæt til exon Pilotforsøg Materialer og metode Materialer Prøvemateriale Sekundært prøvemateriale til optimering af annealingtemperaturen Kvalitetskontroller Reagenser, apparatur, primersæt og genet CerS Metode Temperaturgradienterne opstilles Gelelektroforese udføres Vurdering af resultaterne af temperaturgradienterne PCR-reaktionerne udføres Gelelektroforese udføres Ved manglende produkt foretages en yderligere optimering Pilotforsøg Design af nyt primersæt Oprensning af PCR-produkter Sekventerings-PCR udføres Fældning af sekvens-pcr Sekventering Standardprotokollen Fremstilling af PCR-produkt Gelelektroforese Procedurer for optimeringen af PCR-metoden, hvor annealingtemperaturen er fastlagt

5 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Pilotforsøg Oprensning af PCR-produkt vha. søjlemetoden Sekventerings-PCR Fældning af sekvens-pcr Resultater Resultater fra temperaturgradienterne De fundne annealingtemperatur i forhold til primernes udregnede Tm Resultater fra PCR-reaktionerne Suppleringsskema over resultater fra specifikke PCR-reaktioner Resultater fra pilotforsøget med exon 6 (gamle primersæt) Resultater fra pilotforsøgene med prøve 293 exon Antal succesfulde amplifikationer opnået Resultater fra tjek af oprensningen af PCR-produkter Resultater fra sekventeringen af PCR-produkterne Fejlkilder Diskussion Primerdesign Primer-dimer Optimering af PCR-reaktioner Reamplifikation af PCR-produkter Oprensning, fældning og sekventering Evaluering Konklusion Perspektivering

6 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Bibliografi Bilagsoversigt

7 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Introduktion Indledning I 1953 lykkedes det Francis Crick og James Watson at fremstille en nøjagtig model af DNA-molekylet. Man havde tidligere kunne lokalisere generne til kromosomerne, men havde ikke før kunnet forklare den kemiske struktur af DNA. Crick og Watson s model kunne også forklare, hvordan arvematerialet kan lave en identisk kopi af sig selv i forbindelse med celledeling. Da Crick og Watson byggede denne model af DNA-molekylet, var de en del af en gruppe forskere, der konkurrerede om at komme først med et korrekt bud på arvematerialets struktur. Denne fremstilling af modellen blev en milepæl indenfor genetikkens verden. (Egebo, 2004, s. 13 og 41) Mange sygdomme opstår ved en mutation i DNA og kategoriseres derfor genetiske sygdomme. Den primære årsag til hvilken som helst genetisk sygdom er en forandring i rækkefølgen af baser i DNA, som derved ændrer, hvorledes genet kommer til udtryk. Inden for det genetiske område er det samlede billede af de molekylære defekter, der associeres med sygdommen Diabetes Mellitus type 2 (DMT2), endnu ukendt. (McPhee, Lingappa, & Ganong, 2003, s. 514) Både genetiske, miljø- og livsrelaterede faktorer har betydning for udvikling af DMT2. Sygdommen er et stigende problem i den vestlige verden og er blevet en livsstilssygdom, hvor overvægt og manglende motion spiller en væsentlig rolle for udviklingen af sygdommen. (Sand, Sjaastad, & Haug, 2004, s. 241) DMT2 er karakteriseret ved nedsat glukosetolerance, hvilket medfører højt indhold af glukose i blodet. Den høje glukose skyldes hovedsageligt en nedsat følsomhed for insulin i muskelvæv, fedtvæv og i leveren (insulinresistens) hos disse patienter. Patienter med DMT2 har samtidigt en utilstrækkelig insulinproduktion fra β-cellerne i de Langerhanske øer i pancreas. Den dominerende fejlmekanisme hos DMT2-patienter er insulinresistensen. Enkelte genetiske defekter er forbundet med udtalt insulinresistens, men hos de fleste patienter med diagnosen DMT2 har man ikke kunnet påvise en defekt i et enkelt gen, som kunne være årsag til DMT2 eller insulinresistens. Tvillingundersøgelser har kunnet påvise, at genetiske faktorer er involveret i udviklingen af insulinresistens, dog har man ikke kunnet finde én genetisk defekt som årsag til insulinresistens. (Hilsted, Borch-Johnsen, & Christiansen, 2007, s. 69, 71, 73 og 74) På Forskningsafdelingen Klinisk biokemisk afdeling (KBA) på Hvidovre Hospital (HH) bliver der forsket i sammenhængen mellem SNP er i genet CerS6 og insulinresistens hos patienter med DMT2. Dette projekt kommer til at være en del af forskningen omkring det genetiske aspekt af sygdommen DMT2. I denne opgave vil forkortelsen SNP ikke nævnes, men i stedet refereres til denne forkortelse med ordet mutationer. Et essentielt redskab i sammenhæng med denne type forskning er Polymerase Chain Reaction (PCR), som anvendes til amplificering og opformering af DNA in vitro. Metoden blev opfundet af Kary Mullis og blev publiceret i 1985 af Saiki et al. og Mullis et al. PCR-metoden er yderst specifik og sensitiv, således at et bestemt stykke DNA, på trods af, at dette er til stede i meget ringe mængde, kan opformeres til flere milliarder eksemplarer på relativ kort tid. Selvom konceptet er simpelt, er PCR- 6

8 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 metoden en kompliceret proces med mange forskellige reaktanter. Mange genetiske variationer associeret med sygdomme foreligger bl.a. ved hjælp af PCR-teknikken, som herved har skabt revolution indenfor molekylærbiologien. (Xu & Larzul, 1991, s. 1) (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 137) (McPherson & Møller, 2006, s. 1) I dette projekt anvendes PCR-metoden som forarbejde til sekventering af et specifikt gen, hvor eventuelle mutationer kan detekteres. Mutationer er en permanent ændring af basesammensætningen i et gen og kan bestå af en ændring i et enkelt basepar. Gener koder for proteiner. Fordi strukturen og aktiviteten af hvert enkelt protein er afhængig af en aminosyresekvens, kan en mutation bevirke at proteinet ikke fungerer efter hensigten, eller slet ikke fungerer. Netop derfor er det vigtig, at detektere og identificere disse mutationer. (Alberts, et al., 2004, s. 209) For at kunne sekventere DNA kræves en vis mængde PCR-produkt. Her er det netop, at PCR-metoden skal fungere optimalt, således at den ønskede mængde produkt opnås. PCR-metoden skal kunne frembringe brugbare resultater i overensstemmelse med de kvalitetskrav og kontrolforanstaltninger, der fastsættes for metoden. PCR-reaktionerne til opformering af exons i CerS6-genet er, fra afdelingens side, ikke optimeret og dette danner grundlag for tilblivelsen af dette projekt. Formål Patienterne, hvorfra prøvematerialet stammer fra, har fået stillet diagnosen DMT2. En sygdom, som ikke endnu kan helbredes, men kun symptombehandles. Derfor vil et fund af eventuelle sygdomsfremkaldende mutationer bidrage til det samlede billede af den genetiske årsag til DMT2. Da projektet er en del af forskningen der foregår på Forskningsafdelingen KBA HH, er afdelingen interesseret i, at jeg når frem til nogle sekventeringsresultater, som videre kan bidrage med viden om årsagen til insulinresistens hos patienter med DMT2. Altså er afdelingen interesseret i at få fundet de eventuelle mutationer, der end måtte være hos disse udvalgte patienter. Min opgave er som sådan ikke direkte at finde disse eventuelle mutationer, men derimod at gøre forarbejdet til sekventeringen vha. en PCR-metode, som skal optimeres i forhold til de anvendte primere. Jeg finder eventuelt mutationer i genet CerS6 hos nogle af disse udvalgte patienter. Disse eller denne mutationer/mutation kan måske kædes sammen med årsagen til insulinresistens. Projektet danner grundlag for udvikling af en PCR-protokol, som fremover kan anvendes i forbindelse med opformering af specifikke DNA-sekvenser i CerS6-genet, således at den ønskede mængde PCRprodukt opnås, med henblik på sekventering af lige netop de 10 exons i ovenstående gen. Dette bachelorprojekt er med til at danne grundlag for videre forskning indenfor arveligheden af DMT2, som værende en lille brik i et kæmpe puslespil. 7

9 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Mål Mit mål er at få optimeret en PCR-metode, som er en del af forarbejdet, analysemæssigt, til selve sekventeringen af de 10 exons i genet CerS6, således at det er muligt derefter at detektere eventuelle kendte eller ukendte mutationer i de 10 exons i genet CerS6 på alle de udvalgte prøver. Protokollen for PCR-metoden til amplificering af de 10 exons i genet CerS6 er på KBA Forskningsafdelingen, HH ikke optimeret i forhold til den optimale annealingtemperatur og derfor er afdelingen interesseret i, at denne analyse optimeres. Ved de PCR-reaktioner, som ikke giver et acceptabelt udbytte, er det samtidig et mål at kunne vha. optimering af flere parametre i reaktionen, opnå det ønskede udbytte i den rette mængde. Problemformulering Hvilke analysebetingelser er de optimale for hvert af de 10 exons i CerS6-genet under amplificering af DNA ved PCR-reaktioner, med henblik på sekventering af de 10 exons i CerS6-genet? Er det med denne PCR-amplifikation muligt at sekventere de amplificerede DNA-sekvenser og derved detektere kendte og/eller ukendte SNP'er i CerS6-genets 10 exons hos DMT2 patienter? Begrebsdefinitioner Optimale analysebetingelser defineres som de faktorer, der ændrer på PCR-reaktionen således, at produktet ses som et tydeligt bånd ved udførelse af gelelektroforese. SNP er en forkortelse for Single Nucleotid Polymorphism og betyder en genetisk variation i en DNAsekvens, som opstår når en enkelt nukleotid i et genom ændres. Etiske overvejelser Prøvemateriale anvendt i projektet er eksisterende prøvemateriale fra Endobank fra patienter på Endokrinologisk afdeling, HH, som alle er diagnosticeret med DMT2. Der er indhentet skriftligt informeret samtykke ved alle prøvetagninger. KBA Forskningsafdeling, HH har fået samtykke til at anvende materialet i forbindelse med forskning på afdelingen. I forbindelse med projektet kommer jeg ikke til at have adgang til patienternes identitet. Ved modtagelse af prøvematerialet er patienternes identitet anonymiseret, hvor prøverne er nummeret med tilfældige tal. Det kan forekomme, at der detekteres mutationer, som ikke før var kendte hos patienterne. Hvis og såfremt der findes nye mutationer, lader jeg, i samråd med Overlæge Mogens Fenger, informationerne tilgå den kliniske afdeling, hvorefter der i samarbejde tages stilling til videre 8

10 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 behandling af disse informationer. KBA Forskningsafdelingen, HH har adgang til den database, hvor patientens identitet kan findes. Jeg har ikke adgang til denne database. Al prøvemateriale, der er anvendes til projektet, forbliver i Danmark og destrueres efter afslutning af projektet. Prøvematerialet er indsamlet inden forsøgets start ved venepunktur. Det indsamlede prøvemateriale, som allerede blev indsamlet af andre personer inden forsøgets start, indeholder det DNA, som anvendes til dette forsøg. DNA er allerede oprenset fra veneblodprøven, når jeg begynder udførelsen det praktiske arbejde. Teori Deoxyribonukleinsyre (DNA) Figur 1. ( DNA er opbygget af to komplementære strenge foldet i en dobbelthelix. Strengene består af en lang række nukleotider, som hver er opbygget af et sukkerstof, deoxyribose med fem kulstofatomer, en fosfatgruppe og en nitrogenholdig base. Strengene er bundet til hinanden via hydrogenbindinger mellem baserne. Baserne Adenin og Thymin i de to strenge sidder over for hinanden, holdt sammen af to hydrogenbindinger. Guanin og Cytosin er holdt sammen af tre hydrogenbindinger og sidder derved overfor hinanden. (Alberts, et al., 2004, s. 175) De to DNA-strenge er antiparallelle; dvs. strengene er modsat orienterede, da den ene streng har sin 5 -ende over for den andens 3 -ende. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 29) Syntesen af DNAstrengene foregår således i retning fra 5 -enden til 3 -enden. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 138) DNA-molekylet indeholder områder, som koder for aminosyrer og disse områder hedder exons. De ikke-kodende sekvenser af DNA kaldes introns og er 10 gange længere end exons i det humane genom. (Carlon, Malki, & Blossey, 2005, s. 1) I det humane genom er der 3 x 10 5 kopier DNA i 1 µg oprenset DNA. (McPherson & Møller, 2006, s. 16) CerS6-genet Genet CerS6, ceramid synthase 6 er en LAG1 homolog og befinder sig på kromosom 2, lokation 2q24.3. og mistænkes for at have indflydelse på insulinresistensen hos patienter med DMT2. 9

11 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR-metoden anvendes til in vitro opformering af en specifik DNA-sekvens. Denne sekvens kaldes mål-dna eller mål-sekvensen og er defineret inden metodens udførelse. Sagt med andre ord; man skal vide, hvad man leder efter. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 137) Ved syntetisering af DNA fungerer DNA-strengene som template-strenge, altså en skabelon for den ny-syntetiserede streng. Kittet fra Qiagen indeholder reagenserne som anvendes til PCR-reaktionerne. Ved udførelse af PCR-reaktioner skal der være nogle helt bestemte reagenser til stede i en bestemt mængde. Disse parametre udgør det såkaldte Master Mix; - dntp er den samlede betegnelse for deoxyribonukleotider (frie nukleotider); dgtp, ddtp, datp og dttp, som anvendes til byggesten i syntetiseringen af DNA. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s ) - Primerne, som er korte stykker DNA, er designet til at sætte sig et bestemt sted på det stykke DNA, der skal opformeres. Primersættet består af en forward og en reverse primer, som begge sætter sig på mål-sekvensen med 3 -enden i den retning, hvor de frie nukleotider skal påsættes. - Bufferen er til stede for at holde ph konstant. - MgCl 2 danner kompleks med dntp, som interagerer med sukker-phosfat ryggen og har indflydelse på aktiviteten af Taq polymerasen. (McPherson & Møller, 2006, s. 66) - Taq-polymerasen er et enzym, der syntetiserer DNA. Enzymet anvender de frie nukleotider til at bygge videre på primeren med udgangspunkt i den overfor liggende template streng. (Theophilus & Rapley, 2002, s. 38) - Q-solution - Destilleret H 2 O Reaktionen foregår over 3 trin, som hver har en helt bestemt temperatur og dermed et helt bestemt formål. Se eventuelt afsnittet Temperaturprofilen side Denatureringen af DNA 2. Annealingen af primeren til DNA-template 3. DNA-syntesen (Theophilus & Rapley, 2002, s. 37) 10

12 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Figur 2. (Alberts, et al., 2004, s. 349) Figuren viser hvordan et dobbeltstrenget stykke DNA bliver til mange DNA-strenge under opformering vha. PCR-metoden. Det dobbeltstrengede DNA bliver til to enkeltstrenge ved opvarmning til ca. 95 C (denaturering). Herefter binder primerne til det specifikke stykke DNA, der ønskes opformeret, vha. nedkøling til C (annealing). De frie nukleotider, henholdsvis dgtp, ddtp, datp og dttp, bygges på 3 -enden af den bundne primer således, at der dannes en komplementær-streng til template-strengen (extension). (Egebo, 2004, s. 100) (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 138) Temperaturprofilen Et trin kommer førend de tre cykler i PCR-reaktionen. Enzymet Taq-polymerasen skal aktiveres. Dette trin kaldes Præ-PCR aktiverings trinnet og foretages således, at der varmes op til ca. 95 C i ca min. Dette trin skal samtidig sikre at DNA-strengene er helt adskilte. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 81) (McPherson & Møller, 2006, s. 11) Denatureringen af DNA et sker ved opvarmning til ca. 95 C i sek. Her går de to strenge fra hinanden og tillader derved, at der er plads til, at primerne kan hybridisere til template-strengene. Hydrogenbindingerne mellem baserne i DNA et bliver brudt og der dannes to enkeltstrenge. Annealingen af primeren til template-dna-stykket sker ved C. Annealingtemperaturens øvre grænse er bestemt af primer/template-duplexets smeltepunkt, Tm. Tm defineres som den temperatur, hvor hydrogenbindingerne i halvdelen af duplexmolekylerne er brudt, altså at halvdelen af primer/template-molekylerne er gået fra hinanden. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 85 og 138) Høj annealingtemperatur medfører en specifik amplifikation, men kan resultere i få reaktioner. Dette kan bevirke at hele amplifikationen af et stykke DNA ikke bliver tydelig nok når PCR-produktet visualiseres på en gel vha. gelelektroforese. Lav annealingtemperatur medfører risiko for uspecifik annealing. Kan resultere i en masse reaktioner, hvor mange af disse er underlagt fejlpriming. Her er risikoen høj for en stigning i antallet af uspecifikke reaktioner. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 82) 11

13 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 I praksis må annealingtemperaturen fastlægges empirisk (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 144), dog med en guideline, Tm, som regnes ud således; Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C) Denne formel tager dog ikke højde for en række faktorer, der spiller ind, når annealingtemperaturen skal fastlægges. Og netop derfor anvendes denne simple udregning ofte kun som guideline. Udregningen af Tm er også afhængig af koncentrationen af DNA-strenge, saltkoncentrationen og basesekvens. Forskellen på den empirisk fundne annealingtemperatur og den udregnede kan være over 15 C. (Yuryev, 2007, s. 16) Extension af DNA foregår typisk ved 72 C. Taq-polymerasen bygger videre på den bundne primersekvens med nukleotider, således at mål-dna et bliver kopieret. Varigheden af dette trin kan variere fra 20 til 60 sek. al afhængig af størrelsen af PCR-produkt og hvilken thermocykler, der er anvendt. Længere PCR-produkter kræver længere extensionstid. (Alberts, et al., 2004, s. 349) (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 144) (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 82) Den endelige extensionstid kommer efterfølgende. Denne gennemføres ved 72 C i 7-10 min. Antallet af cykler er afhængig af mængden af DNA fra starten og længden af Præ-PCR aktiverings trinnet. Anvendes min. ved 95 C i præ-pcr aktiverings trinnet, vil cykler være tilstrækkeligt for at få PCR-produkt i den ønskede mængde. (Innis, Gelfand, & Sninsky, 1999, s. 82) Plateaufasen Figur 3. (McPherson & Møller, 2006, s. 15) De tidlige cykler (E), De midterste cykler (M) og Plateaufasen (L) ses på figuren. Den eksponentielle opformering af mål-dna foregår i løbet af De midterste cykler og det er netop her, PCR-reaktionen bør stoppes. Fortsætter PCR-reaktionen ind i plateaufasen pga., at enzymet er optaget af at syntetisere og derved er i underskud, kan der opstå amplifikation af uønskede produkter, som er opstået ved en smule mispriming i de tidlige cykler i reaktionen. Dette forekommer dog oftest ved en reamplifikation af PCR-produkter. (McPherson & Møller, 2006, s. 17) (McPherson, Hames, & Taylor, 1995, s. 5-6) 12

14 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Gelelektroforese Separation af DNA-sekvenser vha. elektroforese er baseret på molekylernes længde og rummelige struktur under indflydelse af elektrisk potentiale. DNA består af nukleotider, der alle indeholder en fosfatgruppe, som i vandige opløsninger med ph over 3 er negativt ladede. De negativt ladede molekyler vandrer i gelen mod den positive pol. Den støbte gel er bygget op af et tredimensionelt netværk, som fungerer som et filter for DNA-molekylerne. Porerne i gelen tillader de mindste molekyler at vandre længst, hvorimod de større molekyler vil opleve mere modstand i gelen. Størrelsen af molekylerne i denne sammenhæng besluttes ud fra, hvor lange DNA-sekvenser der er tale om, altså hvor lange kæderne af nukleotider er. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 61) Primer design Primere skal designes efter, hvilket stykke DNA der skal opformeres. For at opnå optimalt fungerende primere, tages udgangspunkt i følgende; - Primernes længde bør være mellem nukleotider. - G/C-indholdet bør ikke være mindre end i det stykke DNA, der skal opformeres. Menneskers G/C-indhold er omkring 40 %. - Man bør undgå mange på hinanden efterfølgende A/T eller C/G nukleotider, da den optimale annealingtemperatur herved vil være forskelligt gældende fra den ene ende af primeren til den anden. Endvidere kan en 3 -ende med mange C/G nukleotider binde uafhængigt om 5 - enden binder. Dette kan føre til fejlpriming. - Man bør ligeså undgå komplementaritet mellem primerne, specielt 3 -enden, da dette kan føre til primer-dimer. Dette gør at primerne optager hinanden i stedet for at sætte sig på DNA et. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 146) Primer-dimer Disse nærmest udviskede bånd vil fremstå i bunden af gelen som nogle lyse pletter, hvis der er tale om primer-dimer. Disse molekyler løber meget længere på gelen end mål-sekvenserne, da primerne kun er ca. 20 basepar lange og ikke fylder lige så meget som de større molekyler. Primer-dimer kan enten forekomme ved, at de to primere sætter sig sammen eller ved, at en primer annealer til sig selv ved komplementaritet mellem basesekvenserne. (McPherson & Møller, 2006, s. 27) 13

15 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Figur 4. ( På figuren fremgår det, hvordan to forskellige primere i stor mængde annealer til hinanden. Ved extensions-trinnet i PCR-reaktionen syntetiseres to lige lange sekvenser. Derved opformeres primer-dimer-artefakterne i stedet for den ønskede nukleotid-sekvens. Hot star Taq-polymerasen og AmpliTaq Gold Hot star Taq-polymerase og AmpliTaq Gold er enzymer, som anvendes i forbindelse med syntesen af DNA ved anvendelse af PCR-metoden. Disse enzymer er varmestabile, hvilket bevirker, at der ikke skal tilsættes nyt enzym efter hver cyklus i PCR-reaktionen. Men ved høje temperaturer bliver enzymet langsomt inaktivt. Halveringstiden for inaktiveringen af Taq polymerasen er 5 min. ved 97,5 C, 40 min. ved 95 C og 130 min. ved 92,5 C. Enzymkoncentrationen kan varieres fra 5 til 50 U/mL. For meget enzym reducerer specificiteten og for lidt enzym gør udbyttet af reaktionen mindre. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 143 og 148) Forberedelse af DNA-template til sekventering - Oprensning af PCR-produkt - Sekventerings-PCR - Fældning Med henblik på sekventering af PCR-produkterne, skal template-strengene oprenses. Det vigtigste er fjernelse af primere og eventuelle primer-dimer-artefakter. Der skal bruges rene DNA-templates ved sekventering. Oprensningen sker vha. søjlemetoden, hvor DNA tilbageholdes i filteret pga. sin størrelse. Da der skal bruges mange rene template-kopier til sekventering, er en opformering af de oprensede PCR-templates nødvendig at foretage. Denne opformering kan udføres vha. en yderligere PCRmetode, hvor der anvendes specifikke primere, som ikke blandes sammen. Altså opsættes PCR-rør med en forward primer og pcr-rør med en reverse primer igen, dog adskilt. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 145 og 162) Princippet i fældning er at ethanol fjerner de polære vandmolekyler der ligger rundt om DNA. Positive Na + vil derefter kunne binde til ladede phosfatgrupper på polynukleotidet og derved fælder DNA ud. (Kielberg, Nørby, & Rasmussen, 2003, s. 48) 14

16 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Sekventering Sanger Princippet Figur 5. ( Sanger-sekventering kaldes også dideoxy-metoden og har til formål at bestemme sekvensen af DNA-fragmenter. DNA-syntesen foregår i rør inde i et apparat, hvori der foruden nukleotider, er tilsat en meget lille mængde af henholdsvis ddgtp, dddtp, ddatp og ddttp (dideoxynukleotider). Når disse 4 dideoxynukleotider tilfældigt sættes på den ny-syntetiserede DNA-streng, stopper reaktionen. Polymerasen er ikke i stand til at sætte yderligere nukleotider på dideoxynukleotider. Dette resulterer i mange DNA-strenge af forskellige længder. De 4 dideoxynukleotider er mærket med hver sit fluorescerende molekyle, som udsender hver sin farve, når de aktiveres. Inde i apparatet bliver produkterne kørt på en gel. De fluorescerende molekyler vil blive aktiveret vha. en laserstråle, når de passerer i gelen. Farverne, der udsendes, vil blive fanget af en detektor, der sender oplysningerne videre til en computer, som er programmeret til at omdanne farverne til baser. (Sørensen, Falkenberg, Gasbjerg, & Jensen, 2002, s. 217) Metodevalg og afgrænsning Prøvematerialet anvendt til dette forsøg stammer fra en biobank på Endokrinologisk Afdeling, Hvidovre Hospital (HH), hvor prøvemateriale fra en lang række patienter med diagnosen DMT2 er oplagret. Kriteriet var at patienterne skulle have en glukoseværdi på over 11 mmol/l i blodet. Hvis værdien på de ikke-fastende patienters prøver gentagne gange ligger over 11 mmol/l, regnes diagnosen derved som sikker. (Lyngbye, 2001, s. 193) Den anvendte metode PCR-metoden anvendes til, at kunne svare på problemformuleringen i dette projekt. Jeg har valgt, at udføre PCR-reaktioner efter en standard PCR-metode med anvendelse af Taq polymerase, som er 15

17 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 varmestabil og derfor ligger til grund for automatiseringen af metoden. Udgangspunktet for udførelsen af PCR-metoden er standardprotokollen på KBA Forskningsafdelingen, HH, som mangler optimering af flere parametre, hvis og såfremt der ikke viser sig at være produkt på gelen ved gelelektroforesen. Argumenterne for ændring af parametre, som har indflydelse på PCR-reaktionen, er diskuteret i afsnittet Diskussion på side 43. En optimering af de PCR-reaktioner, der ikke i første omgang gav et acceptabelt resultat er udført efter, hvad der fremgår af litteraturen og efter hvilke råd og vejledning, som KBA Forskningsafdelingen, HH har bistået med. Nyt primersæt til exon 6 Kriterierne for valg af nyt primersæt til exon 6 indtastes i programmet Primer3, som findes på webadressen: - Længden skal være mellem med en optimal længde på C/G-indholdet i primerne skal være % med et optimalt indhold på 50 %. Herefter finder programmet et sæt primere, der opfylder de valgte krav. Med egne øjne kigges på om der er komplementaritet mellem eller i de to primere således, at de to primere kan binde til hinanden eller sig selv. Komplementaritet bør undgås, da dette resulterer i en masse primer-dimerartefakter, der kan forstyrre opformeringen af det ønskede produkt. Ligeledes kigges på, hvor de to primere er placeret i forhold til mål-sekvensen. I dette tilfælde blev de placeret således, at de indkredser et område på ca bp. Dette skyldes at mål-sekvenserne for de andre exons i længde er indenfor disse grænser. Hvis der vælges længere mål-sekvenser, er det nødvendigt at optimere ud fra, at der arbejdes med amplificering af længere mål-sekvenser. Eksempelvis bør extensions-tiden sættes op i PCR-reaktionen. En anden observation der er nødvendig ved primerdesign er om Tm for hhv. primer forward og reverse ligger tæt på hinanden. Hvis ikke Tm er nogenlunde ens for de to primere, skal der anvendes to forskellige annealingtemperaturer. Dette er ikke hensigtsmæssigt, da arbejdet med PCR-reaktionerne derved kompliceres. Pilotforsøg Det første pilotforsøg der blev udført, omhandler det gamle primersæt til exon 6 og den manglende amplificering af dette exon. For at være sikker på at dette exon ikke var muligt at amplificere, udførte jeg en slags dobbeltbestemmelse for at se, om det alligevel kunne være muligt, at opnå en amplificering. Samtidig med at dette pilotforsøg udgør en dobbeltbestemmelse, var hensigten med forsøget også at kontrollere om der skulle være en af de to thermocyklere der ikke virkede. Derfor blev forsøget udført på 2 forskellige thermocyklere. De andre pilotforsøg, der blev udført, omhandler Exon 2 i prøve 293 og den manglende amplificering af denne prøve. Disse pilotforsøg blev udført på baggrund af råd og vejledning fra KBA Forskningsafdelingen, HH og ud fra hvad litteraturen siger om ændring af MgCl 2. I litteraturen fremgår det, at MgCl 2 er en vigtig parameter at optimere. Anvendelse af et andet enzym, AmpliTaq 16

18 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Gold til amplificering af denne prøve er udført ud fra, hvad KBA Forskningsafdelingen, HH rådede mig til at prøve efter den manglende amplificering af denne prøve, det pågældende exon. Optimering af PCR er en udviklingsproces. Mange steder i litteraturen beskrives der, at rækkefølgen og parametre der optimeres er op til den enkelte. Jeg har valgt at optimere parametre, der indenfor projektets naturlige tidsbegrænsning, samt den begrænsede mængde prøvemateriale, er mulige at optimere. Dette ligger til grund for, at ikke flere parametre er optimeret i dette projekt. 17

19 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Materialer og metode Retningslinjerne for arbejdet med PCR følges; God Laboratorie Praksis. Laboratoriet er opdelt således, at der arbejdes hhv. i et rent og et urent rum. Intet apparatur eller reagens må tages fra det urene til det rene rum. Handsker anvendes i alle rum, dog udskiftes disse ved udgang af et rum. Stativer mv., som efter brug skal tilbage til det rene rum, lægges i en spand 0,1 M HCl natten over og derefter til vask. Opsætning af PCR til dette forsøg foregår i flowbænken anført DNA og pipetter, hvorpå der er anført DNA, anvendes. Papirarbejde skal så vidt muligt foregå på kontorerne og ikke inde i laboratoriet. (Olsen, Ambye, Madsen, & Jäger, 2004, s. 6) Materialer Prøvemateriale Der er udvalgt 15 EDTA-stabiliseret fuldblodsprøver fra DMT2-patienter tilknyttet Endokrinologisk afdeling, Hvidovre Hospital (HH). Blodprøverne stammer fra Endobank, som er en biobank med blodprøver fra DMT2-patienter. Prøverne stammer fra anonymiserede patienter. Der er ikke adgang til informationer angående patienterne. Sekundært prøvemateriale til optimering af annealingtemperaturen Prøverne er ligeledes fra biobanken på Endokrinologisk afd., HH og indgår som sekundært prøvemateriale. Disse sekundære prøver anvendes til udførelse af temperaturgradienter ved optimeringen af annealingtemperaturen, samt ved afprøvning af større mængde DNA ved PCRreaktionerne, når disse reaktioner ikke forekommer. Disse prøver er blevet opbevaret på samme vis som det primære prøvemateriale og har ligeledes gennemgået samme behandling mht. oprensningen af DNA et fra fuldblod. Kvalitetskontroller Som intern kontrol på analyseserien, hver gang en PCR opsættes, anvendes et ekstra PCR-rør indeholdende H 2 O i stedet for prøvemateriale. Denne vandprøve medtages som kontrol på kontaminering af reagenserne. Hvis der er produkt i sporet for vandprøven ved udførelse af gelelektroforese, forkastes serien. Der er ingen ekstern kontrol på thermocyklerne, dog udføres service en gang årligt. Sekventeringsapparatet Genetic analyzer - ABI PRISM, 3130x indgår i to eksterne kvalitetsprogrammer; DEKS (Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring) og EMQN (European Molecular Genetics Network). (Olsen, Ambye, Madsen, & Jäger, 2004, s. 5) Reagenser, apparatur, primersæt og genet CerS6 Anvendte reagenser og apparaturer fremgår af Bilag 3. En oversigt over primerne fremgår af Bilag 5. En oversigt over hvor primerne er placeret i forhold til de 10 exons fremgår af bilag 6. 18

20 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra a Reinholt Nielsen 2009 Metode Figur 6. Denne figur er en oversigt over metoden i projektet. Temperaturgradienter opstilles Gelelektroforese udføres Vurdering af resultaterne af gradienterne PCR-reaktionerne udføres Gelelektroforese udføres Oprensning af PCRprodukter Ved manglende PCRprodukt, foretages en yderligere optimering Sekventerings-PCR udføres Fældning af sekvens-pcr 3 pilotforsøg udført Sekventering Tjek af oprensningen af PCRprodukter Design af nyt primersæt 6 19

21 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Temperaturgradienterne opstilles Den optimale annealingtemperatur for de anvendte primersæt, som er tilknyttet de 10 exons i CerS6- genet, står som første led i optimeringsproceduren. Opstil 7-8 forskellige PCR-rør med samme indhold i hver rør, altså Mastermix + prøve. Der anvendes her det sekundære prøvemateriale. Prøvenumre fremgår af Bilag 4. Indstil derefter Thermocykleren således, at temperaturen varierer med ca. 1-2 C fra PCR-rør til PCR-rør. Efter råd og vejledning fra KBA Forskningsafdelingen, HH, sættes temperaturen for de 10 temperaturgradienter til 60 ± 5 C. Gennemsnit af Tm for hver af de 10 primersæt anvendes kun som en guideline for, i hvilket område temperaturgradienten skal opstilles, dog ikke som endegyldigt facit på den optimale annealingtemperatur. Hvis og såfremt det ikke er muligt at finde en fælles annealingtemperatur, skal der stræbes efter at benytte så få forskellige annealingtemperaturer som muligt, da det er en ideel analysebetingelse at kunne udføre alle exons ved samme annealingtemperatur. Optimeringen udføres ud fra, at definitionen på den optimale annealingtemperatur bestemmes ved, at et tydeligt bånd fremgår af gelen efter udførelse af gelelektroforese og at der i nabosporet ikke må forekomme et spor uden PCR-produkt. Gelelektroforese udføres Efter opstilling af temperaturgradienter for primerne tilhørende de 10 exons, udføres en gelelektroforese for at kunne vurdere resultaterne. Elektroforesen udføres på en agarosegel, som fremstilles i laboratoriet fra bunden. Procedure for fremstilling af gelen, udførelse af en gelelektroforese og betjening af Image VDS Camera, se Protokol 2. Vurdering af resultaterne af temperaturgradienterne På billedet af gelen, hvorpå prøvematerialet fremgår som bånd, aflæses, hvor langt DNA er vandret. Dette gøres ved at sammenligne det fremkomne bånd med markøren, som udformer sig som en trappestige. Den opformerede mål-sekvens har et bestemt antal basepar, som er klarlagt, idet primerne er designet. Derved sammenholdes det kendte antal basepar med det aflæste. Dette gøres for at sikre, at det rigtige produkt er amplificeret. Den optimale annealingtemperatur vælges ud fra, hvilket bånd på gelen, der er mest klart og tydeligt afgrænset. Et kriterium for om et bånd vurderes til at repræsentere den optimale annealingtemperatur er, at der ikke må være tomt i sporet ved siden af det pågældende bånd. PCR-reaktionerne udføres PCR-reaktionerne udføres efter Protokol 1. Den tidligere fundne optimale annealingtemperatur anvendes, dvs. thermocykleren indstilles derefter. Der medtages en vand-prøve efter hver serie, indeholdende Master Mix + samme mængde H 2 O som der er prøvemateriale i foregående PCR-rør. 20

22 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Gelelektroforese udføres Produkterne fremgår af gelen, hvis og såfremt mål-sekvensen er blevet amplificeret i thermocykleren. Hvis et bånd viser sig ud fra det elektroforesespor tilhørende den brønd, hvori prøven er tilsat, kan oprensning af PCR-produkt udføres. Ved manglende produkt foretages en yderligere optimering Hvis ikke der fremkommer en visualisering af produkt på gelen efter PCR-reaktionen, følges optimeringstrinnene beskrevet i Protokol 3. Pilotforsøg Exon 6 (med gamle primersæt)blev ikke opformeret ved anvendelse af de udleverede primere til amplificering dette exon. Derfor blev et ekstra forsøg udført for at vurdere, om primerne virkede til opformering af det pågældende exon. Forsøget blev udført i henhold til Protokol 1 og Protokol 4. Se evt. Tabel 5 side 34. Prøven 293 exon 2 undergik 2 pilotforsøg, hvortil udførelsen er i henhold til Protokol 1 og Protokol 4. Se evt. Tabel 6 side 34. Design af nyt primersæt 6 Da exon 6 stadig ikke blev amplificeret, blev et nyt primersæt designet. Til design af nyt primersæt 6 anvendtes et computerprogram, Primer3, på webadressen: Oprensning af PCR-produkter Oprensningen udføres vha. et kit tilhørende laboratoriet; GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit. Dette trin udføres i henhold til Protokol 5. Sekventerings-PCR udføres Ud fra gelen, hvor PCR er udført tidligere, vurderes, hvor stor en mængde oprenset prøvemateriale, der skal tilsættes til rørene for netop at få opformeret en passende mængde DNA ved sekventerings- PCR. Hvis båndene på gelen er forholdsvis svage, tilsættes en smule mere prøvemateriale, end hvis båndene på gelen fra tidligere er meget tydelige. Er der derimod meget tykke bånd på gelen fra tidligere, tilpasses mængden af det oprensede prøvemateriale derudfra, således at der tilsættes en smule mindre oprenset prøvemateriale til rørene. Denne PCR udføres efter oprensningen, men vær opmærksom på, at cyklerne er anderledes designet end ved den almindelige PCR. Se Protokol 6. 21

23 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Fældning af sekvens-pcr Fældning af sekvens-pcr udføres efter Protokol 7. Sekventering Sekventeringen foregår i et sekventeringsapparat og har en varighed af ca. 2-3 timer, alt afhængig af, hvor mange prøver der sekventeres samtidig. Efter sekventering vurderes sekventeringen i programmet SeqScape, hvor de kortlagte sekvenser sammenholdes med kontrolsekvenser, som indeholder allerede kendte DNA varianter. 22

24 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 1. Hver gang der henvises til standardprotokollen fra KBA Forskningsafdelingen, HH, er det denne protokol der henvises til. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til amplificering af de 10 exons i genet CerS6. Standardprotokollen Fremstilling af PCR-produkt Der fremstilles en Mastermix-opløsning til n+1 prøve. Mastermixet indeholder alle reagenser undtagen DNA. Primerne skal fortyndes inden brug. Fabrikanten leverer primerne med en fast koncentration på 100 µm. Derfor fortyndes primerne 1:10 med H 2 O inden brug. Fremstilling af mastermix: Stock-koncentration Koncentration i 25 µl PCR µl mix pr prøve dntp 5 mm 0,2 mm 1,0 µl Primer 10 µm 0,5 µm 1,25 µl Primer 10 µm 0,5 µm 1,25 µl Taq 5 U/µl 0,5 U 0,1 µl 10x buffer 15 mm MgCl 2 1xbuffer + 1,5mM MgCl 2 2,5 µl MgCl 2 25 mm 1,5 mm 1,5 µl 5xQ Solution x1 5 µl H 2 O 11,4 µl DNA 50 ng/µl 3 µl I 0,2 μl eppendorfrør afpipetteres 25 µl mastermix + 3 µl DNA arbejdsopløsning 50 ng/µl. Rørene lukkes og anbringes i thermocykler til opformering. Thermocykleren indstilles til den, for PCR-produktet, bestemte optimale annealingtemperatur, tid (denaturering, annealing, extension) og antal cykler. Temperatur Tid Start, præ-denaturering 95 C 10 min. Denaturering 95 C 30 sek. Annealing bestemmes 30 sek. x35 Extension 72 C 70 sek. Slut, endelig extension 72 C 10 min. Hold 10 C forever 23

25 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 2. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH for udførelse af Agarose gelelektroforese. Gelelektroforese Gelkar Gel 1xTBE buffer Agarose Low melt agarose GelStar 10 x 20 cm 2 % 100 ml 1,0 g 1,0 g 15 µl Afvej henholdsvis 1,0 g Seakem agarose og 1,0 g low melt agarose i en 250/300 ml kolbe. Tilsæt 100 ml 1xTBE buffer som anført i tabellen og ryst kolben jævnt (undgå klumper). Kolben sættes i mikroovnen 2 min. og 15 sek., tænd ovnen på 650 W (indtil gelen koger). Når gelen koger, tages kolben ud og omrystes. Kolben med gel afkøles under rindende koldt vand eller stilles på bordet, til opløsningen når en temperatur der er ca C. Tilsæt fortyndet GelStar (fortyndet 1:10 med TBE-buffer) og omryst forsigtigt (undgå for mange luftbobler). Hæld gelen jævnt ud i en støbeform og sæt kammen i. Det er vigtigt, at gelen ikke er for varm, da kammen derved vil røre bunden af støbeformen og skabe hul helt igennem gelen. Gelen skal størkne i min. Fjern forsigtigt kammen og check, at brøndene er dybe og intakte. Støbeformen med gelen placeres i et bufferkar med 1xTBE buffer, som skal dække brøndene. (Skal den færdige gel ikke bruges med det samme, kan den opbevares i fugtighedskasse i køleskab). Der loades 5 µl PCR-prøve, samt vand-prøve + 5 µl GLM loadingbuffer pr. brønd. 5 µl molekylevægtsmarkør (fortyndet) loades i første og sidste brønd. Tilslut strømmen (check at strømmen vender rigtigt!). 135 V. Løbetiden er ca. 30 min. Gelen fjernes forsigtigt fra gelbakken og lægges over i bakken på Image Cameraet. Med indstilling 1 fås visuelt billede af de enkelte bånd. Hvis der er behov for at lade DNA vandre længere, kan gelen placeres i støbeformen igen og elektroforesen kan fortsættes i karret som før. Ved bortskaffelse af den aflæste gel anvendes den gule spand mærket "Gelstar Affaldsgruppe 2.22 B". Der tages billede af den færdige gel med Image VDS Camera. 24

26 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 3. Protokollen er udarbejdet ud fra hvilke parametre, der ændres på, ved manglende produkt på gelen efter forsøg på amplificering af de 10 exons. Procedurer for optimeringen af PCR-metoden, hvor annealingtemperaturen er fastlagt Optimeringen foregår ved forskellige ændringer af reagenser. Opstillingen af PCR-reaktionerne er udført i henhold til Standardprotokollen Fremstilling af PCR-produkt fra Protokol 1 side 23. a. PCR med 3µL DNA b. PCR med 4µL DNA c. PCR med 6µL DNA d. PCR med 1µL DNA + dobbelt Taq-polymerase e. PCR med 3µL DNA + dobbelt Taq-polymerase f. PCR med 6µL DNA + dobbelt Taq-polymerase g. PCR med 1 µl MgCl 2 h. PCR med 3 µl MgCl 2 i. PCR med 0,1 µl AmpliTaq Gold enzym j. PCR med 0,2 µl AmpliTaq Gold enzym Om b. eller c. vælges, afhænger af, om der er prøvemateriale nok til at vælge c. 25

27 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 4. Protokollen er udarbejdet efterhånden, som der ikke viste sig en amplificering af de pågældende prøver med de tilhørende exons. Der er taget udgangspunkt i hhv. hele exon 6 (1. Pilotforsøg) og prøve 293 exon 2 (2. og 3. Pilotforsøg). Pilotforsøg 1. Exon 6 kørt med sekundært prøvemateriale på 2 forskellige thermocyklere 2 x 3 reaktioner blev opstillet med hhv. primer 6 forward og 6 reverse (gamle primersæt). De anvendte prøver er en del af de sekundære prøver; numrene 2, 384 og 426. De to thermocyklere anvendt er fra hhv. Eppendorf og MJ Research. 2. MgCl 2 optimeringstrin g. og h. Dette pilotforsøg omhandler kun prøve 293 exon 2. Der blev taget udgangspunkt i Protokol 1 standardprotokollen til fremstilling af PCR-produkt. Koncentrationen af MgCl 2 blev derefter ændret. Der blev opstillet 2 reaktioner med hhv. 1 µl og 3 µl MgCl 2 i stedet for 1,5 µl. 3. AmpliTaq Gold enzym optimeringstrin i. og j. Dette pilotforsøg omhandler kun prøve 293 exon 2. Igen blev der taget udgangspunkt i Protokol 1 standardprotokollen til fremstilling af PCR-produkt. Et nyt enzym, AmpliTaq Gold blev her tilsat i stedet for Hot Start Taq-polymerase. Hhv. 0,1 µl og 3 µl blev tilsat. 26

28 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 5. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til oprensning af PCR-produkt vha. søjlemetoden. Denne metode indgår i forberedelsen til sekventeringen af prøverne. Oprensning af PCR-produkt vha. søjlemetoden Oprensningen af PCR-produkterne foregår i GFX 1 søjler indeholdende et filter, hvor DNA et, ved centrifugering, sætter sig fast og derefter vaskes/oprenses. Til sidst opsamles DNA i et eppendorfrør. Anbring GFX-søjlen i et opsamlingsrør (begge er fra oprensningskittet 2 ). Tilsæt 500 µl capture buffer til GFX søjlen. Påsæt PCR-opløsning til søjlen, dog højest 100 µl. Bland omhyggeligt ved at pipettere op og ned 4-6 gange. Centrifuger i en microcentrifuge ved G (fuld hastighed i ca. 30 sek.) Tøm opsamlingsrøret for det opsamlede væske og sæt GFX-søjlen tilbage i opsamlingsrøret. Tilsæt 500 µl wash buffer 3 til søjlen og centrifuger ved 2133 G. (fuld hastighed i ca. 30 sek.) Smid opsamlingsrøret væk og flyt GFX-søjlen til et rent 1,5 eppendorfrør. Påsæt 50 µl H 2 O (elution buffer) direkte til toppen af søjlen. Dette skal ske, således at hele filteret er dækket, men dog uden at røre filteret med pipetten. Lad søjlen stå i 1 minut ved stuetemperatur. Centrifuger ved 2133 G (fuld hastighed i ca. 1 minut) for at opsamle det oprensede DNA. Volumen af dette vil være omkring 40 µl. 1 Dobbelstrenget DNA fra 100 bp til 48 kbp kan oprenses. 2 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit. 3 Wash buffer en skal fortyndes før brug. Til flasken med wash buffer tilsættes 48mL 96 % ethanol. Bland opløsningen ved at vende flasken. Der noteres på låget, hvornår ethanol er tilsat. 27

29 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 6. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til amplificering af PCR-produkt, som forberedelse til sekventering. Sekventerings-PCR Mix pr. prøve BDT-mix (Big Dye Terminator v 3.1) Primer 1,6 pmol/μl milliq vand 5x seq buffer I alt 2μL 2μL 12μL 3μL 19μL Der tilsættes 1-2μL oprenset PCR-produkt. Program til thermocykler: På thermocykleren fra MJ Reseach hedder programmet TERMINATOR. 96 C i 1 min. 96 C i 10 sek. 50 C i 5 sek. x C i 4 min. 10 C forever 28

30 Optimering af PCR mhp. detektion af SNP er i CerS6 af Sandra Reinholt Nielsen 2009 Protokol 7. Protokollen stammer fra KBA Forskningsafdelingen, HH til fældning af sekvens-pcr. Denne metode indgår i forberedelsen til sekventeringen af prøverne. Fældning af sekvens-pcr Rørene sættes op i plaststativet i omvendt rækkefølge numerisk, da pladen Optical 96-Well Reaction Plate, som sættes i sekventeringsapparatet, er nummereret omvendt 1. Til PCR 20μL tilsættes 2μL Natriumacetat (NaOAc) 3M ph 5,2, og 50 μl 96 % ethanol. Mix på vortex-mixer og lad blandingen stå i 10 min. Centrifuger ved max hastighed i 30 min. Supernatanten suges fra. Vask pellet med 175μL 70 % ethanol. Mix på vortex-mixer. Centrifuger ved max hastighed i 5 min. Supernatanten suges fra. Tør pellet ved at placere rørene med åbne låg ved stuetemperatur, evt. i stinkskab. Prøverne opløses i 15μL H 2 O. (Prøverne kan også opløses i 15μL Hi Di formamid. Signalerne ved sekventering bliver højere, når prøverne er opløst i H 2 O, men holdbarheden er bedre ved opløsning i Hi Di formamid) 1 H G F E D C B A