Helle Laila Kristiansen. Studienr Anslag: Vejledere: Klinisk vejleder Grethe Bischke. UC-vejleder Anja Dalsgaard Jørgensen.

Transkript

1 2016 Helle Laila Kristiansen. Studienr Anslag: Vejledere: Klinisk vejleder Grethe Bischke. UC-vejleder Anja Dalsgaard Jørgensen. Klinisk Uddannelsessted: Laboratoriecentret, Sygehus Sønderjylland, Kresten Philipsens Vej 15, 6200 Aabenraa. Uddannelsesinstitution: University College Syddanmark, Degnevej 16, 6705 Esbjerg Ø Direkte Anti-humanglobulin Test: Er der en nedre klinisk relevant grænseværdi? En undersøgelse af sammenhænge mellem reaktionsstyrker målt med BioRad LISS/Coombs gelkort og AutoVue Innova Ortho BioVue kassetter og hæmolytiske biomarkører for hæmatologiske patienter. Direct Anti-humane-globuline Test: Is there a clinically relevant lower limit? An exploration of the connections between responses and haemolytic biomarkers for haematological patient samples measured by BioRad LISS/Coombs gel card and AutoVue Innova with Ortho BioVue cassettes. 20/

2 Abstrakt... 4 Introduktion... 5 Baggrund... 5 Formål... 7 Problemformulering... 8 Definitioner og afgrænsning Teori... 9 Anæmi Hæmolytisk anæmi Hæmolyseprofil Autoimmun hæmolytisk anæmi (AIHA) Ætiologisk klassificering af AIHA AIHA-diagnosen Erytrocytserologi Antistoffer Affinitet og aviditet Anti-human-globulin Direkte Anti-humanglobulin Test (DAT) Søjleagglutinationsteknik BioRad og BioVue-metoderne Metoder Design In - og eksklusionskriterier Etik Dataindsamling Forsøgsprotokol Kvalitetssikring Litteratursøgning Materiale Databearbejdning Hæmatologiske patienter Fase 1: Styrker og svagheder ved BioRad og BioVue for DAT- og specifik DAT Fase 2: Sammenhæng mellem hæmolyseprofilen og DAT-reaktioner for BioRad og BioVue

3 Resultater Hæmatologiske patienter Aflæste positive reaktionsstyrker for DAT- og DAT-specifik Sammenligning af BioVue- og BioRad-metodernes sensitivitet Sammenhæng mellem DAT-reaktioner og hæmolyseprofilen Dot-plots for BioRad Dot-plots for BioVue Hæmolyseprofilen for de uoverensstemmende positive patientprøver Diskussion Intern validitet Sensitivitet Sammenhæng DAT og specifik DAT Usikkerhed på aflæst reaktionsstyrke, graduering og svarpolitik Reagens-forskel for BioRad og Autovue Delkonklusion: Sensitivitet Fase 2: Sammenhænge mellem DAT-reaktioner og hæmolyseprofil Hæmoglobin Reticulocytter Lactatdehydrogenase Haptoglobin Bilirubin Analysemodel for hæmolyseprofil Perspektivering Konklusion Referencer Illustrationer

4 Abstrakt Baggrund: Det fuldautomatiske udstyr Autovue Innova i Ortho BioVue kassetter til Direkte Antihumanglobulin Test (DAT) har vist sig vanskelig at implementere i rutinen. Metoden er tilsyneladende mere følsom end den hidtidige manuelle metode BioRad LISS/Coombs gelkort. Metoder: Hæmatologiske patientprøver i rutinen analyseres parallelt med begge metoder. DAT-resultaterne sammenholdes med analyseresultater for patienternes hæmolytiske biomarkører: hæmoglobin, reticulocytter, lactatdehydrogenase, haptoglobin og bilirubin. Sammenstillingen anvendes til at belyse, hvorvidt der er en sammenhæng, der kan anvendes til at fastsætte en nedre klinisk relevant grænseværdi for Direkte Antihumanglobulin Test. Resultater: Autovue Innova i Ortho BioVue kassetter har 10 % flere svagt positive DATreaktioner end BioRad LISS/Coombs gelkort, men hovedparten kunne ikke specificeres. 80 % af de 104 patientprøver var negative i DAT-analysen. Halvdelen af mændene var anæmiske, heraf fire i svær grad. En tredjedel af kvinderne var anæmiske, heraf én i svær grad. Der kan ikke påvises en entydig sammenhæng mellem de hæmolytiske biomarkører og resultaterne fra DATanalyser. Konklusion: Autovue Innova i Ortho BioVue kassetter er mere følsom end BioRad LISS/Coombs gelkort. Resultaterne viser ikke en tydelig sammenhæng mellem reaktionsstyrken i DATanalysen og de hæmolytiske biomarkører, som kan anvendes til at fastsætte en nedre klinisk relevant grænseværdi. Men de kan anvendes til at belyse pejlemærker for en vurdering i samarbejde med klinikere. 4

5 Introduktion Baggrund Den teknologiske udvikling vedrørende erytrocytserologiske metoder har bevæget sig fra manuelle teknikker med subjektiv tolkning af reaktionerne af bioanalytikere f.eks. glasteknik og søjleagglutination i retning mod en fuldautomatiseret proces med software, der fortolker de visualiserede reaktioner. De programmerede tvivlstilfælde valideres af bioanalytikere. Efter EU-udbud vedrørende automatiserede blodtypeserologiske analyser i Region Syddanmark er Orthos AutoVue Innova med BioVue kassetter (Biovue) implementeret på Immunologisk Klinik (IK) Sygehus Sønderjylland (SHS) til rutine-analyser med visse undtagelser bl.a. Direkte Anti-humanglobulin test (DAT). DAT udføres ifølge blodbankens kvalitetskontrolsystem Qualiware(1) på indikation af mistanke om immunmedieret hæmolytisk anæmi f.eks. nyfødte, transfusionskomplikationer eller autoimmun hæmolystisk anæmi (AIHA) herunder monitorering af behandling for tilstanden og i visse tilfælde analyseres bloddonorer. En positiv DAT påviser at erytrocytterne er sensibiliserede med immunglobulin og/eller komplement in vivo. Automatisering af DAT vil medføre en kvalitetsforbedring af analyseresultaterne, da fejlkilder minimeres, den visuelle fortolkning bliver software-baseret og analyseresultater kan overføres elektronisk. I valideringsrapporten fra Odense Universitetshospital (OUH) 2014(2,3) konkluderes at resultaterne for DAT-analysen med BioVue og den hidtidige manuelle metode BioRad LISS/Coombs gelkort (BioRad) ikke er sammenlignelige i acceptabel grad. Resultaterne af OUHvalideringen indikerer at BioVue er mere sensitiv. Lignende observation fremgår af valideringsrapporten fra Region Midtjylland(4). Såfremt BioVue skal anvendes i rutineproduktionen til DAT-analyser på IK, SHS kræves yderligere afprøvninger. Antallet af DAT-analyser er relativt få. I 2015 på IK SHS var der ifølge præstationsstatistikken 763 analyser, hvoraf 125 var positive. DAT-analysen indgår i anæmiudredning og et positivt/negativt resultat kategoriserer ætiologisk hæmolytisk anæmi i hhv. immunmedieret og ikke-immunmedieret(5). 5

6 Ætiologisk fordeler hæmolytiske tilstande i Danmark sig på typerne ca. 33 % af mekanisk f.eks. kunstig hjerteklap eller genetiske årsager f.eks. erytrocyt - eller enzymdefekter, 30 % ukendt årsag, 30 % autoimmun og 7 % medicininduceret autoimmun(6). Det kliniske billede af hæmolystisk anæmi er vidtspændende: Fra stilfærdig kronisk hæmolyse til udvikling af en livstruende tilstand indenfor få dage. Symptomer på manglende iltforsyning gør det livsnødvendigt med hurtig transfusion af erytrocytter. En positiv DAT kan forsinke og vanskeliggøre arbejdet med at finde forligeligt blod ved transfusionsbehov(7,8). Der er tilnærmelsesvist en overordnet sammenhæng mellem hæmolysegrad og reaktionsstyrken af DAT-analysen. Men en positiv DAT er ikke ensbetydende med en immunmedieret hæmolytisk tilstand eller anæmi. Transfusionskomplikationer, antibiotikabehandling og autoimmune sygdomme er eksempler på tilstande, hvor der kan være positiv DAT uden hæmolyse. Hvorvidt erytrocytterne destrueres afhænger bl.a. af det individuelle immunforsvar(7,9). Undersøgelser har vist at der normalt er in vivo sensibilisering i mindre grad hos raske personer. Desuden at 6 8 % af hospitalsindlagte patienter og mellem 1 af 1000 til 1 af raske bloddonorer har en positiv DAT uden kliniske symptomer på immunmedieret hæmolyse. Endvidere er der konstateret forhøjede niveauer af immunproteinmolekyler på forskellige patienters erytrocytter uden entydig korrelation til en positiv DAT og anæmi(9). Trods alt er en positiv DAT er et unormalt analyseresultat og årsagen dertil skal søges klarlagt. Det kan være en bagvedliggende hæmatologisk sygdom f.eks. lymfom, leukæmi. Flere immunologiske sygdomme giver et positivt DAT-resultat uden hæmolyse f.eks. systemisk lupus erytematosus, reumatoid artritis, colitis ulcerosa, human immundefekt virus (HIV)(7). Medicin kan i få tilfælde inducere autoimmun hæmolyse (AIH) og/eller positiv DAT. Den estimerede forekomst var i ud af en million. Antallet af medikamenter, som kan inducere AIH har ekspanderet: Fra 13 i 1967, 32 i 1980 til 100 i Ca. en tredjedel var antibiotika- typer. Forløbet afspejler dynamikken i udviklingen af nye lægemidler og deres anvendelse. F.eks. var det anti-hypertensive methyl-dopa og penicillin de hyppigst forekommende lægemidler associeret til medicininduceret AIH i år senere er mere 6

7 end 80 % af medicininduceret AIH relateret til 2. og 3. generations cephalosporiner(10). Der er adskillige teorier for mulige sammenhænge mellem medicininduceret immunrespons, positiv DAT og AIH. Klinisk og serologisk kan medicininduceret hæmolyse ikke skelnes fra AIH og antistofidentifikationen fordrer særlige metoder(9). DAT-analysen kan ikke anvendes til at skelne mellem de forskellige årsager til evt. immunmedieret hæmolyse og analyseresultatet kan ikke stå alene. Både positive og negative DAT-resultater har betydning for diagnoser og valg af behandling. DAT-resultatet skal vurderes sammenholdt med patientens anamnese f.eks. arvelige forhold, medicin, transfusion og transplantation, samt kliniske tegn og symptomer i sammenhæng med andre undersøgelser f.eks. biopsi, knoglemarvsundersøgelse, billeddiagnostik og biokemiske analyser(7). Den teknologiske udvikling indenfor DAT-analysemetoder er gået i retning mod højere sensitivitet. For søjleagglutinationsteknik er detektionsgrænsen to til tre gange lavere end glasteknik(11). Med en endnu mere sensitiv metode vil der blive flere positive resultater alene i kraft af målemetoden og det er så spørgsmålet, om det er klinisk relevant. Formål Dette projekt bidrager til at supplere OUH-valideringen og sikre kvaliteten af svarafgivelsen af DAT-analysen både af hensyn til klinikerne og patienten. Det er et pilotprojekt, som afdækker hvilke forbindelser der er mellem DAT-resultater for parallel-analyseret patientblodprøve med hhv. BioVue- og BioRad-metoden og hæmolytiske biomarkører. Resultatet anvendes til at belyse muligheder for at justere DAT-analysen med BioVue i forhold til den nuværende BioRadmetode. Det er vigtigt at sikre klinikerne de samme svar fra DAT-analysen uanset analysemetoden. Fortolkningsgrundlaget for patientens tilstand skal være uændret, selvom analysemetoden ændres. Det er ligeså vigtigt at vurdere, hvorvidt en mere sensitiv metode til DAT-analyser kunne anvendes til gavn for patienterne. En fastsættelse af en klinisk relevant nedre grænseværdi for DAT-analyser ved BioVue-metoden er en beslutning som kun kan foretages af klinikere. Pilotprojektet bidrager med forsøgsdata og anskueliggørelse af problemstillingen. Resultatet kan evt. anvendes til at justere svarpolitikken og grænseværdier i samarbejde med klinikerne. Det er hensigten at pilotprojektet ansporer til at gennemføre implementeringen af BioVue for rutineproduktionen af DAT-analyser. 7

8 Problemformulering Hvilken sammenhæng er der mellem den hæmatologiske patients hæmolyseprofil og resultatet af Direkte Anti -humanglobulin Test målt med henholdsvis den manuelle metode i BioRad LISS/Coombs gelkort og Autovue Innova i Ortho BioVue kassetter? Hvordan kan en mulig sammenhæng mellem metoderne og hæmolyseprofilen anvendes til fastsættelse af en nedre klinisk relevant grænseværdi for Direkte Anti -humanglobulin Test? Definitioner og afgrænsning. Definition: Autoimmun hæmolytisk anæmi (AIHA) er en erhvervet tilstand betinget af en type II humoral autoimmun respons mod antigener på erytrocytoverfladen(6). Patientgruppen afgrænses til hæmatologiske patienter over 18 år med mistanke om AIHA. Indskrænkningen skal tjene til at øge sammenligneligheden af patientprøverne. Overvejelserne beskrives under design-afsnittet. Endvidere er afgrænsningen etisk begrundet i Sundhedsloven kapitel 9(12). Overlæge Jacek Kieselewicz, Hæmatologisk Dagklinik, SHS, Aabenraa(13) har givet tilladelse til at de biokemiske data for de hæmatologiske patienters hæmolyseprofil indhentes ved opslag i det elektroniske laboratoriesystem (BCC). Tilladelsen omfatter de hæmatologiske patienter, som er i aktuel behandling og får foretaget en DAT-analyse. De etiske forhold beskrives nærmere i etikafsnittet under metoder. Hæmolyseprofilen tegnes af de klinisk biokemiske biomarkører: B-hæmoglobin (HB), B- reticulocytter (RETI), P-haptoglobin (HAPT), P-laktatdehydrogenase (LD) og P-bilirubin (BILI). De biokemiske analyser fremgår af tabel 1. Overlæge J. Kieselewicz(13) har bekræftet at udvalget repræsenterer de klinisk mest relevante hæmolytiske biomarkører for projektet. Tabel 1 Analysenavn og IUPAC-kode for de biokemiske analyser, som udgør hæmolyseprofilen. IUPAC - kode Analysenavn Hæmolyseprofilens biokemiske analyser NPU02319 NPU08694 NPU19658 NPU01370 NPU19788 B- Hæmoglobin (Fe); stofk. B-Reticulocytter; antalk. P-Laktatdehydrogenase; kat.k. P-Bilirubiner; stofk. Forkortelse HB RETI LD BILI HAPT P-Haptoglobin; massek. 8

9 Teori Der redegøres for de sundhedsfaglige definitioner og begreber indenfor anæmi og hæmolyse, samt sammenhænge mellem DAT-analysen og AIHA. Den teoretiske baggrund for anti-humanglobulin testens reaktioner beskrives. Metoderne BioRad og BioVue gennemgåes og sammenstilles med hensyn til komponenter, graduering og visualisering. Anæmi. Anæmi er en tilstand med nedsat koncentration af HB i blodet. Tabel 2 viser inddelingen i forskellige grader af anæmi. I den danske befolkning forekommer anæmi hos 5 10 % < 75 år og % > 75 år. Moderat til svær anæmi er primært årsag til akut indlæggelse på medicinsk afdeling og anæmi forekommer hos % af patienterne(14). Transfusion kan være livsnødvendig ved HB < 3,5 4 mmol/l, som kan medføre hjerteinsufficiens. Transfusionsgrænsen er højere for ældre og hjerte-lunge-syge(15). Alarmgrænsen er < 4 mmol/l på SHS ifølge BCC. Tabel 2 Definitioner for grader af anæmi(14). Hæmoglobinkoncentration ved grader af anæmi. Kvinder > 18 år Mænd > 18 år Anæmi < 7,0 mol/l < 8,0 mmol/l Moderat anæmi < 6,0 mol/l < 7,0 mol/l Svær anæmi < 5,0 mol/l < 5,5 mol/l Tilstanden opstår enten pga. manglende produktion af erytrocytter eller et øget tab pga. blødning eller øget destruktion af erytrocytter og ofte optræder flere komponenter samtidigt. Anæmi opfattes som et symptom med talrige differentialdiagnoser, som altid skal udredes ætiologisk for at klassificere anæmi-typen og optimere behandlingen. I Danmark er de hyppigste årsager jernmangel eller anæmi som følge af inflammation. Aktivering af inflammatorisk respons er en følge af kroniske inflammatoriske tilstande, infektioner og cancer. Det forekommer især hos ældre personer pga. stigende komorbiditet(16) % af patienter med kroniske medicinske sygdomme f.eks. nyresvigt, hjertesvigt, rheumatoid artritis, cancer og inflammatorisk tarmsygdom har anæmi som følge heraf. Mekanismen er aktivering af cytokiner, som hæmmer erythropoiesen(14). 9

10 Anæmiudredningen kan indledes målrettet efter patientens symptomer, anamnese og kliniske tegn. Hvis det skal gå hurtigt eller patienten skal transfunderes foretages fuld anæmiudredning med samtlige laboratorieanalyser. Indledende er udredningsstrategien ofte baseret på hvorvidt der er reticulocytose eller ej, samt erytrocytternes middelcellevolumen(14). Reticulocytose indikerer tab af erytrocytter f.eks. blødning, hvilket kan være forårsaget af malign lidelse eller hæmolyse. Mangel på retikulocytose udtrykker reduktion i produktionen af erytrocytter f.eks. jernmangel eller anæmi ved inflammation, marvfortrængning eller aplasi. Middelcellevolumen bruges i den videre udredning(16). Udredningen af anæmi videreføres af specialister såfremt anæmiens ætiologi er uafklaret eller ved mistanke om hæmolyse eller malign lidelse. Afvigende resultater for alle tre cellelinjer- erytrocytter, leucocytter, trombocytter indikerer en sekundær anæmi f.eks. i tilknytning til kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) og udredningen videreføres i henhold til sundhedsstyrelsens kræftpakker(17). Hæmolytisk anæmi. Hæmolyse defineres som en tilstand, hvor erytrocytters levetid er kortere end 120 dage. Hæmolytisk anæmi betegner en levetid på mindre end 20 dage for erytrocytterne, samtidigt med en utilstrækkelig knoglemarvsproduktion og dermed et fald i hæmoglobinniveauet. Årsagen kan være intraerytrocytære genetisk betingede forhold eller erhvervede i form af mekanisk betinget eller immunmedieret hæmolyse(7). Tabel 3 viser karakteristiske symptomer, kliniske tegn og analyseresultater fra blodprøver(17). Det er sandsynligt, at der er en hæmolytisk tilstand, hvis HAPT er reduceret og BILI og LD forhøjet. Reticulocytose vil vise sig i løbet af 3 5 dage, såfremt hæmatopoiesen fungerer normalt. En positiv DAT indikerer en autoimmun hæmolytisk tilstand, men resultatet kan være falsk-negativt. Med en negativ DAT er der mange mulige diagnoser og den videre udredning er individuel(18). 10

11 Tabel 3 Symptomer, kliniske tegn og analyseresultater ved hæmolytisk anæmi(17). Karakteristiske mønstre ved hæmolytisk anæmi. Symptomer ved anæmi Kliniske tegn Analyseresultater fra blodprøver Træthed Svimmelhed Åndenød Hjertebanken Angina pectoris Splenomegali Heptomegali Ikterus Hæmoglobinuri Galdesten Lav HB Forhøjede RETI Lav HAPT Forhøjet BILI Forhøjet LD Evt. positiv DAT Hæmolyseprofil. Hæmolytisk anæmi kan måles gennem ændringer i de fem biomarkører (7). Tabel 4 viser hvordan hæmolyseprofilen vil ændre sig i forhold til referenceintervallet fra BCC på SHS. Anæmi ses ved faldende hæmoglobin(hb). RETI er større umodne erytrocytter, som normalt er tilstede i blodbanen, hvor de modnes og mindskes til erytrocytstørrelse. Ved forceret erythropoiese vil antallet være forhøjet, hvilket indikerer en vital knoglemarv, som kompenserer for tab af erytrocytter(19). HAPT er et akut-fase-protein, som er højt ved aktive processer f.eks. inflammation og maligne tumorer. HAPT falder mod nul ved intravaskulær hæmolyse, da HAPT binder frit hæmoglobin i blodet og det er ubundet HAPT, der måles i analysen. Men ofte kan HAPT ikke måles pga. interferens fra hæmolyseindeks i blodprøven(17). Lavt niveau ses også ved ekstravaskulær hæmolyse f.eks. hæmatomabsorption(20). BILI stiger i blodet ved hæmolyse. Normal nedbrydning af erytrocytter foregår primært i lever og milt ved fagocytose af makrofager. Processen gennemløber flere trin og hæm omdannes ved enzymkatalyseret reaktion til det ikke-vandopløselige BILI, som i blodet bæres af albumin. BILI optages i leveren og konjugeres med glukoronat, så det bliver vandopløseligt og kan udskilles via galden til tarmen og fæces. Normalt indeholder blodet < 17 µmol/l BILI og det er fortrinsvist i ukonjugeret form. Ved hyperbilirubinæmi 11

12 er der både konjugeret og ukonjugeret BILI, som kan aflejre sig i væv, når koncentrationen bliver > µmol/l, hvilket giver ikterus. Massiv hæmolyse kan bevirke en ophobning af ukonjugeret BILI, hvis mængden af hæm overstiger leverens konjugeringskapacitet. Voksne har en høj optagelses- og konjugeringskapacitet og ukonjugeret BILI vil oftest være < µmol/l(7,17,21). LD er et enzym som findes i alle kroppens celler og katalyserer den reversible omdannelse af pyruvat til laktat afhængigt af iltforholdene i cellen. Total LD er en uspecifik markør for vævsskade og frigøres ved cellehenfald. LD- koncentrationen afspejler hastigheden af celleomsætningen. Hæmolyse i blodprøven er en fejlkilde til falsk forhøjelse, da erytrocytter ikke indeholder mitochondrier og har et højt indhold af LD(22). Referenceintervallet (RI) viser værdierne for normale raske personer. Intervallet anvendes i BCC på SHS. Tabel 4 Hæmolyseprofilen ved hæmolytisk anæmi. Hæmolyseprofil og referenceinterval for de udvalgte biomarkører. Hæmolyse -profil HB mmol/l HAPT g/l LD U/L BILI µmol/l RETI x 10 9 /L Kvinder Mænd < 50 år 50 år <70 år 70 år MK Kvinder Mænd BCC - SHS Referenceinterval 18 år 7,3 9,5 8,3 10,5 0,35 1,85 0,47 2, Autoimmun hæmolytisk anæmi (AIHA). AIHA adskiller sig fra andre immunhæmatologiske anæmier, idet den immunmedierede hæmolyse udløses af auto-antistoffer. De to andre former er betinget af allo-antigener og forekommer ved hæmolytisk transfusionskomplikation eller hæmolytisk sygdom hos fostre/nyfødte(7). 12

13 Immunhæmolysen forekommer ved at IgG eller IgM binder til antigener på erytrocytternes overflade. Effekten startes ved at bindingen fritlægger domæner i Fc-delen af IgG/IgM, som komplementfaktor C1 kan binde til ( se figur 2.) Dermed er den klassiske aktiveringsvej for komplementkaskaden initieret. Erytrocytter har også receptorer for C1 og hvorvidt aktiveringen af komplementkaskaden fuldføres afhænger af koncentrationen af overflade-antigener og grupperingen sammenholdt med antistoffets aviditet og koncentration. Det sker sjældent, men den terminale del af komplementaktiveringen destruerer erytrocytterne intravaskulært via komplementmedieret cytolyse. Et enkelt membranangrebskompleks kan lysere erytrocytten pga. osmose. Det forekommer ved IgM-typen, som intensivt aktiverer komplement via den klassiske vej f.eks. transfusionskomplikationer med ABO-uforligeligt blod eller aktivering af kuldeautoantistoffer. Tilstanden kan hastigt udvikle sig ret alvorligt. Kuldeautoantistoffer binder til erytrocytter i fingre og tæer ved lave temperaturer og bindingen opløses i varmere dele af kroppen, men C3b bliver siddende på erytrocytten. Er erytrocytten opsoniseret med C3b i tilstrækkelige mængder, hvilket menes at være over fragmenter, genkendes cellen af makrofager i lever og milt, som via C3-receptorer fagocyterer erytrocytten komplementmedieret. Denne ekstravaskulære immunmedierede hæmolyse forekommer oftere. Hvis den C3b-opsoniserede erytrocyt ikke hæmolyseres vil fragmenter fraspaltes og talrige C3d-opsoniserede erytrocytter vil være i blodbanen. Makrofager i lever og milt fagocyterer erytrocytter med forskellig hastighed. Såfremt det er subklassen IgG1 eller IgG3, der er bundet til erytrocytten foregår destruktionen hurtigt ved Fc- receptormedieret fagocytose. Undersøgelser har vist at IgG3 er mest effektiv. Hvis der både er komplement og antistof på erytrocytten sker hæmolysen endnu hurtigere pga. opsoniseringen. De faktorer som har betydning for fagocytose af erytrocytter kan opsummeres til IgGsubklassen, graden af opsonisering og antal Ig, samt T-celleaktiviteten(7,23,24). Ætiologisk klassificering af AIHA. AIHA inddeles i grupper efter antistof-typen og temperaturoptimum. Den autoimmune respons kan være primær dvs. uden en klarlagt årsag eller sekundær dvs. en følge af en bagvedliggende sygdom(8). 13

14 1. Varme auto-antistoffer: Det er den hyppigste form med en incidens på 1: Den forekommer i alle aldersgrupper med lidt færre kvinder end mænd. Antistoffet er hyppigst IgG1 eller IgG3, men få er IgM eller IgA Ca. 50 % er primær. 1.2 Sekundær Lymfeproliferative sygdomme f.eks. kronisk lymfatisk leukæmi, non-hodgkins lymfom Autoimmune bindevævssygdomme f.eks. rheumatoid artritis, systemisk lupus erythematosus (SLE) Ikke lymfoide neoplasmer f.eks. ovarietumorer og bestemte kroniske inflammationssygdomme f.eks. ulcerativ colitis Virale infektioner f.eks. cytomeglovirus og Human Immundefekt Virus (HIV) Visse typer medicin (17,25,26). 2. Kulde auto-antistof: Primær er det en kronisk tilstand som oftest rammer personer over halvtreds år. Som følgevirkning af infektion er tilstanden kortvarig og forekommer i alle aldre. Prævalensen er fjorten pr. million med lidt flere kvinder end mænd. Ved kuldeagglutininsyndrom har antistoffet den optimale binding ved 4 0 C, men reaktionen starter allerede ved 30 0 C. Det er monoklonalt IgM, som binder komplement og giver intravaskulær hæmolyse ved kuldeagglutininsyndrom og sekundært til lymfeproliferativ sygdom. Som følge af infektion har det polyklonale IgM så snæver og lav temperaturoptimum, at det ikke giver anledning til hæmolyse. DAT er negativ medmindre der anvendes AHG-reagens med anti-igm. Alle voksne har antigen I på deres erytrocytter. 2.1 Kuldeagglutininer Primær kronisk kuldeagglutininsyndrom associeret med klonal B-lymfocyt proliferation med eller uden lymfom Sekundær kold agglutinin hæmolytisk anæmi postinfektuøst f.eks. mycoplasma pneumonia, skoldkopper, mononucleose, Epstein-Barr virus Medieret af kolde hæmolysiner. 14

15 Primær paroxymal kold hæmoglobinuræmi Sekundær Donald Landsteiner hæmolytisk anæmi (børn) Syfilis 3. Mixed kold og varm autoantistof 3.1. Primær Sekundær associeret til SLE(17,25,26). 4. Medicininducet 4.1 Der er mindst tre mekanismer for medicininduceret AIHA: Der dannes IgG-antistoffer mod lægemidlet, da det reagerer som hapten og bindes til et protein på overfladen af erytrocytten. Det er mekanismen ved antibiotika. DAT-analysen er positiv med IgG og oftest er der lidt hæmolyse Lægemidlet danner et nyt erytrocytantigen ved at binde sig til et substrat i erytrocytmembranen. Der dannes antistof mod det nye antigen og bindingen aktiverer komplementmedieret hæmolyse. Eks. kinin og rifampicin. DAT er positiv med anti-c Den klassiske antistofdannelse af IgG mod erytrocytmembranen uanset om lægemidler et tilstede eller ej. Der er ingen eller lidt hæmolyse(17). 15

16 Tabel 5 Typiske mønstre for DAT-resultater ved AIHA(17). Typiske mønstre for positive DAT-resultater i tilknytning til AIHA. DAT-specifik + IgG og/eller + C3 50 % + IgG og +C3 +C3 + IgG og + C3 +IgG + C3 Auto-antistof type Temperaturoptimum Varm type IgG 37 0 C Kold type IgM C Varm og kold type IgG og IgM Medicininduceret Hapten /IgG / C3 Autoantistoffets specificitet Panreaktiv Ofte anti- I Panreaktiv Ofte anti-rh Med mere end 300 kendte erytrocyt-antigener kategoriseret i over 30 blodtypesystemer er der en mangfoldighed af fænotyper. Men det er et fåtal, som har klinisk betydning(27). Men uanset specificiteten er ethvert antistof med temperaturoptimum ml C potentielt klinisk betydende. Udføres en serologiske test ved 37 0 C er det temperaturoptimum for både klinisk signifikante allo-antistoffer og autoantistoffer. Da varme autoantistoffer binder uspecifikt og sensibiliseringen med IgG-typen er reversibel kan der være frit antistof i plasma som forstyrrer indirekte AHG-tests og gør det nødvendigt at anvende mere komplicerede metoder. De varme autoantistoffer er oftest indenfor Rh- eller Diego blodtypesystemerne. Auto - anti-wr b er almindelig for varm AIHA (26). AIHA-diagnosen AIHA diagnostiseres på baggrund af anamnesen dvs. symptomer på anæmi, medicinforbrug, infektioner og almensymptomer(8). Nogle AIHA patienter er DAT-positive, men har ikke hæmolyse. Mekanismerne er ikke helt klarlagt, men følgende faktorer har betydning for udviklingen af AIHA: Antistoffets termiske amplitude, subklasse og evnen til at binde komplement in vivo. 16

17 Erytrocytternes sensibiliseringsgrad. Makrofagernes aktivitet. Forskelle i erytrocytternes membran-struktur(26). Nogle AIHA-patienter er DAT-negative, men har hæmolyse. Det kan skyldes følgende: Der er flere IgG på erytrocytterne end normalt, men for få til at blive detekteret med rutinemetoden. Sensibiliseringen kunne være med IgA eller IgM. Polyspecifikt AHG med anti-igg vil ikke give et positivt resultat(26). Figur 1 skitserer forløbet ved udredning af AIHA. Starten er symptomer på anæmi, anæmiudredning, måling af hæmolytiske biomarkører og DAT-analyse, som specificeres ved en positiv DAT. Figur 1 Forløbet ved udredning af AIHA. 17

18 Erytrocytserologi. Den erytrocytserologiske analyse Direkte Anti-humanglobulin Test (DAT) er baseret på den immunkemiske metode agglutination. Analyseprincippet benytter antistoffers kemiske og fysiologiske egenskaber til at genkende og binde til specifikke epitoper på antigener(28). Antistoffer. Antistoffer er immunglobuliner (Ig). Figur 2 illustrerer basalstrukturen for proteinerne, som er opbygget af to lette (L) og to tunge (H) polypeptidkæder sammenholdt af di-sulfid-bindinger i en symmetrisk konstruktion om en akse midt igennem molekylet. Strukturen ligner et Y og de to arme betegnes Fab-delen og foden Fc-delen. Ig s N-terminale del er de blå områder hvor antigenbindingen foregår. Specificiten af Ig er betinget af de variable aminosyresekvenser i de blå områder (VH og VL), samt hængselregionen dvs. den røde bølgede linje. De grønne L-kæder findes i to mulige sekvenser: kappa-(κ) og lambda (λ) -kæder. CH angiver de konstante dele af H-kæderne og findes i fem forskellige aminosyresekvenser, som betegner fem Ig-klasser med forskellige fysiologiske og kemiske egenskaber(29) Det er kun IgG og IgM som har komplementbindende egenskaber. De klinisk mest betydende antistoffer er af IgG-typen. Der er fire subklasser af IgG-typen, som adskiller sig på ændringer i CH-kæden. Der er flest IgG1, men IgG3 er bedre til at binde komplement. Det er kun disse to IgG-iso-typer, som makrofagernes Fc-receptorer kan binde til(26). Figur 2 Antistoffers struktur. 18

19 Affinitet og aviditet. Antistoffer karakteriseres af affiniteten dvs. bindingsstyrken mellem antigenets epitop og antistoffets paratop, som er de blå områder i Fab-delen i figur 2. Antigener er ofte multivalente og mange forskellige Ig er korresponderende til hver enkelt epitop. Antigener kan indeholde identiske epitoper og være immunologisk krydsreagerende dvs. det samme Ig binder til forskellige antigener. Et antistof med høj affinitet vil passe specifikt til epitopen, så molekylerne kan komme tæt på hinanden, hvorved der kan dannes mange forskellige intermolekylære bindinger mellem de variable domæner og epitopen i antigenbindingsstedet(29). Strukturen af de fem Ig-klasser varierer fra monomer til pentamer Ig-molekyler og antallet påvirker antistoffets aviditet dvs. den samlede bindingsevne(29). Anti-human-globulin. Anti- human globulin (AHG) er antistoffer produceret af dyr til at reagere med Fc-delen af humane Ig. AHG-testen visualiserer antigen-antistofreaktionen med inkomplette antistoffer. M. Coombs og Race beskrev testen i 1945 og derfor kaldes den også Coombs Test(30). AHG-reagensets komponenter har afgørende betydning for analysemetodens sensitivitet. Polyklonale antistoffer vil have varierende affinitet, men større aviditet, da mange forskellige epitoper genkendes. Egenskaben fremmes ved at poole antigener til immunisering og poole de producerede anti-igg, samt analysere de enkelte pools styrke for at kunne bestemme den optimale fortynding. Reagens med polyklonale antistoffer er derfor mere sensitivt og har subsidiært mindre specificitet og dermed er der risiko for uspecifikke reaktioner. Monoklonale antistoffer har en høj specificitet og krydsreaktioner kan minimeres ved at bruge en blanding heraf(28,30). Polyspecifik AHG indeholder både anti-human IgG og anti- humankomplement-c3d evt. med anti-c3b, - C4b og C4d tilstede. Der er hovedsageligt ikke reaktion mellem AHG og de tunge kæder i IgA og IgM, men der kan være reaktion med de lette kæder hhv. lambda og kappa. Den vigtigste funktion er at detektere IgG, da de fleste klinisk vigtige antistoffer er af denne type. Der er få antistoffer, som udelukkende binder til komplement, men i forhold til DAT og AIHA er anti-c3 en meget vigtig komponent, da nogle patienter kun har C3dg på deres erytrocytter. 19

20 Monospecifik AHG indeholder enten anti-igg eller anti-c3d.(31). En undersøgelse af indlagte patienter viste en forskel i antal DAT-positive fra 0,3 1 % med anti-igg op til 15 % med polyspecifik AHG, heraf var mange kun positive med C3d. Det er ofte en blanding af monoklonale anti-c3d og - C3b, som indgår i monospecifik AHG. Det minimerer risikoen for falsk-positive med anti-c3-pool, da det er vanskeligt at bestemme antistoffets styrke med en varierende mængde af anti-c3b og- C4b(30). Direkte Anti-humanglobulin Test (DAT). Analysen er baseret på hæmagglutination, som betegner reaktionen mellem human Ig bundet til erytrocytter og AHG-reagens, som binder til Fc-delen, hvorved der dannes agglutinater. Hæmagglutination foregår i to trin: Sensibilisering dvs. antigen-antistof-reaktion på erytrocyt-overfladen. Agglutination dvs. de sensibiliserede erytrocytter bindes sammen af AHG-reagensets sekundære antistof og der dannes agglutinater(27). DAT er direkte, idet kun trin to foretages in vitro, da analysen skal påvise om der er sensibilisering in vivo med Ig og/eller komplement C3d(1). DAT-analysen med polyspecifikt AHG-reagens angiver ikke specificiteten af sensibilisering. Da der kan være mange andre årsager til hæmolyse og klassifiseringen af AIHA har betydning for diagnosen bestemmes specificiteten med monospecifik anti-humanglobulin test i den specifikke DAT-analyse. Antigen-antistof bindingen er en reversibel kemisk reaktion og bindingsstyrken afhænger af antistof-typen. Pentameren IgM er komplette antistoffer, som kan agglutinere erytrocytter direkte, da de har en høj aviditet med ti bindingssteder. Et IgM-molekyle kan forbinde to erytrocytter samtidigt og danne et agglutinat uden AHG-reagens. De irregulære antistoffer af IgG-typen har en høj affinitet, men kun to bindingssteder. Størrelsesforholdet mellem erytrocytter og IgG er 1: 750 og erytrocytterne har en negativt ladet overflade. Det bevirker at afstanden mellem erytrocytterne bliver for stor til at et IgG-molekyle kan danne hæmagglutination. Det sekundære antistof fra AHG-reagens binder til erytrocyt-bundne IgG s Fc-del og danner bro mellem to erytrocyt-bundne IgG-antistoffer, hvorved agglutinationen opstår(7,27). Reaktionen er illustreret i figur 3. 20

21 Figur 3. Hæmagglutination. De grønne antistoffer danner forbindelse mellem sensibiliserede erytrocytter og der dannes et agglutinat. Søjleagglutinationsteknik. Både BioRad og BioVue anvender søjleagglutinationskort. Agglutinationen foregår i søjler med AHG-reagens og gel eller glaskugler, der virker som filter for agglutinater ved centrifugeringen. Ved en positiv reaktion bliver agglutinater tilbageholdt i søjlen. Et stort agglutinat giver en stærk reaktion og bliver tilbageholdt øverst i søjlen. Svagere reaktioner med mindre aggregater tilbageholdes længere nede i søjlen. Ved en negativ reaktion passerer erytrocytterne gennem søjlen og lægger sig i bunden(27). Reaktionsstyrkerne er illustreret i figur 4. BioRad og BioVue-metoderne. De tekniske dokumenter(32 35) angiver at reagenserne kvalitativt påviser IgG og komplement C3- fragmenter bundet til erytrocytter. Hvert lot er kontrolleret for korrekt reaktion. For begge metoder angives at anti-c3 ikke detekterer sensibilisering med C4 og der kan forekomme krydsreaktion med lette kæder og IgM med anti-igg(kanin). Der skal helst anvendes friske prøver, men BioVue angiver at prøverne kan opbevares ved C og testes indenfor tre dage. For at undgå falsk-positive resultater i BioVue skal erytrocytterne pakkes 80 % ved blodprøvens centrifugering, hvilket især kan være vanskeligt ved friske prøver. Det skønnes at være 3 5 minutter ved g(36). Tabel 6 viser forskelle og ligheder for BioRad og BioVue-metoderne ud fra de tekniske dokumenter(32 35,37) Det ses på bestanddelene i BioVue-polykassette at metoden er designet 21

22 til en høj sensitivitet med to monoklonale anti-c3d og makromolekylær forstærker. I DAT/IDAT-kassetten til den specifikke DAT analyse er der også anvendt to monoklonale anti- C3d. Indlægssedlen angiver at intensivt sensibiliserede erytrocytter kan agglutinere spontant i kontrolreagenset. For begge metoder er den negative kontrol en søjle med de samme komponenter som søjle 1 og 2 men uden antistoffer. Suspensionsmediet er i BioVue phosphat bufferet saltvand og for BioRad lav ionstyrke saltvand (LISS). BioVue benytter en to-trins centrifugering, som adskiller serum og erytrocytter og i kraft af en mindre densitet forbliver de neutraliserede serumproteiner over reagensets grænseflade. Den beskrevne centrifugering er afgørende for analyseresultaterne og centrifugen skal være kalibreret korrekt. BioVue vurderes visuelt når tvivlstilfælde ved den programmerede fejlkode skal valideres af bioanalytikeren. Glaskuglesøjlen vurderes bedst i dagslys i modsætning til gel-søjlen. Tabel 6 Komponenter i BioRad LISS/Coombs gelkort, DC Screening II og Ortho BioVue polykassetter og DAT/IDAT-kassetter. Metodernes komponenter Komponenter BioRad BioVue Gelmatrix sephadexgel glaskugler BioRad LISS/Coombs gelkort Polykassette Anti IgG (kanin) Monoklonal anti-c3d, cellelinje C1 39-9) Anti-IgG (kanin) Anti-C3d (mus, monoklonal klon F7G3) Anti-C3d (mus, monoclonal klon C4C7) AHG reagens polyspecifikt Konserveringsmiddel: < 0,1% NaN3 BioRAd DC Screening II gelkort Bufferopløsning: Bovint albumin Makromolekylær forstærker (dextran) Konserveringsmidler: 0,1 % natriumazid 0,01 M ethylendiamintetraacetat (EDTA) Farvestof: FD&C blå nr. 1 og gul nr. 5. DAT/IDAT- kassette AHG-reagens monospecifikt Suspensionsmedie Søjle 1: Anti-IgG (kanin) Søjle 2: Monoklonal anti-c3d, cellelinje C Søjle 3: Negativ kontrol ID-Diluent 2: Modificeret LISS til erytroytsuspension. Søjle 1: Anti-IgG(kanin) Søjle 2: (Monoklonale) Anti-C3b (mus klon F7G3) Anti - C3d (mus klon C4C7) Søjle 3: Negativ kontrol. Suwasol Phosphate buffered saline (PBS) Centrifugering 10 min ved 85 g Centrifugering i 5 min i 2 trin: 2 min v. 55 g og 3 min ved 199 g. Visuel vurdering Aflæses i lyskasse Aflæses i dagslys 22

23 Visualisering og reaktionsstyrker. Det anses for normalt at raske personer er sensibiliserede med 5 90 IgG molekyler/erytrocyt og 5 97 måske op til flere end 500 C3d molekyler/erytrocyt(9). Måleområdet for søjleagglutinationsteknik med IgG i gelkort, IUPAC: NPU20025, analysenummer 517; er immunproteinmolekyler/erytrocyt. Detektionsgrænsen er ca. 100 IgG molekyler/erytrocyt(11). Erytrocytternes sensibiliseringsgrad korrelerer med agglutinatets størrelse. Reaktionsstyrken vurderes afhængigt af, hvor agglutinaterne befinder sig i søjlen. Det tilstræbes at standardisere den visuelle aflæsning og graduering ved hjælp af fotovejledning(1). Figur 4 Princippet for aflæsning og visuel vurdering af reaktionsstyrker i søjleagglutination. Figur 4 viser princippet for aflæsning og visuel vurdering af reaktionsstyrke i søjleagglutination. Fotovejledningerne for BioRad(38) angiver fire positive gradueringer med plusser og BioVue (39) har fem positive gradueringer med tal. Da BioRads aflæsning inkluderer halve gradueringer er der i praksis otte positive gradueringer, som oprundes, så det svarer til de tre kategorier i svarafgivelsen. Tabel 7 viser en sammenstilling af BioRad og BioVue aflæsningssystemerne. Det ser ud til at, der er en overordnet sammenhæng mellem de to metoders fotovejledninger betinget af om hovedparten af agglutinater er i den nedre eller øvre halvdel af søjlen. Begge metoder har den negative reaktion som en helt flad samling af celler nederst i søjlen. I den nedre halvdel af søjlen er de svage reaktioner + og 0,5, 1. Reaktionsstyrke ++ og 2 har agglutinaterne spredt over hele søjlen, men BioVue betoner at halvdelen skal være i den nedre del. Reaktionsstyrker over ++ og 2 har agglutinater i den øverste halvdel og differentierer mellem 3 og 4 ved at den stærkeste reaktion danner et bånd øverst i søjlen. Mixed fields (MF) er en klar adskillelse af cellerne i top og bund og forekommer kun ved to populationer af erytrocytter dvs. transfusionskomplikationer. 23

24 BioVue har fejlkode, hvis der registreres for mange eller for få celler i søjlen eller det ikke er muligt for kameraet i AutoVue Innova at tage et anvendeligt foto. Ligeledes hvis der er bobler i søjlen eller fibrin. Resultatet er semi-kvantitativt og en positiv DAT gradueres efter den aflæste reaktionsstyrke(40). Tabel 7 (1,39) viser sammenstillingen af svarafgivelse og aflæst reaktionsstyrke. Tabel 7 Sammenstilling af svarafgivelse og graduering af DAT reaktionsstyrke for BioRad og BioVue. Svarafgivelse - Negativ + Svagt positiv ++ Middelstærkt positiv +++/++++ Stærkt positiv DAT reaktionsstyrke og svarafgivelse. DAT-analyse og specifik DAT. BioRad LISS/Coombs gelkort DC Screening II Analysemetode Aflæst reaktionsstyrke BioVue Polykassette DAT/IDAT-kassette - 0 (+) + +(+) ++ ++(+) (+) , Ifølge Klinisk Immunologisk Afdelings usikkerhedsestimat(41) svares semikvantitative analyser som en score på en rangstillet ordinalskala. Usikkerheden på scoren er et kvalificeret skøn. Hvis scoren er +++ er usikkerheden + dvs. det er estimeret, som overvejende sandsynligt at det sande svar ligger indenfor ++ og Der er ikke en vedtaget svarpolitik for DAT-analyse med BioVue. I projektet anvendes inddelingen som illustreret i tabel 7. 24

25 Metoder. Undersøgelsens design og dataindsamlingens fremgangsmåde og kvalitetssikring beskrives. Etiske overvejelser omtales og der redegøres for de metodiske overvejelser og valg af data i relation til undersøgelsens formål og problemformulering, samt anvendte materialer. Litteratursøgningen anskueliggøres. Design Sensibilisering af erytrocytter er associeret til autoimmun hæmolytisk anæmi, så sensitiviteten af målemetoden kan anses som en confounder til DAT-analysen og diagnosticering. For at kunne sammenligne de to metoder vha. hæmolytiske biomarkører skal prøvematerialet være så sammenligneligt som muligt mht. alle øvrige årsager. Jo flere faktorer, som kan tænkes at påvirke den mulige sammenhæng mellem DAT-reaktionen og hæmolyseprofilen, jo mindre anvendeligt vil resultatet blive som grundlag for at fastsætte en nedre klinisk relevant grænseværdi ved implementering af BioVue-metoden til daglig DAT-analysering. Teoretisk set skulle patientgruppen være så homogen, at det kun er DAT-resultatet, som adskiller dem fra hinanden. Projektets design skal i så vidt muligt leve op til idealet og derfor afgrænses patientgruppen. Aldersgrænsen er sat til atten år, da referenceintervaller er meget forskellige for børn og voksne. Hæmatologiske patienter kan have mange forskellige sygdomme, hvor en positiv eller negativ DAT indgår i anæmiudredningen(16). IHA er en heterogen sygdomsgruppe og hæmolyseprofilen vil være præget af hvorvidt immunresponset er initieret af auto- eller alloantigener(42). AIHA er udvalgt fordi DAT-analysen indgår i diagnosticering og specificiteten har betydning for behandlingen. Men det må anses for sandsynligt, at der vil være relativt få positive DAT-resultater i projektperioden. Undersøgelsen er et kvantitativt pilotprojekt, som eksperimentelt sammenligner manuel og automatiseret søjleagglutinationsmetode til DAT-analyser med henblik på en metodevalidering, som kan bidrage til at fastlægge en klinisk relevant nedre grænseværdi for den automatiske metode. Pilotprojektet tager afsæt i resultater fra metodevalideringer, hvor det er observeret, at den automatiske metode er mere sensitiv end den manuelle, men uden entydig systematisk 25

26 variation. Pilotprojektet anskuer problemstillingen fra en anvendelsesorienteret synsvinkel med kvalitetssikring, klinisk relevans og den enkelte patient i fokus. Pilotprojektet er struktureret i to faser: Første fase genererer parallelle DAT-resultater med rutine-patientprøver analyseret med begge metoder. Styrker og svagheder ved de to metoder for DAT og specifik DATanalyse vurderes med henblik på kvalitetssikring og klinisk relevans for diagnosticering af AIHA. Fase to sammenholder resultater fra klinisk relevante kvantitative biokemiske analyser for de samme patienter og det semikvantitative serologiske DAT-resultat for hver metode. Såfremt sammenstillingen viser en sammenhæng mellem reaktionsstyrken for hhv. BioRad og BioVue DAT-resultater og hæmolyseprofilen, anvendes denne sammenhæng som analysemodel i forhold til de patientprøver som er positive i BioVue og negative i BioRad. Mulighederne for at fastsætte en klinisk relevant nedre grænseværdi for DAT vurderes. In - og eksklusionskriterier. Inklusion: EDTA-stabiliseret blodprøve. Hæmatologiske patienter over atten år, som har fået foretaget DAT-analyse målt på begge metoder. De biokemiske analyser er foretaget samme dag eller maksimalt 5 dage efter DAT-analysen. Eksklusion: Prøvemateriale: Til DAT-analysen er det bedst at bruge blodprøver tilsat antikoagulans og EDTA anbefales til BioVue. Komplementfragmenter kan binde til erytrocytter in vitro i kølede koagulerede blodprøver(31). Prøver som har overskredet grænsen på fem dage mellem analyserne ekskluderes, da hæmolyseprofilen kan ændres hurtigt. Det er bedst med samtidige resultater for de serologiske og biokemiske analyser. Grænsen er sat med udgangspunkt i LD og HAPT, som kan ændre sig markant efter fem dage(19). Gravide ekskluderes, da reticulocytter og LD påvirkes af graviditeten. 26

27 Patientprøver som udviser MF og der er givet erytrocyt- transfusion indenfor 120 dage ekskluderes. Etik Kapitel 9 i Sundhedsloven(12) beskriver begrænsninger for indhentning af helbredsoplysninger. Overlæge Jacek Kieselewicz, Hæmatologisk Dagklinik, SHS, Aabenraa(13) har givet tilladelse til at oplysninger om de fem hæmolytiske biomarkører kan indhentes ved opslag i BCC for de patienter som hæmatologisk afdeling i Aabenraa rekvirerer en DAT-analyse til. Det er i patienternes interesse, at DAT-analysen foretages med metoder, som bedst muligt sikrer analyseresultater af høj kvalitet. Det er afgørende for patientforløbet og IK s kvalitetsudvikling at den teknologiske progression indenfor analysemetoder løbende vurderes og synkroniseres med den kliniske anvendelse af analyseresultaterne. Projektet er omfattet af tavshedspligten i Sundhedslovens kapitel 9 og patientprøver anonymiseres med et nummer. Den ekstra DAT-analyse af patientprøverne vil ikke betyde en yderligere belastning af patienterne og rutinesvaret bliver ikke forsinket eller påvirket, da BioVue udføres efter BioRad. Projektet vil ikke afsløre nye forhold vedrørende patienternes tilstand, men det vil være forventeligt at der kan forekomme uoverensstemmende resultater for de to metoder. Da det er rutine-analyser sikres kvaliteten af resultaterne gennem kontrol og besvarelse af en bioanalytiker. Såfremt BioVue resultaterne afviger så meget at det giver anledning til at tvivle på BioRad-resultatet konfereres med en bioanalytiker. Dataindsamling Den eksperimentelle del af dataindsamlingen blev udført i perioden 24/10 11/ sammen med Martin Töffner Pedersen og Dennis Renkwitz Holm. Vi vidste at DAT-analyser er fåtallige. Heldigvis var det muligt for Martin Töffner Pedersen at analysere DAT-patientprøver i rutinen på IK, SHS med begge metoder i perioden 23/5 til 3/ Fremgangsmåden var den samme, som beskrevet under forsøgsprotokol. Indledningsvist foretog vi et interview d. 14. oktober 2016 med overlæge Jacek Kieselewicz, Hæmatologisk Dagklinik, SHS, Aabenraa(13). Formålet var at afstemme udvalget af biokemiske analyser i forhold til klinisk relevans i forbindelse med vurdering af hæmolytisk tilstand. 27

28 Endvidere at få indsigt i hæmatologisk afdelings anvendelse af DAT -resultater og reaktionsstyrker, samt holdning til en øget sensitivitet af metoden til DAT-analysen. Forsøgsprotokol Der blev anvendt rutine-patientblodprøver og fremgangsmåden for rutineanalyser ifølge beskrivelserne i Qualiware. Samtlige data blev samlet i et excel-ark. Den EDTA-stabiliserede patientblodprøve blev centrifugeret 5 min ved 1800 g. BioRad-metoden: Der blev udført DAT-analyse med BioRad LISS/Coombs gelkort. Resultaterne blev vurderet ved hjælp af en lyskasse. Forside og bagside af gelkortet blev aflæst. Ved positiv reaktion blev den kraftigste noteret som reaktionsstyrken(1). Såfremt analysen var negativ blev yderligere analyser ikke udført. Såfremt analysen var positiv blev specifik DAT med BioRad DC Screening II gelkort udført(43). Resultaterne blev skrevet i en forsøgsprotokol med prøvenummer, lot.nummer, dato og aktør anført. En bioanalytiker kontrollerede resultatet og foretog svarafgivelsen til rekvirenten. BioVue-metoden. Samme prøve blev analyseret efterfølgende på AutoVue Innova med Ortho BioVue polykassetter. Såfremt det var med negativt resultat blev der ikke udført yderligere analyser. Såfremt resultatet af DAT-screen var positivt blev DAT med BioVue DAT/IDAT-kassetter udført. Såfremt der var resultater, som ifølge programmeringen var tvivlsomme blev søjlerne valideret ved visuel aflæsning ved dagslys og supervisering af en bioanalytiker. Ved MF blev det undersøgt ved opslag i Prosang om patienten var transfunderet. Resultaterne blev dokumenteret ved udskrift af foto. Registeropslag: Indhentning af patientdata blev foretaget ved opslag i Prosang vha. prøvenummeret. Køn, alder og evt. graviditetsrelaterede undersøgelser og transfusion indenfor 120 dage, samt analysedatoer blev noteret. Herefter anvendtes CPR-nummeret til at indhente oplysninger om resultaterne af de biokemiske analyser i BCC. 28

29 For 32 hæmatologiske patienter i et behandlingsforløb på SHS i 2016 med tidligere positive DAT- rutineanalyser med BioRad blev resultaterne fra biokemiske analyser i BCC indhentet på samme måde. Kvalitetssikring For at minimere fejlkilder blev følgende foretaget: Hæmolytiske biomarkører blev udvalgt ved litteratursøgning og den kliniske relevans blev bekræftet af overlæge Jacek Kieselewicz ved interviewet(13). Præanalytisk kontrolleredes patientprøverne visuelt for koagler, hæmolyse, fibrin eller andre uklarheder, som kan give fejlagtige resultater evt. gentages centrifugering. Visuelt kontrolleredes at søjleagglutinations-reagenserne var anvendelige Minimum 1 mm væske over søjlerne og ingen bobler Ingen misfarvning eller andre tegn på mikrobiel kontaminering Ingen mekaniske beskadigelser af gelkort/kassetter. Udløbsdatoen er ikke overskredet. For at sikre en objektiv visuel vurdering ved BioRad foretages analyseringen med denne metode først. Hvis et prøveresultat var uforklarligt inkonklusivt blev analysen gentaget. Såfremt resultatet var negativt anden gang, blev analysen gentaget. Ved to på hinanden følgende negative svar blev resultatet accepteret. Ved BioRad-metoden blev analyseringen superviseret af en bioanalytiker, som også kontrollerede aflæsningen og resultatet og foretog svarafgivelsen. Ved BioVue-metoden blev validering superviseret af en bioanalytiker. Det daglige og ugentlige vedligehold af AutoVue Innova blev udført af bioanalytikere. Vi foretog en indbyrdes kontrol af data noteret i Excel-arket og BioRad-forsøgsprotokol for at undgå forbytning og fejlnotering. De anvendte lot.numre af BioRad gelkort og BioVue- kassetter blev modtagekontrolleret for at sikre at udstyret opfylder de lovgivne kvalitetskrav til blodbanksvirksomhed(44). Ud fra instrukserne i Qualiware blev positive kontroller fremstillet: Fremstilling af svagt IgG-sensibiliserede erytrocytter(45). 0,8 % erytrocytsuspension af optøede C3d-sensibiliserede erytrocytter(46). 29

30 Der er ikke fastsat kontrolkrav til reaktionerne i BioVue. For at sikre at de fremstillede reagenser fungerede tilfredsstillende blev foretaget en analyse af BioRad gelkort med de samme positive kontroller selvom det var foretaget i laboratoriets rutine. Modtagekontrollen var acceptabel og resultaterne fremgår af tabel 8 og 9. Tabel 8 Modtagekontrol af BioVue- kassetter. Polykassetter DAT-screen Kontroldato IDATkassetter DAT Lot.nr. + udløbsdato Lot.nr. AHC 028F ( ) Lot.nr. AHC 563A ( ) Lot.nr. 001F ( ) Modtage kontrol af BioVue - kassetter. Kassettetype. Positiv kontrol. Reaktionsstyrke 26/ IgG 3 (MF) 25/ C3d 3 (MF) IgG 2 25/ C3d 4 IgG C3b, C3d Ctl 26/ IgG 3 (MF) / C3d Tabel 9 Modtagekontrol af BioRad gelkort. Modtagekontrol af BioRad gelkort Reaktionsstyrke Lot.nr. Parallelkontrol med BioVue Laboratoriets kontrol Kontrolkrav BioRad LISS/Coombs BioRad DC screen II /10 16 IgG +(+) ++++ (LISS Coombs kontrol) /10-16 C3d (+) IgG C3d Ctl IgG C3d Ctl IgG C3d Ctl 26/ /

31 Litteratursøgning Indledningsvist blev der søgt bredt på bibliotek.dk og PubMed. Bibliotek.dk Coombs test 164 hits Anæmi 80 hits Hæmolytisk anæmi 21 hits Autoimmun hæmolytisk anæmi 2 hits autoimmune haemoelytic anæmia autovue 1 hit Pubmed Direct antiglobuline test sensitivity 327 hits Serological test for drug-induced immune hemolytic anemia 45 hits Autoimmune hemolytic anemia review 1027 hits Søgningen blev afgrænset til de nyeste artikler, på dansk og engelsk og enkelte blev udvalgt efter skimming af abstracts. Dernæst blev kædesøgning foretaget i de samme databaser fra udvalgte artikler og bøger, samt referencer fra konsulent Kent Elkrog, Ortho Clinical Diagnostics. Materiale 128 patientblodprøver EDTA-stabiliseret til rutine DAT-analysering. De 98 prøver er fra 23. maj til 3. august 2016 og de 30 prøver fra 24 oktober til 11. november Centrifuger: Hettich Universal 320/Rotanta 420, Dia Med Centrifuge 12 S II Cell-stab lot.nr Pipetter Lyskasse til aflæsning af BioRad gelkort. BioRad LISS/Coombs gelkort lot.nr.: 23/5 16: , 14/6-16: , 24/10-16: BioRad DC Screen II lot. nr.: 6/6-16: , 5/7-16: To Ortho AutoVue Innova/Ultra Ortho BioVue polykassetter lot.nr.: 25/5 16: AHC 563A, 25/10 16: AHC 028F. 31

32 Ortho Biovue DAT/IDAT- kassetter lot.nr.: 25/ F. Positive kontroller til modtagekontrol af BioRad gelkort og BioVue-kassetter: Optøet C3d sensibiliserede erytrocytter o Cell-Thaw lot.nr Egen fremstilling af svagt sensibiliserede IgG erytrocytter. o BioRad Medical Diagnostics Kontrol anti-d: Seraclone Anti-D (RH1) Blend. Lot. Nr Data fra Prosang vedrørende køn, alder, graviditet, transfusion. Data fra BCC vedrørende analyseresultater til hæmolyseprofil se tabel 1. Databearbejdning Ud fra projektets problemformulering vælges data til den videre bearbejdning. Indledningsvist skabes overblik over patientgruppen og dernæst følges de to faser i projektets design. Da det er et anvendelsesorienteret pilotprojekt, som benytter en ikke-valideret analysemetode prioriteres metodevalidering i databearbejdningen. Der medtages kun data, som er analyseret med begge metoder, selvom der er 32 positive BioRad resultater tilgængelige og det må erkendes at være en svaghed at der er meget få positive resultater at bearbejde. Dette valg begrundes i problemformuleringens sigte mod at anvende en mulig sammenhæng mellem analyseresultater fra begge metoder i forhold til den hæmatologiske patients hæmolyseprofil for at kunne danne grundlag for fastsættelse af en nedre klinisk grænseværdi for DAT. Når der kun anvendes parallel-analyserede patientprøver vil forskelle mellem de to metoder blive mere synlige og sammenhænge mellem metoderne og hæmolyseprofilen bliver mere transparent med en stringent datagenerering. En forenkling af den komplekse problemstilling vil være en styrke ved vurdering af resultaterne og deres anvendelsesmuligheder. 32

33 Hæmatologiske patienter. I alt er 128 patientprøver analyseret med både BioRad og BioVue-metoden. Der skabes overblik over stikprøven ved at undersøge fordelingen mht. køn, alder, rekvirerende afdeling, transfusion, antal dage mellem serologisk og biokemisk analyse, samt graviditet. Med baggrund i in- og eksklusionskriterierne er der 105 hæmatologiske patienter til den videre databearbejdning. En prøve af de 105 ekskluderes, da den er inkonklusiv i BioRad og negativ i BioVue. Der er få positive BioRad-resultater og derfor vil et afvigende resultat kunne forårsage bias. I BioRad blev prøvens DAT-resultat første gang (+), men negativ i specifik-dat. Anden gang prøven blev analyseret var den negativ i DAT, men (+) i IgG i specifik DAT og negativ i C3d og Ctl. Herefter blev erytrocytterne vasket i saltvand og så blev begge BioRad DAT-analyser negative. Prøven var negativ i BioVue ved første analysering og i øvrigt negativ i BioVue screen-test. For hver metode opdeles data i negative og positive og fordeles efter køn og reaktionsstyrker. Fase 1: Styrker og svagheder ved BioRad og BioVue for DAT- og specifik DAT. Forskelle og ligheder mht. aflæsningsskalaer og -former undersøges ved optælling af de registrerede positive reaktioner for både DAT-analyse og specifik DAT for de to metoder. De aflæste reaktioner opsummeres og sammenstilles efter BioRads graduering med halve reaktionsstyrker og vurderes med udgangspunkt i svarpolitikkens tre kategorier. Sammenstillingen skal belyse i hvilken grad metodernes forskellige aflæsningsformer og gradueringsskalaer påvirker en sammenligning af metodernes sensitivitet og svarafgivelsen. Metodernes sensitivitet sammenlignes ved at opstille analyseresultaterne efter reaktionsstyrke fra de to metoder for DAT og specifik DAT hhv. IgG og C3. Sensitivitetsskemaet afdækker, hvilke patientprøver, der er negative i BioRad og positive i BioVue. Disse prøver anvendes i fase 2. Mulige fejlkilder for resultaterne vurderes. 33

34 Fase 2: Sammenhæng mellem hæmolyseprofilen og DAT-reaktioner for BioRad og BioVue. Som forventet er der få positive resultater og færre antal jo stærkere reaktion. Normalfordelingen for de hæmolytiske biomarkører er vurderet for de negative DAT-reaktioner ved hjælp af qq-plot og resultatet er tvetydigt. Ved reaktionsstyrker over 1 i BioRad og 2 i BioVue er der kun et par resultater for hver reaktionsstyrke. Derfor er den statistiske bearbejdning mht. hæmolytiske biomarkører beskrivende og ikke konkluderende. For at anskueliggøre sammenhængen mellem hæmolytiske biomarkører og DAT-reaktioner fremstilles et dot-plot for hver biomarkør indenfor hver metode. Data er grupperet efter referenceintervallerne, da afvigelser i forhold hertil er i fokus mht. graden af hæmolyse. Det er hensigten at skabe en analysemodel for sammenhængen, som anvendes til at analysere de patientprøver, som er DAT-positive i BioVue, men negative i BioRad. En nedre klinisk relevant grænseværdi for DAT vil skulle fastsættes i det måleområde. Af hensyn til sammenligningen mellem de forskellige grupperinger anvendes medianen. Der er outliers i nogle analyser og medianen er mere robust overfor store afvigelser i et lille datasæt. Medianen er beregnet ved at sortere måleværdierne efter mindst til størst, tildele en rangordning og finde det midterste tal i rækken. Såfremt det midterste tal viser sig at bestå af to værdier beregnes medianen ved lineær interpolation(47). Resultaterne fra dot-plots anvendes til at opstille en analysemodel i form af en hæmolyseprofil, som kan anvendes til at sortere de uoverensstemmende analyseresultater og skitsere en nedre klinisk relevant grænseværdi. Resultater Hæmatologiske patienter. De 104 hæmatologiske patientprøver fordeler sig på 50 kvinder og 54 mænd. Der er flest kvinder mellem år og flest mænd ti år yngre dvs år. Ved en grænse på 70 år fordeler kvinderne sig ligeligt på hver side 25/25 og der er en lille overvægt af yngre mænd 33/ 21. En grænse på 50 år fordeler kvinderne 8/42 og mændene 11/43. 34

35 Elleve havde fået erytrocyttransfusion indenfor 120 dage fem kvinder og seks mænd, men ingen gav MF i BioVue. I stor udstrækning var prøverne analyseret samtidigt for sensibilisering og hæmolytiske biomarkører, kun seks prøver havde et døgn mellem analysetidspunktet. BioRad: Der er 90 negative ligeligt fordelt på negative mænd og kvinder. Der er i alt 14 positive, 9 mænd og 5 kvinder. De 11 prøver har reaktionsstyrke(rs) 1. De er 3 prøver med stærkere reaktion. BioVue: Der er 78 negative, fordelt på 41 mænd og 37 kvinder. Mænd og kvinder fordeler sig nogenlunde ligeligt på alle reaktionsstyrker. Der er i alt 26 positive, 19 svagt positive og 7 med RS over 1. 35

36 Aflæste positive reaktionsstyrker for DAT- og DAT-specifik. Tabel 10 Antal aflæste positive DAT-reaktioner og specifik DAT fordelt efter metodernes gradueringer og kategoriseret efter svarafgivelsen. 26 BioVue-positive hæmatologiske patientprøver Aflæst reaktionsstyrke og specificitet. DAT/ Analysemetode Specifik DAT BioRad BioVue Positive i alt LISS/Coombs DC Screening II gelkort gelkort Polykassette DAT/IDATkassette Svarkategori Svagt positiv (+) + Antal i alt 11 Antal (aflæst reaktionsstyrke ) 6 (+) 5 + Specificitet (aflæst reaktionsstyrke) Antal i alt Antal (reaktionsstyrke) Specificitet (reaktionsstyrke) C3d IgG C3d IgG C3b 1 negativ 8 negative 4 (+) 11 (0,5) 2 (0,5) (1) (+) 1 +(+) 0 8 (1) 2 neg 1 (0,5) 2 (0,5) 0 Middelstærk positiv +(+) ++ Stærk positiv ++(+) (+) (2) (1) 0 1 (0,5) 0 1(1) 0 1(2) 0 2 (3) 2 (3) 0 Inkonklusiv reaktion i alle 2 (4) brønde incl. negativ kontrol Tabel 10 viser en sammenstilling af de aflæste RS for hhv. BioRad og BioVue kategoriseret efter svarafgivelsen. Negativ i specifik DAT angiver at der ikke kan detekteres en specificitet for prøven. 0 i C3d angiver at prøven er positiv i specifik DAT, men ikke positiv i C3. 36

37 Lilla markering: Denne prøve er nr. 107, som var positiv i DAT ved begge metoder, men kun positiv i DAT-specifik med BioVue. Den var kun positiv i C3 og derfor tælles prøven som negativ i IgG. Tabel 10 viser fordelingen af antal prøver for de aflæste reaktionsstyrker for begge metoder. Optællingen vises for både DAT-analysen og specifik DAT. Svarkategorien indeholder score på ordinalskalaen fra begge analyser transformeret til tekst og oprundet til den kraftigste reaktion. F.eks. vil svaret for en svagt positiv i DAT-analysen, som er middelstærk positiv for IgG i DATspecifik være: Middelstærkt positiv med specificitet for IgG. Resultaterne for DAT-analysen viser at der for begge metoder er flest svagt positive reaktioner og meget få med stærkere reaktion. I specifik DAT er kun én prøve positiv for komplement og kun i BioVue. Stærkt positive med reaktionsstyrke 4 i BioVue er inkonklusive. Sammenligning af BioVue- og BioRad-metodernes sensitivitet. Af hensyn til læsevenligheden er de aflæste reaktioner for BioRad omsat til talværdier efter grupperingen i tabel 10. Tabel 11 Sammenligning af DAT-resultater for BioRad og BioVue. 104 hæmatologiske patientprøver. 104 hæmatologiske patientprøver Opdeling efter reaktionsstyrke DAT-analyse BioVue Innova i Ortho BioVue polykassette 0 0, Total BioRad LISS/Coombs gelkort Total Markeringen med lilla viser de tolv prøver, der er positive i BioVue, men negative i BioRad. Disse prøver viser forskellen i sensitivitet mellem de to metoder. Prøverne udgør tabel 14. Sammenhæng mellem hæmolyseprofil og de negative BioRad/positive BioVue. De brune tal markerer de uoverensstemmende reaktioner. I alt er 19 reaktioner uens. Det giver en overensstemmelse på 82 %. 37

38 Tabel 12 Sammenligning af DAT-specifik IgG resultater for BioRad og BioVue. 26 positive efter BioVue. 26 BioVue-positive IgG - Opdeling efter reaktionsstyrke DAT-specifik IgG AutoVue Innova i Ortho BioVue DAT/IDAT-kassette 0 0, Total BioRad DC Screening II gelkort Total Brun markering: De 13 prøver som er negative i BioRad har ikke været analyseret med specifik DAT, da de var negative i DAT-analysen. De to prøver med RS 4 er inkonklusive i Biovue pga. reaktion i samtlige søjler incl. den negative kontrol. Der er ikke reaktion i den negative kontrol i BioRad. Lilla markering: Prøver der er DAT-specifik analyseret i begge metoder og giver uoverensstemmende reaktioner. Uoverensstemmende resultater i tabel 12: BioVue: Der er 13 prøver som var positive i DAT, men de 10 er negative i specifik-dat, IgG. Herunder nr. 107, som er positiv i specifik DAT, C3d. BioRad: De 10 prøver som er negative har ikke været testet, da prøverne var negative i DATanalysen. Tabel 13 Sammenligning af DAT-specifik C3d resultater for BioRad og BioVue. 26 positive efter BioVue. DAT-specifik C3d BioRad DC Screening II gelkort 26 BioVue-DAT-positive C3d -Opdeling efter reaktionsstyrke. AutoVue Innova i Ortho BioVue DAT/IDAT-kassette 0 0, Total Total Tabel 13 viser kun et positivt resultat for komplement i specifik DAT. Prøven er kun positiv på BioVue. De 2 prøver med RS 3 for C3d i specifik DAT på BioVue var begge inkonklusive, da der var reaktion i den negative kontrol. De er negative i BioRad. 38

39 Sammenhæng mellem DAT-reaktioner og hæmolyseprofilen. Dot-plots for de fem hæmolytiske biomarkører og RS grupperet efter RI illustrerer sammenhængen mellem DAT-resultater og hæmolyseprofilen. Illustrationerne præsenteres først for BioRad og dernæst for BioVue. For hver biomarkør er sammenhængen illustreret i et dot-plot. Medianen er markeret når der er mere end tre prøver i RS. Medianen er 0,5-fraktilen og der er lige mange patientprøver hhv. over og under denne værdi. Der er forskel i antal patientprøver mellem de enkelte dotplots. Især HAPT og LD mangler data pga. for højt hæmolyseindeks. I dot-plots følges den samme grafik, som forklaring til samtlige figurer illustreret i figur 5. Figur 5 Grafik til forklaring af dot-plots. 39

40 Hæmoglobin mmol/l Hæmoglobin mmol/l Direkte Anti-humanglobulin Test: Er der en nedre klinisk relevant grænseværdi? Dot-plots for BioRad BioRad Hæmoglobinniveau og reaktionsstyrke 50 kvinder 7,9 7, Reaktionsstyrke Figur 6 Dot-plot BioRad HB- kvinder. Der er 45 negative, RS 1: 3 positive, RS 2 og 4: 1 positiv. RS 3: Ingen positive. 11 BioRad Hæmoglobinniveau og reaktionsstyrke 54 mænd HÆM , Reaktionsstyrke Figur 7 Dot-plot BioRad HB mænd. 45 negative. RS 1: 8 positive. RS 2 og 3: Ingen positive. RS 4: 1 positiv. 40

41 Reticulocytter x 10 9 /L Reticulocytter x 10 9 /L Direkte Anti-humanglobulin Test: Er der en nedre klinisk relevant grænseværdi? BioRad Reticulocytantal og reaktionsstyrke 50 kvinder Reaktionsstyrke Figur 8 Dot-plot BioRad RETI kvinder. 44 negative. RS 1: 3 positive. RS 2, 3 og 4: 1 positiv. BioRad Reticulocytantal og reaktionsstyrke 53 mænd HÆM Reaktionsstyrke Figur 9 Dot-plot BioRad RETI mænd. 45 negative. RS 1: 6 positive. RS 2 og 3: ingen positive. RS 4: 1 positiv. 41

42 Lactatdehydrogenase U/L Lactatdehydrogenase U/L Direkte Anti-humanglobulin Test: Er der en nedre klinisk relevant grænseværdi? BioRad Lactatdehydrogenase og reaktionsstyrke 53 MK < 70 år 550 Outlier Reaktionsstyrke Figur 10 Dot-plot BioRad LD < 70 år. 48 negative. RS 1: 4 positive. RS 2 og 3: Ingen positive. RS 4: 1 positiv. BioRad Lactatdehydrogenase og reaktionsstyrke 41 MK 70 år 550 Outlier Reaktionsstyrke Figur 11 Dot-plot BioRad LD 70 år. 34 negative. RS 1: 6 positive. RS 2 og 3: ingen positive. RS 4: 1 positiv. 42

43 Haptoglobin g/l Bilirubin g/l Direkte Anti-humanglobulin Test: Er der en nedre klinisk relevant grænseværdi? 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,88 BioRad Haptoglobin og reaktionsstyrke 12 MK < 50 år Reaktionsstyrke Figur 12 Dot-plot BioRad HAPT < 50 år. 11 negative. RS 1 :1 positiv. Ingen positive for stærkere RS. 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 BioRad Haptoglobin og reaktionsstyrke 63 MK 50 år 1,29 1, Reaktionsstyrke Figur 13 Dot-plot BioRad HAPT 50 år. 55 negative. RS 1: 6 positive. RS 2 og 3: Ingen positive. RS 4: 2 positive. 43

44 Hæmoglobin mmol/l Bilirubin µmol/l Direkte Anti-humanglobulin Test: Er der en nedre klinisk relevant grænseværdi? BioRad Bilirubin og reaktionsstyrke 104 MK HÆM Outlier Reaktionsstyrke Figur 14 Dot-plot BioRad BILI MK. 90 negative RS 1: 11 positive. RS 2: 1 postiv.rs 3: ingen positive. RS 4: 2 positive. Dot-plots for BioVue ,1 BioVue Hæmoglobinniveau og reaktionsstyrke 54 kvinder HÆM 6,5 8,8-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Reaktionsstyrke Figur 15 Dot-plot BioVue HB kvinder. 37 negative. RS 0,5: 6 positive. RS 1: 3 positive. RS 2: 2 positive. RS 3 og 4: 1 positiv. 44