(19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT. Ci2 (11) DK B1. Patent- og Varemærkestyrelsen

Transkript

1 (19) DANMARK (11) DK B1 Ci2 (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: A 61 K 39/21 A 61 K 39/395 C 07 K 1/00 C 07 K 14/155 C 12 P 21/00 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (30) Prioritet: US FR (73) Patenthaver: Institut Pasteur, rue du Dr. Roux, Paris Cedex 15, Frankrig (72) Opfinder: Luc Montagnier, 21 rue de Malabry, Le Plessis-Robinson, Frankrig Ara Hovanessian, 79 rue Ernest Savart, Montreuil, Frankrig Anne Laurent, 9 avenue Emile Deschanel, Paris, Frankrig Bernard Krust, 7 rue de Madagascar, Paris, Frankrig Marie-Anne Rey, 10 rue du Temple, Paris, Frankrig (74) Fuldmægtig: Plougmann & Vingtoft A/S, Sundkrogsgade 9, 2100 København Ø, Danmark (54) Benævnelse: Precursor for kappeglycolproteiner fra HIV-2-retrovirus og beslægtede antigener (56) Fremdragne publikationer: Ingen (57) Sammendrag: Et gp300-antigenprotein med følgende træk: - en molekylvægt på ca. 300 kd, - forbindelse mellem to enheder af et precursorglycoprotein gp140, især for kappeglycoproteinet gp125, der indkodes af env-genet fra genomet af et humant HIV-2-retrovirus, der er i stand til at fremprovokere SLA eller AIDS, eller proteinet af et retrovirus, som krydsreagerer immunologisk med antistoffer rettet mod gp300 - proteinet fra HIV-2-retrovirus, fremstilling af disse proteiner, monoklonale antistoffer rettet mod proteinerne samt immunogene præparater, der indeholder dem. fortsættes

2 - e- Kontrol Cast gp300--s- - -«* ,11.A gp148,_+ es aik gp125 -' ad Mø - -b- Kontrol Monensin /... =1".~~.6. gp ag, gp g p125''' Fig. 8

3 1 Den foreliggende opfindelse angår precursorantigener for kappeglycoproteiner fra et humant HIV-2-retrovirus samt antigener, der krydsreagerer immunologisk med specifikke monoklonale antistoffer, som genkender ovenstående precursorantigener for kappeglycoproteiner fra HIV-2-retrovirus. 5 Opfindelsen angår mere specifikt antigener, der kun er til stede under visse faser af udviklingen in vivo af en infektion, der skyldes et humant HIV-2-retrovirus. Disse antigener er karakteristiske ved dannelses- og modningsprocessen af dette retrovirus' kappeglycoprotein, og de er derfor impliceret i udviklingen og proliferationen 10 af HIV-2-retrovirus og deltager i infektionens spredning. Opfindelsen angår også antistoffer, som genkender antigenerne, samt immunogene præparater, der indeholder antistofferne. 15 Opfindelsen angår desuden fremstilling af de ovenfor nævnte antigener samt deres anvendelse til diagnose af en infektion med et humant HIV-2-retrovirus. Ætiologiske agentier, der er ansvarlige for udvikling af lymfadenopatisyndromer (hvis engelske forkortelse er SLA), eller som ledsager udviklingen af disse syndro- 20 mer eller er ansvarlige for udvikling af erhvervet immundefektsyndromer (AIDS), er blevet isoleret, identificeret og karakteriseret. Flere humane retrovira, som under visse betingelser kan fremkalde et SLA, der eventuelt afløses af AIDS, hos mennesker, betegnes HIV (engelsk forkortelse af 25 Human Immunodeficiency Virus). Et første virus, der betegnes LAV-1 eller HIV-1, er således blevet isoleret og beskrevet i GB 83/24.800, der svarer til ansøgning EP 84/ af 14. september 1984, offentliggørelsesnr Dette virus er også beskrevet af F. Barre 30 Sinoussi et al. i Science 220, nr , 20, s Varianter af dette HIV-1-virus med betegnelsen LAV ELI og LAV MAL er også isoleret, karakteriseret og beskrevet i EP 84/

4 2 Isolering og karakterisering af retrovira, som tilhører en bestemt klasse og kun har et begrænset immunologisk slægtskab med de foregående, er beskrevet i EP 87/ , offentliggørelsesnr Disse retrovira, som er grupperet under betegnelsen HIV-2, er isoleret hos flere afrikanske patienter med symptomer 5 på lymfadenopati eller AIDS. Undersøgelse af disse HIV-retrovira, isolering og analyse af deres nukleotidsekvenser samt karakterisering af deres antigenproteiner har gjort det muligt at foretage sammenligningsforsøg mellem de forskellige stammer, der er isoleret, med henblik 10 på deres slægtskab eller modsat deres specificitet, både i strukturel og funktionel henseende. Disse HIV-1- og HIV-2-retrovira er også blevet undersøgt i sammenligning med et retrovirus af abeoprindelse (betegnet med forkortelsen SIV eller STLV-III), og den- 15 ne undersøgelse har vist et vist slægtskab mellem proteinerne og glycoproteinerne fra HIV-2-retrovirus og varianter deraf og proteinerne og glycoproteinerne fra SIVretrovirus. Der bemærkes især et slægtskab med hensyn til kappeproteinet på hvert af disse vira. Der er nemlig påvist immunologiske krydsreaktioner mellem kappeglycoproteinet på SIV-retrovirus og antistoffer rettet mod kappeglycoprote- 20 inet på HIV-2-retrovirus, mens denne immunologiske krydsreaktion ikke finder sted mellem SIV-retrovirus og HIV-1-retrovirus og ej heller mellem HIV-1- og HIV-2- retrovirus. Resultater angående kappeglycoproteinet fra HIV-2-retrovirus, der indkodes af 25 env-genet fra dette retrovirus' genom, er anført i den ovenfor nævnte EP 87/ , offentliggørelsesnr I denne EP-ansøgning blev dette glycoprotein betegnet med forkortelsen gp140 under henvisning til dets molekylvægt på ca dalton. Det blev imidlertid præciseret, at udregningen af molekylvægten blev foretaget med ± 10%. I en tidligere fransk patentansøgning (nr /03881, offentliggørelsesnr ) var der ligeledes blevet beskrevet en precursor for gp140 med betegnelsen gp160 (molekylvægt: 160 kd ± 10%). Der er udført mere grundige undersøgelser af kappeglycoproteinet fra HIV-2-retrovirus, og disse har gjort det muligt for nærværende opfindere at foretage andre 35 målinger af de molekylvægte, der hidtil har været anført, og dermed forfine resul-

5 3 taterne ud fra de ovenfor beskrevne molekylvægtintervaller. Det eksterne kappeglycoprotein har i HIV-2-viruspartikler - under arbejdsbetingelserne ifølge den foreliggende opfindelse - en molekylvægt på ca dalton (det betegnes gp125). Under de samme arbejdsbetingelser har den precursor, som allerede er 5 påvist og betegnes gp160 i FR 86/03881, ifølge de seneste resultater en molekylvægt på ca dalton. Den betegnes derfor "gp140" i den foreliggende ansøgning. Ifølge den foreliggende opfindelse har opfinderne påvist eksistensen af flere udvik- 10 lingsfaser, som fører til opnåelse af kappeglycoproteiner i moden form, idet disse modne kappeglycoproteiner omfatter et gp125-glycoprotein og et gp36-glycoprotein. Nærværende opfindere har således identificeret forskellige stadier i forløbet af den virale replikationscyklus, som forekommer, når patogene forstyrrelser udvikler sig som følge af en infektion med et humant HIV-2-retrovirus. Opfinderne har i 15 denne forbindelse understreget vigtigheden af flere trin, som finder sted i de celler, der er inficeret med HIV-2-retrovirus, især i de humane T4-lymfocytter. Parallelt hermed har de udført lignende forsøg med de virale cykler for HIV-1-retrovirus og SIV-retrovirus. Disse forsøg har vist meget specifikke fælles egenska- 20 ber hos HIV-2-retrovirus og SIV-retrovirus, hvilke egenskaber derimod tilsyneladende ikke findes under HIV-1's virale replikationscyklus. Opfindelsen tilvejebringer således hidtil ukendte metoder til detektion af en infektion, som specifikt kan tilskrives et humant HIV-2-retrovirus. 25 Under hensyntagen til de sidstnævnte resultater ser den virale cyklus, som er særegen for HIV-2-retrovirus og SIV-retrovirus, ud til at være en kompleks kædereaktionsproces, som i sig selv kan føre til dannelse af det eksterne glycoprotein, som findes i kappen på HIV-2-retrovirus i sin endelige form. Under denne proces har 30 man kunnet genkende, isolere og identificere forskellige antigenprecursorer. Alle har især et strukturelt slægtskab bygget på peptidskelettet af det kappeglycoprotein, som indkodes af env-genet fra HIV-2-retrovirus, hvilket gen er beskrevet i ovennævnte EP-patentansøgning.

6 4 Den foreliggende opfindelse angår således proteiner eller glycoproteiner, som produceres som følge af en infektion med et humant HIV-2-retrovirus under de forskellige trin af cyklen med dannelse og modning af det eksterne kappeglycoprotein gp125 fra HIV-2, hvilke proteiner som fælles træk har peptidskelettet af det eks- 5 terne kappeglycoprotein fra humant HIV-2-retrovirus, eller et glycoprotein, som udviser en immunologisk krydsreaktion med ovennævnte gp125 og er forskelligt, hvad angår tilstedeværelsen og/eller sammensætningen af de eventuelle oligosaccharidkæder. 10 De specifikke træk ved proteinerne og glycoproteinerne ifølge opfindelsen opnås ved hvert trin, der er uundværligt for dannelsen og modningen af det modne ydre kappeglycoprotein fra humant HIV-2-retrovirus. Ved hjælp af undersøgelsen af viruscyklen har opfinderne foreslået muligheden af 15 at gribe ind under de særlige trin med dannelse af de modne kappeglycoproteiner fra humant HIV-2-retrovirus, hvilket således tilvejebringer midler til at afbryde viruscyklens normale forløb og afbøde propagationen af retroviruset, som er infekti-. øst for mennesker og under visse betingelser patogent. 20 I overensstemmelse med ovenstående angår opfindelsen et retroviralt antigenglycoprotein, som er kendetegnet ved, at det drejer sig om: - enten et glycoprotein benævnt gp300 med en molekylvægt på ca. 300 kd bestående af forbindelsen mellem to enheder af et precursorglycoprotein gp140, 25 især for kappeglycoproteinet gp125, der indkodes af env-genet fra genomet af et humant HIV-2-retrovirus, der kan fremkalde SLA eller AIDS, - eller dimeren.af precurseren for kappeglycoproteinet af en retrovirus, som krydsreagerer immunologisk med antistoffer rettet mod gp300-glycoproteinet. 30 Det skal bemærkes, at gp140-precursoren også er precursoren for gp36 fra humant retrovirus af typen HIV-2. Opfinderne har konstateret, at den ovenfor nævnte forbindelse mellem de to en-heder af gp140 er en iboende egenskab hos deres peptidskelet. 35 Antigenproteinet gp300 er endvidere ejendommeligt ved følgende egenskaber:

7 5 det findes i cellerne i en biologisk prøve fra en patient, der er inficeret med et retrovirus af HIV-2-familien, især i de humane T4-lymfocytter eller i permanente cellelinjer afledt af disse T4-lymfocytter, dets isoelektriske punkt (pi) opnås ved en ph-værdi i området [6,8-7,8], 5 det glycosyleres af oligdsaccharidkæder forbundet til nitrogen, det er stabilt i ioniske detergenter, især 1% SDS, i ikke-ioniske detergenter, især 2% Triton X-100, i 4M urinstof, i kraftige salte og i reduktionsmidler, det spaltes spontant in vitro til to glycoproteiner med en molekylvægt på ca. 140 kd ved ph 4-5, 10 - efter isolering og oprensning på elektroforesegel spaltes det i en acetatbuffer in vitro til to glycoproteiner med en molekylvægt på ca. 140 kd ved phværdier, der er lig med eller mindre end 6, efter oprensning på en HIV-2-serum-Sepharose immunaffinitetssøjle i nærværelse af specifikke antistoffer, der er vundet ud fra serum fra en patient, 15 som er inficeret med humant HIV-2-retrovirus, giver det et elektroforesebånd på en 7,5%'s SDS-polyacrylamidgel i nærværelse af 6M urinstof svarende til en molekylvægt på 300 kd. Nærværende opfindere har bemærket, at dannelsen af den dimer, som består af 20 gp300, er et kortvarigt trin i viruscyklen, som sandsynligvis er nødvendigt for modningen af kappeglycoproteinerne fra HIV-2-retrovirus. Ovennævnte antigenprotein gp300 er nemlig ejendommeligt ved, at det tilsyneladende ikke fremkaldes ved elektroforeseanalyse af et biologisk medium, som består af viruspartikler, der er til stede i det specifikke dyrkningsmedium af celler, som er inficeret med humant 25 HIV-2-retrovirus, efter mærkning med 35S-methionin (200 gci/m1; 4 x 10 6 cel- ler/ml) i 18 timer og oprensning af de vundne ekstrakter, som indeholder de inficerede celler og deres tilsvarende dyrkningsmedium, hvorimod det fremkaldes under samme betingelser i ovennævnte inficerede celler. 30 Dette har ført til den betragtning, at gp300 er en foreløbig precursor, som er specifik for de endelige kappeglycoproteiner. Denne egenskab hos viruscyklen af humant HIV-2-retrovirus, der medfører opnåelse af et gp300-protein, er original og usædvanlig i forhold til det kendskab, der er opnået om de generelle mekanismer for dannelse af glycoproteiner, som indeholder oligosaccharid-glycosyleringskæder, 35 der er bundet til nitrogen.

8 6 Desuden har nærværende opfindere på interessant måde bemærket, at der ved dannelsen og modningen af kappegiycoproteiner af SIV mac-retrovirus også forekommer et dimerisationstrin, som fører til dannelse af et glycoprotein af gp300-typen, som er særlig karakteristisk for humant HIV-2-retrovirus. I modsætning hertil 5 har parallel iagttagelse af viruscyklen af det humane HIV-1-retrovirus ikke gjort det muligt at konstatere noget dimerisationstrin, som fører til dannelse af et glycoprotein, som er beslægtet med gp300. Disse resultater antyder overraskende, at dannelse af en dublet (eller dimer) ud fra 10 gp140-precursoren for kappeglycoproteinet af humant HIV-2-retrovirus er en egenskab, der er specifik for ekspressionen af env-genet fra humant HIV-2-retrovirus og SIV-retrovirus. Denne konstatering kan udnyttes ved undersøgelse og udvikling af midler til selek- 15 tiv diagnose af en infektion, som skyldes et humant HIV-2-retrovirus, der kan fremprovo-kere SLA eller AIDS under visse betingelser. Disse hensigtsmæssige diagnostiske midler vil blive beskrevet nærmere i det følgende. Opfindelsen angår også et protein, som har identiske træk med gp300, hvad angår 20 peptidskelettet, hvilket protein er ejendommeligt ved, at det er i ikke-glycosyleret form, og at dets molekylvægt er ca. 200 kd. Dette protein, p200, som vil blive beskrevet nærmere i eksemplerne nedenfor, er blevet påvist under et spaltningsforsøg med endo-(3-n- acetylglucosaminidase H (i 25 det følgende betegnet "endo-h"). Dette protein, som udgør den ikke-glycosylerede form af gp300, kan have særlig interesse på grund af den eventuelle forekomst af en fælles epitop for gp300 og p200, som kan vise sig at have ringe antigenicitet i gp300 på grund af tilstedeværelsen af oligosaccharidkæder, som har betydning for den endelige konformation af gp300, men som alligevel hæmmer tilgængeligheden 30 af en interessant epitop. Under undersøgelsen af viruscyklen blev der detekteret et andet glycoprotein; der er tale om et oprenset gp150-glycoprotein, som er ejendommeligt ved, at det detekteres in vitro (kun i celler fra en patient inficeret med et humant retrovirus af 35 HIV-2-typen) efter mærkning af cellerne med et radioaktivt sporstof, som tilsættes

9 7 i et kort tidsrum, i nærværelse af en inhibitor af glucosidaseenzymer, især castanospermin, efterfulgt af fjernelse af det radioaktive sporstof ved vask og erstatning med ikke-radioaktive molekyler forud for et trin med bestemmelse af radioaktiviteten af prøver, der er taget med forskellige tidsintervaller, hvilket trin gør det mu- 5 ligt at detektere sporstoffet i de proteiner og glycoproteiner, der dannes efter mærkningen. Observationen af gp150 foretages efter et tidsrum, der er lig med eller tæt ved det tidsrum, som er nødvendigt for detektionen af gp300. Glycoproteinet gp150 er også ejendommeligt ved følgende træk: 10 en molekylvægt på ca. 150 kd, peptidskelettet af precursoren for kappeglycoproteinet gp125, der indkodes af env-genet fra genomet af et humant HIV-2-retrovirus eller et retrovirus, hvis ydre kappeglycoprotein genkendes af antistoffer fra et serum fra en pa- 15 tient, der er inficeret med det humane HIV-2-retrovirus, især antistoffer rettet mod gp125, terminale glucoserester på en oligosaccharidkæde. De ovenfor beskrevne proteiner og glycoproteiner og fortrinsvis gp300 har vist sig 20 nyttige til anvendelse i antigenpræparater til diagnose af tilstedeværelsen af antistoffer i celler i en biologisk prøve fra en patient, der er inficeret med et humant retrovirus af HIV-2-typen, idet disse præparater er ejendommelige ved, at de omfatter et antigenprotein eller -glycoprotein som defineret ovenfor. 25 Disse præparater er særlig interessante i det omfang, de muliggør dannelse af immunologiske komplekser af antigen-antistoftypen med antistoffer fra serummet fra en patient, der er inficeret med et humant HIV-2-retrovirus. Som følge heraf anvendes disse præparater og/eller de antigener, som de indeholder, med fordel til udførelse af specifik diagnose af en infektion, som skyldes et humant retrovirus af 30 HIV-2-typen. Opfindelsen angår også monoklonale antistoffer, der er ejendommelige ved, at de 35 genkender det ovenfor definerede gp300, og at de ikke genkender det modne kappeglycoprotein gp125 og det modne gp36.

10 8 Andre monoklonale antistoffer er ejendommelige ved, at de genkender en epitop, 5 som i ovennævnte gp300 er blotlagt og tilgængelig for antistoffet, idet denne epitop imidlertid enten ikke er blotlagt eller er maskeret i de modne gp125 og gp36 i deres naturlige konformation. Sådanne monoklonale antistoffer kan også være neutraliserende, idet de især forhindrer binding af humant HIV-2-retrovirus til dets receptor, især til T4-receptoren på de humane lymfocytter, som omfatter den. 10 Andre interessante monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende opfindelse genkender det ovenfor definerede p200 og genkender ikke de modne glycoproteiner gp125 og gp36. Andre monoklonale antistoffer er ejendommelige ved, at de genkender en epitop i 15 p200, idet denne epitop imidlertid enten ikke er blotlagt eller er maskeret på gp125 og gp36 og/eller på gp300, således som de fås i deres naturlige konformationer. Ovennævnte monoklonale antistoffer kan have immunogene og neutraliserende egenskaber og afbryde proliferationen af humant HIV-2-retrovirus. 20 Flere fremgangsmåder til fremstilling ạf disse antistoffer kan anvendes til udøvelse af den foreliggende opfindelse. Fx kan der anvendes kulturer i ascites hos dyr, især hos gnavere såsom mus. Antistofferne kan også produceres ud fra cellekulturer, der enten er immobiliserede eller indkapslede eller er i suspension. Der anvendes 25 især teknikken med hybridomer, der er vundet ved fusion af lymfocytter fra et dyr, som i forvejen er inokuleret med humant HIV-2-retrovirus. Derefter udtages lymfocytter fra det inficerede dyr, og disse fusioneres med udvalgte myelomceller til dannelse af hybrider, som derpå selekteres for deres evne til at producere specifikke antistoffer rettet mod de ovenfor beskrevne antigenproteiner og -glycopro- 30 teiner. Disse producerede monoklonale antistoffer anvendes fx til inaktivering af de proteiner og/eller glycoproteiner, hvormed de danner et immunologisk kompleks, eller på grund af deres evne til at forhindre det normale forløb under dannelsen af endelige 35 glycoproteiner i kappen på et humant HIV-2-retrovirus. Under hensyntagen til

11 9 slægtskabet mellem peptidskelettet af proteinerne og glycoproteinerne ifølge opfindelsen kan de monoklonale antistoffer, som er dannet mod disse glycoproteiner, især mod gp300 og p200, desuden vise sig at være effektive mod gp En anden eventuel anvendelse af disse antistoffer er fx til detektion af virusantigener i biologiske præparater eller til oprensning af proteiner og/eller glycoproteiner, fx på en affinitetssøjle. Generelt er opfindelsen ikke begrænset til glycoproteiner og proteiner som beskre- 10 vet ovenfor, når de fås ud fra det humane HIV-2-retrovirus. Opfindelsen omfatter derimod også proteiner og glycoproteiner, der har antigene, immunologiske og også immunogene egenskaber til fælles med de ovenfor beskrevne proteiner og glycoproteiner, idet disse proteiner og glycoproteiner da fx kan defineres ved deres evne til at blive genkendt af antistoffer, der specifikt er rettet mod de tilsvarende 15 proteiner, som er karakteristiske for et humant HIV-2-retrovirus. Dette gælder fx glycoproteinerne gp300 og andre precursorer for det ydre kappeglycoprotein af et SIV mac-retrovirus, hvis viruscyklus, der er undersøgt af nærværende opfindere, har vist egenskaber, der er fælles med de ovenfor nævnte pro- 20 tejner og glycoproteiner af humant HIV-2-retrovirus. 25 Opfindelsen angår også et immunogent præparat, som indeholder et gp300-glycoprotein som defineret ovenfor sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer, der er egnet til fremstilling af vacciner. Et således udformet immunogent præparat indeholder antigenproteiner og/eller -glycoproteiner i en sådan mængde, at der kan administreres en dosis på pg/kg. 30 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af gp300-antigenglycoproteinet, hvilken fremgangsmåde omfatter følgende trin: lysering af celler, der er inficeret med et humant HIV-2-retrovirus, og separation af supernatanten og celleekstrakten,

12 1 0 inkubation af celleekstrakten og/eller supernatanten på en immunaffinitetssøjle, på hvilken der er anbragt en immunadsorbent omfattende oprensede antistoffer, der er vundet fra serummet fra en patient, som er inficeret med humant HIV-2-retrovirus, og hvilke antistoffer er fikseret på et passende 5 underlag, i nærværelse af en buffer og i et tilstrækkelig langt tidsrum til at opnå dannelse af et immunologisk antigen-åntistofkompleks, vask af søjlen med en buffer for at fjerne de ikke-tilbageholdte molekyler, opløsning af de eluerede proteiner, fx tilbageholdte ved elektroforese og elektroeluering, 10 - isolering af de ønskede antigenproteiner. De inficerede celler kan tages fra en patient, der er inficeret med et humant HIV-2- retro-virus. De kan også fås in vitro fra en cellekultur, der er inficeret med HIV-2. Sådanne cellekulturer kan fås fra CEM-celle-linjer. 15 En anden fremgangsmåde til fremstilling af glycoproteinet udføres analogt med ovenstående fremgangsmåde, idet elektroelueringstrinnet imidlertid erstattes af følgende trin: 20 - eluering af de proteiner, der er fikseret på ovennævnte immunaffinitetssøjle, oprensning af de således eluerede produkter på en kromatografisøjle, der fikseret på separationsunderlaget indeholder monoklonale antistoffer rettet mod gp I en særlig udførelsesform af opfindelsen udføres lyseringen af de inficerede celler i en detergentopløsning, idet de antistoffer, der er omfattet i immunadsorbenten, fikseres til agarosekugler, og der arbejdes i nærværelse af en koblingsbuffer. Opfindelsen angår også en metode til diagnose in vitro af tilstedeværelsen af anti- 30 stoffer i celler i en biologisk prøve fra en patient med henblik på at bekræfte en eventuel infektion med humant HIV-2-retrovirus, hvilken metode omfatter følgende trin:

13 11 den biologiske prøve bringes i kontakt med et antigen som beskrevet ovenfor eller med et antigenpræparat ifølge opfindelsen under betingelser, der muliggør dannelse af et immunologisk kompleks af antigen-antistoftypen, det dannede antigen-antistofkompleks detekteres. Den biologiske prøve, på 5 hvilken diagnosen udføres, kan være en biologisk væske, især et serum, en biologisk vævsekstrakt, når blot den formodes at indeholde celler, der er inficeret med humant HIV-2-retrovirus. En sådan metode kan have særlig interesse i det omfang, den muliggør en tidlig 10 detektion af en infektion, som skyldes et humant HIV-2-retrovirus eller et beslægtet retrovirus, idet nærværende opfindere har påvist forekomsten af gp300 på et tidligt stadium under virus-reillikationscyklen af det retrovirus, som er ansvarligt for infektionen. 15 Til udøvelse af ovenstående diagnostiske metode har opfinderne fremstillet en indretning eller et kit til detektion af antistoffer i celler i en biologisk prøve fra en patient, som kan være inficeret med et humant HIV-2-retrovirus, hvilket kit omfatter: i det mindste & antigenprotein og/eller -glycoprotein som beskrevet ovenfor 20 eller et præparat fremstillet ud fra disse bestanddele eller en blanding af disse forskellige bestanddele og midler, der muliggør en reaktion til dannelse af et immunologisk kompleks mellem ovenstående antigener og d,e antistoffer, der eventuelt findes i den 25 biologiske prøve, som skal testes, om nødvendigt en eller flere inkubationsbuffere, en negativ kontrolprøve, midler til fremkaldelse af det dannede antigen-antistofkompieks. 30 Efter at have bestemt de forskellige trin med dannelse af det infek-tiøse HIV-2-retrovirus samt betydningen af forskellige af disse trin for infektionens udvikling har nærværende opfindere udviklet et farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt ved, at det omfatter i det mindste &I inhibitor af glucosidaserne I og/eller II, især castanospermin eller deoxyjirimicyn eller en blanding af disse inhibitorer, i en do- 35 sis, der er tilstrækkelig til at blokere elimineringen af terminale glucoserester i

14 12 oligosaccharidkæderne på gp150-glycoproteinet under viruscyklen, sammen med en fysiologisk acceptabel excipiens. Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret under henvisning til neden- 5 stående eksempler og tegningen, der viser følgende: Fig. 1, som består af fig. 1A og 18, viser HIV-2-kappeglycoproteiner. Fig. 1A: 10 HIV-2 Sammenligning af proteiner med høj molekylvægt fra HIV-1 og CEM-celler inficeret med HIV-1 eller HIV-2 blev mærket med 35S-methionin (200 pci/m1; 4 x 10 6 celler/m1) i 18 timer. Ekstrakter af de inficerede celler (CELL) og deres tilsvarende dyrkningsmedium (SN) blev oprenset på specifikke immunaffi- 15 nitetssøjler: HIV-1-serum-Sepha-rose-søjle, specifik for HIV-1-proteiner (Krust et al., 1988); og HIV-2-serum-Sepharose-søjle, specifik for HIV-2-proteiner (se "eksperimentelle procedurer"). De oprensede proteiner blev analyseret ved elektroforese på 7,5%'s SDS-polyacrylamidgel indeholdende 6M urinstof. En fluorograf af gelen er vist i fig. 1A. Størrelsen af HIV-i- og HIV-2-proteinerne er vist til venstre 20 og til højre for banerne. p68 og p55 er henholdsvis revers transkriptase og gagpre-cursoren. gp160 og gp120 er henholdsvis precursoren for HIV-1-kappeglycoproteinet og dets spaltningsprodukt. gp300, gp140 og gp125 er precursorerne for glycoproteinet og spaltningsproduktet af HIV-2-kappeproteinet. 25 Fig. 1B Identificering af HIV-2-glycoproteiner CEM-celler inficeret med HIV-2 og T-lymfocytter blev mærket med 3H-glucosamin (200 ici/ml; 4 x 10 6 i 18 timer. Ekstrakter af de inficerede celler (bane C) og dyrkningsmediet indeholdende viruset (bane V) blev oprenset på HIV-2-se- 30 rum-sepharose-søjle, og de mærkede proteiner blev analyseret ved elektrofo-rese på 7,5%'s gel af HIV-2-glycoproteinerne, der var syntetiseret i CEM-cellerne. I banen yderst til venstre viser elektroforese på 12,5% acrylamidgel tilstedeværelsen af gp36. Denne del af figuren skulle overeksponeres for at påvise gp36, hvorfor gp140/125 er opløst i form af et tæt bånd. 35

15 13 Fig. 2 Analyse ved gelelektroforese i to dimensioner af HIV-2-glycoproteiner Glycoproteinerne gp300, gp140 og gp125, som var oprenset ud fra CEM-celler inficeret med HIV-2 (CELL), blev mærket med 35S-methionin. Glycoproteinerne samt 5 dyrkningsmediet indeholdende viruset blev analyseret (SN repræsenterer det resultat, der blev opnået med dyrkningsmediet; fremstillingsbetingelserne svarer til fig. 1A for gelelektroforese i to dimensioner (se "eksperimentelle procedurer"). ph-gradienten for isoelektrisk fokusering (første dimension) svarer til den angivne. -I den anden dimension blev proteinerne opløst på 7,5% SDS-polyacrylamidgel indehol- 10 dende 6M urinstof. Fluorografer af gelerne er vist i fig. 2. Fig. 3: Dissociering af det native (a) og det denaturerede (b og c) gp300- protein 15 (a) Ekstrakter af CEM-celler inficeret med HIV-2 og mærket med 35S-methionin blev oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle. Prøven blev derpå opdelt i to lige store dele: den ene blev inkuberet i en koblingsbuffer (bane 1), mens den anden blev inkube- 20 ret i en buffer indeholdende 30 mm natriumacetat, ph 4,0, 0,2 mm PMSF, 100 enheder/ml aprotinin og 5 mm p-mercaptoethanol (bane 2). Efter 1 time ved 37 C blev det sure medium neutraliseret, og de to prøver blev analyseret ved elektroforese. 25 (b) gp300, der var mærket med 35S-methionin, oprenset og lyofiliseret, blev suspenderet i en natriumacetatbuffer (100 pi) ved ph 4 som beskrevet ovenfor (bane 2). Der blev udført inkubationer i 30 minutter ved 37 C før tilsætning i to omgange af en elektroforesebuffer indeholdende 2M urinstof. Resultaterne -i bane 1 svarer til lyofiliseret gp300 direkte suspenderet i elektroforesebufferen. 30 (c) gp300, der var mærket med 35S-methionin, oprenset og lyofiliseret, blev suspenderet i en opløsning indeholdende 30 mm Tris-HCI, 0,2 mm PMSF og 100 enheder/ml aprotinin og bufret med HCI til ph 7,5; 7,0; 6,5; og 6,0 (som vist i figuren). Efter 60 minutter ved 37 C tilsattes i to omgange en elektroforesebuffer, og 35 prøverne blev analyseret ved elektroforese.

16 14 Fluorografer af disse geler er vist under (a), (b) og (c). I sektion (c) er det karakteristiske bånd for gp300 dissocieret til gp140, idet denne dissociering kan kvantificeres ved udførelse af en densiometrisk scanning af denne fluorograf. 5 Fig. 4: Spaltning af HIV-2-glycoproteinerne med endo-1-1 Glycoproteinerne gp300, gp140/gp125 og gp125, der var oprenset og lyofiliseret (se "eksperimentelle procedurer"), blev suspenderet i en buffer indeholdende 150 mm natriumcitrat, ph 5,5, 0,1% SDS (vægt/volumen), 0,5 mm PMSF, hvor-. 10 efter det hele blev opvarmet i 2 minutter ved 90 C. Alikvoter af disse prøver blev inkuberet (2 timer ved 30 C) uden endo-h (bane 1) eller med 0,4 (bane 2), 2 (bane 3) og 10 (bane 4) millienheder endo-h. Alle disse reaktioner blev standset ved tilsætning af elektroforesebuffer i to om- 15 gange. Elektroforesen blev udført som beskrevet under fig. 1. Fluorografer af de forskellige geler er vist. Pilene p90 og p80 til højre viser spaltningsproduktets position. Betingelserne for endo-h-spaltningen er beskrevet af Tarentino et al., Fig. 5: 20 ler 3 H -fucose Isotopisk mærkning af HIV-2-glycoproteinerne med "C-mannose el- HIV-2-inficerede celler blev mærket i 18 timer med "C-mannose (25 1.1Ci/m1; 4 x 10 6 celler/m1) eller 3 H-fucose (200 i.tci/m1; 4 x 10 6 celler/ml). Ekstrakter af de inficerede celler (bane C) og af dyrkningsmediet indeholdende viruset (bane V) blev 25 oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle. De mærkede glycoproteiner blev derefter analyseret ved elektroforese på polyacrylamidgel. Fluorografen er vist i fig. 5. Fig. 6: 30 tunicamycin Inhibering af den nitrogenforbundne glycosylering ved hjælp af Celler, der var inficeret med HIV-2 i fravær af tunicamycin (bane C) eller i nærværelse af tunicamycin (2 pg/ml) (bane TM), blev mærket med 35S-methionin (betegnet 35S-met; 200 pci/ml; 4 x 10 6 celler/ml) eller med 311-glucosamin (beteg- 35 net 3 H-GIcNAc; 200 pci/m1; 4 x 10 6 celler/m1) i 16 timer. De tunicamycinbehand-

17 15 lede celler blev først inkuberet (37 C) med antibiotikummet (2 1. g/ral) i 2 timer før mærkning med 35S-methionin eller 3H-glucosamin. Ekstrakter af de inficerede celler (CELL) og af dyrkningsmediet indeholdende viruset (SN) blev oprenset på HIV-2- serum-sepharose-søjle og analyseret ved elektroforese på 7,5% polyacrylamidgel. 5 Fluorografer af disse geler er vist. Positionerne af den ikke-glycosylerede kappeprecursor (p90/80) og den ikke-glycosylerede dimer (200 kd) er vist med små pile til højre. Proteinerne 90/80 kd og 200 kd inkorporerer ikke 3H-glucosamin ( 3 H- GIcNAc, CELL, bane TM). 1.0 Fig. 7: Virkning af oligosaccharid-spaltningsinhibitorer på processen til dan- nelse af HIV-2-kappeglycoproteinet HIV-2-inficerede CEM-celler blev mærket (16 timer, 37 C) med 35S-methionin (200 pci/ml; 4 x 10 6 celler/ml) i fravær af spaltningsinhibitor (bane T) eller i nær- 15 værelse af en oligosaccharidspaltningsinhibitor: 1 mm bromconduritol (bane Bro); 1 mm castanospermin (bane Cast.); 10 pg/ml swainsonin (bane Sw); 3 mm deoxynojirimycin (bane dnm) og 1 mm deoxymannojirimycin (bane dmm). Ekstrakter af de inficerede celler (CELL) og af dyrkningsmediet indeholdende viruspartiklerne (SN) blev oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle for at identificere virusglyco- 20 proteinerne gp125, gp140 og gp300 i de inficerede celler og gp125 i dyrkningsmedierne. Alle prøverne blev analyseret ved elektroforese på 7,5% polyacrylamidgel. For at påvise, at inhiberingen af produktionen af gp125 ved hjælp af de celler, der var behandlet med de forskellige inhibitorer, er specifik for virusglycoproteinet, blev dyrkningsmediet testet, hvilket førte til detektion af tilstedeværelsen af kerne- 25 proteinet, p26, ved en immunpræcipitationstest, hvor der anvendtes et serum, der var HIV-2-seropositivt (Clavel et al., 1986a, 1987). p26 blev analyseret ved elektroforese på polyacrylamidgel (12,5%). Figurerne viser fluorografen, hvor der kun er vist en enkelt del af hver gel. 30 Fig. 8: Virkning af castanospermin og monensin på processen til dannelse af HIV-2-glycoproteiner (a) Der blev udført forsøg med mærkning med et radioaktivt sporstof i et kort tidsrum efterfulgt af fjernelse af sporstoffet og erstatning deraf med ikke-radioaktive 35 molekyler ("pulse-chase"-eksperiment). Disse forsøg blev udført på CEM-celler infi-

18 16 ceret med HIV-2 i fravær af castanospermin (kontrol) eller i nærværelse af 1 mm castanospermin (Cast.). Kontrol: De inficerede celler blev inkuberet i 1 time ved 37 C i et medium uden 5 methionin før mærkning i et kort tidsrum på 15 minutter med 35S-methionin (200 tci/ml; 4 x 10 5 celler/mil; bane 1). Det radioaktive sporstof blev fjernet og erstattet med dyrkningsmediet indeholdende koldt 5 mm methionin i 0,5, 1,5 og 3 timer (resultatet er vist henholdsvis i bane 2, 3 og 4). Cast.: De HIV-2-inficerede CEMceller blev inkuberet (1 time ved 37 C) i et medium uden methionin, men indehol- 10 dende castanospermin før hurtig mærkning i 30 minutter med 35S-methionin. Disse celler blev derpå fulgt efter fjernelse af det radioaktive sporstof og erstatning med ikke-radioaktive molekyler som beskrevet ovenfor, men i nærværelse af castanospermin i 0,5, 1,5 og 3 timer (henholdsvis bane 2, 3 og 4). 15 (b) Der blev udført forsøg med mærkning med et radioaktivt sporstof efterfulgt af sporstoffet under de ovenfor beskrevne betingelser i HIV-2-inficerede celler i fravær af monensin (kontrol) eller i nærværelse af 1 j_im monensin. Inficerede celler med eller uden monensin blev inkuberet (1 time, 37 C) i et medium uden methionin før mærkning i et kort tidsrum (30 minutter) med 35S-methionin (bane 1). De 20 mærkede celler blev derefter fulgt i dyrkningsmediet indeholdende koldt 5 mm methionin i 0,5, 1,5 og 3 timer (henholdsvis bane 2, 3 og 4). Ekstrakter blev oprenset på HIV-2-serum-Sepharose-søjle, og de mærkede proteiner blev analyseret ved elektroforese på 7,5%'s polyacrytamidgel. Resultaterne er 25 vist i fluorograferne. p55 angiver gag-precursoren i sektion A, bane 1. Fig. 9: Precursorer for SIV-olygoproteiner SIV-inficerede HUT-78-celler blev mærket (16 timer, 37 C) med 35S-methionin 30 (200 pici/p1; 4 x 10 6 celler/m1), 3H-fucose (200 pci/pl; 4 x 10 6 celler/ml) og "Cmannose (25 ici/pl; 4 x 10 6 celler/ml). Ekstrakter af de inficerede celler (bane C) og af dyrkningsmediet indeholdende SIV (bane V) blev oprenset på HIV-2-serum- Sepharose-søjle. Et HIV-2-positivt serum blev anvendt til udførelse af en immunpræcipitationsreaktion af SIV-proteiner, da HIV-2-proteinerne og SIV-proteinerne 35 udviser immunologiske krydsreaktioner. Alle prøverne blev analyseret ved elektro-

19 17 forese på 7,5% polyacrylamidgel (se "eksperimentelle procedurer"). En fluorograf af de forskellige geler er vist. Den elektroforetiske mobilitet af gp300s1 v og 9p1 40Sw svarer til mobiliteten af glycoproteinerne gp300 og gp140 fra HIV-2. gp har en lidt større-mobilitet end gp125 fra HIV-2. p55 mærket med 35S- 5 methionin er formodentlig gag-precursoren fra SIV. Fig. 10: Skematisk fremstilling af trinnene under dannelsen af HIV-2- kappeglycoproteinet 10 Det syntetiserede og glycosylerede polypeptid på 80 kd giver anledning til dannelse af en "umoden precursor for glycoproteiner" gp150, som hurtigt deglycosyleres af glucosidaserne i det ru endoplasmatiske retikulum (RER). En ændring af omgivelserne (især af ph) medfører således dimerisation, hvilket giver anledning til dannelse af gp300, "intermediær precursor i form af dimer". gp300 spaltes af manno- 15 nidaserne fra RER, før det transporteres ind i'golgi-apparatet. Andre spaltninger af gp300 udføres af mannosidaserne i Golgi-apparatet før overførsel af fucose og sialsyrerester til Golgi-medialen og til trans-golgi. Til sidst nedbrydes dimeren til en "moden precursor" gp135 på grund af den sure ph, som hersker i trans-golgi-netværkets (TGN) hulrum. gp135 transporteres til plasmamembranen og spaltes af 20 celleproteasen, hvilket giver modne HIV-2-kappeglycoproteiner, gp125 og gp36. Tunicamycin (TM) inhiberer samling af dolichol-p-p-glycan-rester; castanospermin (Cast.) og deoxynojirimycin (dnm) inhiberer glucosidaserne i RER; deoxymannojirimycin (dmm) inhiberer spaltningsmannosidaserne i RER og i cis-golgi og i Golgimedial; monensin inhiberer transporten af membranglycoproteinerne og sekre- 25 tionsproteinerne fra Golgi-apparatet. EKSEMPLER 30 EKSPERIMENTELLE PROCEDURER I. Materialer L-( 35S)Methionin (specifik aktivitet: 1000 Ci/mmol), L-(6-3H)fucose (specifik aktivi- 35 tet: Ci/mmol), D-(6-3H)glucosamin (specifik aktivitet: Ci/mmol) og D-

20 18 (U- 14C)mannose (specifik aktivitet: mci/mmol) blev leveret af Amersham (Amersham, UK). Bromconduritol, castanospermin, 1-deoxymannojirimycin (dmm), 1-deoxynojiri- 5 mycin (dnm), swainsonin og tunicamycin blev leveret af Boehringer-Mannheim (Mannheim, BRD). Endo-/I-N-acetylglucosaminidase H blev leveret af Calbiochem (San Diego, USA). 10 Ampholinerne stammer fra Pharmacia (Uppsala, Sverige). II. Virus og celler Et HIV-1 8Ru-isolat fra humant immundefektvirus, type 1 (beskrevet af Montagnier 15 et al., 1984), et HIV-2 ROD-isolat fra humant immundefektvirus, type 2 (beskrevet af Clavel et al., 1986a) og et abe-immundefektvirus, SIVmac 142 (beskrevet af Daniel et al., 1985) blev anvendt i denne undersøgelse. De forskellige cellelinjer og de humane lymfocytter blev dyrket i et RPMI-1640-sus- 20 pensionsmedium (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise, Frankrig) indeholdende 10% (vol/vol) føtalt kalveserum; 2 pg/m1 polybren (SIG-MA) blev sat til de HIV-inficerede cellekulturer. Celler fra klonen CEM13 stammer fra CEM-cellelinjen af humane lymfoide celler (deponeret i ATCC med nr. CCL119) og udtrykker T4-antigenet på højt niveau. 5 dage efter infektionen med HIV-1 BRu-isolatet eller med HIV-2R00-25 isolatet producerer ca % af cellerne viruspartikler og kan identificeres ved de cytopatogene virkninger, som svarer til vakuolisering af cellerne og fremkomst af syncytier med lille størrelse. Cellelinjen HUT-78 er en anden cellelinje af positive humane T4-lymfocytter 30 (Gadzdar et al., 1980), som i høj grad tillader replikation af SIVmac142 (Daniel et al., 1985). Perifere blodlymfocytter fra sunde bloddonorer blev stimuleret i 3 dage med 0,02% (vægt/volumen) af fraktion P af phytohæmagglutinin (DIFCO, Detroit, USA) i et RPMI-1640-medium tilsat 10% føtalt kalveserum. Cellerne blev derpå dyrket på et RPMI-1640-medium indeholdende 10% (vol/vol) T-cellevækstfaktor

21 19 (TCGF, Biotest). Efter infektion med HIV-2 blev lymfocytterne dyrket i nærværelse af 10% (vol/vol) TCGF og 2 pg/ml Polybren. 5 III. Metabolisk mærkning af cellerne Til metabolisk mærkning af proteiner blev inficerede celler inkuberet i 16 timer ved 37 C i et MEM-dyrkningsmedium (engelsk forkortelse af Minimum Essential Medium) uden L-methionin eller serum, men tilsat 200 pci/rni L-( 35S)methionin. Til 10 metabolisk mærkning af glycoproteinerne blev inficerede celler inkuberet i 16 timer ved 37 C i et MEM-dyrkningsmedium' uden serum eller glucose, men tilsat 200 pci/m1 3H-fucose og 200 pci/m1 D-(6-3H)glucosamin eller 25 ici/r-n1 14C_ mannose. 15 IV. Celler og virusekstrakter Cellebundfald svarende til 10 7 celler blev resuspenderet i 100 gi af følgende buffer: 10 mm Tris-HCI, ph 7,6, 150 mm NaCI, 1 mm EDTA, 0,2 mm PMSF, 100 enheder/ml aprotinin (Iniprol, CHOAY) før tilsætning af 100 pl af samme buffer indeholdende 20 2% (vol/vol) Triton X-100. Celleekstrakter blev centrifugeret ved x g i 10 minutter, og supernatanten blev opbevaret ved -80 C indtil brug. For præparaterne af virusekstrakten blev der tilsat 100 pl 10x lysebuffer (100 mm Tris-HCI, ph 7,6, 1,5M NaCI, 10 mm EDTA, 10% (vol/vol) Triton X-100, 100 enheder/ml aprotinin) pr. ml klaret supernatant af inficerede CEM-celler. Disse præ- 25 parater blev anvendt som følger. V. Fremstilling af en immunabsorbent med antistoffer, som findes i serum fra en patient, der er seropositiv for HIV-2-virus 30 Immunglobuliner fra et serum fra en HIV-2-seropositiv patient blev præcipiteret med 50% (NH4)2SO4, opløst i 20 mm natriumphosphat (pli 8,0) og derpå oprenset på en DEAE-cellulosesøjle (DE 52, Whatman) ved eluering med 20 mm natriumphosphat (ph 8,0). De således oprensede immunglobuliner blev bedømt til at være 90% rene. Antistofferne blev derefter koblet til Sepharose CL 4B aktiveret med 35 CNBr ifølge den teknik, der er beskrevet af Berg (1977). 2 pg IgG blev koblet pr.

22 20 ml Sepharose CL 4B. Denne immunabsorbent betegnes "HIV-2-serum-Sepharose". VI. Bindinger af HIV-2-proteiner på en immunaffinitetssøjle 5 Celleekstrakter fra HIV-2-producerende CEM-celler blev først fortyndet i 2 volumener koblingsbuffer (20 mm Tris-HCI, ph 7,6, SO mm KCI, 150 mm NaCI, 1 mm EDTA, 1% (vol/vol) Triton X-100, 20 0/0 (vol/vol) glycerol, 7 mm mercaptoethanol, 0,2 mm PMSF, 100 enheder/ml aprotinin) før inkubation med et volumen "HIV-2-10 serum-sepharose". Supernatanter af celler, som producerede HIV-2-virus, blev behandlet på samme måde som celleekstrakterne bortset fra, at 1/10 af koblingsbufferen koncentreret 10x blev tilsat pr. volumen af supernatanten. Koblingstrinnet blev udført natten over, hvorefter søjlen blev vasket tilstrækkeligt i koblingsbufferen. De proteiner, der var bundet til søjlen, blev elueret ved at lade dem koge i 15 en elektroforesebuffer (125 mm Tris-HCI, ph 6,8, 1% (vægt/volumen) SDS, 2M urinstof, 20% glycerol, 1%13-mercaptoethanol). De eluerede proteiner blev analyseret på 7,5%'s SDS-polyacrylamid-elektroforesegeler indeholdende 6M urinstof og 0,1% bis-acrylamid i stedet for 0,2% (vægt/volumen). 20 VII. Præparativ elektroforese De HIV-2-glycoproteiner, der blev elueret fra affinitetssøjlen, blev analyseret ved elektroforese på polyacrylamidgel som beskrevet ovenfor, og de regioner af gelen, som indeholdt virusglycoproteinerne, blev skåret ud med reference til positionen af 25 proteinmarkører med i forvejen fastsat molekylvægt (BRL). Glycoproteinerne blev elueret ved inkubation i 16 timer ved 4 C i en elueringsbuffer (0,1M NaHCO3, 0,5 mm EDTA, 0,05% (vægt/volumen) SDS, 0,2 mm PMSF). De således vundne glycoproteinfraktioner blev lyofiliseret og opbevaret i køleskab, indtil 30 de skulle anvendes. VIII. Elektroforese på gel i to dimensioner Der blev udført elektroforese på gel i to dimensioner som beskrevet af O'Farrel 35 (1975) med følgende modifikationer: proteiner, der var mærket med L-(35S)methi-

23 21 onin og bundet til en "HIV-2-serum-Sepharose"-søjle, blev elueret ved at lade dem koge i en elektroforesebuffer som beskrevet ovenfor før fortynding i et volumen buffer indeholdende 9,5M urinstof, 8% (vol/vol) mercaptoethanol, 1,6% (vægt/volumen) ampholiner ved en ph i området 6,5-9, 0,4% (vægt/volumen) ampholiner 5 ved en ph i området 3-10 og 100 enheder/ml aprotinin. EKSEMPEL 1 Karakterisering af glycoproteinerne gp300 og gp Det opspaltningsskema, der blev opnået ved elektroforetisk analyse på gel i to dimensioner af glycoproteinerne gp300, gp140 og gp125, der var mærket med 35Smethionin, viser, at gp300 og gp140 er beslægtede. Disse to proteiner giver forskellige aflejringer på gelen, men de har et identisk isoelektrisk punkt (pi) for en 15 ph, der går fra 6,8 til 7,8. Disse resultater er vist i fig. 2. Denne lighed mellem proteinerne gp140 og gp300 tyder på, at gp300 er en dimer form af gp140. gp125 har mindre heterogenitet både i de inficerede celler og i viruspartiklerne og vandrer ved et isoelektrisk punkt ved ph-værdier på mellem 6,2 og 6,5. 20 I de inficerede celler bemærkedes tilstedeværelsen af mindre underenheder af proteinet gp125 med et isoelektrisk punkt ved ph-værdier mellem 7,2 og 7,3. Denne sidstnævnte kategori af proteiner er ikke til stede i HIV-2-virionen, hvorfor den sandsynligvis udgør et ikke-definitivt dannet glycoprotein. 25 Den sure natur af modent gp125 kan skyldes sialsyren ved visse carbonhydratkæder, der er tilføjet under modningen af kappeglycoproteinet. Kappeglycoproteinet gp300 er meget stabilt, idet det er modstandsdygtigt over for 30 joniske detergenter (1% SDS) og ikke-ioniske detergenter (2% Triton X-100 9), over for urinstof (2-6M), over for kraftige salte (1M NaCI) og over for reduktionsmidler (1% (3-mercaptoethanol). Det har imidlertid kunnet fastslås, at gp300 kan nedbrydes i et medium ved sur ph, idet der dannes to gp140-glycoproteiner. I disse forsøg blev proteiner, der var bundet til en immunaffinitetssøjle, inkuberet i en 35 acetatbuffer ved ph-værdier på mellem 4 og 7. Disse prøver blev derpå analyseret

24 22 ved elektroforese på polyacrylamidgel. Fig. 3A, hvor resultaterne er vist, viser, at et gp300-bånd omdannes til et bånd, som svarer til gp140's position, når prøven inkuberes ved ph 4. Andre forsøg er foretaget under anvendelse af oprensede præparater af gp300, der var vundet ud fra præparative elektroforesegeler som be- 5 skrevet ovenfor. Sådanne denaturerede prøver af gp300 blev fuldstændig nedbrudt i en acetatbuffer ved ph 6,0. Resultaterne af disse forsøg er vist i fig. 3B. Effektiviteten af nedbrydningen af det oprensede gp300-glycoprotein skyldes sandsynligvis sænkningen af ph og tilstedeværelsen af SDS-rester i den lyofiliserede prøve, idet det native gp300-glycoprotein, der var bundet til en søjle, ikke kunne 10 nedbrydes i samme buffer ved ph-værdier på over 5. I en Tris-HCI-buffer er nedbrydningen mindre effektiv. Ved ph 7,5 bemærkes kun en svag nedbrydning af gp300 i form af gp140, hvilket dog stiger ved sænkning af ph-værdierne. I en Tris-buffer ved ph 6,0 var nedbrydningen ca. 80%, hvilket er 15 vist i fig. 3C. Ved nedbrydning af rent gp300 i en anden acetatbuffer eller Tris-HCIbuffer kunne der ikke detekteres andre proteiner end gp140 (forsøgene blev udført på 15% polyacrylamidgel). Disse resultater antyder, at gp300 er en dimer form af gp140, som selv er en precursor for HIV-2-kappeglycoproteinet. Derfor er det sandsynligt, at to gp140-molekyler ved dannelsen af kappeglycoproteinet tager del 20 i en fusionsmekanisme, som er afhængig af ph. EKSEMPEL 2 Karakterisering af laterale oligosaccharidkæder i HIV-2-glycoproteiner 25 En spaltning med endo-(3-n-acetylglucosaminidase H (endo-h) gjorde det muligt i HIV-2-glycoproteinerne at påvise tilstedeværelsen af oligosaccharider bundet til nitrogen (Tarentino et al., 1974). gp300, en blanding af (gp140, gp125) og gp125 alene blev oprenset ved affinitetskromatografi og præparativ elektroforese (se 30 "eksperimentelle procedurer"). De lyofiliserede prøver blev suspenderet i en endo- H-spaltningsbuffer, som ikke fremmer nedbrydning af gp300 til gp140. Efter spaltning med endo-h svarer den elektroforetiske mobilitet af gp300 til den svagere mobilitet af et protein på kd. En lille fraktion af gp300, der var 35 nedbrudt til gp140, blev spaltet og gav et protein på 80 kd. Resultaterne er vist i

25 23 fig. 4, sektion gp300. Den prøve, der indeholdt en blanding af gp140 og gp125, blev spattet med endo-h og gav proteiner på 90 og 80 kd, mens gp125 alene blev omdannet til et protein på 90 kd under denne spaltning, hvilket er vist i sektionerne gp140/125 og gp125 i fig. 4. En spaltning af gp140 og gp125 med endo-h giver 5 produkter med en molekylvægt på henholdsvis 80 og 90 kd. Ved metabolisk mærkning af cellerne med 14C-mannose og 3H-fucose blev det påvist, at mannose var inkorporeret i gp300, gp140 og gp125, hvorimod kun gp300 og gp125 var i stand til at inkorporere fucose (fig. 5). Fucoseresterne overføres 10 normalt til oligosaccharidkæder på et fremskredet stadium af glycosyleringscyklen efter virkningen af kohæsionsenzymerne i det endoplasmatiske retikulum og Golgiapparatet (Kornfeld og Kornfeld, 1985; Fuhrmann et al., 1985). Af disse grunde kan man formode, at gp125's svage modstandsdygtighed over for 15 spaltning med endo-h i forhold til gp140 efter al sandsynlighed skyldes omdannelse af visse laterale oligosaccharidkæder af mannosetypen til komplekse oligosaccharider ved omdannelsen af kappeglycoproteinet (Kornfeld og Kornfeld, 1985). Den omstændighed, at gp140 ikke indeholder fucoserester, stemmer overens med, at det udgør en precursor for gp300 og gp EKSEMPEL 3 Virkning af tunicamycin, en glycosyleringsinhibitor, på dannelsen af HIV-2-glycoproteiner 25 Alle de glycoproteiner, der bærer oligosaccharider bundet tilnitrogen, modtager deres oligosaccharidkæde Glc3Man9-GIcNAc2-pp-dolichol på grund af en reaktion, der udføres af proteinet oligosaccharidyl-transferase, som katalyserer blokoverførslen af oligosaccharidkæder til asparaginrester (se Kornfeld og Kornfeld, 1985). 30 Tunicamycin blokerer en sådan nitrogenforbundet glycosylering ved at inhibere produktionen af N-acetylglucosamin-pyrophosphoryldolichol, som er det første trin i samlingen af oligosaccharider, der er forbundet af lipiderne (Li et al., 1978; Heifetz et al., 1979). I nærværelse af 2 pg/mitunicamycin blokeres hele den nitrogenforbundne glycosylering af HIV-2-kappeglycoproteinerne i de inficerede celler. Dette 35 resultat kan påvises ved manglende inkorporering af 3H-glucosamin i virus-glyco-

26 24 proteinerne gp300, gp140 og gp125 (fig. 6). Under disse forsøgsbetingelser blev syntesen af proteinet imidlertid ikke påvirket i de inficerede celler, som var behandlet med tunicamycin. Sådanne kulturer, der var mærket med 35S-methioninisotoper, indeholder to større proteiner med en skønnet vægt på 200 og kd, 5 som vandrer i store bånd (fig. 6). Disse proteiners molekylvægt falder sammen med produkterne fra spaltningen med endo-h af gp300, gp140 og gp125 (fig. 4), hvilket antyder, at proteinerne med en molekylvægt på 200 kd og kd svarer til ikke-glycosylerede former af HIV-2-kappeglycopro-teinerne. 10 Molekylvægten af proteinet på kd svarer til den forventede molekylvægt af den ikke-glycosylerede HIV-2-kappeprecursor, beregnet ud fra dens nukleotidsekvens (Guyader et al., 1987). Glycoproteinet på 200 kd er formodentlig den dimere form af den ikke-glycosylerede kappeprecursor. Disse resultater bekræfter, at HIV-2-kappeproteinerne indeholder polysaccharidkæder forbundet til nitrogen. 15 Foruden inhiberingen af glycosyleringen inhiberer en behandling med tunicamycin dannelse og eksport af kappeglycoproteinet, eftersom proteinet på kd ikke er påvist i det ekstracellulære miljø, hvilket er vist i fig. 6, bane SN. Resultaterne af disse forsøg gør det muligt at antage, at glycosaccharidkæderne af 20 HIV-2-kappeproteinerne sandsynligvis er impliceret i den cellulære transport gennem Golgi-apparatet. Fraværet af ikke-glycosylerede former af kappeproteinet i det ekstracellulære miljø af celler, der er behandlet med tunicamycin, kan eventuelt skyldes den hurtige nedbrydning. Flere rapporter har antydet, at den ikke-glycosylerede form af et protein generelt er mere følsom over for proteasers virkning end 25 den glycosylerede form (Olden et al., 1978; Schwartz et al., 1976). I overensstemmelse med disse resultater repræsenterer de proteiner med lille molekylvægt, der findes i celler, som er mærket med 35S-methionin og dyrket i tunicamycin, formodentlig produkter fra en delvis nedbrydning af det ikke-glycosylerede kappeprotein (fig. 6)