Humane embryonale stamcellers udvikling til kardiomyocytter

Transkript

1 Elise Hoffmann Munk Nielsen STAMCELLER 885 Humane embryonale stamcellers udvikling til kardiomyocytter Samt patenteringsproblemstillingen Dette er den tredje af 5 artikler, der gør status over de senere års resultater inden for human embryonal stamcelleforskning. Artiklerne beskriver først forskning inden for en specifik vævstype, dernæst gives et generelt perspektiv på det, såsom terapeutisk kloning, teratomdannelse, transplantatsafstødning og etiske problemstillinger. Her ses på celler, der har egenskaber karakteristiske for kardiomyocytter og på patentering og kommercialisering af stamceller. biografi: Forfatteren er turnuslæge. Hun har som lægestuderende i samarbejde med endokrinologisk afdeling på Odense Universitetshospital lavet et literaturstudie om de seneste års udvikling inden for stamcelleforskning. forfatters adresse: Nørrebrogade 164A, 5. sal, 2200 København N. eniel99@student.sdu.dk Kardiomyocytlignende celler er nu udviklet ud fra humane embryonale stamceller uden om embryoid body-stadiet. Cellerne har egenskaber karakteristiske for kardiomyocytter, men yderligere forskning er nødvendig før cellerne en dag kan anvendes til behandling. Patentering af stamceller spiller en rolle både for fremdriften af forskningen, men også i forhold til potentielle rettigheder til fremtidige behandlingsformer. Patentering af stamceller rejser et etisk dilemma. Forskning i stamceller kan bidrage til den videnskabelige fremdrift på mange områder. Viden om stamceller kan bedre vores forståelse af fosterets udvikling, samt anvendes i efterprøvning af medicinsk behandling. Umiddelbart mest interessant er dog stamcellens potentielle evne til at generere alle menneskekroppens forskellige vævstyper. En række sygdomme skyldes nedsat eller defekt funktion af eller mangel på en specifik celletype. Anvendelse af stamceller udgør et interessant behandlingspotentiale i forbindelse med denne type sygdomme, som eksempelvis omfatter diabetes, forskellige degenerative neurologiske sygdomme, leversygdomme, men også myokardieinfarkt. Meget af den igangværende stamcelleforskning retter sig netop mod at effektivisere proliferation og kontrollere differentiering af stamceller med henblik på at generere væv eller celler, der kan transplanteres bl.a. til hjertepatienter.

2 886 Åreforkalkning af koronarkarrene og tilstopning af disse fører til nedsat blodforsyning af kardiomyocytterne. Både det akutte infarkt, men også den deraf følgende iltdeprivation, medfører celledød og dermed nedsat hjertepumpefunktion. Endnu har man ikke identificeret specialiserede eller voksne stamceller i hjertevævet, som efter beskadigelse af hjertet kan dele sig og udvikle sig til»erstatningsceller«en proces der ses i mange andre væv. Forskning i stamceller Forskere arbejder med at dirigere humane stamcellers udvikling til kardiomyocytter, der kan transplanteres og forbedre patienters hjertefunktion. Reparation af et hjerte vil kræve utroligt mange celler, hvorfor cellernes evne til at proliferere er essentiel for denne forskningsniche. Humane embryonale stamceller (hes) har denne egenskab, hvilket fremmer interessen for forskning i netop disse celler. Andre forskere arbejder med voksne stamceller fra knoglemarven, som muligvis efter injektion i dyret kan udvikles til kardiomyocytlignende celler. Der skal her kort nævnes, at der også arbejdes med at uddifferentiere endotelceller og glat muskel-væv til udvikling af et nyt karnetværk i hjertet, en proces som forløber in vivo særligt hos sportsudøvere (1). Forskning i embryonale stamceller Humane embryonale stamceller kan spontant udvikles til embryoide bodies, der indeholder celler med hjertemuskulaturs karakteristika. Det er dokumenteret, at man via antigenmærkning af embryoide bodies kan identificere proteiner, karakteristiske for hjertemuskulatur. Proteinerne er alfaactin, desmin, antinatrieuretisk protein, hjertetroponin og en del af myocinproteinet. Cellerne har endvidere evne til spontan kontraktion; en evne der påvirkes af hormonet katekolamin (Fig. 1). Yderligere reagerer cellernes elektriske potentiale på calciumionens koncentrationsændring over cellemembranen. Sidst men ikke mindst udtrykker cellerne transkriptionsgener og transkriptionsfaktorer, der også udtrykkes ved tidlige kardiomyocytstadier (2). Efter således at have påvist, at hes spontant kan differentiere til kardiomyocytlignende celler arbejder forskere på at kontrollere og dirigere denne uddifferentiering samt på at udforske, hvorvidt cellerne også in vivo vil have de eftertragtede egenskaber. Via dyreforsøg fremkom hypotesen om, at kardiomyocytdifferentiering kan initieres af END-2-celler. END-2 er en klonet cellelinje stammende fra en muse-embryoid karcinogen (EC) cellelinje. Denne cellelinje har viscerale endodermale karakteristika; eksempelvis udtrykker den alfaføtoprotein og proteinet ENDO-A, der har med cytoskelettet at gøre. I 2003 lod en forskergruppe kulturer af hes-celler dyrke på END-2-celler i stedet for museembryonalt fibroblast (MEF)-

3 887 Beating muscle Undifferentiated hes colony on MEFs hes after 14 days in culture with endoderm α-actin staining of human ESC derived cardiomyocyte. Fig. 1. Differentiation of hes to heart cells. Kilde: C.L. Mummery Hubrecht Laboratory. Humane embryonale stamceller dyrkes på END-2-celler hvilket medfører epiteliale og kardiomyocytlignende celler. END-2 er en klonet cellelinje fra museembryonale karcinomer. Cellerne har viscerale endodermale karakteristika. Kardiomyocytlignende celler isoleres via kollagenase. Immunhistokemisk undersøgelse identificerede: alfa-actin, tropomyosin, pan-adherin samt myocinkæder. RT-PCR identificerer genet for L-calciumkanalen, og en af kaliumkanalerne. Ca 2+ -kanalen stimuleres af adrenalin og hæmmes af verapamil, hvilket indikerer høj udvikling. Elektrofysiologisk måling viser ventrikulære og atriale aktionspotentialer. Fluorescensmærkning og mikroskopi viser, at udbredelsen af calcium mellem cellerne svarer til gap junctions. Fig. 2. Kardiomyocytter. hes på END-2 Kardiomyocytter på gelatin Gap junctions Kardiomyocytter epiteliale celler Kollagenase Genet for L-calcium-kanal og kaluim-kanal Syntese af proteinerne: alfa-actin, tropomyosin, pan-adherin og myocin Verapamil og adrenalinafhængige Ca 2+ -kanaler Aktionspotentialer

4 888 feeder layer, der ellers normalt anvendes ved arbejdet med stamceller. Herved genereredes to nye celletyper: Epiteliale celler dannende cystiske formationer kodende for alfa-føtoprotein, hvilket indikerer oprindelse i ekstraembryonalt visceralt endoderm. Kardiomyocytlignende celler. De kardiomyocytlignende celler isoleres via kollagenase og sås i gelatin-coatede skåle, hvorefter de undersøges ved forskellige metoder. Gelatin benyttes ofte til dyrkning af celler, der ikke skal differentiere (Fig. 2). Via immunhistokemisk mærkning identificeres proteinerne: alfa-actin, tropomyosin, pan-cadherin, og de to lette myosinkæder (mlc) 2a og 2v. Via RT-PCR undersøges cellernes ionkanalstatus. Man finder her ekspression af genet for alfa-subunit en af den kardiale L- calcium-kanal samt for Kv4.3-kalium-kanalen, men ikke for KvLQT1-kalium-kanalen. Ydermere påvises, at Ca 2+ -kanalen stimuleres af adrenalin og hæmmes af verapamil, hvilket indikerer en høj udvikling af disse Ca 2+ -kanaler. Denne høje udvikling kan ikke registreres hos kardiomyocytter udviklet fra føtale museceller. Ved elektrofysiologisk måling på cellerne kan man registrere forskellige aktionspotentialer, svarende til aktionspotentialer i henholdsvis ventrikulære og atriale kardiomyocytter, samt elektropotentialer svarende til pacemaker-lignende celler og karvægs glatmuskulatur. Via fluorescensmærkning og mikroskopi kan man beregne calciumkoncentrationen i cellerne på forskellige tidspunkter. Det kan påvises, at koncentrationen stiger og udbredes i cellerne på en måde, der indikerer, at disse må være forbundne med gap junctions. Denne hypotese sandsynliggøres yderligere via Lucifer Yellowinjektion i cellerne og dennes spredning. En sådan sammenkobling af cellerne er dog tidligere vist også at kunne findes hos umodne spontant differentierede kardiomyocytter (3). Mange af de ovenfor beskrevne fund er bekræftet ved reproduktion i flere forskningsarbejder. Således har en anden gruppe forskere ligeledes udviklet celler med spontan kontraktion fra hes-celler. Studiet sammenligner embryoide karcinogene museceller (mec), embryonale stamceller fra mus (mes), humane embryoide karcinogene celler (hec) og hes. Celler sammenlignes med henblik på deres egenskaber efter vækst i END-2-kulturer. Efter 2 til 3 uger udviklede hes-celle-kulturerne områder af spontant kontraherende væv. Via immuncytokemisk undersøgelse verificeres det, at cellerne bl.a. udtrykker markøren alfa-actin, hvilket bekræfter deres muskulære differentiering. Det må dog konstateres, at de fra hes-celler udviklede kardiomyocytter morfologisk er underlegne de fra muse-es og EC udviklede kardiomyocyt-

5 889 ter. hec-kulturerne udviklede ikke kontraherende celler. hes-cellernes aktionspotentiale måltes via elektrofysiologiske forsøg på hele celleaggregater i stedet for på de enkelte celler. Således kunne man registrere aktionspotentialer, men det var umuligt at identificere disse som enten atriale eller ventrikulære. Forskerne håber at kunne optimere vækstforholdene for hes-cellerne via den videre forskning (4). Der forskes naturligvis også videre i andre faktorers eventuelle indflydelse på differentieringen af hes til kardiomyocytter. I 2003 er der eksempelvis publiceret en artikel, hvor et gen kaldet cripto undersøges på mes-celler. Genet koder for et overfladeprotein. Det dokumenteres, at timing og varighed af ekspressionen af dette gen er afgørende for den tidlige uddiferentiering af mes-celler til kardiomyocytter. Man må efterforske, om lignende forhold gør sig gældende for hes (5). Den videre forskning retter sig mod at teste metodens anvendelse på flere cellelinjer samt at forbedre denne. Forskerne pointerer selv, at finjustering af Ca 2+ -kanalerne er blandt de elementer, der bør optimeres. Åbenlyst er det, at den potentielle mulighed for at frembringe transplantabelt hjertevæv ansporer en ikke kun fagligt men også økonomisk og etisk interesse i området. Patentering og kommercialisering Forskning i stamceller rummer store potentielle terapeutiske, men også økonomiske muligheder. I dag skal en afdød eller dennes pårørende give tilladelse til transplantation af afdødes organer; vi er ikke i tvivl om, hvem der har ejerskab og bestemmelsesret. Hvis det i fremtiden bliver muligt at frembringe transplantable kardiomyocytter ud fra humane embryonale stamceller, hvem har da rettigheder i forhold til disse celler? Forskning og medicinudvikling er kostbar, og mange medicinalfirmaer ser patentrettigheder som deres mulighed for at tjene deres investeringer hjem igen. Samtidig er ejerskab og patentrettighed over gener eller menneskelige celler en stødende tanke for mange. Debatten synes at cirkulere omkring, hvorvidt det bør være muligt at lave patenter på menneskelige gener og celler, samt hvilke regler en sådan tilladelse bør omgæres af, og endelig hvilke konsekvenser det vil afføde. Tilladelse til patentering af stamceller vil medføre et økonomisk incitament til yderligere forskning, hvilket sandsynligvis vil have en fremmende effekt på denne. Omvendt viser erfaringer fra genpatentering i USA, at meget brede patenter medfører nedsat konkurrence på videreudviklingen inden for forskningen, hvilket i sidste ende er til skade for patienterne. Patentering og rettighedsforhold kan

6 890 også være langtrukne og bekostelige at afgøre, hvilket ikke umiddelbart synes at åbne eller fremme forskningen. Hvordan en patentrettighed defineres, er afgørende for diskussion. Er patentretten at sidestille med et ejerskab? Må man gøre, hvad man vil med det, man patenterer, eller har man en særlig forpligtigelse i forhold til et sådant ejerskab? Det at et menneskeliv kan ejes eller begrænses til fordel for noget andet, synes at være i strid med fundamentale vestlige værdier, der bl.a. danner grundlaget for menneskerettighederne. Heraf følger, at hvis embryonet vurderes etisk at have status som et foster eller et barn, er patentmuligheder etisk kompromitterende, hvis patentering og ejerskab kan sidestilles. Opfattes embryonet ikke som menneskeligt liv, men blot som celler fra et menneske, bliver problemstillingen en anden. Hvis man ikke kan eje et menneske, kan man så eje dele af et menneske? Hvordan adskiller det sig at eje et menneske, et menneskes hjerte, et menneskes stamceller eller celler udviklet fra et menneskes stamceller? Samtidig er det ikke entydigt, hvem der normalt»ejer«generne. Sædvanligvis betegner vi vores gener netop som noget meget individuelt, men de er jo fælles med vores families, mange af dem er fælles med alle andre menneskers (6). Måske kan disse forståelses- og sproglige problemer i relation til patentering løses via definitioner og lovgivning. En sådan løsning eliminerer dog ikke helt fundamentale problemstillinger, som en sådan lovgivning ville medføre. Det Etiske Råd pointerer, at fundamentalt set består spørgsmålet, om hvorvidt patentering er en tingsliggørelse af mennesket og dermed en krænkelse at dets identitet og værdighed! Hertil kan det indvendes, at også den allerede tilladte forskning med stamceller kan ses som udtryk for en tingsliggørelse af mennesket, og at patentering i denne forbindelse er en yderligere gradbøjning at dette forhold. Man må gøre sig klart, om det at patentere noget gør det patenterede til en vare. En del medlemmer at Det Etiske Råd er af den opfattelse, at patentering i nævneværdig grad ændrer vores måde at forholde os til stamceller på. Rådet udtrykker bekymring over for den»geneticering«af mennesket, som opleves i form af gentestningsmuligheder, og muligheden for i fremtiden at få kortlagt sit genom. Patentering af stamceller vil i nogen grad bidrage til denne geneticering, fordi cellerne indeholder det enkelte individs informationer. Patentering af stamceller adskiller sig dog fra patentering af gener, bl.a. ved at stamcellerne er levende celler. Samlet forholder medlemmerne af Det Etiske Råd sig kritisk til alle former for patentering af embryonale celler. Begrundel-

7 891 serne og stillingtagen til forskellige delspørgsmål varierer dog betydeligt mellem de enkelte medlemmer. Endelig er det væsentligt at holde sig for øje, hvorvidt det er patenteringen eller kommercialiseringen af stamceller, man forholder sig til. Stamceller og viden herom vil muligvis blive en»handelsvare«uanset patentmuligheder. Vil man undgå en kommercialisering, er det nødvendigt at lave en lovgivning der forbyder økonomisk profitering på forskning med stamceller. Ejerskab over stamceller og kommercialisering af stamceller er således to forskellige men sammenknyttede etiske dilemmaer (6). Mens vi diskuterer implementeringen af nye opdagelser i vores samfund, øjner forskere muligheder længere ude i fremtiden, der umiddelbart kan synes helt surrealistiske. Måske kan man i fremtiden tage en celle fra en patient, og via kloning anbringe dens DNA i en ægcelle. I petriskåle fremdyrkes således pluripotente stamceller, hvis uddifferentiering dirigeres til en bestemt celletype. Disse forstadier af f.eks. hjertemuskelceller overflyttes herefter til en»hjerteform«lavet af et biologisk nedbrydeligt materiale. Cellerne vokser her frem i en tredimensionel struktur og danner til sidst et nyt hjerte. En sådan udvikling er endnu rent spekulativ, men måske bliver det en dag en reel mulighed (7). RT-PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) er en teknik, som benyttes til at opformere en bestemt DNA-sekvens. Metoden anvendes blandt andet til identifikation af celler, som udtrykker specifikke gener. Via PCR opformeres ekspressionen af den ønskede DNA-sekvens, såfremt den er til stede. PCR forudsætter et kendt template (området omkring det DNA-stykke, som vi skal have udtrykt), for at vi kan tilsætte den tilsvarende primer, hvorpå RNA et dannes. Substratet opvarmes således, at DNAstrengene går fra hinanden, hvorpå temperaturen sænkes, og primeren sætter sig på templatet. Herved dannes RNA svarende til det ønskede DNA, og cyklus gentages. For at afgøre, hvorvidt substratet indeholder det ønskede RNA (som udtryk for tilstedeværelse af det gen, vi undersøger DNA et for), køres substratet på en gel, hvor RNA-sekvensen identificeres, f.eks. ud fra dens længde eller ved specifik mærkning. Kender man ikke templatet, tilsættes substratet et restriktionsenzym, der skærer DNA et omkring det stykke, der ønskes opformeret, hvorefter DNA-sekvensen indsættes i en vektor via ligase-enzymer. RT- PCR derimod danner en DNA-streng ud fra den oprindelige celles mrna. Isoleret mrna tilsættes primer og enzymet revers transkriptase, hvorved dannes en hybrid- DNA-streng. Denne DNA-streng kan via ovenfor beskrevne PCR-teknik opformeres, og der-

8 892 med afsløre den oprindelige celles genekspression (8). Stamcelleforsknings udvikling I løbet af 1970 erne begyndte forskere at publicere studier af teratokarcinomer isoleret fra mus. Disse tumorer blev udviklet efter implantation af embryonale celler eller primordiale kønsceller. Tumorerne indeholdt væv deriveret fra et museembryons tre kimlag, samt udifferentierede celler (9). I 1981 udvandt man de første museembryonale stamceller direkte fra den indre cellemasse fra en blastocyt. I de følgende år udvikledes tilsvarende celler fra høns, kaniner, svin m.m. Behandling af barnløshed via kunstig befrugtning blev tilladt i Danmark i Både i udlandet og herhjemme bidrog forskningen inden for dette felt til en øget viden og interesse for det tidligt befrugtede æg. I 1998 udvandt forskere for første gang udifferentierede og pluripotente stamceller fra det humane embryon (10). Siden 1998 har forskningen i stamceller udviklet sig inden for forskellige områder: Hvordan hes-celler manipuleres til at proliferere uden at differentiere spontant i laboratorieskålene. Identificering af in vivo-kontrolmekanismer til uddifferentiering og in vitro-efterligning af disse mekanismer, herunder forsøg med tilsætning af vækstfaktorer, vækst i co-kulturer med forskellige vævstyper og selektion efter genetiske faktorer eller overflademarkører. Beskrivelse af egenskaber og karakteristika ved forskellige cellelinjer (den 22. august 2003 var der registreret 78 forskellige hes-linier) (11). Afledning og differentiering af nye cellelinjer (12). Kloning i terapeutisk øjemed i forbindelse med stamceller (9, 13). Genetisk modifikation og dets potentiale i forbindelse med stamceller (14). Optimering af differentieringen af stamcelledyrkningen (15, 16). Interessekonflikter: ingen angivet. litteratur 1. Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. Bethesda: National Institute of Health, 2001: Kapitel Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, Sergev H, Amit M, Gepstein A et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest 2001; 108: Mummery C, Ward-van Oostwaard D, Doevendans P, Spijker R, van den Brink S, Hassink R et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes. Circulation 2002; 107: Mummery C, Ward D, van den Brink CE, Bird SD, Doevendans PA, Opthof T et al.

9 893 Cardiomyocyte differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Anatomical Society of Great Britain and Ireland 2002; 200: Parisi S, D Andrea D, Lago CT, Adamson ED, Persico MG, Minchiotti G. Nodal-dependent Cripto signalling promotes cardiomyogenesis and redirects the neural fate of embryonic stem cells. J Cell Biol 2003; 163: Patent på menneskers gener og stamceller. Det Etiske Råd, Det Etiske Råds hjemmeside Devlin TM, ed. Textbook of biochemistry: with clinical correlations. 4th ed. New York: Wiley-Liss, 1997: kapitel Pfendler KC, Kawase E. The potential of stem cells. Obstet Gynecol Surv 2003; 58: Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: Zeng X, Miura T, Luo Y, Bhattacharya B, Condie B, Chen J et al. Properties of pluripotent human embryonic stem cells BG01 and BG02. Stem Cells 2004; 22: Heins N, Engelund MCO, Sjöblom C, Dahl U, Tonning A, Bergh C et al. Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 2004; 22: Sunde A, Eftedal I. Embryonale stamceller og terapeutisk kloning. Tidsskr Nor Laegeforen 2001; 121: Kaji EH, Leiden JM. Gene and stem cell therapies. JAMA 2001; 285: Levenberg S, Huang NF, Lavik E, Rogers AB, Itskovitz-Eldor J, Langer R. Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds. The National Academy of Sciences of the USA 2003; 100: Gerecht-Nir S, Cohen S, Itskovitz-Eldor J. Bioreactor cultivation enhances the efficiency of human embryoid body (heb) formation and differentiation. Biotechnol Bioeng 2004; 86: