Samspil mellem planter og arbuskulære mykorrhiza til remediering i jord forurenet med polycykliske aromatiske hydrokulstoffer

Transkript

1 Samspil mellem planter og arbuskulære mykorrhiza til remediering i jord forurenet med polycykliske aromatiske hydrokulstoffer Combination of plants and arbuscular mycorrhiza for remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soils Bachelorprojekt i Agrobiologi Maja Klaaborg Jensen, Juni 2017

2 Institut for Agroøkologi, Aarhus Universitet Titel Samspil mellem planter og arbuskulære mykorrhiza til remediering i jord forurenet med polycykliske aromatiske hydrokulstoffer Engelsk titel Combination of plants and arbuscular mycorrhiza for remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soils Forsidebillede fra Projektperiode Januar-Juni 2017 Forfatter Maja Klaaborg Jensen Sted Institut for Agroøkologi, Aarhus Universitet Opgave Bachelorprojekt (15 ECTS) Vejleder Sabine Ravnskov Institut for Agroøkologi, Afgrødesundhed Antal printet 4 kopier Antal sider 25 Maja Klaaborg Jensen Aarhus, 8. juni 2017

3 I RESUMÉ Denne opgave undersøger effekten af arbuskulære mykorrhiza svampe (AMS) til oprensning af polycykliske aromatiske hydrokulstoffer (PAHer) i remedieringsprocessor. Gennem et litteraturstudie analyseres fem forskellige artikler for de underliggende mekanismer bag phytoremediering, samt hvilken rolle den arbuskulære mykorrhiza (AM) symbiose spiller i nedbrydningen af PAH forbindelser. Det diskuteres, om planter alene kan bruges til phytoremediering, og om AM symbiosen kan forbedre effekten af phytoremedieringen af forskellige PAH forbindelser. Af analysen kan det konkluderes, at symbiosen mellem AM og forskellige planter har en positiv effekt på reduceringen af PAH forbindelser i jorden. Ligeledes forbedrer AM symbiosen planters vækstbetingelser, når de dyrkes i PAH forurenet jord. Dog er flere markforsøg nødvendige for at få et realistisk billede af phytoremediering. II ABSTRACT This paper focuses on the effect of arbuscular mycorrhiza fungi (AMF) for remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) contaminated soils. Through a literature study, five different articles analyze the underlying mechanism for phytoremediation, plus what role the symbiosis with arbuscular mycorrhiza (AM) plays in the dissipation of PAH. It is discussed whether plants alone can be used for phytoremediation, and if the AM-symbiosis improve the effect of phytoremediation of various PAH compounds. The analysis concludes that the symbioses between AM and different plants has a positive effect on the dissipation of various PAH compounds in the soil. The AM-symbioses is likewise improving growth conditions of plants grown in contaminated soil. However, more field experiments are necessary to get a realistic picture of phytoremediation.

4 INDHOLDSFORTEGNELSE 1 Indledning 5 2 Introduktion Polycykliske aromatiske hydrokulstoffer De hyppigste forekommende PAHer i jorden Økotoksikologiske effekter af PAHer Bioremediering Arbuskulære mykorrhiza svampe Livscyklus af AMS Mekanismerne bag optag, translokering og transport af fosfor i AM symbiosen Phytoremediering Mekanismerne bag optag og transport af anthracen og phenanthren i majs og hvede AM til phytoremediering Mekanismerne bag AM i phytoremediering af PAHer i jord AM symbiosen frigører et bredt spektrum af metabolitter i jorden AM symbiosen tiltrækker PAH-nedbrydende bakterier AM symbiosen forøger sorptionsoverfladen i jorden Interaktionen mellem planter og AMS Analyse Effekten af phytoremediering til oprensning af PAHer i jord Udskillelse af planteenzymer ved dyrkning af Fire Pheonix Samdyrkningssystemer med strandsvingel og lucerne øger nedbrydningen af PAHer AM s rolle i nedbrydningen af PAHer i jord Translokering af fluoren og phenanthren fra AM hyfer til rajgræsrødder Effekten af PAH-nedbrydende bakterier i AM symbiosen 21 4 Diskussion Kan planter alene medvirke til en reducering af PAHer i jorden? Kan AM symbiosen forstærke nedbrydningen af PAHer? Hvilken effekt har planter og AM på optag og translokering af PAHerne? Konklusion Perspektivering Referenceliste 27

5 1 INDLEDNING I løbet af det 19. århundredes globale industrialisering er forureningskilder blevet et stigende problem. Persistente organiske forureningskilder (POPer) kommer fra både pesticider, industrielle kemikalier, restprodukter samt fossile brændstoffer. Polycykliske aromatiske hydrokulstoffer (PAHer) er en gruppe af POPer og inkluderer over 100 forskellige forbindelser. Fælles for dem alle er den karakteristiske kemiske stabile opbygning af brint- og kulstofatomer, ofte i 2-7 benzenringe. De er generelt kendetegnede ved lav vandopløselighed, moderat flygtighed og langsom nedbrydelighed (Sverdrup et al., 2003). Samtidig er de også hydrofobe stoffer, der bindes til fedt, og derfor bioakkumuleres og -magnificeres i fødekæden (Lenoir et al., 2016). Ligeledes har de stor økotoksikologisk effekt på landbrugsafgrøder, hvorfor de potentielt set også er af stor sundhedsskadelig betydning for dyr såvel som mennesker. Blandt mange tilgængelige teknikker til miljømæssig genopretning er bio- og phytoremediering generelt et godt valg grundet lave økonomiske omkostninger og høj effektivitet (Cabral et al., 2015). Et middel til bio- og phytoremediering er arbuskulære mykorrhiza svampe (AMS), der danner symbiose med ca. 80% af de terrestriske planter (Smith and Smith, 2011) samt mange af de landbrugsafgrøder, der dyrkes til både foder og konsum (Ravnskov and Larsen, 2007). Symbiosen mellem arbuskulære mykorrhiza (AM) og forskellige planter kan medvirke til at forstærke phytoremedieringen af forskellige PAH forbindelser, men hvordan og i hvor høj grad, undersøges nærmere i denne opgave. 2 INTRODUKTION 2.1 POLYCYKLISKE AROMATISKE HYDROKULSTOFFER PAHer er en gruppe af POPer, der består af aromatiske kulbrinter, ofte sammensat af 2-7 benzenringe bestående af kulstof og brint. De dannes både fra naturlige processer såvel som menneskeskabte forureningskilder. Fremkomsten af naturlige PAHer kan skyldes skov- og græsbrande, vulkanudbrud og exudater fra træer (Haritash and Kaushik, 2009). Menneskeskabt PAH forurening stammer fra bl.a. afbrænding af fossile brændstoffer som kul, træ og olie, tobaksrøg, slam og udstødningsgasser fra trafikken. De er ofte kendetegnede ved at have lav vandopløselighed, høj smelte- og kogepunkt samt moderat til højt damptryk (Kaushik and Haritash, 2006). PAHernes skæbne i miljøet er derfor afgjort af deres kemiske og fysiske egenskaber. De er til stede i luften, jorden, vandet og sedimentet, og kan derfor flyttes lange afstande som følge af deposition (Liang et al., 2016). I takt med deres lave vandopløselighed, bioakkumuleres- og magnificeres de nemt i fødekæden, og koncentrationen er derfor størst i topprædatorerne (Kallenborn, 2006). De er generelt meget persistente i naturlige miljøer, med svingende halveringstid (DT50 værdi). Eksempler på forskellige DT50 værdier er 26 dage for phenanthren og 6250 dage for benzo[a]anthracen (Sims and Overcash, 1983). Side 5 af 30

6 2.1.1 DE HYPPIGSTE FOREKOMMENDE PAHER I JORDEN Samlet set findes over 100 forskellige PAH forbindelser, alle med forskellige kemiske og fysiske egenskaber. De hyppigste forekommende PAH forbindelser, samt deres fysiske egenskaber, er vist i tabel 1. Forbindelser med lav molekylevægt ses ofte på dampfase og har derfor en høj flygtighed. De har en stærk affinitet for partikler i atmosfæren, og kan derfor kondensere på partikulært stof i luften og transporteres langt væk med vinden (Kaushik and Haritash, 2006). LogKOW er octanol-vand fordelingskoefficienten, der beskriver, hvor hydrofobt stoffet er. Jo højere LogKOW, jo større er sandsynligheden for, at det bioakkumuleres. TABEL 1 KEMISKE OG FYSISKE EGENSKABER FOR DE HYPPIGSTE FOREKOMMENDE PAHER. LOGK OW ER OCTANOL-VAND FORDELINGSKOEFFICIENTEN. Navn Molekylformel b Strukturformel b Damptryk (Pa ved 25 C) a Vandopløselighed ved 25 C (mg/l) b Anthracen C 14 H 10 1*10-3 0,6905 4,45 LogK OW b Fluoranthen C 16 H 10 1,2*10-3 0,1297 5,16 Phenanthren C 14 H 10 2*10-2 0,667 4,46 Pyren C 16 H 10 6,0*10-4 0,225 4,88 Fluoren C 13 H 10 0,039 b 1,39 4,18 a (Haritash and Kaushik, 2009) b (CHEMSPIDER, Unknown publ. year) ØKOTOKSIKOLOGISKE EFFEKTER AF PAHER Flere studier peger på, at PAHerne har teratogene og karcinogene effekter på dyr og mennesker (Delistraty, 1997, Pickering, 1999, Jones and Voogt, 1999). De fleste PAHer med 5-7 benzenringe menes at have karcinogene egenskaber, og anses derfor at have stor økotoksikologisk effekt på miljøet (Haritash and Kaushik, 2009). Ofte vil organiske forureningskilder kunne måles i fedtvævet på mennesker og dyr i flere årtier, og de kan være skyld i bl.a. kræft, fødselsdefekter, læringsvanskeligheder, neurologiske og reproduktive Side 6 af 30

7 problemer (Sweetman et al., 2005, Pauwels et al., 2000). Flere forsøg peger på, at koncentrationen af PAH forbindelserne phenanthren, pyren, fluoranthen og fluoren ikke skal være særlig høj, før der ses en effekt på overlevelse og reproduktionen af organismerne Enchytraeus Crypticus (Oligochaeta, Clitellata) og Folsomia Fimetaria L. (Collembola, Isotomidae) (Sverdrup et al., 2001, Sverdrup et al., 2002). Også planteafgrøder påvirkes af PAH forbindelser. Sverdrup et al. (2003) fandt at PAH forbindelserne phenanthren, pyren, fluoranthen og fluoren havde en effekt på frøudviklingen af alm. rajgræs (Lolium perene). Samtidig fandt de også, at våd- og tørvægt blev reduceret i alm. rajgræs, rødkløver (Trifolium pratense) og gul sennep (Sinapsis alba). Frøvæksten i både enkimbladede planter som hvede, havre og majs og tokimbladede planter som tomat, bønne og solsikke bliver også påvirket ved eksponering af PAHer (Maliszewska-Kordybach and Smreczak, 2000). Morfologiske symptomer på plantestress, der skyldes phenanthren forurening, kan være reduceret vækst af rødder og skud, deforme plante- og rodhår og sen blomstring (Alkio et al., 2005). Selvom POPer forurener mange forskellige miljøer, vil flertallet af dem opkoncentreres i jorden (Wania and Mackay, 1996). En opgørelse fra 2013 viser en oversigt over den formodede andel af forureningskilder der har en effekt på jorden såvel som grundvandet (Panagos et al., 2013). På figur 1 ses, at 10,9% af de forureningskilder, der har en effekt på jorden, kommer fra PAH forbindelser. I grundvandet menes det, at 6,4% af forureningen skyldes PAH forbindelser. På baggrund af den opgørelse, udgør PAHer en stor andel af de organiske forureningskilder i miljøet, hvorfor det er vigtigt at finde muligheder for oprensning af disse økotoksiske forbindelser. FIGUR 1 OVERSIGT OVER FORDELINGEN AF FORURENINGSKILDER DER PÅVIRKER JORD OG GRUNDVAND. POLYCYCLISKE AROMATISKE HYDROKULSTOFFER (PAH); BENZEN, TOULENE, ETYL BENZEN OG XYLEN (BTEX); KLORINEREDE HYDROKULSTOFER (CHC); TUNGMETALLER (HEAVY METALS); MINERALSKE OLIER (MINERAL OIL); CYANIDER (CYANIDES); FENOLER (PHENOLS) (PANAGOS ET AL., 2013). Side 7 af 30

8 2.1.3 BIOREMEDIERING Ordet bioremediering udspringer fra en handling, hvor der gøres brug af organismer til at nedbryde uønskede forurenende stoffer i miljøet. Bioremedieringen omfatter mange forskellige grupper af svampe og bakterier, herunder bl.a. Acinobacter, Flavobacterium, Pseudomonas og AMS (Mansfeld-Giese et al., 2002, Singh et al., 2014, Lenoir et al., 2016). Stimuleringen af bakterieforøgelsen i et område, afhænger af tilgængeligheden af næringsstoffer, vækstsubstrater samt energikilder (Johnsen et al., 2005). Ofte vil bakterierne få kulstof og energi fra nedbrydningen af de organiske forureningskilder, men det kan være nødvendigt at tilføre flere bakterier via en proces, der kaldes bioaugementation (Mrozik and Piotrowska-Seget, 2010). Ofte vil de tilførte bakterie dø, når der ikke længere er rigeligt tilgængelige organiske kilder tilstede, der giver dem gode vækstbetingelser. Total mineralisering er et resultat af en synergistisk nedbrydning på tværs af forskellige bakteriegrupper (Singh et al., 2014). Ofte vil bioremedieringen foregår under aerobe forhold, men der er også observeret nedbrydning via anaerobe forhold (Costa et al., 2017). Den primære måde PAHerne fjernes på, er via bakteriel nedbrydning (Haritash and Kaushik, 2009). I en heterogen jord, vil PAHerne sorberes til organiske partikler eller være lokaliseret i mikroporer, der ofte kan være utilgængelige for bakterierne. Bakterierne er afhængige af, at PAHerne er opløst i jordvæsken, hvor de er nemmere at komme til (Johnsen et al., 2005). Nedbrydningen initieres af, at bakteriecellerne optager PAHerne og detoxifikere dem, ofte ved at gøre dem mere vandopløselige via oxidering. Den biologiske nedbrydning kan tjene flere forskellige funktioner for bakterierne: Enten kan bakterierne bruge PAHerne som kulstof- og energikilde til vedligeholdelse af metabolismen og reproduktionen, ellers kan de udskille enzymer, og via co-metabolsk nedbrydning mineralisere PAH forbindelserne (Johnsen et al., 2005). Formålet med begge former for nedbrydning er en total mineralisering af PAHerne til H2O, CO2 og mineraler for at rense jorden (Johnsen et al., 2005). Forøgelsen af netop disse PAHnedbrydende bakterier har vist at forstærkes i en jord, der er påvirket af AMS (Prashar et al., 2013). 2.2 ARBUSKULÆRE MYKORRHIZA SVAMPE AMS er obligate biotrofe rodsymbionter, der tilhører svamperækken Glomeromycota (Smith and Read, 2008). De etablerer en mutualistisk symbiose med ca. 80% af de terrestriske plantearter, og modtager sukkermolekyler fra planterne i bytte for uorganiske mineraler som fosfor og zink (Smith and Smith, 2011, Souza, 2015). Mange afgrøder til foder og humant konsum danner symbiose med AMS. Dog er der undtagelser, som f.eks. korsblomstrede afgrøder, sukkerroer og rødbeder (Ravnskov and Larsen, 2007). AM symbiosen har en betydelig effekt på planternes tolerance over for biotiske såvel som abiotiske stressorer. AM symbiosen kan hjælpe planter med at vedligeholde vandbalancen ved både overvandende og tørre områder (Augé, 2001). Samtidig kan AM symbiosen styrke planternes modstand over for fremmede bakterier og svampe, og kan derfor også indgå som et middel til biologisk Side 8 af 30

9 bekæmpelse (Pal and Gardener, 2006, Li et al., 2007, Schouteden et al., 2015). Desuden er det også bevist, at AM symbiosen kan forstærke planters tolerance over for både tungmetaller og PAH forbindelser (Hildebrandt et al., 2007, Debiane et al., 2008) LIVSCYKLUS AF AMS AMS er komplet afhængig af en værtsplante, der kan forsyne dem med organisk kulstof. Svampene menes at leve aseksuelt, og når ikke svampene lever i symbiose med en plante, eksisterer de i jorden som ukønnede klamydosporer. Sporerne har et højt indhold af kitin i cellevæggen, der gør dem modstandsdygtige, så de kan fungerer som hvilesporer i jorden (Souza, 2015). Under gunstige forhold vil sporerne udvikle spirehyfer, og søge efter en planterod. Hyfernes vækst kontrolleres bl.a. af plantehormonet strigolactones (Evert and Eichhorn, 2013, Makhzoum et al., 2017). Når kontakten mellem svampen og planterodens overflade er etableret, vil svampen udvikle et appressorium, hvormed de tynde hyfer kan penetrere planterodens epidermis. Efter penetreringen vil hyferne vokse intercellulært mellem plantecellerne i cortex, og danne et intercellulært mycelium. Derefter vil hyferne penetrere plantecellerne og udvikle intracellulære arbuskler som vist på figur 2. I plantecellen dannes en specialiseret membran, der kaldes den periarbuskulære membran. Den er, sammen med den arbuskulære membran, afgørende for udvekslingen af næringsstoffer mellem de to symbionter FIGUR 2 ARBUSKLER OG VESIKLER FRA GLOMUS VERSIFORME I RODCELLER HOS PORRE (EVERT AND EICHHORN, 2013). (Souza, 2015). Arbusklerne har et stort overfladeareal, der øger diffusionen af næringsstoffer og vand mellem svampens hyfeceller og plantecellerne (Harrison, 2005). Det intercellulære mycelium er også ansvarlig for dannelse af vesikler, der oplagrer energirige fedtstoffer (Souza, 2015). Arbuskler, vesikler og det intercellulære mycelium udgør til sammen det interne mycelium. Hyferne er samtidig ansvarlige for dannelse af klamydosporer og et eksternt mycelium i jorden. Overfladearealet af hyferne i det eksterne mycelium menes at være 100 gange større end overfladearealet af planterødder af samme vægt (Harley, 1989). Den jord, der påvirkes af myceliet, kaldes mykorrhizosfæren, og kan strække sig flere centimeter fra planteroden (Souza, 2015). Side 9 af 30

10 2.2.2 MEKANISMERNE BAG OPTAG, TRANSLOKERING OG TRANSPORT AF FOSFOR I AM SYMBIOSEN Det eksterne mycelium fungerer som en forlængelse af planterødderne, og muliggør opsamlingen af svært tilgængelige næringsstoffer som f.eks. fosfor i jorden (Smith and Read, 2008). Da man endnu ikke kender mekanismerne bag optag, transport og translokering af PAHer i AM symbiosen vil følgende afsnit fokusere på optag, transport og translokering af fosfor. Ligesom PAHerne har fosfor en lav opløselighed og derfor en lav mobilitet i jorden (Brady and Weil, 2014). Fosfor er stærkt bundet til mineraler i jorden, som f.eks. calcium, jern og aluminium. Omkring planterødder og hyfer opstår der et område, hvor indholdet af fosfor i jordvæsken er lavt. Det fosfor, der er tilgængeligt for planterne, optages som orthofosfat (Bucher, 2007). Efterfølgende sker der en langsom frigivelse af fosfor til jordvæsken, der betyder, at koncentrationen af fosfor i jorden sjældent overstiger 10 M (Mimura, 1999). I de levende organismer i jorden er koncentrationen højere. F.eks. menes koncentrationen i planters cytoplasma at være omkring 10 mm (Mimura, 1999). Det efterlader en koncentrationsgradient mellem jordvæsken og plantecellerne. Optag af orthofosfat i AM symbiosen sker ved, at orthofosfat aktivt optages ind i det eksterne mycelium over en elektrokemisk gradient via højaffinitets H + /orthofosfat symportere drevet af H + -ATPase protonpumper (Ezawa et al., 2002). Efter optag af orthofosfat i det eksterne mycelium, kan orthofosfat inkorporeres i fosforylerede metabolitter og aminosyrer i AM svampens cytoplasma (Viereck et al., 2004). Det menes, at overskydende optag af orthofosfat vil translokeres til vakuoler i de intracellulære hyfeceller, og oplagres som polyfosfat, der er lineære kæder af orthofosfat (Ezawa et al., 2002). Oplagringen fungerer som en buffer for koncentrationen af orthofosfat i cytoplasma (Ezawa et al., 2002). De fosfor-indholdene forbindelser translokeres til de intracellulære hyfer, hvor polyfosfat hydrolyseres og orthofosfat frigives og transporteres til plantens rodceller (Viereck et al., 2004). Transporten til plantecellerne menes at foregå i den arbuskulære interface, der er et smalt rum omkring nm tykt, mellem plantens membran og svampens cellevæg (Balestrini and Bonfante, 2005). Ifølge Solaiman og Saito (2001) er effluxen af orthofosfat fra hyferne af Gigaspora margarita til rodcellerne af løg (Allium cepa) styret af hydrolysen af polyfosfat, på baggrund af en forøget tilførsel af glukose fra planten. Optaget i plantecellerne menes, at være styret af orthofosfat transportere, der specifikt bliver udtrykt i koloniserede cortexceller (Bucher, 2007). Da der endnu ikke er beviser for, hvordan PAHer optages, transporteres og translokeres via AM symbiosen, kan man antage, at processen er vanskeligere, da PAH molekyler er væsentlig større end orthofosfat. Det har vist sig, at PAHer har svært ved, at translokeres fra planterødder til -skud (Gao et al., 2011), mens rodkoncentrationen af PAHer i planter er højere i AM symbiose end ikke-am symbiose (Gao et al., 2010). På baggrund af det, kan AM symbiosen have en indflydelse på phytoremediering af PAHer (Su and Zhu, 2008). Side 10 af 30

11 2.3 PHYTOREMEDIERING Phytoremediering gør brug af planternes egenskaber til at oprense uønskede forurenende stoffer in situ. Denne grønne teknologi bruger planter og deres associerede mikroorganismer til at nedbryde, stabilisere og fjerne forureningskilder fra miljøet. Det er blevet en populær måde at omgås oprensning på, da det er en billig og effektiv løsning, hvor der er uanede mængder af miljøvenlige oprensnings midler tilgængeligt i form af planter og mikroorganismer (Pilon-Smits, 2005). Phytoremediering har dog også sine begrænsninger. Planterne skal dyrkes der, hvor forureningen er, rødderne skal kunne nå forureningskilderne og desuden skal de klimatiske forhold tillade plantevækst (Pilon-Smits, 2005). Afhængig af de biologiske processer og de klimatiske forhold, er phytoremediering måske langsommere end bioremediering alene med mikroorganismer, da det tager tid for planterne at etableres (Pilon-Smits, 2005). Dog har det vist sig, at symbiose med AM kan forbedre mange planters vækst under PAH forurening og dermed forstærke phytoremedieringen (Verdin et al., 2006, Wu et al., 2011, Aranda et al., 2013) MEKANISMERNE BAG OPTAG OG TRANSPORT AF ANTHRACEN OG PHENANTHREN I MAJS OG HVEDE Organiske forureningskilder har tendens til at transporteres ind i plantevævet via simpel diffusion, afhængig af deres kemiske egenskaber (Pilon-Smits, 2005). Hvis LogKOW > 3, er der tendens til, at organiske forureningskilder bindes i membranen og cellevæggene (Pilon-Smits, 2005). Lipofile forbindelser har en stærkere affinitet for plantevævet, der indeholder proteiner, fedtsyrer og aminosyrer (Kang et al., 2010). Et eksempel på, hvordan optag og transport af PAHerne anthracen og phenanthren i majs (Zea mays) og hvede (Triticum aestivum), blev undersøgt af Wild et al. (2005). For at få en forståelse for PAHernes transport i roden, blev roden af hvede og majs opdelt i fem zoner: Rodkappen og væksttop, en skillezone, en zone for elongering, en zone med rodhår og en forgreningszone. Wild et al. (2005) viste, at PAHerne kun blev observeret i zonerne for elongering, rodhår og forgrening på overfladen af roden, både på og i epidermiscellerne. Optag af begge forbindelser blev observeret ved rodhårene og forgreningszonen ved både majs og hvede, og en radial bevægelse medførte transport fra epidermiscellerne til cortex i roden. Begge forbindelser trængte ind i cellevæggene i cortexcellerne i roden via apoplastisk transport og en mindre del trængte ind i vakuolerne via symplastisk transport. I cortexcellerne blev begge forbindelser koncentreret på langs i en linje mod skuddene, men ingen påviselig koncentration kunne måles i skuddene. Derudover var ingen af forbindelserne transporteret ind i hverken floemet eller xylemet. Transporten af vand og opløste stoffer gennem apoplastisk transport er domineret af diffusionen ind i rodens cellevæggene og bevægelsen gennem cellevægge fra celle til celle. Side 11 af 30

12 Epidermis opførte sig som en barriere for diffusionen af de to PAHer, der bremsede den radiale bevægelse af PAHerne ind i rodcellerne i modsætning til vand. Wild et al. (2005) foreslog, at PAHernes fedtopløselighed kunne være forklaringen på tilbageholdelsen samt manglende akkumuleringen i planteskuddene. Metabolismen af anthracen menes, at skyldes forskellige ikke-specifikke enzymer i cellevæggene og vakuolerne i majs og hvede. Wild et al. (2005) observerede bl.a. forskellige metabolitter af anthracene i cortexcellerne. Cellerne i elongerings zonen besidder komplette enzymsystemer, der medvirker i elongeringen samt til optag og transport af forskellige forbindelser. Nedbrydningen af organiske molekyler i vakuolerne er formodentlig en beskyttende mekanisme, hvor isoleringen af toksiske komponenter sker, som følge af omdannelse via metabolisme (Wild et al., 2005) AM TIL PHYTOREMEDIERING Biotilgængeligheden af PAHerne vil med tiden aftage, og det kan være problematisk for planterrødder at optage dem (Flechas and Latady, 2003). Desuden kan det også være sværere for planter, at etableres i PAH forurenede jorde (Sverdrup et al., 2003). Derfor er der blevet større fokus på AMS som en agent til phytoremediering (Joner et al., 2001, Joner and Leyval, 2003, Chaudhry et al., 2004, Wu et al., 2011, Mishra et al., 2016, Ingrid et al., 2016). Mange PAH forbindelser forurener indirekte langbrugsjorde, netop som følge af deposition (Liang et al., 2016). I og med, at mange afgrøder danner symbiose med forskellige AMS, er det interessant at undersøge, om symbiosen har gavnlig effekt på afgrøder, der dyrkes i forurenede jorde, og dermed også for phytoremediering. Flere undersøgelser har vist, at ved dyrkning af afgrøder på forurenede jorde, kan AM symbiosen have en gavnlig effekt på den totale produktion af biomasse (Rabie, 2004, Wu et al., 2011, Aranda et al., 2013). Resultater fra undersøgelser af forskellige afgrøder i symbiose med forskellige AMS dyrket under forskellige PAH forureninger er vist i tabel 2. Side 12 af 30

13 TABEL 2 OVERSIGT OVER FORBEDREDE VÆKSTBETINGELSER FOR FORSKELLIGE AFGRØDER I SYMBIOSE MED FORSKELLIGE AMS UNDER FORSKELLIG PAH FORURENING. Vækstbetingelser forbedret af AMS PAH forbindelse Værtsplante AMS Kultur Total biomasse Skud biomasse Rod biomasse Reference Anthracen Cikorie (Chicory intybus L.) R. intraradices In vitro (Verdin et al., 2006) Gulerod (Daucus carota) R. custos In vitro (Aranda et al., 2013) Phenanthren Gulerod (Daucus carota) R. custos In vitro (Aranda et al., 2013) Majs (Zea mays) F. mosseae I potte (Wu et al., 2011) Pyren Majs (Zea mays) F. mosseae I potte (Wu et al., 2011) Mix af fluoren og phenanthren Rajgræs (Lolium multiflorum) G. mosseae I potte G. etunicatum I potte (Gao et al., 2010) (Gao et al., 2010) Mix af anthracen, pyren, chrysen og benzo(a,h) anthracen Hvede (Triticum aestivum) Mungbønne (Vigna radiata) G. mosseae I potte G. mosseae I potte (Rabie, 2004) (Rabie, 2004) Hovedpointerne ved disse undersøgelser er, at PAHer reducerer enzymaktiviteten, den mikrobielle fauna og væksten af de forskellige afgrøder, der dyrkes i PAH forurenede jorde. Ved tilstedeværelsen af de forskellige AMS ses, at især rodbiomassen øges og reduktionen af de forskellige PAHer er signifikant større ved AM symbiosen end uden tilstedeværelsen af AMS. Det tyder på, at mekanismerne bag en forstærket reduktion af PAHer i plantet jord både skyldes en stimulering af rodvækst og udskillelse af rodenzymer samt en stimulering af bakterievæksten (Rabie, 2004). Phytoremediering med AMS forstærker altså reduktionen af PAHer i jorden samt forbedre planternes vækst (Wu et al., 2011, Aranda et al., 2013) 2.4 MEKANISMERNE BAG AM I PHYTOREMEDIERING AF PAHER I JORD AM hyfer kan medvirke til at forlænge planteroden og dermed dække et større område i rhizosfæren (Facelli et al., 2009). De forskellige mekanismer, der er involveret i nedbrydning af PAH i AM symbiosen, er: 1) producering af forskellige metabolitter, 2) tiltrækning af PAH- Side 13 af 30

14 nedbrydende bakterier, 3) forøgelse af sorptionsoverfladen og 4) interaktionen mellem planter og AMS AM SYMBIOSEN FRIGØRER ET BREDT SPEKTRUM AF METABOLITTER I JORDEN AM symbiosen er med til at øge koncentrationen af enzymer som dehydrogenase, peroxidase, catalase og polyphenol oxidase i jorden (Sun et al., 2011, Liu et al., 2014). Disse enzymer er vigtige oxidoreduktaser i jorden, der medvirker til at katalysere nedbrydningen og transformeringen af aromatiske komponenter (Criquet et al., 2000). Planter frigør et bredt spektrum af rodexudater, der indeholder forskellige komponenter som aminosyrer, organiske syrer, nukleotider, flavoner, phenoler og forskellige enzymer (Chaudhry et al., 2004). AM kolonisering kan forøge mængden af udskilte exudater, da assimilater fra plantens fotosyntese udskilles fra både hyfer og svampevævet, og øger den samlede koncentration af exudater i jorden (Langley and Hungate, 2003). Rodexudaterne stimulerer bl.a. bakterievæksten og ændrer ph værdien i jorden (Chaudhry et al., 2004). En stor andel af de organiske syrer menes at eksistere som anioner, der kan binde sig til f.eks. forskellige toksiske forbindelser, og gøre dem mindre toksiske (Ryan et al., 2001) AM SYMBIOSEN TILTRÆKKER PAH-NEDBRYDENDE BAKTERIER I takt med at dyrke planteafgrøder, der kan danne symbiose med AMS, øges bakteriepopulationen og mykorrhizosfæren bliver levested for mange forskellige bakterier (Pilon-Smits, 2005). Derved bruges både planternes og svampenes udskilte exudater, som f.eks. forskellige enzymer, simple sukkermolekyler og aminosyrer, som tiltrækning af de associerede bakterier (Pilon-Smits, 2005). Bakterierne kan medvirke til nedbrydningen af flere forskellige organiske forurenende forbindelser (Mishra et al., 2016). Antallet af bakterier i mykorrhizosfæren menes at være op til 100 gange større end i jord, der ikke er påvirket af mykorrhiza (Andrews and Harris, 2000). Mange forskellige PAH-nedbrydende bakterier er identificeret (Samanta et al., 2002). Det menes, at bl.a. Pseudomonas putida er ansvarlige for nedbrydningen af napthalen (Samanta et al., 2001), mens bl.a. Arthrobacter sulphureus og Aeromonas sp. er ansvarlige for nedbrydningen af phenanthren (Kiyohara et al., 1976, Samanta et al., 1999). Det er desuden bevist, at tilstedeværelsen af Pseudomonas spp. er forstærket i en jord påvirket af AMS (Viollet et al., 2011) AM SYMBIOSEN FORØGER SORPTIONSOVERFLADEN I JORDEN PAH reduktionen er vist at gå hurtigere omkring AM rødder end ikke-am rødder (Joner and Leyval, 2003). Det skyldes bl.a., at AM symbiosen er med til at forøge sorptionsoverfladen i jorden via hyfer og sporer, der bidrager til PAH mobilisering. Cellevæggen på svampen indeholder både frie aminosyrer, hydroxyl, carboxyl og andre grupper, der også repræsenterer forskellige bindingssider og dermed øger muligheden for reduktionen af PAHer fra mediet (Zhou, 1999). Det kan også skyldes en akkumulering af PAHer i de ekstraradikale hyfer og Side 14 af 30

15 sporer i mykorrhizosfæren, eller at svampen danner oplagringsstrukturer i de arbuskulære vesikler (Verdin et al., 2006). Anthracen er fundet i oplagringsorganer i både planterrødder og i AMS myceliet, der direkte indikerer, at hydrofobe forureningskilder kan optages (Verdin et al., 2006). AM symbiosen forstærker derved reduceringen af anthracene som følge af intracellulær oplagring i både rødder og AMS INTERAKTIONEN MELLEM PLANTER OG AMS Brugen af planter i remedieringsprocesser giver forskellige fordele. Bl.a. forbedrer planter jordstrukturen og luftgennemstrømningen, der øger de aerobe nedbrydningsprocesser. Planterne er også med til at optage og opbevare de organiske forureningskilder i plantevævet via lignificering, men kan også forstærke fordampningen fra bladene og mineraliseringen af forskellige PAH forbindelser (Schnoor et al., 1995). Samtidig udskiller planter også oxidative enzymer, der er med til at nedbryde PAH forbindelser i den omkringliggende rhizosfære. Planternes samspil med AM svampe, øger generelt planternes tilgængelighed af næringsstoffer og vand, i og med at hyferne kan nå porer i jorden, der er betydeligt mindre end dem planterødderne kan nå (Smith and Read, 2008). Som respons på øget næringsstofforsyning, kan planternes tolerance over for forureningskilder øges (Evelin et al., 2009). Flere studier viser generelt en hurtigere nedbrydningshastighed af forskellige PAH forbindelser ved en etableret plante-am symbiose i modsætning til ikke-am planter (Joner and Leyval, 2001, Verdin et al., 2006). 3. ANALYSE 3.1 EFFEKTEN AF PHYTOREMEDIERING TIL OPRENSNING AF PAHER I JORD Nogle af de mekanismer, der er involveret i phytoremediering med planter i PAH forurenede miljøer er: 1) planters udskillelse af enzymer, der kan nedbryde PAHer, 2) planters ekstrahering af forureningskilder og akkumulering i plantevævet, og 3) PAHer nedbrydes via det mikrobielle samfund i rhizosfæren (Pilon-Smits, 2005) UDSKILLELSE AF PLANTEENZYMER VED DYRKNING AF FIRE PHEONIX Første mekanisme er undersøgt af Liu et al. (2014). De testede forholdet mellem udskilte planteenzymer, det mikrobielle samfund og muligheden for phytoremediering med planten Fire Phoenix af otte forskellige PAHer: fluoranthen, pyren, benzo(a)anthracen, benzo(k)fluoranthen, chrysen, benzo(b)fluoranthen, benzo(k)fluoranthen, benz(a)pyren og dibenzo(a,h)anthracen. Fire Pheonix er en græs kombineret af Festuca arundinacea, Festuca elata og Festuca gigantea. Jord fra en forurenet oliemark i Shandong Provinsen i Kina blev indsamlet i potter og PAH koncentrationerne varierede fra mg kg -1. De vurderede, at planter ikke kunne gro i den forurenede jord, så jorden blev fortyndet med ikke-forurenet jord. PAH koncentrationerne Side 15 af 30

16 varierede nu mellem 70,80-79,81 mg kg -1. Forspirede Fire Pheonix frø blev sået, og de målte nedbrydningsraten efter hhv. 60, 120 og 150 dage. Kontrol jorden uden PAHer stammede fra Wanliutang Parken i Kina. Allerede 60 dage efter forsøgets start måltes nedbrydningsraten at være 71,37% for de otte forskellige målte PAH forbindelser i plantet jord (Figur 3). De målte desuden også en nedbrydningsrate på 100% af benzo(k)fluoranthen. Efter 120 dage, målte de en samlet nedbrydningsrate på 96,18% i modsætning til 50,51% for kontroljorden uden Fire Pheonix. Ved forsøgets afslutning, efter 150 dage, målte de en nedbrydningsrate på 99,4% for alle otte PAH forbindelser (Figur 4). Derudover var den endelige koncentration af de otte PAHer i jorden faldet fra 78,62 mg kg -1 til 0,47 mg kg -1. FIGUR 4 FORSVINDINGSRATEN AF OTTE PAH FORBINDELSER EFTER 60 DAGE (LIU ET AL., 2014). FIGUR 3 FORSVINDINGSRATEN AF OTTE PAH FORBINDELSER EFTER 150 DAGE (LIU ET AL., 2014). Forsøget viste desuden en stigning i aktivitetsniveauet af enzymet polyphenol oxidase (PPO) efter 60 dage i jord plantet med Fire Phoenix. Over samme periode, målte de ingen ændring i kontroljorden. PPO er en af de vigtigste oxidoreduktaser i jorden, der er tæt forbundet med omdannelsen af organiske aromatiske komponenter i hummus fraktioner (Liu et al., 2014). Efter 60 dage blev enzymet dehydrogenase (DHO) målt til 3,25 gange større i plantet jord i forhold til kontroljorden. DHO aktiviteten steg ved tilstedeværelsen af planterødder, og indikerede, at den overordnede aktivitet af mikrobielle organismer måske har en sammenhæng med nedbrydningen af PAHer i jorden. Enzymet catalase (CAT) var også steget signifikant i aktivitet. CAT menes at medvirke til at splitte hydrogen peroxid til oxygen og vand molekyler, og dermed forebygge den toksiske effekt af hydrogen peroxid (Lionetto et al., 2003). Alle disse observationer kunne tyde på, at dyrkning af Fire Phoenix øgede nedbrydningshastigheden af de otte forskellige PAHer, som følge af en ændring af PPO, DHO og CAT i rhizosfæren. Side 16 af 30

17 3.1.2 SAMDYRKNINGSSYSTEMER MED STRANDSVINGEL OG LUCERNE ØGER NEDBRYDNINGEN AF PAHER PAHer kan også ekstraheres af planter og akkumuleres i plantevævet, samt nedbrydes via den mikrobielle aktivitet i rhizosfæren. Disse mekanismer er undersøgt af Sun et al. (2011). De undersøgte lucerne (Medicago sativa) og strandsvingel (Festuca arundinacea) for deres kapacitet til phytoremediering af seksten forskellige PAHer i en forurenet landbrugsjord ved siden af et jern- og stålstøberi i det sydøstlige Kina. De undersøgte for akkumulering af PAHerne i planterne, samt en forøgelse af den mikrobielle aktivitet. Landbrugsjorden blev opdelt i tolv felter af 1,6m*2,2m, hvoraf fire forskellige behandlinger blev udført i tilfældig rækkefølge: 1) lucerne monokultur, 2) strandsvingel monokultur, 3) lucerne samdyrket med strandsvingel og 4) uplantet kontrol uden hverken lucerne eller stand-svingel. Startkoncentrationen af de seksten forskellige PAHer varierede mellem 747 til 810 g kg -1. Efter syv måneders plantevækst blev fem tilfældige jordprøver fra hver behandling undersøgt i en dybde på femten cm for at undersøge den mikrobielle aktivitet. Derudover blev femten planter fra hver behandling høstet, og undersøgt for biomassen af skuddene samt koncentrationen af PAHerne. Den gennemsnitlige PAH koncentration i planterne var højest for samdyrkningen af de to afgrøder. Man målte helt op til 270 og 284 g kg -1 PAHer i samdyrkning, modsat 190 g kg -1 og 231 g kg -1 for hhv. lucerne og strandsvingel. Ved forsøgets slutning blev den totale PAH koncentration i jorden ved samdyrkningen målt til ,2 g kg -1 hvorimod koncentrationen ved monokulturer af hhv. lucerne og stand-svingel blev målt til ,9 g kg -1 og ,5 g kg -1. Kontrollen viste en koncentration på ,7 g kg -1. Nedbrydningsraten beregnes til 30,4% for samdyrkningen, 14,4% og 24,0% for hhv. monokulturer af lucerne og stand-svingel. Antallet af bakterier viste en signifikant forøgelse i samdyrkningssystemet på 1,7-2,3 gange højere end hhv. monokultur af lucerne og strandsvingel. En forøgelse i aktiviteten af bakterierne mente Sun et al. (2011) skyldes en forstærket udskillelse af enzymer til rhizosfæren. Aktiviteten af DHO blev også undersøgt, og viste en signifikant forøgelse på 2,36 gange højere for samdyrkningen i forhold til kontrollen. Selvom nedbrydningsraten for samdyrkningen af lucerne og strandsvingel kun var 30,4% efter syv måneder, fandt man en signifikant forstærket nedbrydning af PAHer med 4 og 5 aromatiske benzen ringe. Ligesom konklusionen i Liu et al. (2014), er konklusionen i dette forsøg også, at tilstedeværelsen af planter kan forstærke reduktionen af PAHer i jorden og samdyrkning af lucerne og strandsvingel giver det bedste resultat. Samdyrkningssystemer kan øge jordens indhold af PAH-nedbrydende bakterier, øge enzymaktiviteten samt øge akkumuleringen af PAHer i planterne. Side 17 af 30

18 3.2 AM S ROLLE I NEDBRYDNINGEN AF PAHER I JORD Symbiosen mellem AM og forskellige planter kan medvirke til en forstærket nedbrydning af PAH forbindelser (Gao et al., 2010, Aranda et al., 2013). AM s rolle i nedbrydningen af PAHer kan bl.a. skyldes en forstærket translokering af PAH fra AM hyfer til planterødder (Gao et al., 2010). Det kan også skyldes en forstærket effekt af nedbrydningen i mykorrhizosfæren, som følge af interaktionen mellem AM symbiosen og PAH-nedbrydende bakterier (Yu et al., 2011) TRANSLOKERING AF FLUOREN OG PHENANTHREN FRA AM HYFER TIL RAJGRÆSRØDDER Gao et al. (2010) undersøgte effekten af AM svampene G. mosseae (AMF1) og G. etunicatum (AMF2) optag af fluoren og phenanthren i en jord dyrket med rajgræs (Lolium multiflorum) i dage. Undersøgelsen bestod af et trekammer, system som vist på figur 5. Kammer A og B var adskilt med et 1 mm trådnet, så rajgræsrødder kunne passere, og kammer B og C var adskilt med et 30 m trådnet, så kun AM hyfer kunne passere. I kammer C tilføjede man jorden de to PAHer, og kammer A og B var pakket med ren jord. Koncentration af hhv. fluoren og phenanthren blev målt til 79,52 og 72,35 mg kg -1 tørvægt. Forspirede rajgræsfrø blev sået i kammer A, og AM svampene blev inokuleret i kammer B. FIGUR 5 TRE-KAMMER SYSTEM. KAMMER A OG B ER ADSKILT MED ET 1MM TRÅDNET. KAMMER B OG C ER ADSKILT MED 30 M TRÅDNET (GAO ET AL., 2010). Resultatet af undersøgelsen ses i tabel 3, hvorfra det fremgår at begge AMS kraftigt øger rodkoncentrationen af fluoren i både kammer A og kammer B efter dage i modsætning til kontrolforsøget. Det viser, at AM svampenes hyfer kan penetrere jorden helt ned til 30 m, og derfor nå PAH forbindelser, der er utilgængelige for planterødderne. Gao et al. (2010) foreslår, at faldet i rodkoncentrationen mellem 60 og 70 dage skyldes enten fortynding ved plantevækst, metabolisme af PAHer i plantevævet eller translokering til andre plantedele. Side 18 af 30

19 TABEL 3 KONCENTRATION (MG KG -1 TØRVÆGT) AF FLUOREN OG PHENANTHREN I AM RØDDER AF RAJGRÆS (GAO ET AL., 2010). AMF1 G. MOSSEAE, AMF2 G. ETUNICATUM, CK KONTROL UDEN AM. TALLET I PARENTES ER STANDARDAFVIGELSERNE (SD). Ligeledes er koncentrationen af phenanthren i AM rødder steget og faldet i kammer B som en funktion af tiden. Netop phenanthrens høje molekylevægt og lave vandopløselighed kan være årsag til en lavere koncentration i AM rajgræsrødderne i forhold til fluoren. Planten har behov for et større volumen af transpirationsstrømmen og derfor kan det tage længere tid at opnå den maksimale koncentrationen af phenanthren i rajgræsrødderne. En translokations faktor (TF) blev udregnet på baggrund af en ønsket forståelse for, hvor meget PAH der bliver translokeret fra AM hyfer til rajgræsrødder. Den udregnes på baggrund af koncentrationen af PAHer i AM rødder (kammer B) og koncentrationen af PAH i den forurenede jord (kammer C). Figur 6 viser den beregnede TF værdi for både fluoren og phenanthren. Den beregnede TF værdi var højest for fluoren, og det understøtter dels den tidligere antagelse af hhv. stigningen og faldet i koncentrationen i AM rajgræsrødderne samt de forskellige iboende egenskaber ved fluoren og phenanthren. FIGUR 6 TRANSLOKATIONSFAKTOREN (TF) FRA AM HYFER TIL RAJGRÆSRØDDER AF FLUOREN ( ) OG PHENANTHREN ( ) MED AMF1 G. MOSSEAE (a), OG AMF2 G. ETUNICATUM (b) (GAO ET AL., 2010). Side 19 af 30

20 Translokeringen af pyren og phenanthren i lucerne (Medicago sativa L.) er også undersøgt (Gao et al., 2011). Gao et al. (2011) ønskede at undersøge effekten af samspillet mellem de to forskellige AMS G. mosseae (AMS1) og G. etunicatum (AMS2) i jord forurenet med enten phenanthren eller både phenanthren og pyren. Jorden, der blev opsamlet i Nanjing i Kina, var fri for PAHer og blev, inden forsøgets start, steriliseret for at inaktiverer de mulige AM svampe i jorden. Phenanthren og/eller pyren blev tilført jorden, så startkoncentrationen var hhv. 103 mg kg -1 og 74 mg kg -1. Forspirede lucernefrø blev sået og fire forskellige behandlinger blev udført: 1) uden AMS inokulering, 2) med AMS1 inokulering, 3) med AMS2 inokulering, 4) med AMS1 og AMS2 inokulering. Det var klart, at tilstedeværelsen af AM reducerede nedbrydningstiden af de testede PAH forbindelser. I modsætning til kontrollen uden AM, var koncentrationen af phenanthrene og pyrene 10,0-63,5% og 23,4-47,0% mindre ved tilstedeværelsen af AM. Reduktionen af hhv. phenanthrene og pyrene i mykorrhizosfæren blev målt til 98,6% og 88,1%, og Gao et al. (2011) peger på, at forskellen i reduktionen skyldes de to PAHers forskellige molekylvægt samt opløselighed. Inokulering af AMS1, AMS2 eller begge viste en klar fordel i rodoptaget af PAHer. Rodkoncentrationen af phenanthren og pyren i lucerne var signifikant højere end koncentrationen i skuddene som følge af inokuleringen af AMS1, AMS2 eller begge. Det indikerede, at der er en begrænset translokering af de to PAHer ind i selve planten. Koncentrationen af phenanthren i skuddene fra jord inokuleret med AMS1 eller begge efter dage var 18,3-43,1% lavere end koncentrationen i skuddene fra ikke-am planter. I og med at AM hyfer øger kontaktoverfladen mellem rødder og jord, vil AM lucerne akkumulere væsentlige mere phenanthren i rødderne end ikke-am lucerne, ca. 40,2% mere. Forstærket PAH optag i lucernerødder ved tilstedeværelsen af AMS1 og AMS2 kan forklares ud fra en øget PAH partitionering i rødderne, hvor assimilaterne fordeles i plantens organer. Det vides ikke hvordan assimilaterne fordeles i planten, men translokeringen af PAHer fra planterod til -skud er meget begrænset (Gao and Ling, 2006). Antagelsen underbygges også af resultatet, hvor fordelingen af phenanthren mellem planterødder og vand såvel som hyfer og vand blev undersøgt (Gao et al., 2011). Fordelingskoefficienten (Krt) udtrykkes som: Krt = Q eq C w Hvor Q eq er mængden af phenanthren absorberet af rødder eller hyfer (mg kg -1 ) og C w er ligevægtskoncentrationen af phenanthren i den vandige fase (mg L -1 ). Krt værdierne blev udregnet til at være 2275 L/kg for lucernerødder, 9499 L/kg for AMS1 og 8862 L/kg for AMS2. Det indikerer at AM koloniseringen signifikant øger fordelingen af PAHer mellem rødder og porevandet, der resulterer i en øget rodkoncentration af phenanthrene efter AM kolonisering. Side 20 af 30

21 3.2.2 EFFEKTEN AF PAH-NEDBRYDENDE BAKTERIER I AM SYMBIOSEN Yu et al. (2011) undersøgte interaktionen mellem svampen G. mosseae, PAH-nedbrydende bakterier Acinetobacter sp. og rajgræs (Lolium perenne) i forhold til nedbrydningen af de to PAH forbindelser phenanthren og pyren. Ikke forurenet jord blev indsamlet i Loi Tung Village i Hong Kong og mixede koncentrationer af phenanthren og pyren blev tilsat i 0, 50+50, og mg kg -1. Jorden blev opbevaret i et mørkt rum i to uger og startkoncentrationen af de to PAHer varierede mellem 39,01-189,73 mg kg -1. Nedbrydningsraten af phenanthren og pyren alene ved inokulering af Acinetobacter sp. blev testet over to uger, og resultaterne viste, at 32,2% phenanthren og 15,8% pyren blev nedbrudt hver for sig, hvorimod en samtidig tilsætning af de to PAHer viste en nedbrydningsrate på hhv. 29,5% for phenanthren og 18,3% for pyren. Koloniseringen af G. mosseae i rajgræsrødderne blev målt efter 60 dage til 8-26%. Inokuleringen af Acinetobacter sp. øgede signifikant G. mosseae koloniseringen af rajgræs i kontroljorden uden PAHer, men inokuleringen havde ingen signifikant virkning på koloniseringen i de forurenede jorde. Ved de højeste koncentrationer af PAHer på 200 mg kg -1 måltes en signifikant lavere AM kolonisering i forhold til kontroljorden uden PAHer, og generelt faldt både rod- og skud biomassen af rajgræs i takt med øgede PAH koncentrationer. Men på trods af et fald i biomassen, var PAH-reduktionen fra jorden signifikant større ved tilstedeværelsen af både G. mosseae, Acinetobacter sp. og rajgræs i modsætning til kontrollen. Reduktionen af phenanthren i kontroljorden blev målt til 58-71%, mens reduktionen af phenanthren ved tilstedeværelsen af G. mosseae, Acinetobacter sp. og rajgræs blev målt til 91-97%. En lavere reduktion på 35-55% blev fundet for pyren i kontroljorden. Den højeste reduktion målt for pyren var 90-96% ved behandlinger med både G. mosseae, Acinetobacter sp. og rajgræs. Yu et al. (2011) peger på, at tilførslen af Acinetobacter sp. kan medføre en hjælp til udviklingen og spiring af AM sporer og føre til en højere infektionsrate, som følge af øgede enzymaktivitet i jorden. Interaktionen mellem sporerne og bakterierne kan blive forstyrret under PAH forurening, hvilket kan forklare den lavere kolonisering ved høje PAH koncentrationer. Endvidere målte de også pyren og phenanthren akkumuleringen i rajgræsskuddene. Her fandt de, at pyren koncentrationen i rajgræsrødderne var meget højere end phenanthren koncentrationen i tilsvarende behandlinger. De konkluderede derfor, at rajgræs inokulereret med G. mosseae alene eller sammen med Acinetobacter sp. signifikant forstærkede akkumuleringen af pyren i rajgræsrødder. Side 21 af 30

22 4 DISKUSSION PAH forbindelser er et stigende problem i en verden med høj befolkningstilvækst, stor industri og stigende klimaforandringer, da mange udledningsprocesser bliver forstærket af stigende temperatur. Forbindelserne har vist sig at have mange økotoksikologiske effekter både i jorden og i planter, hvorfor det er vigtigt, at finde en effektiv oprensningsmetode. Det er observeret at planter og AMS kan bruges til phytoremediering af jorde forurenet med PAHer (Gao et al., 2010, Gao et al., 2011, Yu et al., 2011). Derfor diskuteres i dette afsnit om planter alene kan bruges til phytoremediering, og om AMS kan forbedre phytoremediering af forskellige PAH forbindelser. 4.1 KAN PLANTER ALENE MEDVIRKE TIL EN REDUCERING AF PAHER I JORDEN? Phytoremediering med Fire Pheonix, lucerne og strandsvingel er demonstreret som et effektivt middel til at oprense PAH forbindelser som bl.a. fluoranthen, pyren, benzo(a)anthracen, benzo(k)flouranthen, chrysen, benzo(b)flouranthen, benzo(k)flouranthen, benz(a)pyren og dibenzo(a,h)anthracen. To undersøgelser udført af Liu et al. (2014) og Sun et al. (2011) viste meget forskellige nedbrydningsrater. De to meget forskellige resultater kan skyldes to forskellige testmiljøer. Lui et al. (2014) udførte potteforsøg i væksthus med Fire Pheonix hvor et homogent miljø kan opretholdes, hvorimod Sun et al. (2011) udførte markforsøg, hvor et ukontrollerbart heterogent miljø kan have forskellige biotiske og abiotiske effekter på nedbrydningen. Resultatet kan også skyldes de forskellige iboende egenskaber af de testede PAHer. Sun et al. (2011) konkluderede, at lucerne havde den laveste nedbrydningsrate af de seksten testede PAHer, men senere konkluderede Liu et al. (2015) at lucerne har god potentiale til phytoremediering af de tidligere nævnte otte testede PAH forbindelser. Xiao et al. (2015) testede også nedbrydningsraten af otte PAHer ved phytoremediering med Fire Phoenix og lucerne. De fandt, at PAHer som fluoranthen og pyren med 4 aromatiske ringe var nemmere nedbrydelige, end andre 4-rings PAHer som benzo(a)anthracen og chrysen. Resultatet er sammenligneligt med resultatet fra Sun et al. (2011). De fandt også, at specielt 4- og 5-rings PAHer viste den højeste nedbrydning. Meng et al. (2011) mener dog, at planter generelt foretrækker optag af 2- og 4-rings PAHer, mens de stimulerer den mikrobielle nedbrydning af 3- og 6-rings PAHer i jorden, og forklaringen kan være PAHernes forskellige opløselighed samt molekylestørrelse. Nedbrydning af PAHer kan forstærkes ved plantevækst som vist af både Lui et al. (2014) og Sun et al. (2011). Andre forsøg har vist at inokuleringen af PAH-nedbrydende bakterier kan forstærke nedbrydningen af pyren i rhizosfæren af ris (Oryza sativa L.) med 43-62% i modsætning til 6-15% i kontrollen uden bakterier (Gao et al., 2006b). Binet og Leyval (2000) fandt også en forstærket nedbrydning af otte forskellige PAHer i rajgræs rhizosfæren, samt et signifikant højere bakterieantal i en 180 dage ældet forurenet jord. Tidligere undersøgelser har vist en signifikant hurtigere nedbrydning af anthracen og pyren i rhizosfæren af forskellige planter, men nedbrydningen af pyren går væsentlig hurtigere i ren jord tilsat med pyren i modsætning til industrielle jorde, hvor jorden har en lang historie med forurening (Reilley et Side 22 af 30

23 al., 1996, Gfinther et al., 1996). Resultaterne harmonerer med de tidligere antagelser, og generelt afspejler nedbrydningshastigheden både PAHernes iboende egenskaber, biotilgængeligheden af PAHerne og dermed også den forurenede jords alder. Det tyder altså på, at i et ukontrollerbart miljø, hvor mange forskellige faktorer spiller ind, vil nedbrydningen gå langsommere. Det kan hænge sammen med, at PAH forbindelserne bliver mindre biotilgængelige med tiden, og derfor sværere for både bakterier og rødder at tilgå. Selvom det også kan skyldes forskelle i vand- og næringsstofforsyning, vil en dyrkningspraksis, der gør brug af flere afgrøder på samme tid, øge nedbrydningshastigheden (Sun et al., 2011). En stigning i enzymaktiviteten kan være årsagen. Jo flere enzymer planterne udskiller, jo flere bakterier tiltrækkes. De iboende egenskaber for PAHer er også sigende for nedbrydningshastigheden, og ofte vil større forbindelser være langsommere nedbrydelige. Phytoremediering alene med planter er potentielt set et effektivt middel til at oprense forurenede jorde, men dyrkningspraksis samt omfanget af forureningen er afgørende for hvor hurtigt det går. 4.2 KAN AM SYMBIOSEN FORSTÆRKE NEDBRYDNINGEN AF PAHER? Ved AM symbiose står det klart, at tilgængeligheden af PAH forbindelser i jorden øges. Både Gao et al. (2010) og Gao et al. (2011) viste, at rodkoncentrationen af fluoren, phenanthren og pyren i rajgræs og lucerne øges ved samspil med G. mosseae og G. etunicatum. Desuden er PAHernes molekylevægt samt opløselighed sigende for optaget og transporten i planten. En lavere akkumulering af PAH i planteskuddene observeres ved symbiose med AMS. Forklaringen kan skyldes en øget PAH partitionering i hyferne som følge af høje Krt værdier for både G. mosseae og G. etunicatum. Jo højere Krt værdi, jo større mængde PAH er absorberet af rødder eller hyfer fra den vandige fase, og dermed mere fjernet fra jorden. LogKOW værdier for hhv. flouren, phenanthren og pyren fremgår af tabel 1, hvor rækkefølgen er således: flourene < phenanthrene < pyrene. Ifølge Gao et al. (2010) er TF for phenanthren langsommere end TF for flouren, og det kan netop hænge sammen med LogKOW værdien. Ligeledes understreger forsøget af Yu et al. (2011) de forskellige LogKOW værdiers effekt på reduktionen af hhv. phenanthrene og pyrene. En lavere reduktion i jorden blev målt for pyrene ved tilstedeværelsen af G. mosseae, Acinetobacter sp. og rajgræs. Overraskende var koncentration af pyrene i rajgræsrødder signifikant højere end koncentrationen af phenanthrene, og det kunne tyde på at LogK OW ikke er altafgørende for akkumuleringen i rajgræsrødder. Det kan måske skyldes, at forbindelser med højere LogKOW bindes i plantemembran og -cellevægge. Det kan også skyldes, at bakteriel nedbrydning er nemmere for forbindelser med lavere LogKOW. Yu et al. (2011) konkluderede dog at reduktionen af både pyren og phenanthren gik signifikant hurtigere ved tilstedeværelsen af G. mosseae, Acinetobacter sp. og rajgræs. Ligeledes viste Aranda et al. (2013) hvorledes symbiosen mellem Rhizophages custos og gulerod (Daucus carota) medvirker til en forstærket nedbrydning af anthracen, phenanthren og Side 23 af 30