Thyreoidea hormoner, frie i forhold til index målt på ADVIA Centaur

Thyreoidea hormoner, frie i forhold til index målt på ADVIA Centaur Figur 1 Her ses ADVIA Centaur [1] Lisa Skotte 220387 studie nr. 60080100 Projekt periode fra den. 19. marts til den 7. juni 2012 Bachelorprojekt for bioanalytikeruddannelsen på Professionshøjskolen Metropol Vejleder: Klinisk underviser Jens Peter Phillipsen og Lektor Søren Jensen

Fra Bekendtgørelse om prøver og eksamen i erhvervsrettede uddannelser BEK nr 1016 af 24/08/2010 19. En eksaminand, der under en prøve skaffer sig eller giver en anden eksaminand uretmæssig hjælp til besvarelse af en opgave eller benytter ikke tilladte hjælpemidler, skal af uddannelsesinstitutionen bortvises fra prøven. Stk. 2. Opstår der under eller efter en prøve formodning om, at en eksaminand uretmæssigt har skaffet sig eller ydet hjælp, har udgivet en andens arbejde for sit eget eller anvendt eget tidligere bedømt arbejde uden henvisning, indberettes dette til uddannelsesinstitutionen. Bliver formodningen bekræftet, og handlingen har fået eller ville kunne få betydning for bedømmelsen, bortviser uddannelsesinstitutionen eksaminanden fra prøven. Stk. 3. Udviser en eksaminand forstyrrende adfærd, kan uddannelsesinstitutionen bortvise eksaminanden fra prøven. I mindre alvorlige tilfælde giver uddannelsesinstitutionen først en advarsel. Stk. 4. Uddannelsesinstitutionen kan i de i stk. 1-3 nævnte tilfælde under skærpende omstændigheder beslutte, at eksaminanden skal bortvises fra institutionen i en kortere eller længere periode. I sådanne tilfælde gives en skriftlig advarsel om, at gentagelse kan medføre varig bortvisning. Stk. 5. En bortvisning efter stk.1-3 medfører, at en eventuel karakter for den pågældende prøve bortfalder, og at eksaminanden har brugt en prøveindstilling, jf. 6, stk. 3 og 4. Stk. 6. En eksaminand skal ved aflevering af en skriftlig besvarelse med sin underskrift bekræfte, at opgaven er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf. stk. 1 og 2. Undertegnede bekræfter hermed, at denne projektrapport er udfærdiget af mig, uden at udgive andres arbejde for mit og uden uretmæssig hjælp jf. ovenstående uddrag af eksamensbekendtgørelsen. Dato: Underskrift 2

Forord Projektet er udført på Hillerød Hospital på Klinisk Biokemisk Afdeling (HIHKBA). Projektets målgruppe er bioanalytikere. Jeg vil gerne sige tak til mine vejledere Søren Jensen og Jens Peter Phillipsen, samt et stort tak til Christina Bertram Andersen min medstuderende og partner i udførslen af dette projekt. Tak til de bioanalytikere fra afdelingen, som har været meget venlige og hjælpsomme under min oplæring af ADVIA Centaur. En speciel tak til Pernille Holm som er tidligere specialist for Centaur, der har været en stor hjælp. En tak til Ester Jensen, overlæge på HIHKBA og specialist inden for Thyreoidea sygdomme. Sidst men ikke mindst et kæmpe tak til min veninde Johanne Ahrenfeldt Stud. Polyt. for hjælp og support til rettelse af dette projekt. 3

Resumé Thyreoidea producerer stofskift hormonerne trijodthyronin (T 3 ) og thyroxin (T 4 ). Disse kan forekomme bundet til proteiner eller i fri form. Det diskuteres rundt omkring i verden, om det er mest korrekt at måle total hormoner eller frie hormoner. På HIHKBA måles der totalhormoner, denne korrigeres med Tuptake(T up ), et mål for frie bindingspladser, dette giver T 3 index (T 3i ) og T 4 index (T 4i ). Projektet her går derfor ud på at undersøge, om der sammenhæng mellem index og frie hormoner, og hvordan præcisionen er. Dette undersøges på Siemens ADVIA Centaur som udfører immunoassay med kemiluminescens som målemetode. 100 patientprøver analyseres til undersøgelse af sammenhæng og to kontroller analyseres i 20 dage for undersøgelse af præcision. Resultaterne viser tydelig sammenhæng mellem FT 3 og T 3i, og tydelig sammenhæng mellem FT 4 og T 4i. Det viser sig, at Centaurs målinger for FT 3 og FT 4 er klart mere præcise end de beregnede index. Det vil derfor være muligt at over gå til at måle frie hormoner i stedet for måling af totale hormoner og T up. 4

Indhold Indledning... 7 Problembaggrund... 7 Problemformulering... 7 Metodevalg... 8 Valg af arbejdsmetode... 8 Valg af statistiske metoder... 8 Teori... 9 Centaur... 9 Analyseprincip... 10 Thyreoidea... 11 Materialer og metoder... 15 Materialer... 15 Apparatur... 15 Reagenser... 15 Kontrolmateriale... 15 Prøvemateriale... 16 Utensilier... 16 Etiske overvejelser... 16 Metoder... 16 Sammenligningsforsøg:... 16 Præcisions forsøg:... 17 Resultat vurdering... 18 Resultater... 19 Resultater for sammenhængsundersøgelse... 19 Resultater for præcisionsforsøg... 22 Diskussion... 29 Sammenhængsforsøg... 29 Præcisionsforsøg... 30 Frie hormoner eller total hormoner?... 33 Konklusion... 35 Litteraturliste... 36 5

Bilag 1... 38 Bilag 2... 39 Bilag 3... 42 Bilag 4... 44 6

Indledning Problembaggrund På Klinisk Biokemisk afdeling på Hillerød Hospital måles der stofskiftehormoner på Siemens ADVIA Centaur (Centaur). De hormoner, som undersøges i dette projekt, er total trijodthyronin(tt 3 ) samt den frie form (FT 3 ) og total thyroxin(tt 4 ) og den frie form (FT 4 ) samt T uptake (T up ). Ud fra de nuværende analyser beregnes en normaliseret værdi, der er korrigeret for bindingsproteiner. Denne værdi kaldes T 3 index (T 3i ) og T 4 index (T 4i ) [2,3,4,5,6]. Måden, hvorved indexet udregnes på, er ved at gange total hormonerne med T up. Hele projektet handler om at se, om der er proportionalitet mellem målt FT 3 og T 3i og proportionalitet mellem målt FT 4 og T 4i. Grunden, til at dette ønskes undersøgt, er, at det muligvis i fremtiden ikke vil være muligt at skaffe reagenser til analyserne for TT 3 og TT 4. Det ville derfor være optimalt at kunne bevise, at der er sammenhæng mellem målte frie hormoner og beregnede hormoner. Det menes, at målingen på de frie hormoner er upræcis og derfor ikke er lige så korrekt til diagnostisk brug [7]. Det virker mere oplagt at måle på de frie hormoner, da det er dem, som er aktive i kroppen [8]. Offie et al. [9] mener, at det er mest korrekt, at der ved vurdering af thyreoidea sygdomme bør kigges på måling af de frie hormoner frem for det totale hormonbillede. Da det frie hormon er det aktive, giver dette det mest korrekte billede af, hvordan patientens thyreoidea status er. De proteiner, som er bundet til hormonerne, har stor indflydelse på målingen, og derfor mener Offie et al., at der bør måles på frit hormon [7,9]. Det skyldes, at langt de fleste T 3 og T 4 in vivo er bundet til proteiner, omkring 99,6 % af TT 3 og 99,98 % af TT 4 er proteinbundet [10]. På grund af den store effektivisering, der foregår på alle Region Hovedstadens Hospitaler, vil der i nærmere fremtid være udskiftning af apparaturet til undersøgelse af stofskiftehormoner. Det er meningen, at alle prøver skal køre på et fuldautomatisk bånd, og at stofskiftehormonerne skal være en del af dette. Til dette automatiske system skal der indkøbes nye maskiner. De maskiner som er indkøbt, er Vista, som også kommer fra Siemens. Indtil videre bliver Centaur flyttet med ned i det fuldautomatiske rum, men i fremtiden vil det være muligt at fjerne Centaurerne og flytte de analyser, den laver i rutinen, over til Vista. Problemformulering Er der lineær proportionalitet mellem FT 3 og T 3i og mellem FT 4 og T 4i målt på Siemens ADVIA Centaur? Er der signifikant forskel på præcisionen for FT 3 og FT 4 i forhold til T 3i og T 4i? 7

Metodevalg Valg af arbejdsmetode Projektet er delt op i to forsøg. I det ene forsøg undersøges, om der er sammenhæng mellem analyserne. I det andet forsøg undersøges præcisionen for de 4 relevante metoder, FT 3, FT 4, T 3i og T 4i. Til analysen måles FT 3, FT 4, TT 3, TT 4 og T up. T up måles for at kunne beregne index. Til undersøgelse om sammenhængen mellem FT 3 og T 3i samt sammenhængen mellem FT 4 og T 4i findes i alt 100 patient prøver. Disse vælges fra de praktiserende læger i håb om at fjerne de akut syge patienter og sandsynligvis finde raske patienter. For en del af de prøver, der er fundet, vil en håndfuld af disse patienter allerede være udredt for thyreoidea sygdomme og i behandling. Dette har dog ikke den store effekt på resultaterne for forsøget. De udvælges ud fra T 4 niveau. Der vælges at tage 30 på lavt niveau under referenceintervallet, 30 på højt niveau over reference intervallet, mens de resterende 40 prøver tages inden for referenceintervallet 70-140 nmol/l [11]. Dette gøres for at få så stor spredning som muligt. Prøverne indsamles over en uge. Prøvematerialet kommes i nye glas, som mærkes og nedfryses i henhold til holdbarheden af prøvematerialet [2,3,4,5,6]. Patientprøverne analyseres alle på én dag for at undgå forskellige kalibreringer, så alle prøver er målt på samme betingelser. De analyseres i én serie, og der laves dobbeltbestemmelser for at kunne se den intraserielle variation. Der gives nye prøvenummer inden analysen for at gøre prøverne usporbare. For at undersøge præcisionen udføres der kontrolforsøg. Her analyseres to kontroller i lavt og højt niveau. Disse analyseres én gang dagligt, efter rutinekontrollerne er godkendt. De laves som dobbeltbestemmelser for at kunne kigge på den intraserielle præcision. [12] Valg af statistiske metoder Til bearbejdningen af resultater bruges Microsoft Excel. Til forsøg 1, undersøgelse af om der er lineær regression for de kliniske områder, laves et xy-plot, som bruges til at finde linjens ligning og korrelationskoefficienten, for dermed at se om der er lineær sammenhæng. Når disse værdier er fundet, udføres en F-test for at finde ud af om der er signifikant forskel på FT 3 og T 3 index, og om der er signifikant forskel på FT 4 og T 4 index [12]. Til undersøgelse af præcisionen beregnes standard afvigelse (SD) og variationskoefficienten (CV %). Der laves dobbeltbestemmelse, så den intraserielle præcision også kan beregnes. Herefter udføres en F-test, hvilket gøres med CV % for at undgå komplikationen for de forskellige enheder [12]. 8

Teori Centaur Apparatet, der bruges til projektet, er Centaur, som er fuldautomatisk. Prøverne bliver fra båndet sat ind i proceskøen. Herfra afpipetteres prøvematerialet til cuvetter i inkubationsringen. Her bliver de forskellige reagenser afpipetteret til cuvetten i de tidsintervaller, der passer til den specifikke analyse. I inkubationsringssystemet sidder der en magnet, der under vask af cuvetten holder fast på de paramagnetiske Figur 2 Her ses den kemiske reaktion ved Acridinium ester. Den gule stjerne symboliserer lysudsendelsen [13]. Figur 3 Her ses brugen af de paramagnetiske partikler, hvor de bliver holdt tilbage af en magnet, så de overskydende analytter kan vaskes væk.[egen tegning]. partikler. Vaskesystem, syre/base tilsætning og fotometeraflæsning forgår alt sammen i denne ring. Det hele styres af softwaressystemet, der er i computeren, som sidder ved maskinen. Bilag 1 viser en oversigt over centaur samt apparaturet [1]. De to ting, som gør centauren unik, er brugen af målestoffet Acridinium ester og brugen af paramagnetiske partikler. Acridinium ester er det kemiske stof i reagenserne, som giver et lyssignal, der kan måles på. Det specielle ved Acridinium ester er, at lyssignalet er kort (se Figur 2). Det er smart at bruge et kort lyssignal, fordi det mindsker analysetiden, idet man ikke skal vente på, at en reaktion løber til ende. Acridinium esters lyssignal varer cirka 5 sekunder eller mindre. Acridinium ester har heller ikke effekt på specificiteten af antistoffer. Samtidig bruges der kun en simpel alkalisk peroxidase i stedet for en katalysator, som muligvis har effekt på baggrundsstøj.[13] Paramagnetiske partikler er unikke. De bruges til at holde de komplekser eller de parametre, vi gerne vil måle på, tilbage i cuvetten og hermed fjerne alt det overskydende snavs, som forstyrrer analysen (se Figur 3). Det gør dem ideelle til kompetetive analyseprincipper med flere trin. Ved at bruge magnetisme i stedet for coatede cuvetter eller brønde gøres det nemt og billigt, idet magneten kan genbruges [1]. 9

Analyseprincip I de analyser, der er lavet i projektet, findes der 3 variationer. Analyseprincippet for T 3 og FT 3 er det samme. Forskellen på de to analyser er et hjælpereagens, der gør alt det proteinbundne T 3, til frit T 3. Det samme gælder for FT 4 og T 4, den sidste variation er T up. Alle fem analyseprincipper er kompetetive analyseprincipper. Forskellen på dem er, om det er det konkurrerende antistof eller det konkurrerende antigen, der er mærket med Acridinium ester [2,3,4, 5,6]. Analyseprincippet for FT 3 og T 3 er det samme. Her konkurrerer FT 3 /T 3 fra prøven med dét T 3, der er bundet til de paramagnetiske partikler i reagenset. De konkurrerer om pladserne på de Acridinium ester mærkede antistoffer mod T 3 (se Figur 4A). Som resultat vil et højt signal vise en lav koncentration af FT 3 /T 3 i prøven, og modsat vil et lavt signal være tegn på en høj koncentration [2,4]. Analyseprincippet for FT 4 og T 4 har også det samme princip. Her konkurrerer FT 4 /T 4 fra prøven med det Acridinium ester mærkede T 4 fra reagenset om pladserne på antistof rettet mod T 4. Antistofferne er mærket med paramagnetiske partikler (se Figur 4B). Som resultat vil et højt signal vise en lav koncentration af FT 4 /T 4 i prøven, og modsat vil et lavt signal være tegn på en høj koncentration [3-5]. Et andet analyseprincip, som benyttes, bruges til at måle T up på. I bund og grund er det også et kompetetivt analyseprincip. Det er dog lidt mere indviklet end de foregående, da der undersøges, hvor mange ledige bindingspladser, der er. Først tilsættes T 3 BBG, der er mærket, og T 3, der er umærket. Her vil kun T 3 optage de frie bindingspladser, mens T 3 BBG ikke vil optage nogen. Herefter tilsættes museanti T 3 -antistof bundet til antimuse-antistof mærket med paramagnetiske partikler. Her vil de ubundne T 3 og T 3 BBG konkurrerer om de ledige pladser på antistoffet (se Figur 4C). Ved et højt signal vil der være mange T 3 BBG bundet til antistoffet, og der vil derfor have været mange frie bindingspladser. Ved et lavt signal vil der være flere T 3 bundet til antistoffet, og der vil derfor ikke have været mange frie bindingspladser.[6] 10

Figur 4 Her vises tegning af de 3 forskellige analyse principper. A) Her ses analyseprincippet for FT 3 og TT 3, hvor T 3 fra patienten konkurrerer med T 3 fra reagenset, der er bundet til paramagnetiske partikler om pladserne på anti T 3, der er mærkede med Acridinium ester. B) Her ses analyseprincipper for FT 4 og TT 4, hvor T 4 fra patienten konkurrerer med T 4 fra dét reagens, der er mærket med Acridinium ester om pladserne på anti T 4, der er bundet til paramagnetiske partikler. C) Her vises analyseprincippet for målingen af T up. Her optager T 3 fra reagenset alle de frie bindingspladser fra patienten. Det resterende T 3 konkurrerer med T 3 BBG mærket med Acridinium ester om pladserne på anti T 3 komplekset, der er bundet til paramagnetiske partikler. Thyreoidea Thyreoidea, også kaldet skjoldbruskkirtlen på dansk, sidder i halsen fast på trachea (se Figur 5). Den er formet som en sommerfugl med to lapper og vejer i gennemsnittet 15-20 g for en voksen rask person [15]. Thyreoidea producerer stofskiftehormonerne T 3 og T 4, som er med til at regulere metabolismen i kroppen. Cellestrukturen i thyreoidea består af kolloid, hvor hormonerne lagres. Disse rum er omgivet af follikelcellerne (se Figur 6). Follikelcellerne er dem, der producerer thyreoideahormonerne. Thyreoideas hormonproduktion bliver stimuleret af hypothalamus, der producerer TRH (TSH Releasing Hormon), som stimulerer hypofysen til at producere TSH (Thyreoidea Stimulerende Hormon). TSH stimulerer thyreoidea til produktion og frigivelse af T 3 og T 4. Når T 3 og T 4 frigives i blodet og stiger, giver det negativ feedback til receptorer i hypothalamus og hypofysen, og produktionen af TRH og TSH reduceres (se Figur 7). Når koncentrationen af T 3 og T 4 igen falder i blodet, stiger produktionen af de stimulerende hormoner igen [15, 18]. 11

Figur 5 Her ses thyreoideas placering i kroppen. [14] Figur 6 Her ses et histologisk billede af thyreoidea. De store klare lyserøde områder er kolloidet, og de lilla tråd med mørke pletter er follikelcellerne der omkredser kolloidet. [16] Figur 7 Her ses et skema over den negative feedback mekanisme. [17] Figur 8 Her ses en follikelcelle og dens metabolisme. Produktionen fra thyreglubolin til T 3 og T 4.[19] Produktionen af T 3 og T 4 foregår som tidligere nævnt i follikelcellerne (se Figur 8). Syntesen af T 3 og T 4 starter med at I - /Na + pumpen åbner for indtagelse af I -. Thyreoglubolin, der indeholder cirka 120 tyrosinmolekyler [15], som danner grundsten for T 3 og T 4, bliver syntetiseret i follikelcellen. Disse tyrosin molekyler bliver ioderet via peroxidase, så der bliver dannet monoidotyrosin(mit) og di-iodotyrosin(dit) (se Figur 9). Ude i kolloidet samles disse molekyler til T 3 og T 4. For at danne T 3 skal en MIT og DIT bindes, og til T 4 skal to DIT bindes. Fra kolloidet kommer T 3 og T 4 ud i blodet og videre til målcellerne [15, 18]. 12

Figur 8 Her ses syntesen af tyrosine til først DIT og MIT og videre til T 3, rt 3 og T 4.[20] T 3 og T 4 findes som både frie hormoner og proteinbundne. Det er de frie hormoner, der er aktive, mens de proteinbundne er en form for lager. Dog er størstedelen af hormonerne proteinbundet. 99,98 % af T 4 er bundet og 99,6 % af T 3 er proteinbundet [10]. Af de aktive hormoner i kroppen findes altså kun 0,02 % FT 4 og 0,4 % T 3. Dette kan også ses ved at kigge på enhederne, der måles i, hvor TT 4 bliver målt i nmol/l ved de FT4 måles der i pmol/l. Dette er en faktor 1000 til forskel, det er det samme for TT 3 og FT 3. Der er tre proteiner, som binder de frie hormoner: Thyroxine-binding globulin (TGB), transthyretin (TTR) og albumin. Disse faktorer skal der derfor tages højde for, når man på klinisk basis vil måle på thyreoideahormoner [10]. Langt de fleste T 3 hormoner bliver produceret perifert ud fra T4 molekyler. Det er cirka 80 % af alle T 3 molekyler, der kommer derfra.[7] Thyreoideahormoner virker som vækstfaktorer og virker på næsten alle celler i diverse væv og organer. De virker ved at diffundere ind i cellerne gennem plasmamembranen og binde til en specifik receptor på kernemembranen, hvor der stimuleres til transskription af en bestemt gruppe af gener [15]. For at bestemme thyreoidea status analyseres TSH, som er det hormon, der stimulerer follikelcellerne til produktion af T 3 og T 4. For at kunne bestemme om patienten er rask eller syg, kigges der på referenceintervallet. På KBA HIH ligger referenceintervallet på 0,35-4,0mIU/L [11]. Referenceintervallet varierer dog fra land til land, der er selv variationer i referenceintervallet internt i Norden [21]. 13

Parameter Referanceinterval [11] Mean Referenceinterval [21] Frit T 3 4,1-6,9 pmol/l 5,5 pmol/l 4,2 6,8 nmol/l Total T 3 1,4-2,8 nmol/l 2,1 nmol/l 1,4 2,9 pmol/l Frit T 4 14-23 pmol/l 18,5 pmol/l 14,2 22,3 pmol/l Total T 4 70-140 nmol/l 105 nmol/l 74 142 nmol/l Tup 0,35-1,15 - TSH 0,85 4,0 miu/l 0,59 4,8 miu/l Tabel 1 Her vises referenceintervaller over de målte parameter Bliver man syg i thyreoidea kan det skydes 3 sygdomme: Struma, hypo- eller hyper- thyreoidisme. Struma betyder, at man har en forstørret thyreoidea. Struma kan være forårsaget af hyper- eller hypo-thyreoidisme, men produktionen af hormonerne kan også være normal. Hypothyreoidisme er en underproduktion af hormoner, disse kan være samlet eller de kan stå alene, så eksempelvis kun T 4 er meget lavt. Figur 10 Her vises en algoritme over, hvordan udledningen af thyreoidea sygdomme foregår. Det starter med at patienten får målt TSH. Er denne værdi forhøjet eller for lav, bliver der målt FT4. I Danmark måles der T4 og ikke FT4. Er denne normal mens TSH er for høj, måles der T3 [15] Hyperthyreoidisme er en overproduktion af hormoner, dette kan være både T 3 og T 4, men disse kan også være forhøjet alene. Dette kan også skyldes en fejl i hypothalamus eller hypofysen [22]. Der er derfor lavet skemaer for udredning af disse sygdomme, hvilke ses på Figur 10[15]. 14

Materialer og metoder Materialer Apparatur Siemens ADVIA Centaur XP Reagenser - Reagenspakke til FT 3, FT 4, TT 3, TT 4, T up. Alle indeholder lite reagens og solid phase reagens. - Hjælpereagens til T 3 og T 4 - Syre/Base reagens til visualisering - Kalibrator A til FT 3, FT 4, TT 3, TT 4 og T up - Wash til rens af maskinen - Cleaning solution Materiale Lotnummer IUPAC-kode Firma Tørglas A1110N9/00379 Greiner BioOne (3) Propper, hvide med sort A12010NQ Greiner BioOne (3) indre ring Kalibrator A 84072A76 Siemens (X) Kontrol 371 40241 BioRAD (X) Kontrol 373 40243 BioRAD (X) Ancillary/Hjæpereagens 83497 Siemens (X) T 3 /T 4 /VB12 Reagens FT 3 83371193 NPU03625 (X) Siemens (X) Reagens FT 4 83837034 NPU03579 (X) Siemens (X) Reagens T 3 83924178 NPU03624 (X) Siemens (X) Reagens T 4 83524149 NPU03578 (X) Siemens (X) Reagens T up 85192211 Siemens (X) Cuvette Q00705 Siemens (X) Pipettespidser 6480/PKG Siemens (X) Syre reagens 2B074 Siemens (X) Base reagens Wash 1 110552 Siemens (X) Tabel 2 Her ses en tabel over de reagenser, kalibratorer og utensilier, der er brugt på Centaur til udførelse af projektet. Kontrolmateriale Der er valgt to forskellige kontrolmaterialer, som begge er fra BIORAD nr. 371 og 373. Disse ligger i to niveauer, et højt og et lavt. Disse kontroller bruges til alle 5 analyser. Kontrolmaterialet opløses og neddeles og fryses, da det opløste materiale ikke er holdbart i længere tid på køl [23]. Kontrolmaterialet er fra BIORAD level 1 40241 og BIORAD level 3 40243 15

Prøvemateriale Prøvematerialet er plasma, der er indsamlet over en uge fra praktiserende læger, samt enkelte høje eller lave værdier fra hospitalet. Prøvematerialet kommes i nye glas, disse mærkes og nedfryses. Utensilier - Cuvetter - Pipettespidser Etiske overvejelser Der er ikke etiske overvejelser ved dette projekt. Da de blodprøver, der bruges, er bestilt til thyreoidea hormon status af en læge, og de bruges nu til at undersøge en analyse, der er tilsvarende, og i fremtiden muligvis bliver en afløser til de nuværende analyser. Metoder Projektet er delt op i to forsøg. I det ene forsøg undersøges, om der er lineær proportionalitet mellem FT 3 og T 3i og mellem FT 4 og T 4i. I det andet forsøg undersøges præcisionen for de 4 analyser. I begge forsøg måles der på Siemens ADVIA Centaur XP, som er beskrevet tidligere. Sammenligningsforsøg: Her skal undersøges, om der er lineær sammenhæng mellem de 4 analyser. Det gøres ved at analysere 100 patientprøver, hvor der måles FT 3, FT 4, T 3, T 4 og T up. Morgenen starter med opstart af maskinen ved at analysere rutinekontroller og fylde godt med reagenser på og analyse af egne kontroller til anden del af projektet. Herefter tages patientprøverne op af fryseren. Disse ommærkes, så de bliver anonyme. Derefter bestilles de 5 analyser og dobbeltbestemmelserne til at foregå i en batch. Prøverne blandes omhyggeligt, og de sættes på maskinen i vilkårlig rækkefølge. Der sættes ca. 15 prøver på af gangen, svarende til 3 racks. Under analysen fyldes der op med cuvetter og pipettespidser samt reagenser. Alt forløber roligt og 6 timer senere er alle 100 prøver færdiganalyseret. Ugerne op til analysedagen 1. Der samles prøvemateriale sammen en uge, til der er tilstrækkeligt med prøver, disse fryses ned til analysedagen Selve analysedagen 2. Reagens og utensilier fyldes op, omrystning af reagenser samt daglig vedligehold. 3. Rutinekontroller analyseres. Inden kontrollerne kalibreres der, hvis maskinen beder om det. 4. Rutinekontroller tjekkes. Er disse ikke i orden, handles der herefter. 5. Egne kontroller analyseres, disse tjekkes. 6. Bestilling af batch, hvor der bestilles FT 3, FT 4, TT 3,TT 4, T up alle til dobbeltbestemmelse. 16

7. Prøver tages op af fryseren. 8. De mærkes og blandes godt. 9. Alle prøver placeres i køleskabet, og de første 4 racks fyldes med prøver i tilfældig rækkefølge. Disse kommer på maskinen og analysen er i gang. Undervejs holdes der øje med reagenser og utensilierne, så maskinen ikke løber tør. Efter noget tid fyldes flere racks med prøver og sættes på, indtil alle prøverne er kommet over. Det tager ca. 6 timer at analysere de i alt 1200 analyser. 10. Analysesvarene printes ud fra apparatet, og der ryddes op. Præcisions forsøg: Der er valgt 2 kontroller fra BIORAD, der kan bruges til Centaur XP. Disse kontroller er i to niveauer. De måles på alle 5 analyser over 20 dage med dobbeltbestemmelser. Hver morgen laves rutine opstart, hvor der påsættes reagenser og fyldes op med utensilier, bagefter analyseres rutinekontroller. Når disse er godkendt, og alle 5 analyser er klar, analyseres egne kontroller. Disse svar kommer ind i centralink, som er et hjælpeprogram til Centaur. Herfra kan svarene trækkes ud. Hver dag tjekkes, om alle analysesvar er kommet igennem, og der tjekkes, om de passer nogenlunde. 1. Reagens og utensilier fyldes op, omrystning af reagenser samt daglig vedligehold. 2. Rutinekontroller analyseres. Inden kontrollerne kalibreres der, hvis maskinen beder om det. 3. Rutinekontroller tjekkes. Er disse ikke i orden, handles der herefter. 4. Egne kontroller analyseres, disse tjekkes. 17

Resultat vurdering Der vil blive vurderet resultater for præcisionsforsøget ud fra Westgards regler. Følgende er taget fra Noter I Statistik http://statnoter.biolyt.dk/. 1 3s - Denne regel siger at kontrollen forkastes, hvis en måling ligger mere end 3 standardafvigelser fra middelværdien. Dette er blot den regel svarer til at tegne kontrolgrænser ved ±3s, og så forkaste kontrollen, hvis den ligger uden disse grænser.[12] 2 2s - 2 på hinanden følgende kontroller udenfor ±2 standardafvigelser (begge kontroller skal ligge til samme side).[12] 4 1s - 4 på hinanden følgende kontroller udenfor ±1 standardafvigelse (alle kontroller skal ligge til samme side). [12] 10 x - 10 på hinanden følgende kontroller på samme side af middelværdien.[12] R 4s - 2 på hinanden følgende kontroller med en forskel på 4 standardafvigelser. I praksis fortolkes denne regel ofte som 1 kontrol over 2 SD og den følgende kontrol under -2 SD (eller omvendt).[12] 18

FT3 pmol/l FT3 pmol/l Resultater Resultater for sammenhængsundersøgelse Her vises målingerne af 100 patientprøver vist ved xy-plot med 99,7 % konfidensinterval med og uden mulig outlier. På x-aksen ses T 3i og T 4i, som er beregnet ved TT3*T up =T 3i og TT 4 *T up =T4i. På y-aksen ses de frie hormoner, FT 3 og FT 4. Rådata findes i bilag 2. 25 Sammenhæng mellem T3i og FT3 med 99,7 % konfidensinterval med outlier 20 15 Linear fit (2.085 +1.715x) 10 5 99.7 % konfidens interval A 0 0 5 10 T3 index nmol/l 16 14 Sammenhæng mellem T3i og FT3 med 99,7 % konfidensinterval uden mulig outlier 12 10 Linear fit (1.683 +1.981x) 8 6 99.7 % konfidens interval 4 2 B 0 0 2 4 6 T3 index nmol/l Figur 11 A) Her vises 99.7 % interval af sammenhængen mellem T 3i og FT 3 med outlier. På figuren ses et forstørret billede af den mulige outlier. B) Her vises 99.7 % interval af sammenhængen mellem T 3i og FT 3 uden outlier 19

FT4 pmol/l FT4 pmol/l 70 Sammenhæng mellem T4i og FT4 med 99,7 % konfidensinterval med outlier 60 50 40 30 Linear fit (4.818 +0.1061x) 20 10 99.7 % konfidens interval A 0 0 100 200 300 400 500 T4 index nmol/l 40 35 Sammenhængen mellem T4i og FT4 med 99,7 % konfidensinterval uden mulig outlier 30 25 20 Linear fit (4.323 +0.1111x) 15 10 99.7 % konfidens interval 5 B 0 0 50 100 150 200 250 T4 index nmol/l Figur 12 A) Her vises 99.7 % interval af sammenhængen mellem T 4i og FT 4. B) Her ses sammenhængen mellem T 4i og FT 4 uden outlier 20

Her vises et skema over korrelationskoefficienterne beregnet ud fra xy-plottet med og uden mulig outlier, beregnet ved hjælp af Microsoft Excel. Korrelationskoefficient T 3 og T 3 index T 4 og T 4 index Med outlier 0,983 0,960 Uden outlier 0,979 0,940 Forskel 0,004 0,02 Tabel 3 Her ses et skema over korrelationskoefficienterne, når det yderste punkt er med eller fjernet. Her vises skemaet over konfidensintervallet over skæringen med y-aksen, beregnet ved hjælp af Microsoft Excel. Afvigelse fra mean reference Nedre grænse 95 % Øvre grænse 95 % Forskel til øvre grænse 95 % T 3 med outlier 1,95 2,22 0,27 40,4 % T 3 uden outlier 1,54 1,83 0,31 33,3 % T 4 med outlier 4,06 5,57 1,51 30,1 % T 4 uden outlier 3,41 5,23 1,82 28,3 % Tabel 4 Her ses konfidensintervallerne for skæringen med y-aksen 21

pmol/l pmol/l Resultater for præcisionsforsøg Her vises resultaterne for analysen af kontrol BIORAD 371 og BIORAD 373 over 20 dage. Resultaterne er tegnet ind som kontrolkort, med kontrol linjer i form af 1, 2 og 3 SD. Kontrolkortene viser resultater af FT 3, FT 4, T 3i og T 4i. Rådata findes i bilag 3 Kontrolkort for BIORAD 371 med FT3 4 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 0 5 10 15 20 Antal dage middelværdi 1 SD 2 SD 3 SD Figur 13 Her vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 371 for FT 3 med dobbeltbestemmelse 16,5 16 15,5 15 14,5 14 13,5 13 Kontrolkort for BIORAD 373 med FT3 0 5 Antal dage 10 15 20 middelværdi 1 SD 2 SD 3 SD Figur 14 vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 373 for FT 3 med dobbeltbestemmelse 22

pmol/l pmol/l 12,5 Kontrolkort for BIORAD 371 med FT4 11,5 10,5 9,5 8,5 7,5 middelværdi 1 SD 2 SD 3 SD 6,5 0 5 Antal dage 10 15 20 Figur 15 Her vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 371 for FT 4 med dobbeltbestemmelse 51 49 47 45 43 41 39 37 Kontrolkort for BIORAD 373 med FT4 0 5 Antal dage 10 15 20 middelværdi 1 SD 2 SD 3 SD Figur 16 Her vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 373 for FT 4 med dobbeltbestemmelse 23

nmol/l nmol/l 1,7 1,5 1,3 Kontrolkort for BIORAD 371 med T3index middelværd i 1 SD 1,1 0,9 0,7 2 SD 3 SD 0,5 0 5 Antal dage 10 15 20 Figur 17 Her vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 371 for T 3i med dobbeltbestemmelse 12 11 10 9 Kontrolkort for BIORAD 373 med T3index middelværdi 1 SD 8 2 SD 7 3 SD 6 0 5 Antal dage 10 15 20 Figur 18 Her vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 373 for T 3i med dobbeltbestemmelse 24

nmol/l nmol/l 95 Kontrolkort over BIORAD 371 for T4 index 85 75 65 55 45 middelværdi 1 SD 2 SD 3 SD 35 0 5 Antal dage 10 15 20 Figur 19 Her vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 371 for T 4i med dobbeltbestemmelse 450 Kontrolkort over BIORAD 373 for T4 index 400 350 300 250 middelværdi 1 SD 2 SD 3 SD 200 150 0 5 Antal dage 10 15 20 Figur 20 Her vises kontrolkortet over kontrol BIORAD 373 for T 4i med dobbeltbestemmelse 25

Her er ses skemaer over variationskoefficienterne for kontrollerne over de 20 dage. Her er medtaget alle 5 kontroller, der er analyseret FT 3, FT 4, TT 3 TT 4 og T up samt de to beregnede T 3i og T 4i. BIORAD 371 Intraserielt Intermediært FT 3 1,84 % 2,86 % FT 4 3,83 % 8,03 % TT 3 4,50 % 7,75 % TT 4 3,48 % 9,26 % T up 2,97 % 5,32 % T 3index 5,68 % 10,16 % T 4index 3,01 % 12,60 % Tabel 5 Her ses CV % over Kontrol BIORAD 371, både intraserielt og intermediært BIORAD 373 Intraserielt Intermediært FT 3 2,02 % 2,86 % FT 4 2,12 % 4,46 % T 3 1,65 % 3,35 % T 4 1,61 % 7,62 % T up 2,55 % 5,32 % T 3index 2,92 % 7,44 % T 4index 0,85 % 11,07 % Tabel 6 Her ses CV % over Kontrol BIORAD 373, både intraserielt og intermediært 26

T 3i CV % 10,16 % 7,44 % Her ses skemaer og F-test udført over CV % for kontrolforsøg. Disse er udført for FT 3 og T 3i samt FT 4 og T 4i. Sammenhæng mellem FT 3 og T 3i med BIORAD 371 og 373 FT 3 BIORAD 371 BIORAD 373 CV % 2,86 % 2,86 % CV % 2 0,000817 0,000816 CV % 2 0,010325 0,005542 F test 12,6423 6,788306 P værdi = 0,05 Kritisk F værdi = 1,704465 Tabel 7 Her ses skema over F-test resultater beregnet mellem FT 3 og T 3 index Sammenhæng mellem FT 4 og T 4 index med BIORAD 371 og 373 FT 4 BIORAD 371 BIORAD 373 CV % 8,03 % 4,46 % CV % 2 0,006452 0,001987 T 4 index CV % 12,6 % 11,1 % CV % 2 0,015869 0,012265 F test 2,459547 6,174171 P værdi = 0,05 kritisk F værdi = 1,704465 Tabel 8 Her ses skema over F-test resultater beregnet mellem FT 4 og T 4 index 27

Her ses skema over CV % fundet på Westgards hjemmeside. Disse er de forventede mål. Biologisk variation Analytiske mål Intra Inter Total Præcision Bias Total T 3 total 8,7 % 17,2 % 19,3 % 4,4 % 4,8 % 12,0 % T 3 Frit 7,9 % 17,6 % 19,3 % 4,0 % 4,8 % 11,3 % T 4 total 4,9 % 10,9 % 12,0 % 2,5 % 3,0 % 7,0 % T 4 frit 5,7 % 12,1 % 13,4 % 2,9 % 3,3 % 8,0 % Tabel 9 Den nyeste og mest omfattende liste over biologiske mål [24]. 28

Diskussion Sammenhængsforsøg På Figur 11A ses sammenhængen mellem T 3i og FT 3. På denne graf er der samtidig angivet linjer, som viser afvigelsen på 3 SD værdier. Denne linje er angivet for at se, om den mulige outlier, det yderste punkt, afviger mere end 3 SD værdier. Punktet ligger ikke udenfor, men dette fjernes og en ny graf laves. Punktet fjernes, for at se hvor stor effekt det ene punkt har på korrelationskoefficienterne samt skæringen med y-aksen, hvilket vil blive diskuteret senere. Resultaterne af de 100 patientprøver minus den ene outlier viser, at der er klar sammenhæng mellem T 3i og FT 3 (se Figur 11B). På Figur 12A ses sammenhængen mellem T 4i og FT 4. På denne graf er der samtidig angivet linjer, som viser afvigelsen på 3 SD værdier. Denne linje er angivet for at se, om den mulige outlier, det yderste punkt, afviger mindre end de 3 SD værdier. På denne graf ses ikke nogle outliers, og derfor tages alle 100 punkter med i vurderingen af sammenhængen mellem T 4i og FT 4. På Tabel 3 kan korrelationskoefficienterne for de fire grafer ses. Der findes en korrelationskoefficient på 0,983 for sammenhængen mellem T 3i og FT 3, og for T 4i og FT 4 findes en korrelationskoefficient på 0,96. Disse er tæt på 1 og det kan derfor vurderes, at der er en klar lineær sammenhæng mellem de to parametre. Kigges der på forskellen mellem korrelationskoefficienterne for grafen med og uden outlier, er der for T 3 en forskel på 0,004 og for T 4 en forskel på 0,02. Ud fra Figur 11A og Figur 12B ses en klar sammenhæng mellem de direkte målte frie hormoner og de beregnede index. For både T 3 og T 4 gør det sig gældende, at der er ét punkt, der ligger langt fra de resterende punkter, hvorfor der kan stilles spørgsmålstegn ved, om dette punkt er en del af den samme population. Dette punkt ligger for T 4 s vedkommende inden for grænsen med 3 SD (se Figur 12A) men indenfor hos T 3 (se Figur 11A). Dette punkt fjernes for begge for at se hvor stor indflydelse, det har på korrelationskoefficienten. I Tabel 2 kigges der på korrelationskoefficienterne, og her kan det ses, at hvis dette punkt fjernes i beregningen af T4, så falder korrelationskoefficienten med 0,02. Det er en forholdsvis stor betydning dette ene punkt har ud af alle 100. Hvis det derimod fjernes for T 3, falder korrelationskoefficienten kun med 0,004. Havde der været mere end ét punkt der lå højt, ville der kunne vurderes mere sikkert på betydningen af dette. Men eftersom punktet ligger inden for de 3 SD værdier, som er kravet, så vil det indgå i beregningerne, selvom en eventuel fjernelse vil gøre korrelationen bedre. 29

Kigges der på skæringen med y-aksen, ligger denne langt fra punktet (0;0), hvilket egentlig ville være det mest optimale. Grunden til dette er, at hvis der intet frit hormon er, burde der heller ikke være noget proteinbundet hormon og tendenslinjen burde altså gå gennem (0;0). Skæringen med y- aksen kan ses på Figur 11A og B samt 12A og B. I Tabel 4 ses skæringspunkterne med y-aksens 95 % konfidensinterval. Ingen af disse indeholder 0, og skæringen vil derfor ikke gå gennem (0;0). Det kan ses, at hvis den mulige outlier fjernes, rykker grænserne for skæringen med y-aksen tættere på 0-punktet. For at kunne sammenligne afvigelserne for T3 og T4 med hinanden, er der omregnet hvor stor afvigelsen er i procent fra den øvre grænse af 95 % konfidensinterval med mean værdien for referenceintervallet. Dette er gjort for de frie hormoner, fordi de er på y-aksen. De resultater kan ses i Tabel 4. Her vises, at hvis den mulige outlier fjernes, falder afvigelsen med 7,1 procentpoint for T 3 men kun med 1,8 procentpoint for T 4. Det kan igen siges at det ydre punkt har utrolig stor indflydelse på de resterende faktorer. Men dette retfærdiggør dog ikke at fjerne ét punkt for at gøre resultaterne pænere. Spørgsmålet er også, hvor klinisk vigtigt det er at kunne måle så høje værdier. Det er klart, at det skal kunne vises om T 3 og T 4 er forhøjede, men om den ligger på 300 eller 400 gør nødvendigvis ikke den store forskel på behandlingen. Kigges der på referenceintervallerne både for Labka [11], som viser et referenceinterval for FT 3 på 4,1-6,9 pmol/l, og for FT 4, der viser et referenceinterval på 14-23 pmol/l. Når der måles værdier over disse referenceintervaller, betyder det, at patienten har en forhøjet FT 3 eller FT 4, om den viser 40 pmol/l eller 50 pmol/l for FT 4 gør sandsynligvis ikke den store forskel for diagnosticeringen. Præcisionsforsøg Her kigges på Figur 13-20, som viser kontrolkort over kontrollerne BIORAD 371 og 373. På Figur 13 og 14 ses kontrolkort over FT 3, der holder sig inden for Westgards regler. Dog ses at flere resultater i træk ligger uden for 1 SD, men der er foretaget kalibrering for at ændre situationen. På Figur 15 og 16 ses kontrolkort over FT 4. Her findes ingen afvigelser fra Westgards regler. På Figur 17 og 18 ses kontrolkort for T 3i. Her ses heller ingen afvigelser fra Westgards regler. På Figur 19 og 20 ses kontrolkort for T 4i, hvor der heller ikke ses afvigelser fra Westgards regler [12]. Det vil sige, at de to anvendte kontroller, BIORAD 371 og BIORAD 373, overholder reglerne for kontrolkort til brug af immunoassays. For at undersøge hvordan præcisionen er i mellem de fire analyser, er der beregnet CV %. Her er brugt CV % i stedet for SD værdier, hvilket skyldes, at der er forskellige enheder, så det giver et 30

mere præcist billede at bruge CV %. Tabel 5 og 6 viser CV % for fem af de analyser som er målt under forsøget samt de to beregnede index. Sammenligner man FT 3 og T 3i, er det tydeligt at se præcisionen er meget bedre for FT 3 end for T 3i, og her tages der udgangspunkt i den intermediære præcision. Der er en forskel på 7,3 procentpoint for BIORAD 371 og en forskel på 4,58 procentpoint for BIORAD 373. Det er derfor tydeligt, at FT 3 målingen er klart mere præcis end T 3i. Det samme gælder for FT 4 og T 4i. Tabel 5 og 6 viser, at der er en forskel på 4,57 procentpoint for BIORAD 371 og 6,61 procentpoint for BIORAD 373. Det ses igen, at der er en tydelig forskel på præcisionen. For at bevise den ovenstående påstand om, at der er forskel på måling af de frie hormoner i forhold til totale hormoner, er der lavet F-tests på forholdet mellem de frie hormoner og indexene. Denne test kan afgøre, om der er signifikant forskel på T 3i og FT 3, og om der er signifikant forskel på T 4i og FT 4. Der beregnes en kritisk F-værdi på 1,704 med en p værdi på 0,05, hvilket altså er signifikansniveauet. For at bevise at der ikke er forskel, skal F-værdien ligge under den kritiske F- værdi. I Tabel 7 og 8 ses oversigten over F-testen samt resultaterne for denne. Da ingen af de fire beregnede F-værdier for T 3 eller T 4 ligger under den kritiske værdi, betyder det, at resultaterne har overholdt et signifikansniveau, som er lavere end det minimum, der er fastlagt på 0,05. Da F- værdierne er markant højere end den kritiske F-værdi, vil den tilsvarende p-værdi være meget lavere end minimumskravet på 0,05. Disse er ikke beregnet, da F-værdierne er meget høje i forhold til kravet. Det betyder at målingen på FT 3 og T 3i er signifikant forskellige fra hinanden, og at FT 4 og T 4i også er signifikant forskellige fra hinanden. Samtidig skal det dog nævnes, at når der måles T 3i og T 4i, analyseres der fire parametre. Disse kan hver for sig have en usikkerhed og er sandsynligvis også med til at gøre analysen mere upræcis. Man kan sammenligne de CV %, der er kommet ud af analysen af de to kontrolmaterialer, med en standard fra Westgards hjemmeside [24]. Disse er beregnet ud fra den biologiske variation, som det er beskrevet af Klee, at den anbefalede analytiske præcision er mindre end ½ af den relevante biologiske variation [7]. Når disse sammenlignes, er det kun målingerne for FT 3, der overholder kravene, som stilles til analysen. Den største afvigelse er mellem T 3i og T 4i målingerne. Dette beviser igen, at målingerne af de frie hormoner er de mest præcise. Her skal det nævnes, at der sammenlignes TT 3 og T 3i, og TT 4 og T 4i. Disse kan ikke sammenlignes direkte, men det er mere korrekt at bruge index, i stedet for de totale hormoner, da indexene er korrigeret for 31

proteinbindinger. Men selv om der kigges på målingerne af de totale hormoner, er disse stadigvæk tættere på den kritiske præcision end de beregnede index. Thienpont et al. [25,26] har undersøgt en række forskellige analysemetoder fra forskellige producenter. Artiklerne er delt på den måde, at part 1 handler om TSH målingerne (dette undersøges ikke i dette projekt, så derfor tages denne artikel ikke med i litteraturlisten), part 2 handler om målingerne af de frie hormoner altså FT 3 og FT 4, og part 3 omhandler målinger af totalhormonerne altså TT 3 og TT 4. I denne undersøgelse er inkluderet ADVIA Centaur, men det er dog ikke til at se, hvilken af analyserne, der er lavet på Centaur. Herunder ses to tabeller, Tabel 10 og 11, der indeholder resultaterne fra denne artikel [25,26]. Her bliver de frie hormoner sammenlignet med de totale hormoner. Kode for analyser Intermediær CV % FT 3 Intermediær CV % TT 3 Forskel i procentpoint A 4,1 a 4,2-0,1 B 4,2 4,6-0,4 E 4,9 6,8-1,9 F 6,2 a 7,5-1,3 H 5,3 2,8 2,5 J 5,3 3,7 1,6 K 2,4 6,5-4,1 M 6,7 12,7-6,0 N 6,5 8,7-2,2 Tabel 10 Her vises CV % over resultaterne fra Thienpont [25,26] sat over for hinanden. a Den CV %, der ses her, er den samme som CV % intraserielt fordi CV total < CV intraserilt. De grå mærkede felter er de analyser, hvor præcisionen er højere for de frie hormoner i forhold til de totale hormoner. 32

Kode for analyser Intermediær CV % FT 4 Intermediær CV % TT 4 Forskel i procentpoint A 4,2 3,1 1,1 B 12,2 4,9 a 7,3 C 1,7 a 3,0 a -1,3 E 10,0 3,3 6,7 F 8,8 5,0 a 3,8 G 14,1 6,7 7,4 H 2,1 a 9,4-7,3 K 4,8 4,3 0,5 M 5,0 6,6-1,6 P 1,5 4,6-3,1 Tabel 11 Her vises CV % over resultaterne fra Thienpont [25,26]] sat overfor hinanden. a Den CV % der ses her, er den samme som CV % intraserielt fordi CV total < CV intraserilt De grå mærkede felter er de analyser, hvor præcisionen er højere for de frie hormoner i forhold til de totale hormoner. I Thienpont [25,26] findes, for langt de fleste af T 3 analyserne, at målingen på de frie hormoner har en bedre præcision. I enkelte tilfælde, der ses i Tabel 10, findes, at analyserne K og M er mere end 4 procentpoint bedre for de frie hormoner end målingen af totale hormoner. For T 4 viser det sig, at de fleste analyser er bedre til at måle total hormoner for T 4, end de er til at detektere frie hormoner. Disse resultater ses i Tabel 11. Ud fra denne artikel kan det derfor ses, at før man bestemmer at måle frie eller totale hormoner, bør det undersøges, hvordan dét apparatur og den metode, man vil bruge, forholder sig til hinanden. I forsøgene, der er udført i projektet her, viser det at Centaur måler mere præcist for de frie hormoner end den gør for de totale hormoner. Frie hormoner eller total hormoner? Nelson et al. [8] mener, at præcisionen ved måling af de frie hormoner er dårligere end ved målingen af de totale hormoner. Det hænger sammen med, at impræcisionen stiger ved lave koncentrationer. Det vil sige, at det er svært at detektere små koncentrationer i forhold til høje koncentrationer. Det kan skyldes, at TT 4 har en biologisk naturlig højere koncentration end FT 4, da der måles i nmol/l for TT 4 og i pmol/l for FT 4 [7]. Resultaterne fra dette projekt modstrider påstanden fra Nelson et al, der mener, at impræcisionen for TT 4 er lavere end for FT 4 [8]. Det er ikke tilfældet ved denne undersøgelse, idet her findes en bedre præcision ved målingen af de frie hormoner. Artiklen er dog fra 1996 og dermed 16 år gammel. Der er sket meget inden for 33

udviklingen både af udstyr og metode. Så grunden til, at Nelson mener, at præcisionen er bedre for TT 4 end for FT 4, kan skyldes dårligt og gammelt udstyr. Grunden, til at der i dette projekt findes en bedre præcision, kan skyldes den store udvikling inden for laboratorieudstyr samt udviklingen af nye metoder og bedre kvalitet af reagenser og apparatur. Uenigheden kan også skyldes, at der i denne undersøgelse bliver beregnet ud fra T 3i og T 4i, som begge indeholder to analyser. Dog kan der i Tabel 5 og 6 ses CV % over målingerne af TT 3 og TT 4. Disse er begge lavere end de tilsvarende CV % for FT 3 og FT 4. Dette må derfor siges ikke at være tilfældet. Klee [7] mener også, at det er en fordel at bruge FT 3 i forhold til TT 3, idet der tages højde for T 3 - bindings proteiner. Samtidig mener Klee [7], at det er biologisk mere korrekt at måle på T 3, da det er det aktive hormon i kroppen. T 3 er cirka 5 til 10 gange mere aktivt i kroppen end T 4 [7]. Hertil skal nævnes, at cirka 80 % af det cirkulerende T 3 er udvundet fra T 4 ved den perifere omdannelse [7]. Ud fra denne viden stiller det tvivl om, hvor korrekt det egentlig er at måle på T 3, hvis 80 % af dét T 3, der findes i blodet, egentligt er omdannet fra T 4. Der findes kun én situation, hvor det er nødvendigt at måle T 3, og det er ved thyrotoxicosis, hvor der er en forhøjet TSH, mens T 4 er normal [8]. Dette kan ses ved at kigge på algoritmen på Figur 10. Denne bruges til at udrede for thyreoidea sygdomme. Tidligere viste studier, at FT 3 og TT 3 var mere korrekte at bruge til monitoreringen af medicin i forhold til FT 4 ogtt 4. Dog er det senere blevet bevist, at FT 3 og TT 3 sjældent kan bruges diagnostisk, da den kan ændre sig ved sult og ved akut syge patienter. Derfor bruges TSH måling som start ved thyreoidea udredning. Denne udløser T 4 eller FT 4 analyse, hvis TSH niveauet er for højt eller for lavt. Er denne normal, udløses en FT 3 eller T 3 analyse for videre diagnosticering af patienten [7], hvilket svarer til algoritmen på Figur 10. Kigges der på bindingsproteinerne, er der også forskel på, hvilke proteiner der bindes til T 3 og hvilke, der bindes til T 4 [7]. Samtidig er bindingen til T 4 stærkere end til T 3 [10]. Dette tages der ikke højde for, når index beregnes. Offie et al. [9] mener, at fordi koncentrationen af bindingsproteinerne svinger, er det mere korrekt at måle de frie hormoner. Især når der skal skelnes mellem thyrotoxicosis, hypothyreoidisme og euthyroid tilstanden. Grunden til dette er, at der ikke tages højde for arvelige og erhvervede variationer af bindingsproteiner i koncentrationen af total hormoner. Dog gøres dette ved målingen af T up, der er et mål for frie bindingspladser. Der korrigeres med T up, og index findes. Denne måling må derfor være mere korrekt i forhold til totale hormoner. 34

Det er svært at sige, præcist hvad der er det mest korrekte at bruge, men ud fra projektet her er det svært at komme udenom at bruge de frie hormonmålinger i stedet for index. Når sammenhængen er tydelig, og det klart er tydeligt, at præcisionen er bedre for de frie hormoner. Teorien peger i begge retninger, men der er mest, som underbygger at det er de frie hormoner, der bør måles på. Præcisionen er bedst, sammenhængen er tydelig og det er de hormoner, der er aktive i kroppen. Kigges der kort på et økonomisk aspekt, er det underforstået at dét at analysere på én analyse i stedet for to klart bør være billigere materialemæssigt. Undtagelsen er, hvis reagenserne er mere end dobbelt så dyre. Prislisten over reagenser ses i Bilag 4. Her ses det, at prisen for kun én analyse ikke er dobbelt så dyr, som prisen for de to analyser. Prisen for at reagens til analyse af FT 3 er 12,52 kr. pr. analyse, prisen for reagens til at analysere og kunne beregne T 3i er 7,41 kr. pr. analyse af TT 3 og 9,79 kr. pr. analyse af T up. Dette giver i alt 17,20 kr. pr. analyse og ved at måle FT3 i stedet for T3i giver dette en besparelse på 4,68 kr. pr. analyse. Prisen for at reagens til analyse af FT 4 er 12,24 kr. pr. analyse, prisen for reagens til at analysere og kunne beregne T 4i er 7,01 kr. pr. analyse af TT 4 og 9,79 kr. pr. analyse af T up. Dette giver i alt 16,80 kr. pr. analyse og ved at måle FT 4 i stedet for T 4i giver dette en besparelse på 4,56 kr. pr. analyse. Færre analyser mindsker også forbruget af utensilier såsom pipetter og cuvetter. Da arbejdsbyrden ikke ændres har denne ingen effekt på udgifterne. Det er derfor billigere end at måle de frie hormoner end at beregne index. Konklusion Der er klar lineær sammenhæng mellem FT 3 og T 3i, og der er en klar lineær sammenhæng mellem FT 4 og T 4i. Der er klar signifikant forskel på præcisionen for FT 3 og T 3i. Det er tydeligt, at FT 3 har en klart bedre præcision. Det samme kan siges om FT 4 i forhold til T 4i, hvor præcisionen for FT 4 er tydeligt bedre end præcisionen for T 4i. Derved kan konkluderes, at for T 3 er målingen af de frie hormoner, altså FT 3, signifikant bedre end det beregnede index og at for T 4 er målingen af de frie hormoner, altså FT 4, bedre end beregningen af index. 35

Litteraturliste 1. Bruger manual til ADVIA Centaur XP immunoassay system REF 06460398 (078D0501-02) Siemens Medical Solutions Diagnostics. 2. Metodeblad for FT 3, fra Siemens af ADVIA Centaur til analyse af FT 3 3. Metodeblad for FT 4, fra Siemens af ADVIA Centaur til analyse af FT 4 4. Metodeblad for T 3, fra Siemens af ADVIA Centaur til analyse af T 3 5. Metodeblad for T 4, fra Siemens af ADVIA Centaur til analyse af T 4 6. Metodeblad for T up, fra Siemens af ADVIA Centaur til analyse af T up 7. Klee, G. Clinical usage recommendations and analytic performance goal for total and free triiodothyronine measurements. Clinical Chemistry 1996. 42.1:155-159 8. Nelson, JC and Wilcox, RB. Analytical performance of free and total thyroxine assays. Clinical Chemistry 1996. 42.1:146-154 9. Offie P. SOldin, Steven J. Soldin. Thyroid hormone testing by tandem mass spectrometry. Clinical biochemistry. 2011. 44:89-94. 10. Schussler GC. The thyroxine-binding Proteins. Thyroid. 2000. vol. 10 No. 2:141-149 11. Labka IT program til data styring og opslag på KBAHIH 12. Bendsen, Thomas. Noter I Statistik. University College Bioanalytikeruddannelsen. 2008. http://statnoter.biolyt.dk/ den 4. juni 2012 13. Ian Weeks, Iraj Beheshti, Frank McCapra, Anthony K Campbell and Stuart Woodhead. Acridinium Esters as High-Specific-Activity Labels in Immunoassay. Clinical Chemistry. 29/8-1983. Vol. 29, No. 8:1474-1479 14. http://www.google.dk/imgres?q=thyreoidea&hl=da&biw=1280&bih=631&tbm=isch&tbnid =y1nkgdai0u5jpm:&imgrefurl=http://medicaldictionary.thefreedictionary.com/glandula%2bthyreoidea&docid=o2n3dxjyk2jerm&imgur l=http://img.tfd.com/mk/t/x2604-t- 18.png&w=279&h=300&ei=oVy7T5rcMoTFswbL6Yz5Ag&zoom=1 den 22 maj 2012 15. Winter, W og Roger L. Bertholf. Chapter 55, The Thyroid: Pathophysiology and thyroid function testing. In Carl A. Burtis, Edward R Ashwood and David E Bruns, editors. Tietz: Textbook of Clinical chemistry and molecular diagnostics. 5nd ed. St Louis, Missouri, USA: Elsevier Inc; 2012. p. 1905-1944 16. F_3_Kirtel_epiteler_E09_M03 fundet via Fronter.com den 22. maj 2012 Undervisningsmateriale 36