Direkt Antihumanglobulin Test i forbindelse med hæmolyseparametre i diagnostikken af Autoimmun Hæmolytisk Anæmi

Transkript

1 Direkt Antihumanglobulin Test i forbindelse med hæmolyseparametre i diagnostikken af Autoimmun Hæmolytisk Anæmi Direct Antihumanglobulin Test together with hemolytic parameters for the diagnosis of Autoimmun Hemolytic Anemia [År] (Eget billede) Martin Tøffner Pedersen, Studienummer Ba12s005, Bioanalytiker Udd., Hold Ba13s, UCSyd Esbjerg 2016, Anslag: 65555, Vejleder: Grethe Bischke og Anja Dahlgaard Jørgensen Klinisk uddannelsessted: Biokemisk og Immunologisk Klinik- Immunologi, Aabenraa, Sygehus Sønderjylland

2 Indholdsfortegnelse 1.0 Abstract Introduktion Baggrund Formål Problemformulering Teori Autoimmun hæmolytisk anæmi Direkt Antihumanglobulin Test (DAT) Immunglobulin og Komlement Hæmolyse og Hæmolyseparameter Biovue system med Autovue Innova Biorad system Metode og Materiale Design Litteratursøgning Materiale Dataindsamling Databearbejdning Kvalitetssikring Etik Resultater Sammenligning af DAT metoderne uden hæmolyse parameter Sammenligning af DAT Biorad og hæmolyse parameter Kontrol af de kun i Biovue positive set over for hæmolyse parameterne Undersøgelse af procentmæssig fordeling af hæmolyseindikatorer Diagrammer over medianer og procentfordeling over for DAT i de forskellige grupper Diskussion Patienter positiv i IgG Patienter kun positiv i Biovue Problemer ved projektet Patienter positiv i C3d og/eller C3d+IgG Graduering af DAT Biovue forskelle i DAT og specifik DAT

3 5.7 DAT negativ AIHA Perspektivering Konklusion Referenceliste Bilag

4 1.0 Abstract Introduktion Autoimmun hæmolytisk anæmi er en anæmiform som diagnosticere bl.a. vha hæmolyseparameter og DAT. En lille andel af patienter diagnosticeres DAT negativ selvom de viser tegn på AIHA. Formålet med dette projekt er at undersøge et evt. sammenhæng mellem hæmolyseparametre og DAT resultat og samtidig undersøge to Metoder til DAT, Biorad og Biovue. Problemformulering Hvilken sammenhæng er der mellem den hæmatologiske patients hæmolyseprofil og resultatet af Direkte Antihumanglobulin Test målt med henholdsvis den manuelle metode i Biorad LISS/ Coombs gelkort og Autovue Innova i Ortho Biovue kassetter? - Hvordan kan en mulig sammenhæng mellem metoderne og hæmolyseprofilen anvendes til fastsættelse af en nedre klinisk relevant grænseværdi for Direkte Antihumanglobulin Test? Teori Der forklares nærmere hvad en AIHA er. Fordi de er vigtige i projektet forklares selve Antihumanglobulin testen og de fem hæmolyseparametre. I sammenhæng med de diagnostiske test kommes der også ind på Immunglobulin, Komplement og den deraf resulterende evt. hæmolyse. Til sidst kommes der ind på DAT testen udført med Biovue og Biorad. Metode Det er et pilotforsøg med aspekterne metodesammenligning af DAT analyse og en retrospektiv sammenligning af hæmolyseparametre over for DAT resultater. En stikprøve på 160 patienter blev opdelt efter grupper og in og eksklussionskriterier og der blev beregnet vægtet Kappa, median og procent fordelinger for derefter at sammenligne disse data. Til metoden tilhørte et interview med en hæmatologisk overlæge. Resultater Sammenligning af DAT metoderne gav en vægtet Kappa på 0,83. Beregning af medianer og procent fordeling viste en forskel i hæmoglobin fra patienter negativ i DAT og patienter positiv i DAT, men ingen ændring efter hvor stærk DAT var positiv. De andre hæmolyseparameter viste først en ændring ved de DAT stærk positiv. 3

5 Diskussion Meget tyder på at der er en gruppe af patienter som er DAT negative AIHA patienter som kun detekteres i Biovue. Så selvom der er problemer kunne det være en ide at undersøge nærmere om Biovue DAT på Autovue Innova skulle implementeres. Konklusion Der ses måske et sammenhæng, hvilket dog ikke er så troværdig, men alligevel viser der sig et billede som kunne tyde på at Biovue metoden kunne forbedre diagnostikken af AIHA pga formodet øget sensitivitet 2.0 Introduktion 2.1 Baggrund Anæmi, dvs. nedsat hæmoglobin niveau i blodet, kan være livstruende. Grunden er, at blodet ikke mere er i stand til at forsyne kroppens celler med ilt, hvilket fører til iskæmi og hypoksisk celleskade. Der findes mange former for anæmi, f.eks. jernmangel anæmi (produktions deficit) som den mest almindelige eller hæmolytisk anæmi (øget destruktion) som bl.a. kan være immunmedieret. (1,2) Immunhæmolytisk anæmi kan forårsages af allo-antistoffer, f.eks. ved Erytroblastosis føtalis eller som følge af transfusionskomplikationer. En anden årsag er autoantistoffer. I dette tilfælde danner kroppen antistoffer mod antigener på egne erytrocytter, som kan føre til autoimmun hæmolytisk anæmi (AIHA). Antistoffer og/eller komplement binder til erytrocytterne in vivo, hvilket kan betyde intra- eller ekstravaskulær hæmolyse. En serologisk metode til at diagnosticere om erytrocytter er in vivo sensibiliseret med antistoffer eller komplement er Direkt Antihumanglobulin Testen (DAT). DAT sammen med en grundig anamnese og blodprøver, som indebærer bl.a. biokemiske parametre, såsom haptoglobin, bilirubin, laktatdehydrogenase (LDH) og hæmatologiske parametre, såsom hæmoglobin og retikulocytter udgør den analytiske del af diagnosen AIHA.(3 5) 4

6 Aktuelt udføres DAT analysen i Danmark hovedsageligt vha. 2 forskellige, men principielt ens metoder, nemlig hæm agglutination vha. antihumanglobulin i matrix-fyldte brønde i plastikkort fra Biovue eller Biorad. Biorad gelkortet er i stand til at måle ned til 100 IgG molekyler per erytrocyt. For Biovue var der ikke information tilgængelig, hvad denne detektionsgrænse angår.(6) I Region Midt og Region Sjælland bruges Biovue CAT (Column Agglutination Test, søjleagglutinationskort), hvor analysen enten foregår vha. det automatiserede udstyr Autovue eller manuelt i Biovue eller Biorad.(7,8) På Biokemisk og Immunologisk Klinik Immunologi, Aabenraa, Sygehus Sønderjylland (BIK-I SHS) og hele Region Syd Danmark udføres DAT manuelt med Biorad gelkortet.(6,9) Flere undersøgelser viser dog, at der er en procentdel af patienter, som har en AIHA, men analyseres DAT negativ. Sachs et al (10) viser i deres studie at 3% at deres undersøgte patienter får et falsk negativt svar. Segel og Lichtman angiver 3-11%(11). Årsagen ses i antistoffets aviditet eller at det er IgM/ IgA, som ikke genfindes i en almindelig polyspecifik DAT. Men en anden årsag er de forskellige metoder der anvendes i verden og deres sensitivitets forskelle.(11) Et vigtigt spørgsmål, der rejser sig i den forbindelse, er, i hvor vidt de forskellige metoders sensitivitet er gode nok til det daglige analytiske rutinearbejde og hvis de ikke er, hvordan der kan rettes op på det. Et problem kan nemlig være, at man med analysen er enten for sensitiv eller ikke sensitiv nok, hvilket så fører til en for stor gruppe af falsk positive og falsk negative analysesvar. Det, man har fundet ud af, er, at alle mennesker har et vist antal af sensibiliserede antistoffer på deres erytrocytter og det har vist sig, at mængden af de sensibiliserede molekyler har betydning for, om denne tilstand udløser en hæmolyse. I artiklen Cut-off value of red-blood-cell-bound IgG for the diagnosis of Coombs-negative autoimmune hemolytic anemia har Kajii et al (12) vha. Immunradiometric assay (IRMA) fundet ud af, at der i gennemsnit er 33±13 IgGmolekyler/erytrocyt hos raske mennesker/donorer og at der ved personer med en DAT-negativ AHIA var ca. 133 molekyler/ erytrocyt og ved patienter uden AIHA ca. var 58 IgG-molekyler/ erytrocyt. Deres undersøgelse har så ført til, at de har fast sat en cut-off værdi ved 78,5 IgGmolekyler/ erytrocyt. Dvs. at sensibiliseringsdensiteten af IgG-molekyler på over 78,5 efter deres beregninger er betegnende for en AIHA. Garraty nævner i artiklen The Significance of IgG on the Red Cell Surface at Mery et al ved raske DAT negative personer har fundet et gennemsnit 5

7 på 39 molekyler/ erytrocyt, hvilket passer til det Kajii et al har fundet. Spredningen var dog fra 5 90 molekyler/ erytrocyt. Det betyder at der findes personer uden diagnosen AIHA med 90 molekyler/ erytrocyt. Det drejer sig dog ikke om mange.(13) Ser vi nu på cut-off værdien på 78,5 IgG molekyler/ erytrocyt og ser vi samtidig på, at man med almindelig glasteknik kan detektere ned til 200 sensibiliserede molekyler/ erytrocyt og i gelkort kan måle ned til 100 molekyler/ erytrocyt (Biorad)(6), så betyder det, at man har visse AIHA patienter, som ikke analyseres korrekt med disse teknikker, fordi de ligger lige under detektionsgrænsen. Dette understøttes af Sachs et al (10) med deres konklusion, om at der er ca. 3% af patienterne med AIHA, der er DAT negative. Segel og Lichtman (11) konkluderer at 3-11% af AIHA er DAT negative. Spørgsmålet her er om Biovue CAT er mere sensitiv end Biorad gelkort og dermed kan løse problemet. I form af et mindre projekt, hvor DAT rutineprøver blev analyseret med manuel Biorad og efterfølgende med Autovue Biovue, viste det sig, at Biovue systemet gav flere positive svar end Biorad systemet. Grunden til det formodes i en øget sensitivitet af Biovue systemet. Region Midt har tilpasset svarproceduren, fordi deres hæmatologiske afdeling forventede flere positive DAT svar. Mange patienter viser kliniske tegn på en autoimmun hæmolytisk anæmi dog har de en negativ DAT(5,10,11). I et interview med Overlæge Jacek Kieselevicz fra Hæmatologisk dagklinik, Aabenraa, Sygehus Sønderjylland, som blev afholdt i forbindelse med dette projekt, blev denne problemstilling diskuteret, hvilket overlægen synes kunne være interessant at få belyst.(14,15) Overlægen giver dog også udtryk for, at det ikke er klinisk relevant for dem med en positiv DAT uden hæmatologiske og biokemiske tegn på hæmolyse. Det betyder derfor ikke at generering af flere positive DAT svar løser problemet. Det er nødvendigt samtidig at se på hæmolyseparametre. For det første fordi det er det, der er vigtigt for klinikeren for at stille en diagnose og planlægge en adækvat behandling. For det andet er det evt. muligt at bedømme om DAT svaret er falsk eller sandt positiv/negativ. (14,15) 2.2 Formål I det følgende projekt vil vi udvide sammenligningen af Biorad og Biovue systemet, ved at medtage hæmolyseparametrene i vores analyse. 6

8 Formålet med projektet er at undersøge om der er en sammenhæng mellem hæmolyseparametere og DAT resultatet. En positiv DAT hos en patient, som ikke udviser hæmolyse, er klinisk irrelevant, fordi det er hæmolysen der skal behandles, som overlæge Jacek Kisielevicz nævner i et interview. (14,15) Derfor ville en sammenhæng mellem hæmolyseparametrene og DAT svaret specielt i de forskellige gradueringer, give mulighed for at bedømme den kliniske relevans af DAT svaret og gradueringen af denne. Der skal specielt ses på hæmolyseparametre for de patienter, som viser et negativt resultat i Biorad metoden, men svag positiv i Biovue metoden. Dette kan nemlig betyde, at det, pga. en øget sensitivitet af Biovue metoden, er muligt at diagnosticere patienter, som før evt. ville være falsk negativ. Ved at se på sammenligning af hæmolyseprofilen og DAT resultater og ved at sammenligne de forskellige DAT resultater fra Biorad og Biovue er det muligt at give et forslag om Biovue metoden burde implementeres. Resultaterne kan også danne baggrund for en evt. grænseværdi værdi, for hvornår en analyse svares ud som positiv. En grænseværdi ville evt. betyde, at man kunne implementere Biovue, men samtidig ikke ændre analysens sensitivitet kendt fra Biorad, hvis dette ønskes. Det ville betyde, at man kunne få øget patientsikkerhed ved minimering af menneskelige fejl og bedre økonomi gennem automatisering af analysen, men samtidig have samme analysebillede som med Biorad. På BIK-I SHS anvendes aktuelt som nævnt Biorad. Men fordi Autovue Innova allerede er implementeret på afdelingen til rutineanalyserne Blodtype, BAC, BF og Antistof-identifikation, så er der en oplagt mulighed for at skifte til Biovue systemet. 2.3 Problemformulering Hvilken sammenhæng er der mellem den hæmatologiske patients hæmolyseprofil og resultatet af Direkte Antihumanglobulin Test målt med henholdsvis den manuelle metode i Biorad LISS/ Coombs gelkort og Autovue Innova i Ortho Biovue kassetter? - Hvordan kan en mulig sammenhæng mellem metoderne og hæmolyseprofilen anvendes til fastsættelse af en nedre klinisk relevant grænseværdi for Direkte Antihumanglobulin Test? 7

9 2.4 Teori Autoimmun hæmolytisk anæmi AIHA er en form for anæmi hvor patientens erytrocytter hæmolyseres forårsaget af type II humorale immunreaktioner, dvs. antistof-/ komplement-medieret cellelyse.(16) Omkring 30% af de hæmolytiske anæmier i Danmark er autoimmune. 7% er såkaldt medicin inducerede og kan serologisk ikke skelnes fra den autoimmune, fordi medicinen vha. forskellige principper binder antistoffer til erytrocyttens cellemembran ved f.eks. at fungere som hapten. AIHA kan opstå idiopatisk/primær eller symptomatisk/sekundær til en anden sygdom. Disse sygdomme kan være lymfoproliferative, infektiøse eller autoimmune.(17,18) Man skelner sygdommen i varm AIHA (waiha), kold AIHA (caiha) eller bifasisk. I waiha betyder, at antistofferne, der er involverede, har deres temperatur optimum ved 37 c. Ved caiha betyder, at antistoffernes temperatur optimum er under 30 c. Incidensen for waiha er 1: og incidensen for caiha er 1: Den bifasiske Type, som indebærer, at bindingen til erytrocytten sker ved lav temperatur og aktiveringen/hæmolysen først ved højere temperatur, er meget sjælden. (4) Ved en waiha er antistoffet som binder til erytrocytten for det meste af IgG karakter og ved en caiha af IgM karakter. De forskellige IgG subtyper samt IgM adskiller sig fra hinanden, mhp. deres Effektivitet til at aktivere komplementsytemet. Det kan have betydning for, hvordan hæmolysen forholder sig ved patienten. Den autoimmune reaktion kan nemlig forårsage intra- og ekstravaskulær hæmolyse. Intravaskulær hæmolyse betyder destruktion af erytrocytter i blodbanen. Destruktionen sker ved at komplementsystemet aktiveres fuldstændig og danner membran angrebs komplekset (MAC) på erytrocytmembranen, hvilket fører til perforering af membranen med efterfølgende cellelyse (se afsnit om komplement). Resultatet af denne hæmolyse er, at erytrocytternes indhold, som bl.a. hæmoglobin, fordeles i blodet som frit hæmoglobin. Det kan ses som rødfarvning af plasma. Ekstravaskulær hæmolyse forgår derimod i milten eller leveren. Her er det retikuloendotheliale system (RES), i form af fagocytter, som nedbryder erytrocytterne. RES er en normal og vigtig 8

10 proces i raske mennesker. Det er her de ældre og slidte erytrocytter nedbrydes. Ved waiha er problemet dog, at raske og vitale erytrocytter, pga. sensibiliseringen med IgG, nu er markeret til at blive nedbrudt. Det sker fordi IgG Fc-delen demaskeres efter sensibiliseringen til en erytrocyt. Makrofagerne kan nu vha. deres Fc-receptorer (FcγRI CD64, FcγRII CD32 und FcγRIII CD16) skabe kontakt og fagocytere cellen. Denne nedbrydning af erytrocytter kan således opnå et omfang, som knoglemarven ikke kan udligne med egen ny produktion, hvilket resulterer i en anæmi.(2,16) Diagnosen af AIHA stilles på baggrund af en grundig anamnese og ikke mindst Blodprøver. På Tabel 1 ses en standard prøve pakke i AIHA udredningen.(3,4) Tabel 1 viser opstilling af de forskellige analyser der anvendes ved diagnostik af AIHA.(11) Blodprøver ved diagnostik af Autoimmun hæmolytisk anæmi Hb, Ret#, LDH, Bili, Hapt. MCV, Lkc+Diff, Trc DAT, KAT, Donath-Landsteiner-Test Perifert udstryg ANA, ANCA Levertal, væsketal, B12., Folat HIV, EBV, CMV, Parvovirus B-19 Der ses typisk på hæmolyseparametre som ses i Tabel 1 (19) øverst første linje, hvilket er parametrene som også nævnes i de fleste artikler. Er der tegn på hæmolyse udføres DAT analysen. Er denne positiv er det stor sandsynlighed for at det drejer sig om en immunmedieret hæmolytisk anæmi Direkt Antihumanglobulin Test (DAT) Robin Coombs fandt i 1946 ud af, at man vha. antihumanglobulin (AHG) reagens kunne påvise, at erytrocytter var sensibiliseret med et antistof, hvilket førte til den direkte antihumanglobulin test (DAT) også kaldt for direkte coombs test, som kan påvise sensibiliseringen af erytrocytter.(5) DAT bruges ved anæmiudredning for at kontrollere, om patienten har en immunhæmolytisk anæmi. Den udføres ved nyfødte med formodning om Erytroblastosis foetalis og ved 9

11 transfusionskomplikationer eller AIHA. Dvs. situationer, hvor det er afgørende at finde ud af, om patientens erytrocytter er sensibiliserede eller ikke. (5,9) Testens princip har ikke ændret sig over de sidste mange år, den er dog blevet moderniseret fra at bruge glasteknik til søjleagglutinationsteknikken. Det vigtigste reagens, der bruges, er stadig antihumanglobulin (AHG), som er et antistof mod humant antistof, dvs. et såkaldt anti-antistof. Det fremstilles ved at injicere humanglobulin i kaniner, som så danner antistof mod humanglobulin. Det oprenste antistof fra kaninernes blod, er de vi senere hen bruger i laboratoriet som AHG.) Ud over AHG kan der være forskellige forstærkende og konserverende stoffer i de forskellige søjleagglutinationskort. Det kan være bovint albumin og dextran, som de makromolekylære forstærkere og natriumazid til bedre holdbarhed. Dette er oftest opløst i lav ionstyrke saltvand (LISS). Derudover skal blodprøven, som bruges til DAT, være EDTA stabiliseret for at undgå in vitro aktivering af komplementsystemet.(20 23) Selve reaktionen man ønsker ved DAT ses i Figur 1(16). Der fremstilles en suspension af patientens pakkede blodlegemer i Cellstab eller phosfat buffret saltvand (PBS), som derefter afpipetteres til brønden i søjleagglutinationskortet. DAT er positiv, når patientens erytrocytter er in vivo sensibiliseret med IgG og/eller C3d/C3b, dvs. at immunglobulinerne allerede er bundet til erytrocytterne i blodbanen. (20,22) Figur 1 viser reaktionen ved en DAT. Fra at der helt til venstre sker en in vivo senibilisering af erytrocytterne og til højre sker hæmagglutinationen in vitro vha AHG. (16) Er suspensionen afpipetteret til brønden i kortet giver makromolekylære forstærkere, som bovint albumin, erytrocytterne mulighed for at komme nærmer til hinanden. LISS betyder, at erytrocyttens zetapotentiale nedsættes og antistoffer bedre kan bindes, hvilket øger antigenantistof (Ag-Ab) reaktionens hastighed. (5) I en brønd, specifik DAT for IgG, kan AHG, som i dette tilfælde er specifikt for IgG-gammakæden, lave tværbindinger mellem erytrocytterne. Det sker, ved at AHG s hypervariable domæne i antistoffets Fab-del er specifikt for den antigene determinat, som i dette eksempel er IgG s gammakæde. Disse Ag-Ab reaktioner udgør, på 10

12 baggrund af de dannede erytrocyttværbindinger, hæmagglutinationen, som kan ses som et positivt resultat i brønden. Ved en DAT negativ person, er der ingen sensibilisering, som antages for at være patogen og den positive reaktion, dvs. den for os synlige hæmagglutination, vil udeblive. Fremgangsmåden på laboratoriet er typisk følgende: Det første, der analyseres ved en DAT, er om erytrocytter generelt er sensibiliserede med enten et IgG-antistof og/eller komplement i form af produkterne C3d eller C3b. Denne analyse betegnes som DAT og er denne test negativ, så er analysen færdig og der svares ud, at personen er DAT negativ. Er testen positiv, betyder det, at der er sensibiliserede erytrocytter til stede. Det vil så sige, at den polyspecifikke test er positiv og at der nu udføres en supplerende monospecifik test eller en såkaldt specifik DAT for at undersøge, hvad erytrocytterne er sensibiliserede med. I modsætning til den polyspecifikke DAT, hvor man kun testede med en brønd for generel sensibilisering, så har man ved den specifikke DAT 3 brønde (IgG, C3d/C3b og Ctl). En brønd der indeholder anti-igg, en med anti-c3d/c3b og en kontrolbrønd uden antistof. Så alt efter hvor i brønden der ses en positiv reaktion, betyder det en sensibilisering med IgG og/eller C3d/b. Kontrolbrønden skal være negativ, for at testen er gyldig. Følgende billede i et Biovue CAT kort (se Figur 2) kan ses efter, at kortet er centrifugeret. Er prøven negativ vil man se, at erytrocytterne er centrifugeret gennem kortets matrix og dermed ligger i bunden af brønden, som det ses på Figur 2, tredje brønd fra venstre. 11

13 Figur 2 Viser et polyspecifikt søjleagglutinations kort fra Biovue til brug ved Autovue Innova. Til venstre ses hele kortet og til højre er reaktionerne i brøndene forstørret for at vise forskellige reaktioner. I brønden helt til højre er der ikke til at erytrocytsuspension. I den anden brønd fra højre ses en negativ reaktion fordi alle erytrocytter er centrifugeret gennem matrix. Tredje brønd fra højre viser en 3+ reaktion og helt til venstre ses en 1+ reaktion. De sidste to brønde viser dermed at erytrocytter er tværbundet vha. AHG og som resultat på det kunne de ikke centrifugeres ned til bunden af brønden fordi disse større komplekser stoppes af matrixen som i dette tilfælde er glas kugler. (Eget billede) Er prøven derimod positiv, vil erytrocytterne ikke være centrifugeret helt igennem søjleagglutinations kortets matrix. Alt efter graduering af DAT reaktionen ses erytrocytter i forskellige højder og sammensætninger i kortet som i Figur 2, hvor der i første brønd til venstre ses en 1,5 plus positiv reaktion og en 3 plus i brønden ved siden af. Vigtigt at nævne til sidst er, at selvom der bruges søjleagglutinationsteknik i både Biorad og Biovue, så fungerer aflæsningen. Dvs. at det kræver nøje træning, når der skiftes fra det ene til det andet system, hvilket Kent Elkrogh ansat i Ortho Clinical Diagnostik påpeger i et møde.(24) Den specifikke DAT bruges til at afgøre, om det er en waiha eller caiha. Er den specifikke DAT positiv i IgG eller IgG + C3d så det er det med stor sandsynlighed et varmeantistof. Er den specifikke DAT kun positiv i C3d er der stor sandsynlighed for, at det er et kuldeantistof af IgM typen, der har aktiveret komplementsystemet.(5) Immunglobulin og Komlement Immunglobulin Immunglobuliner er proteiner som udgør kroppens antistoffer. Ud over de naturlige antistoffer som anti-a og anti-b, som man har fra ca. 1. leveår, så produceres antistoffer af B-celler. 12

14 B-celler har den såkaldte B-celle receptor (BCR) som er antistof (Ig) som med Fc delen er bundet til B-celle overfladen og Fab delen, som den antigen genkendende del, ud ad til. I starten når B-cellen er umoden og stadig befinder sig i knoglemarven producerer den kun antistof af IgM karakter. Aktiveres den, ved at den møder antigenet som BCR kan binde til, vha. antigen præsenterende celler (APC) og CD4+ Th-celler begynder den at producere IgG eller IgA/ IgE. B- cellen kan også selv genkende antigen og har dermed ikke absolut brug for en APC, men den har stadig brug for kostimulation af Th-cellen. Efterkommerne til disse aktiverede B-celler, som har optimeret deres BCR bindingsevne, udvikler sig til de antistof producerende plasmaceller som så kan producere f.eks. IgG med en øget specificitet end IgM antistoffet der blev dannet i starten.(25) Figur 3 viser opbygningen af de forskellige Immunglobulinklasser som monomer, dimer og pentamer. (16) Immunglobuliner (Ig) opdeles i fem klasser og opbygges af tunge og lette kæder. De lette kæder kan enten være kappa eller lambda og har en molekylvægt på ca Dalton. De tunge kæder, som er varierende i deres molekylvægt, kaldes hhv. gamma for IgG, my for IgM, epsilon for IgE, delta for IgD og alfa for IgA. IgG, IgE og IgD er monomere og har en Y- formet struktur. IgA kan være monomer eller dimer, bestående af to Y-formede strukturer. IgM er en pentamer opbygget af fem Y-formede strukturer (se Figur 3), findes dog også som monomer.(16) Et monomert antistof som IgG, opbygges af to tunge kæder (gamma-kæder) og to lette kæder af enten kappa eller lambda dog aldrig begge former i samme antistof. De lette og tunge kæder i immunglobulinet holdes sammen af disulfidbroer. IgG kan opdeles i Fab-delen og i Fc-delen. Fc-delen er den del hvortil antihumanglobulin, komplement faktor C1q eller fagocytter med de forskellige Fcγ-receptor, binder til. Fab delen er regionen som binder til de antigene determinanter. 13

15 Antistoffets lette og tunge kæder kan inddeles i den såkaldte konstante og variable del. Fab-delen består således af den lette kædes variable og konstante del plus halvdelen af den tunge kæde med en konstant og variabel del. De lette og tunge kæders variable del udgør antistoffets variable domæne (Fab). Det er den hypervariable del af domænen, der har betydning for hvilket antigen antistoffet kan binde til. Helt præcis betyder det, hvilken specificitet det pågældende antistof har. Den konstante del af den tunge kæde i Fab-delen bindes sammen med Fc-delen vha. af hængsels regionen. Fc-delen består udelukkende af den tunge kædes resterende konstante domæner (se Figur 4).(16) De to immunglobulinklasser, som er vigtige i forbindelse med dette projekt, er IgG og IgM, som i det følgende vil blive gennemgået i detaljer. IgM tilhører gruppen af de komplette antistoffer eller selvagglutinerende. Dvs. at antistoffet alene kan føre til hæmagglutination i et saltvandsmiljø. Grunden til det, er at IgM med sin store molekylstruktur kan danne tværforbindelser mellem erytrocytter. Ud over disulfidbroerne holdes molekylet sammen af J-kæder.(16,25) IgM antistoffer vil for det meste være den form kuldeantistoffer ses i, hvilket betyder at de i DAT analysen detekteres vha. C3d/C3b, fordi de aktiverer komplementsystemet. Kuldeantistoffers affinitet er stigende fra 32 mod 4 C. (17) I et immunrespons dannes IgM antistoffer først og dernæst produceres IgG, som det specifikke modsvar. IgG antistoffer er de inkomplette antistoffer, fordi de ikke, som IgM, er selvagglutinerende. Pga. deres mindre struktur kan de ikke nå over den strækning, som erytrocytter ligger fra hinanden pga. deres zeta-potentiale. Derfor er det nødvendig at bruge AHG i den indirekte og direkte agglutinationsteknik ved analysearbejdet. IgG er overvejende varmeantistoffer og dannes efter antigeneksponering. Deres Temperaturoptimum ligger ved 37 C. Figur 4 viser opdeling af monomert Immunglobulin i konstant del (c), variabel del (v), tunge (H) og lette kæder(l). Disulfidbroer og hængsel regionen kan også ses. (16) 14

16 IgG opdeles i de fire forskellige subklasser IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4, alt efter hvor mange disulfidbindinger de har i deres hængsels region. De forskellige subklasser har f.eks. betydning for, hvor gode de er til at aktivere komplement. Her kan det siges, at IgG3 er bedst til aktivere komplement efterfulgt af IgG1 og IgG2. IgG4 aktiverer ikke komplement.(16) Komplement Komlementsystemet består af ca. 20 plasmaproteiner, som tilregnes det innate immunsystem, og har til opgave at danne membran angrebs komplekset (MAC), opsoniner og anafylatoksiner. Dette sker i form af tre forskellige aktiveringsveje, den klassiske, lektinmedierede og alternative aktiveringsvej. Dannes MAC, betyder det, at komplementsystemet er aktiveret fuldt. Komplement kan dog også delvis aktiveres. Det betyder at cellen eller erytrocytten kun markeres (opsonisering) og derved kan nedbrydes af fagocytter med C3-receptorer i leveren.(16,26) I det følgende vil jeg komme nærmere ind på den klassiske aktiveringsvej, fordi denne form af komplementaktiveringen typisk sker ved at plasmaproteinet C1 binder til antistof, som er bundet til et antigen (f.eks. blodtypeantigen), og herved udløser en kaskadereaktion. Figur 5 viser den klasiske aktiveringsvej af komplement kaskaden. (16) 15

17 C1, som består af C1q, C1r og C1s, binder med dens tulipanlignende hoveder (C1q) til domæner på IgG eller IgM, som så blotlægges, når antistoffet binder til antigenet. C1q aktiverer C1s, som spalter C4 til C4a og C4b, som kan binde til overfladen af cellen eller bakterien. Det antigenbundne C4b binder C2, som af C1s spaltes til C2a og C2b. C4b og C2a danner et kompleks, som er lig med den klassiske C3 konvertase. Denne konvertase spalter C3 til C3a og C3b, hertil skal nævnes at C3d er det terminale spaltningsprodukt af C3b og begge er bundet til celleoverfladen.(26) C3b danner så kompleks med C4bC2a til C4bC2aC3b, som er lig med den klassiske C5 konvertase. Når C4bC2aC3b spalter C5, bliver det til anafylatoksinet C5a og C5b, som er en del af MAC. Fordi C5b er løst bundet til C5 konvertasen, kan den binde C6 og C7 og efter dissocieringen fra C5 konvertasen kan C5bC6C7 binde til cellemembranen. Nu binder C8 til C5b og gennemborer membranen. Til sidst bindes op til 18 C9-molekyler, som danner en kanal i cellemembranen, og vha. udskifting af vand og ioner forårsager cellelyse (se Figur 6).(16) Figur 6 viser hvordan membran angrebs komplekset (MAC) opbygges, hvilken medfølger perforering af cellemembranen. (16) Hæmolyse og Hæmolyseparameter Hæmolyse Hæmolyse betyder nedbrydning af erytrocytter, hvilket fører til frit hæmoglobin i blodet. Alvorlig hæmolyse ses i rødfarvning af patientens plasma. Rødfarvningen kommer fra det jernholdige hæmoglobin fra de nedbrudte erytrocytter. Erytrocytterne nedbrydes vha. MAC induceret cellelyse MAC eller fagocytering. MAC, som er det sidste step i komplementkaskaden perforerer erytrocytmembranen. Pga. den osmotiske trykforskel mellem erytrocytten og plasma trækkes væske ind i erytrocytten og den sprænges.(16) 16

18 Fagocytering af erytrocytter sker vha. makrofager i lever og milt. Milten er dog 100 gange mere efficient end leveren i nedbrydningen af celler.(5) Nedbrydningen sker ved at erytrocytten markeres med IgG eller C3b/C3d. Makrofager binder disse markerede erytrocytter med deres receptorer C3R og FcγR. Efter at have etableret bindingen til den sensibiliserede erytrocyt fagocyteres denne af makrofagen.(16,25) Hæmolyse er en normal proces i kroppen. Det er den måde kroppen kommer af med de gamle og slidte erytrocytter. Disse erytrocytter har dannet det såkaldte SCA antigen og fordi alle mennesker har anti-sca i plasma så markeres disse erytrocytter og nedbrydes. Men hæmolysen kan også være pathogen, nemlig når raske celler nedbrydes og det i en hastighed som overstiger den røde knoglemarvs evne til nydannelse af blodlegemerne. Hæmolyse frisætter mange stoffer som før har været bundet i cellen. Hæmolyseparametre På baggrund af projektet vil dette kapitel omhandle hæmolyseparametrene P-haptoglobin, P- laktatdehydrogenase og P-bilirubin samt de hæmatologiske parametre B-hæmoglobin og B- retikulocytter. Hæmoglobin nedbrydes og genanvendes af kroppen og det betyder at andre stoffer krydsreagerer, som f.eks haptoglobin der binder frit hæm, hvilket betyder at haptoglobin koncentrationen falder. Ved nedbrydning af hæmoglobin i makrofager dannes bilirubin hvilket kan spores som forhøjet ved hæmolyse. LDH, som er til stede i erytrocytter, kan også spores som for høje Sammen kan disse parametre give information om en evt. igangværende hæmolyse. I forskellige artikler, bl.a. Autoimmun hæmolytisk anæmi en kort oversigt Sprogøe & Birgens og Autoimmunhämolytische Anämi eine diagnostische und therapeutische Herausforderung af Zeerleder, som omhandler AIHA og dens udredning, nævnes samme parametre.(3,4) 17

19 Se i Tabel 2 for reference intervaller, analyse usikkerhed, måleapparatur og indikation for de 5 hæmolyseparametre.(27 31) Tabel 2 viser reference intervaller, analyse usikkerhed, måleapparatur og metode samt indikation for B-Hæmoglobin, B- Retikulocytter, P-LDH, P-Billirubin og P-Haptoglobin. Analyse B-hæmoglobin(Fe); Stofk. B-retikulocytter; Antalk. P- haptoglobin; Massek. P- billirubiner; Stofk. P- laktatdehydrogenase; Kat.k. Reference Interval Kvinder >18 år 7,3-9,5 mmol/l Mænd >18 år 8,3-10,5 Kvinder >18 år x 10 9 /L Mænd >18 år x 10 9 /L 0-50 år 0,35-1,85 g/l >50 år 0,47-2,05 g/l Analyse Målemetode Usikkerhed /apparatur 3% Fotometri /Sysmex XN9000 7% 4% >1 år 5-25 umol/l 4% år U/L >70 år U/L 4% /Sysmex XN9000 Immunturbidimetrisk analyse /Cobas 8000 Modul c 702 Kolorimetrisk Diazometode /Cobas 8000 Modul c 702 UV-Analyse (Fotometri) /Cobas 8000 Modul c 702 Indikation Anæmi udredning. Høje værdier som følge af polycytæmi også pga. dehydrering Mål for erytropoiesen. Forhøjet ved akutte / kroniske blødninger og hæmolytiske og andre tilstande grundet nedsat erytrocyt levetid. Akut-fase-reaktant. Nedsatte værdier ved levercirrose og østrogenbeh. Øget værdier ved kortikosteroid og androgen beh. Lave værdier ved intra- og ekstravaskulær hæmolyse Forhøjede værdier ved perniciøs og hæmolytisk anæmi, erytroblastosis føtalis og resorption af større hæmatomer. Herudover ved hepatobiliære sygdomme.. Øget ved Cellehenfald pga f.eks. iskæmi, malignitet, stase, inflamation B-Hæmoglobin (B-Hb): B-Hb betegner det hæmoglobin, der er bundet i en persons erytrocytter. Hæmoglobin er et molekyle bestående af et alfa- og beta-protein, som hver indeholder to hæmgrupper. Dermed er 18

20 der i alt 4 hæmgrupper, som hver binder Fe2+, som er den ilt-bindende del af hæmoglobin. Lav B-Hb kan være et tegn på forskellige slags anæmier, såsom jernmangelanæmi og megaloblastær. Lav B-Hb pga. immunhæmolytisk anæmi er ensbetydende med en nedsat erytrocytlevetid ved immunmedieret hæmolyse.(31,32) B-Retikulocytter (B-Ret): B-Ret angiver antallet af retikulocytter i en given person. Retikulocytter er et udviklingsstadie af den modne erytrocyt, som stadig har kernefragmenter i cytoplasma. Retikulocytter er lidt større end erytrocytter og initialt beliggende i knoglemarven indtil de gennem sinusoiderne vandrer til blodbanen. Ved hæmolytiske anæmier vil antallet af retikulocytter i blodbanen være forhøjet og graden af retikulocytose kan være betegnende for hæmolysens sværhedsgrad.(31) P-Bilirubin (P-Bili): Høje P-Bili værdier kan ses ved lever/galdesygdom og specielt i forbindelse med hæmolyse af forskellig årsag. Man kan dog differentiere yderligere, ved at kigge på konjungeringen af bilirubin. Når hæmgrupper nedbrydes af makrofager frisættes den unkonjugerede, hydrophobe form af bilirubin til blodbanen. Denne bindes reversibelt til albumin og transporteres til leveren. Konjungeringen af bilirubin sker i hepatocytterne, hvorved det bliver vanopløseligt og kan udskilles via galden ti mavetarmsystemet, hvilket giver vores afføring dens brune farve. En utilstrækkelig udskillelse via galden, f.eks. ved en akut galdestase, kendetegnes således af kit farvet afføring og kompensatorisk porterfarvet urin, pga. den øgede udskillelse af bilirubinnedbrydningsprodukter, såsom urobilinogen via urinen, som normalt kun indeholder meget lave koncentrationer.(31) P-Laktatdehydrogenase (P-LDH): P-LDH findes i alle kroppens celler. Derfor vil cellehenfald af alle celler give forhøjede P-LDH værdier. P-LDH kan inddeles i fem forskellige isoenzymer, LDH 1-5. Erytrocytter indeholder LDH 1 og LDH 2. Ligesom i skelet- og hjertemuskulatur samt nyre-, hjerne- og leverceller, så er der stor LDH-aktivitet i erytrocytterne, hvilket betyder at LDH er en god, men ikke særlig specifik hæmolyseparameter. Yderligere kan den være falsk forhøjet pga. insufficiente, præanalytiske forhold, såsom dårlig blodprøvetagningsteknik. Der skal også tages til eftertragtning, at P-LDH værdier genspeiler alle isoenzymer, således kan P-LDH være høj også uden at der er hæmolyse, f.eks. ved et AMI.(29,30) 19

21 P-Haptoglobin (P-Hapt): P-Hapt er et akut-fase-protein, hvilket betyder at der ses høje værdier ved inflammation. Derudover kan lave værdier bruges udredningen af hæmolyse. Det betyder dog, at de nævnte processer kan udligne hinanden og give falsk normale værdier. Det meste af hæmoglobinmolekylet fra nedbrudte erytrocytter nedbrydes i makrofagerne, men en del af molekylet bliver omdannet til frit hæmoglobin. Haptoglobin binder det frie hæmoglobin, som så elimineres i leveren.(31) Biovue system med Autovue Innova Biovue er et søjleagglutinationskort-system fra firmaet Ortho Clinical Diagnostic. I Biovue bruges 8 µm store glaskugler som matrix (de resterende indholdsstoffer kan indses i materiale afsnittet). Det kan bruges til manuel analyse med tilhørende redskaber eller automatiseret vha. en Autovue Innova eller Autovue Vision maskine til bl.a. DAT og specifik DAT. (24,33) Figur 7 viseret centrifugeret polyspecifik og specifik DAT Biovue kort. (Eget billede) Autovue Innova kontrollerer vha. en stregkodelæser, at det er den korrekte prøve og hvad der skal udføres. Samtidig kontrollerer maskinen med stregkodelæseren, at det rigtige Biovue kort bruges samt holdbarheden. Til Biovue DAT kortene bruges der kun lidt materiale. Der tilsættes 10 mikroliter af en 3,5% Suwasol-patient erytrocyt suspension til hver brønd. Pga. maskinens time management beregnes den hurtigst mulige analysetid uden at andre analyser, der køres samtidigt forstyrres. En DAT analyse på Autovue Innova tager minimum 6 minutter fra start til slut. 20

22 Centrifugering sker i to faser. I første fase (2 min) separeres erytrocytterne, for derefter i anden fase (3 min) at blive centrifugeret gennem matrixen. Aflæsning sker vha. et CCD kamera og IPS software algoritme. Autovue Innova`s IPS software er oplært ved at mange, erfarne bioanalytikere har aflæst og gradueret reaktioner ud fra billeder, hvilket er samlet til et stort archiv, som IPS software gør brug af. (24,34) Aflæsning foregår så, ved at Autovue Innova laver 3 billeder per side, 2 brønde per billede. Brønden der skal aflæses skæres digitalt ud af softwaren og deles op i 5 zoner: P-neg, 1, 2, 3 og P-pos. Der måles nu 20 punkter, som hver for en talværdi, som bedst kan forklares ved at jo mørkere punktet på billedet er, desto højere er talværdien, der tildeles. Der hvor erytrocytkoncentrationen er højest, vil billedet være mørkest. Når der udelukkende måles høje værdier i P-neg zonen, dvs. den nederste del af brønden, så er prøven negativ (se Figur 8). Ud over i de fem zoner måles også plastikken og kolonnen som baggrundsfarve. Der kontrolleres, om der er for mange celler (TMC), for få celler (TFC), fibrin (FIB) eller hæmolyse (HEM) i brønden. Er dette ikke tilfældet og er kvalitetskontrollerne (se afsnit om kvalitetskontrol) for centrifuge, daglig- og ugentlig vedligehold samt dekontaminering i orden, så gradueres resultatet og svares automatisk ud, såfremt det ikke skal vurderes af personalet. En stærk sensibilisering og høje Ig-koncentrationer i plasma kan forudsage spontan agglutination i Biovue og derved bliver kontrol brønden og de andre brønde i den specifikke DAT ofte positive. Da Biovue stadig er et nyt system, kan manuel aflæsning give problemer og det kræver træning pga. genskær i glaskuglerne, derfor skal der gerne bruges dagslys. Der er et standard skema tilgængeligt til sammenligning af reaktionerne.(24,33,35) Biorad system Biorad systemet arbejder også med søjleagglutinationskort fra firmaet Diamed. Som matrix anvendes Cefadex gel (de resterende indholdsstoffer kan indses i materiale afsnittet). Biorad anvendes til DAT og specifik DAT, som manuel metode. Dertil skal der bruges en inkubator og centrifuge fra Diamed.(23) Figur 8 viser en Biovue brønd forstørret op med zone inddeling.(eget billede) 21

23 Figur 9 viser et centrifugeret polyspecifik og specifik DAT gelkort fra Biorad. (Eget billede) Bioanalytikeren markerer reagensglas samt Biorad gelkort og fremstiller en 0,8% suspension af patientens pakkede erytrocytter i Cellstab. Der skal bruges 50 µl suspension til hver brønd. Gelkortet centrifugeres i 10 minutter før det kan aflæses og svaret indtastes i Prosang. Det betyder, at en manuel DAT i Biorad kort i alt tager ca. 15 minutter. Til aflæsning er der også et standard skema tilgængeligt. De ansatte på BIK-I er bedre bekendt med aflæsningen af Biorad gelkort end Biovue, hvorfor denne foretrækkes som manuel metode. Endvidere er systemet mere stabilt sammenlignet med Biovue. Især spontanagglutinationen+ er relativt sjælden.(9,36) 3.0 Metode og Materiale 3.1 Design Selve projektet var et pilotforsøg med aspekterne metodesammenligning af DAT analyse manuel i Biorad system og DAT analyse med Autovue Innova i Biovue system. Samtidig blev der udført en retrospektiv sammenligning af forskellige hæmolyse parametre over for DAT resultaterne. For at data blev medtaget i de statistiske beregninger blev der overordnet fastsat nogle in- og eksklusions kriterier (se Tabel 5). Disse kriterier var forskellige alt efter hvad der blev sammenlignet. 22

24 Tabel 3 viser en opsætning af in- og eksklusionskriterier for sammenligning af DAT metoderne og for sammenligning af DAT og hæmolyseparametre. Inklusionskriterier Eksklusionskriterier Sammenligning kun DAT resultater i de to metoder - Alle DAT fra rutinen i perioden Kun positiv i IgG - Mixed field reaktion samtidig med transfusion inden for 3 måneder - Positiv Ctl brønd - Positiv i C3d Sammenligning DAT resultater med hæmolyseparametre - alder >18 år - patienter under Hæmatologisk regi - analyseret i 2016 i Biorad - Positiv i IgG - Positiv i Ctl brønd - Positiv i C3d - Mixed field reaktion samtidig med transfusion inden for 3 måneder Der er i det hele analyseret 128 pt prøver i projektperioden. Dertil kom 32 hæmatologiske patienter med en positiv DAT udført udenfor projektperioden i 2016 som blev medtaget for at øge stikprøvens størrelse til 160 patienter for opdelingen af data grupper og hensyntagen til inog eksklusionskriterier. 3.2 Litteratursøgning Pubmed er brugt for at finde Artikler som præcis omhandler det undersøgte emne. Der er anvendt følgende Mesh-termer: "Anemia, Hemolytic, Autoimmune"[Mesh] AND "Coombs Test"[Mesh] AND "Immunoglobulin G"[Mesh] Disse Mesh-termer har, den , ført til en søgning der gav 189 artikler. Ved litteratursøgning er der gået ud fra viden og materiale fra uddannelsen. Hjemmesider som Lægehåndbogen, infonet gennem og har sammen med det sygehusinterne Qualiware (kvalitetstyringssystem for immunologien i region syd) også været med til at give mere viden. 23

25 3.3 Materiale I tabel 3 og 4 er der medtaget hvilke apparaturer og materialer der er brugt til at gennemføre projektet. Økonomisk set har der været en udgift på 6000 kr. excl. Moms for Biovue søjleagglutinations kortene der bruges til Autovue Innova. Biorad gelkortene blev brugt til rutinen, dvs vi har brugt det resultat man genererede via rutinen for patienten. Det betyder at der ikke er kommet ekstra udgifter i form af Biorad gelkort. Tabel 4 viser en oversigt over de maskiner, materialer og apparaturer der i en eller anden form er anvendt til projektet. Apparatur Autovue Innova ID nr.: J-Nr Ortho Clinical Diagnostik REF Autovue Innova ID nr.: J-Nr Ortho Clinical Diagnostik REF ID-Centrifuge 12SII og 24S Diamed ID Rotanta 460 og Universal 320 Hettich Zentrigugen EBA 20 Hettich Zentrifugen Finpipetter 2-20µl, µl, µl, 0,5-5 ml THERMO og BIOHIT Lysbord Model 837 C DANUBIA Calibration Cassette cc No Ortho Clinical Diagnostic Cobas 8000 c702 Sysmex XN 9000 Anvendelse Analysering af DAT med Biovue kort. Analysering af DAT med Biovue kort. Til centrifugering af Biorad gelkort (10 min ved 85 g). Til centrifugering af pt blodprøven før analysering. Lille bordcentrifuge blev brugt til vask ved fremstilling af kontroller. Til brug ved fremstilling af kontroller, susp og afpipettering ved Biorad. Til aflæsning af reaktioner i Biorad. En kassette i samme form som Biovue kort til kalibrering af Autovue Innova. Analyseapparat der blev brugt til at analysere de biokemiske parameter der blev genfundet i BCC for patienterne Analyseapparat der blev brugt til at analysere de hæmatologiske parameter der blev genfundet i BCC for patienterne 24

26 Tabel 5 viser en oversigt over reagenser, søjleagglutinationskort og humant materiale der blev anvendt i projektet. Materiale Lot. Nr. Indhold Anvendelse Cellstab Diamed Cell Thaw Diamed Seraclone Anti- D(RH1) Blend Diamed LISS/Coombs Biorad DC screening II Biorad Polykassette Ortho Biovue Saltvand med glycinbuffer, trimetoprim, sulfamethoxazol Glycin fosfat saltvandsbuffer, med sukre og bovin albumin, trimetoprim, sulfamethoxazol Anti-D fra cellekloner BS232(IgM), BS221(IgG), H4111B7(IgG); <0,1% Natriumazid , , , AHC563A, AHC028F Cefadexgel, Anti-IgG (Kanin), Anti-C3d (Monoklonalt Celleklon c-139-9), < 0,1% Natriumazid (Konserveringsmiddel), Lav Ion Styrke Saltvand (LISS) Cefadexgel, Anti-IgG (Kanin), Anti-C3d (Monoklonalt Celleklon c-139-9), < 0,1% Natriumazid (Konserveringsmiddel), Lav Ion Styrke Saltvand (LISS) Glas beads, Dextran, Bovint albumin, 0,1% Natriumazid, 0,01M Ethylendiamintetraeddikesyre(EDTA), Anti-IgG (Kanin), Anti C3b (Mus, monokl.)(klon F7G3), Anti-C3d (Mus, monokl.)(klon C4C7), FD&C blå nr.1 og Gul nr.5 Bruges til at fremstille erc. suspensioner ud fra pt. erc. Bruges til at tøe frossene erc. suspensioner op med Til at fremstille kontrolmateriale som er erc., sensibiliseret med anti- D Polyspecifik gelkort for at kontrollere om erc. er sens. Med IgG og/eller C3d Monospecifik gelkort for at kontrollere om erc. er sens med enten IgG eller C3d Polyspecifik kort for at kontrollere om erc. er sens. Med IgG og/eller C3d/C3b på Autovue Innova eller Vision DAT/IDATkassette Ortho Biovue 128 Patientprøver DAT001F Glas beads, Dextran, Bovint albumin, 0,1% Natriumazid, 0,01M Ethylendiamintetraeddikesyre(EDTA), Anti-IgG (Kanin), Anti C3b (Mus, monokl.)(klon F7G3), Anti-C3d (Mus, monokl.)(klon C4C7) - Fuldblodsprøve EDTA stabiliseret 10 ml BD vacutainer K2 EDTA Monospecifik kort for at kontrollere om erc. er sens. med enten IgG eller C3d/C3b på Autovue Innova eller Vision Til analysering DAT 3.4 Dataindsamling Indsamlet er data over en længer periode. I perioden er der indsamlet 98 prøver og i perioden , 30 prøver fra den daglige rutine hvor der blev udført manuel DAT i Biorad og DAT på Autovue i Biovue. Udførelsen af analyserne så således ud at alle rekvirerede DAT analyser gennemgik to skridt. Først den manuelle rutine metode i Biorad gelkort og derefter automatiseret analyse af samme prøve vha. Biovue på Autovue Innova. Selve fremgangsmåden beskrives i Tabel 10 25

27 Rutine metoden bestod af at udføre en Biorad polyspecifik DAT og var den positiv blev der udført en Biorad specifik DAT (IgG, C3d, Ctl). DAT - Biorad Centr. blodprøve 5 min 1800g Fremstil 0,8 % susp. af pt. erc. i Cellstab Afpip. 50 µl af 0,8% susp. til Biorad DAT gelkort og centr. 10 min 85 g Hvis pos. afpip 50 µl til IgG, C3d og Ctl brønd i spec. DAT Biorad gelkort og centr. Aflæs resultatet og noter i skema DAT - Biovue Centr. blodprøve 5 min 1800g Bestil DAT i Autovue system Påsæt prøven Ved positiv DAT bestil spec. DAT og analyser på Autovue Noter resultatet i skema Hæmolyse parameter Kontroler om DAT er udført på en Hæmatologisk pt. Hvis ja slå Hæmolyse parameter op i BCC for pt. Har pt fået transfusion de sidste 3 måneder Noter i skema: alder, køn, Hæmolyse parameter og hvornår de er taget Figur 10 viser hvordan analysen DAT manuel i Biorad og DAT automatisk med Autovue Innova i Biovue udføres. Der forklares også hvordan fremgangsmåden var for at indhente oplysning om hæmolyseparametrene.(9,33) Efter at have kørt patientprøven gennem rutinen blev prøven analyseret på Autovue Innova i form af en DAT og specifik DAT hvis nødvendigt. For alle patienter som var i regi Hæmatologisk dagklinik, Sygehus Sønderjylland, blev der så i perioden genfundet parameter for Haptoglobin, Billirubin, Retikulocytter, Hæmoglobin og LDH max 5 dage fra datoen hvor DAT er analyseret. Værdierne blev genfundet i BCC som er BIK-B datasystem ligesom Prosang er BIK-I datasystem. Den fra blev der afholdt et planlagt interview med hæmatologisk overlæge Jacek Kisieleviecz. Ud fra på forhånd planlagte spørgsmål blev temaet DAT og brug af denne ved AIHA drøftet. Interviewet er med tilladelse af overlægen optaget på bånd og transkripteret efterfølgende. I dette sammenhæng er der også givet tilladelse, af overlægen Jacek Kisielevicz, for at der til dette projekt måtte indhentes biokemiske Data fra patienter under hæmatologisk regi.(15) Dette var nødvendigt fordi lovgivningen har ændret sig og det ikke er muligt at trække biokemiske parameter for alle patienter selvom de anonymiseres. Projektet kører under sundhedslovens paragraf 42a. 26

28 Ud over analysering af DAT, genfinding af hæmolyseparameter for de hæmatologiske patienter og interview med Jacek Kiecelevicz, har der løbende under projektet været møder og samtaler med Kent Elkrogh fra Otho Clinical Diagnostic. 3.5 Databearbejdning Sammenligning af DAT resultat i Biorad og hæmolyse sker vha. i alt 119 DAT negative og kun IgG positive patienter, under hæmatologisk regi, som er analyseret i projektet, inklusiv patienter som er analyseret DAT positiv for IgG i 2016 bare udenfor projektperioden. Der var kun få patienter som var C3d positiv og med Biovue metoden var der et problem med at stikprøven i de forskellige DAT gradueringer var meget lille. En grund var at der kun var givet lov til at genfinde hæmolyseparameterne for patienter i hæmatologisk regi. Det betød at undersøgelsen om sammenhæng mellem DAT graduering og hæmolyseparameter blev udført med IgG positive patienter analyseret i Biorad. Data er indelt i grupper efter graduering i Biorad med negativ, svag positiv for IgG, middelstærk positiv for IgG og stærk positiv for IgG, hviket i alt var 119 patienter. Dertil kommer en gruppe af patienter som var positiv i C3d eller C3d+IgG, i alt 5 patienter samt en gruppe af patienter som kun var positiv i DAT med Biovue metoden, i alt 12 patienter. For hver af de nævnte grupper er der beregnet et datasæt. Data bestod af medianer for hver af de 5 hæmolyseparametre, samt den procentmæssig andel af patienter der udviser tegn på hæmolyse, dvs. hvor mange patienter af hver gruppe der viste en hæmolyseparameter udenfor reference intervallet i en grad som kan tyde på hæmolyse. De beregnede Data for gruppen af patienter som kun var positiv i Biovue metoden og gruppen af patienter som var positiv i C3d eller C3d+IgG blev så sammenlignet med de beregnede data for de 119 i Biorad DAT negative og IgG positive. Ved siden af sammenligning af DAT og hæmolyseparametre er selve de to DAT metoder sammenlignet. Dette er gjort ved at inddele patienter i grupper DAT negativ, DAT svag positiv for IgG, DAT middelstærk positiv for IgG og DAT stærk positiv for IgG. For Biovue resultaternes vedkommende så er 0,5 resultaterne medtaget som plus 1 resultat. Selve DAT resultatet som er sammenlignet er selve svaret, som en konklusion af den polyspecifikke og specifikke DAT, dvs at den specifikke DAT har bestemt det endelige svar. 27

29 Resultaterne fra begge metoder, i alt 122 patienter er så sammenlignet ved beregning af vægtet Kappa. 3.6 Kvalitetssikring Kvalitetssikringen for dette projekt er delt op i 3 dele, punkter ved Biovue metoden med Autovue, punkter ved den manuelle metode i Biorad samt punkter ved dataindsamling i form af genfinding af hæmolyseparameter, dokumentation af det daglige analyse arbejde osv. Autovue Kvalitetsikring ved Biovue metoden på Autovue Innova udføres af bioanalytiker og automatisk af maskinen. Der er fremstillet svagt sensibiliserede erytrocytter med IgG til kontrol af Biovue kort og C3d sensibiliserede erytrocytter er tøet op og anvendt. Kontrollerne var alle akceptable.(37) Dagligt og Ugentligt vedligehold er den del af kvalitesikringen som bioanalytikeren står for. Med det menes dekontaminering af selve væskesystem og rengøring af selve apparaturet samt udskiftning af mikrotiterplader til suspensionsfremstilling og nyt Suwasol og destilleret vand. En vigtig del af det ugentlige vedligehold er kalibrering. Dette udføres vha en kalibreringskassette (se Fig. 10), som der tages billeder af for at kontrollere om maskinen måler korrekt. Kassetten gengiver eksempler på brønde med forskellige reaktioner. Alle disse punkter skal udføres tilfredsstillende. Ud over det kontrolleres om LIS sytemet svarer de prøvesvar ud den skal til Prosang. Autovue Innova renser selv pipetten mellem to afpipetteringer. Den kontrollerer brøndene for afvigelser som for mange eller for få celler, fibrin, hæmolyse eller luftbobler. Den kontrollerer om det er det rigtige Biovue kort der bruges og om holdbarheden er i orden. Er der et problem med svaret og bioanalytikeren skal kontrollere kortet sættes kortet automatisk ud og via stregkodescanner er de korrekte reaktioner man så kigger på. Figur 11 viser et billede af kalibrerings kassetten der anvendes til Autovue Innova. (Eget billede) Et kvalitetssikrings punkt eller retter sagt et punkt som øger kvaliteten er den Bifasiske centrifugering som anvendes i Autovue Innova. Der centrifugeres i 2 skridt i forskellig længde 28