Abstrakt. Abstract. Side 3 af 78

Transkript

1 Bachelorprojekt af Sidsel Salling Thorborg, Chalotte Poulsen og Grith Mai Tønnesen Vejledt af Lisbeth Birk Møller (seniorforsker på Kennedy Instituttet) Bachelormodul II/ Forår 2008 Medicinalbiologi / RUC Side 1 af 78

2 Forord Vi vil gerne takke Lisbeth Birk Møller, seniorforsker ved Kennedy Centret for god vejledning i forbindelse med udarbejdelsen af dette bachelorprojekt. Vejen var lang fra Kennedy Centret til Roskilde Universitetscenter og arbejdsmetoderne forskellige, men det har uden tvivl været et værdifuldt samarbejde. Ikke mindst på grund af de mange teoretisk tunge forskningsartikler, som skulle læses og forstås, før vi kunne komme i gang med skriveprocessen. Tak for hjælp til indsamling af den rette litteratur og til forståelsen af samme. Dette har sammen med vores eget engagement og interesse, bragt dette projekt om X-kromosominaktivering i kvinder til live. Side 2 af 78

3 Abstrakt X-kromosominaktivering sker under embryogenesen og er et fænomen, hvormed enten det paternelle eller det maternelle X-kromosom inaktiveres i samtlige celler i kvindens krop. Dette sker for at kompensere for den ellers ulige fordeling af arvemateriale mellem de to køn. Inaktiveringsprocessen er som udgangspunkt tilfældig, således at halvdelen af cellerne har inaktiveret det maternelle X-kromosom, og den anden halvdel har inaktiveret det paternelle X-kromosom. Det kan dog ske, at inaktiveringsmønsteret er skævt, så det i overvejende grad er det ene X-kromosom der udtrykkes. Dette kan være en tilfældighed, men som regel skyldes det at der på det ene X-kromosom er en mutation. Inaktiveringsmønsteret kan altså fungere som en beskyttende mekanisme, idet cellerne kan vælge at inaktivere det X-kromosom som bærer på en mutation. Da dette er muligt, vil kvinder, som er bærere af en X-bundet mutation ofte være symptomfri. Det har dog vist sig, at inaktiveringen også kan ske til fordel for den syge allel, og dette er et fænomen hvis baggrund man ikke endnu kan forklare. Det er netop denne problematik vi finder særlig interessant, og vores projekt omhandler derfor de humane sygdomme, der bliver udtrykt hos kvinder når X-inaktiveringsmønstret ikke virker beskyttende. Der er stadig mange løse ender i forbindelse med forskningen i X- inaktiveringsmekanismen, og dette kan gøre det svært for studerende og andre at sætte sig ind i emnet. Projektet tilstræber derfor at formidle fænomenet på en let tilgængelig måde, så en bredere gruppe af mennesker kan nås. Abstract X-chromosome inactivation occurs during embryogenesis and is a phenomenon, where either the paternal or the maternal X-chromosome is inactivated in all of the cells in the female body. This is to compensate for the uneven balance of genetic inheritance between the two sexes. The inactivation process is usually random, thus half of the cells inactivate the maternal X-chromosome and the other half inactivates the paternal X-chromosome. Sometimes the inactivation-pattern is skewed, meaning that one of the X-chromosomes is predominantly expressed. This can occur by coincidence, but usually it is due to a mutation on the other X- chromosome. The inactivation-pattern can function as a protective mechanism, where the cells can choose to inactivate the chromosome carrying a mutation. This can make women Side 3 af 78

4 carriers of diseases, without expressing any symptoms. Unfortunately it appears that the inactivation process sometimes inactivates the healthy X-chromosome, leaving the mutated chromosome, the functional one. This phenomenon s origin still remains unexplained. It is this subject we find very interesting and therefore our project deals with this exact issue about how the inactivation-pattern sometimes works against females so that they express diseases. There are still several problems to be resolved regarding the X-inactivation mechanism, and it can be difficult for students and others to obtain knowledge concerning these issues. Therefore this project aims to communicate the issues regarding X-inactivation on an accessible level, so that more people can acquaint with the phenomenon. Side 4 af 78

5 INDLEDNING...7 Generel introduktion til emnet...7 PRÆSENTATION AF PROBLEMFORMULERING OG RELEVANTE PROBLEMSTILLINGER... 9 Problemformulering...10 X-INAKTIVERING I KVINDER...10 Introduktion...10 Selve inaktiveringsprocessen...11 Kromatinstrukturens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering...15 X-REAKTIVERING...20 Hvorfor er der nogle gener på X i, som ikke er inaktiveret?...20 Undersøgelser af det humane X-kromosom viser, at nogle gener udviser et varieret inaktiveringsmønster...22 Reaktivering og ICF-syndrom...24 X-INAKTIVERINGSMØNSTER...24 Genetisk baggrund...25 Skæv X-inaktivering...25 BESTEMMELSE AF X-INAKTIVERINGSMØNSTRE...27 INTRODUKTION TIL SYGDOMSAFSNIT...32 MENTAL RETARDERING...34 Hvad er mental retardering?...34 Hvorfor opstår mental retardering?...34 Påvisning af skæve X-inaktiveringsmønstre hos bærere af XLMR-mutationer...35 Diskussion af forskningsresultaterne...36 ATR-X SYNDROMET Hvad er ATR-X og hvorfor opstår det?...37 Ikke-skæv X-inaktivering kan resultere i sygdomssymptomer hos kvinder...37 DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY (DMD)...38 Hvad er DMD?...38 Hvorfor opstår DMD? - Fysiologiske og genetiske årsager...39 Uensartet X-inaktivering i kvindelige tvillinger med DMD...40 HÆMOFILI BLØDERSYGDOM...41 Hvad er hæmofili?...41 X-inaktivering og hæmofili...42 Undersøgelse af et tvillingepar med svær hæmofili...43 Undersøgelse af et hæmofiliramt tvillingepar med raske forældre...45 Side 5 af 78

6 RETT-SYNDROM...47 Hvad er Rett?...47 Symptomer på Rett...47 Hvorfor opstår Rett? genetisk baggrund...48 Mutationer i MECP2 kan resultere i Rett-syndrom...50 X-kromosominaktiveringsmønstre og Rett-syndrom...50 X-INAKTIVERING OG AUTOIMMUNE SYGDOMME...52 Hvad er autoimmune sygdomme og hvorfor opstår de?...52 Autoimmune thyroid disease og X-inaktiveringsmønsteret...53 Resultater fra tre undersøgelser af patienter med AITD...55 OPSAMLING...57 DISKUSSION...60 Kan gener på det inaktiverede X-kromosom reaktivere, og hvilke konsekvenser kan det få?...60 Har alle bærere af en X-bunden sygdom et skævt X-inaktiveringsmønster?...60 Kan X-inaktiveringsmønsteret variere fra væv til væv?...61 Kan den store fænotypiske variabilitet, der ses hos forskellige kvinder med de samme mutationer, tilskrives X-inaktiveringsmønsteret?...62 Hvilken rolle spiller inaktiveringen, når man udvikler autoimmune sygdomme?...62 Kan raske kvinder have et skævt inaktiveringsmønster?...63 Bliver kvinders inaktiveringsmønster mere skævt med alderen?...63 Hvis der er mutationer på begge X-kromosomer, skelner cellen så mellem alvorlige og mindre alvorlige mutationer, og kan inaktiveringsdefekter på det ene X-kromosom spille ind her?...64 Er der andre faktorer end X-inaktiveringsmønsteret, der medvirker til den store fænotypiske variabilitet?...64 Kildekritik...65 PERSPEKTIVERING...65 ORDLISTE...69 LITTERATURLISTE...71 PRIMÆR LITTERATUR: Artikler...71 Bøger...75 Internetsider...75 Figurer...76 SEKUNDÆR LITTERATUR (BAGGRUNDSVIDEN): Artikler...76 Bøger...78 Side 6 af 78

7 Indledning Generel introduktion til emnet X-kromosom-inaktivering (XCI) er et fænomen, hvis eksistens man første gang fandt beviser for i 1949, da Murray L. Barr og Ewart G. Bertram observerede en dense staining nuclear structure i neurale cellekerner hos hunkatte [Wutz et al., 2002; Barr et al., 1949]. Senere i 1969 kom Mary Lyon med en hypotese, som gik ud på, at det ene X-kromosom i kvinder bliver inaktiveret i alle kroppens celler ved et tidligt stadie i embryogenesen. Endvidere mente hun, at dette inaktiveringsmønster nedarves til dattercellerne gennem celledelinger, og at processen, hvormed enten det paternelle eller det maternelle X-kromosom inaktiveres, er tilfældig [Okada et al., 2008]. Denne hypotese er siden hen blevet anerkendt som et faktum verden over. Det kvindelige og det mandlige kønskromosom er ikke lige store, og mængden af gener er derfor ikke ligeligt fordelt mellem dem. X-kromosomet indeholder elleve gange så mange gener som Y-kromosomet, og mange af disse gener har vigtige funktioner i kroppen, heriblandt regulering af immunforsvar og metabolisme. Til sammenligning indeholder Y- kromosomet kun ét vigtigt gen, nemlig det gen som er ansvarlig for testis [Migeon, 2007]. Da kvinder har to X-kromosomer og mænd kun har ét, vil kvinder som udgangspunkt have flest gener. For at kompensere for dette, sker der netop den omtalte inaktivering af det ene af kvindens X-kromosomer, så der i cellerne altid kun er ét aktivt X-kromosom pr. diploide kromosomsæt [Wutz m.fl., 2006]. X-kromosom-inaktiveringen i kvinder sker altså for at kompensere for den ellers ulige fordeling af arvemateriale mellem mænd og kvinder [Karen et al., 2006; Wutz et al., 2007; Salstrom, 2007]. Inaktiveringsprocessen er som udgangspunkt tilfældig, men i tilfælde hvor der er opstået en mutation på det ene X-kromosom, kan cellerne vælge at inaktivere det syge X, for at undgå følgerne af mutationen. Her kan fordelingen af raske og syge celler så være mere eller mindre skæv, afhængigt af hvor mange celler der har inaktiveret det raske X-kromosom, og hvor mange celler der har inaktiveret det syge X-kromosom. I henhold til dette kan kvinder, som er bærere af en given X-bunden sygdom, både være symptomfrie og de kan have mere eller mindre alvorlige symptomer. Mænd har, med deres ene X-kromosom, ikke samme mulighed for at undgå følgerne af en eventuel X-bunden mutation, da deres X-kromosom altid vil være Side 7 af 78

8 aktivt, uanset om det indeholder mutationer eller ej [Migeon, 2007]. En lang række X-bundne sygdomme er derfor letale for drengefostre, og vil således kun blive udtrykt hos kvinder i større eller mindre grad. Disse er de såkaldt dominante sygdomme. Det at en sygdom er dominant betyder at den allel, som bærer mutationen, udtrykker sin fænotypiske effekt, uanset om der også er en rask allel til stede. Der findes også mildere varianter af X-bundne sygdomme, og disse vil man stort set kun observere hos mænd [Migeon, 2007]. Disse sygdomme er de recessive sygdomme, altså sygdomme, der kun kommer til udtryk i kvinder, når begge alleler bærer på den samme mutation. I de senere år er man begyndt at koble X-inaktiveringsmønsteret sammen med en række fænomener såsom aldring og cancer, og man er også begyndt at overveje den mulighed, at reaktivering af ellers inaktiverede gener, kan bruges i behandlingen af forskellige sygdomme, hvor det raske X-kromosom, i størstedelen af cellerne, er blevet inaktiveret [Pan et al, 2008]. I en undersøgelse af inaktiveringmønsteret i forskellige kvinder har man sågar observeret, at en lang række kvinder som har oplevet gentagne aborter, har et skævt inaktiveringmønster. Også mødre til homoseksuelle mænd har i flere tilfælde vist sig at have et skævt inaktiveringsmønster [Reviewed af Uz et al., 2006]. Disse observerede fænomener vender vi tilbage til i vores perspektivering. Vi finder det meget interessant, at X-inaktiveringsmønsteret kan kobles sammen med så mange forskellige fænomener. Der ligger imidlertid stadig en stor opgave i nøjere at afdække dets rolle i disse forskellige sammenhænge. De mange løse ender gør det vanskeligt for studerende og andre interesserede at få overblik over området. Herudover er det svært at finde let forståeligt stof omkring emnet, og det tilgængelige materiale er primært at finde i svære teoretiske forskningsartikler. Vi mener således, at der mangler et let tilgængeligt materiale, som giver et overordnet overblik over emnet. Et materiale, som formår at formidle den svære teoretiske viden på en let tilgængelig måde, så en bredere gruppe af mennesker kan nås. Det er derfor vores mål med denne rapport netop at lave et materiale, som opfylder disse kriterier. Vi vil udforme et projekt, som præsenterer teorien i et forståeligt sprog, og som til sidst, i et opsamlende afsnit, gennemgår de vigtigste pointer, så man sidder tilbage med et samlet overblik over emnet. Vi vil desuden, i en perspektivering, diskutere hvilke nye muligheder der opstår, i Side 8 af 78

9 takt med at man via forskningen, opnår en bedre og bedre forståelse for de biologiske mekanismer og deres betydning for organismens funktionsevne. Præsentation af problemformulering og relevante problemstillinger Da vi nu kort har beskrevet det fænomen, vi har valgt at koncentrere os om i dette projekt, vil vi gå et skridt videre, og introducere læseren for en række relevante problemstillinger i forbindelse med emnet. Da vi valgte emnet X-inaktivering i kvinder, var det i høj grad, fordi det er et interessant fænomen, som vi ikke var bekendt med, og som vi fik lyst til at undersøge nærmere. Det viste sig også hurtigt at være velvalgt, da vi, efterhånden som vi opnåede større indsigt i emnet, blev mere og mere fascinerede af dette komplekse fænomen og dets betydning for organismen. Man har allerede i mange år forsket intensivt i X- inaktiveringsmekanismens betydning, men det er først i de seneste år at brikkerne i puslespillet langsomt er begyndt at falde på plads. Der er dog stadig en lang række spørgsmål, som rejser sig, hver gang forskningsteams rundt om i verden høster nye og interessante resultater. En særlig interessant observation forskningsverdenen har gjort sig, er den, at X- inaktiveringsmønsteret tilsyneladende har stor betydning for det fænotypiske udfald af en sygdom hos kvinder. Denne problemstilling samt en lang række andre interessante spørgsmål, præsenterer vi i punktform nedenfor. Vi vil ikke her gå nærmere ind på de enkelte spørgsmål, da vi løbende i rapporten vil gå mere i dybden med dem. Til sidst i rapporten vil vi diskutere, om vi har fundet svar på de spørgsmål, vi har valgt at koncentrere os om. Hvis ikke, vil vi diskutere, hvad et muligt svar kan være, og vi vil så præsentere vores egne tanker i forbindelse med de opdagelser, man har gjort sig i laboratorier verden over. Centrale spørgsmål i forbindelse med X-inaktiveringsmønsteret: Kan gener på det inaktiverede X-kromosom reaktivere, og hvilke konsekvenser kan det få? Har alle bærere af en X-bunden sygdom et skævt X-inaktiveringsmønster? Kan X-inaktiveringsmønsteret variere fra væv til væv? Kan den store fænotypiske variabilitet, der ses hos forskellige kvinder med de samme mutationer, tilskrives X-inaktiveringsmønsteret? Hvilken rolle spiller inaktiveringen, når man udvikler autoimmune sygdomme? Side 9 af 78

10 Kan raske kvinder have et skævt inaktiveringsmønster? Bliver kvinders inaktiveringsmønster mere skævt med alderen? Hvis der er mutationer på begge X-kromosomer, skelner cellen så mellem alvorlige og mindre alvorlige mutationer, og kan inaktiveringsdefekter på det ene X-kromosom spille ind her? Er der andre faktorer end X-inaktiveringsmønsteret, der medvirker til den store fænotypiske variabilitet? Alle disse spørgsmål kan ses som underspørgsmål til den problemformulering, vi præsenterer nedenfor, da det er spørgsmål, som er opstået undervejs i vores litteraturstudie, og som har hjulpet os til at finde ud af, hvad det helt konkret er, vi vil koncentrere os om i dette projekt. Problemformulering Hvilken rolle spiller X-inaktiveringsmønsteret i forbindelse med udviklingen af humane sygdomme hos kvinder? X-inaktivering i kvinder Introduktion Vores krop består af millioner af celler, som hver især indeholder 46 kromosomer, 44 autosomer og 2 kønskromosomer. De to kønskromosomer kan være XX eller XY afhængigt af, om der er tale om en pige eller en dreng. Som nævnt i indledningen er X-kromosomet større end Y-kromosomet, og X-inaktivering i kvinder sker således for at kompensere for den ulige fordeling af arvemateriale, der ellers vil være mellem de to køn. Der er, som nævnt, mange faktorer, som spiller ind, når inaktiveringen finder sted, og trods de mange endnu ubesvarede spørgsmål, er man kommet langt i forsøget på at opklare selve inaktiveringsprocessens forløb. I mennesker og andre pattedyr kaldes X-inaktiveringen for "random inaktivering", idet det i hver celle er tilfældigt, om det er X-kromosomet fra faderen, eller om det er X-kromosomet fra moderen som inaktiveres. Random inaktivering forekommer i det tidlige embryo, og denne proces bliver irreversibel, når cellerne differentieres [Valley et al., 2006]. I mennesker Side 10 af 78

11 uden X-kromosom-mutationer vil fordelingen af inaktive maternelle og paternelle X- kromosomer oftest være 50:50, men i tilfælde hvor der er sket en mutation på det ene X- kromosom, kan fordelingen være mere eller mindre skæv (dette kommer vi nærmere ind på i afsnittet om skæv X-inaktivering) [Franco et al, 2006; Chahrour og Zoghbi, 2007]. X-kromosomet indeholder flere gener og DNA-sekvenser, som samarbejder med adskillige af cellernes proteiner om at fuldføre inaktiveringsprocessen (se afsnittet Kromatinstrukturens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering). Hvis bare et enkelt protein mangler, kan det resultere i, at det forkerte X-kromosom inaktiveres. Selve inaktiveringsprocessen Et vigtigt locus på X-kromosomet i forbindelse med X-inaktivering er inaktiveringscenteret Xic. Xic er ansvarlig for at inaktiveringen starter, og i dette afsnit vil vi således indledningsvis redegøre for funktionen af inaktiveringscenteret. Begge X-kromosomerne indeholder Xicloci et, og forsøg tyder på, at de to X-kromosomer parrer umiddelbart før inaktiveringen, således at deres to Xic-loci kommer i kontakt med hinanden (se figur 1) [Wutz, 2007]. Dette indikerer, at kommunikation mellem de to Xic-loci er nødvendig, når det skal bestemmes, hvilket et kromosom der skal inaktiveres [Reviewed af Karen et al., 2006]. Nedenfor ses en figur som viser processens forløb. Figur 1. Figuren viser, hvordan de to Xic-loci bestemmer hvilket et X-kromosom, der skal inaktiveres. Ved start af denne proces, kommer de to loci i kontakt med hinanden, så X-kromosomerne kan tælles, og det kan afgøres, hvilket et X-kromosom der skal inaktiveres. Det inaktiverede X-kromosom vil, hvis processen er forløbet som den skal, forblive inaktivt efter at cellerne er differentierede. Kilde: [Internetside A] Side 11 af 78

12 Xic indeholder to gener der koder for ikke-translateret RNA, nemlig Xist og Tsix, som er involveret i inaktiveringsprocessen [Reviewed af Karen et al., 2006]. Xist-genet producerer Xist-RNA, som ved starten af inaktiveringsprocessen breder sig over hele det X-kromosom, der skal inaktiveres. Når Xist-RNA et spreder sig over kromosomet, forandres kromatinstrukturen, og DNA et bliver utilgængeligt for cellens transkriptionsfaktorer (se figur 2). Hermed er silencing af X-kromosomet påbegyndt. Figur 2. Denne figur viser, hvordan Xist-RNA et spreder sig over X-kromosomet, og inaktiverer det. Til venstre på figuren ses et aktivt X-kromosom med en ikke-kondenseret kromosomstruktur (eukromatinstruktur). I midten af dette kromosom ses Xic-loci et, hvorfra Xist-RNA et spredes. Efterhånden som RNA et spredes, bliver kromosomet mere og mere kondenseret, for til sidst at blive helt inaktivt. Billedet helt til højre viser, hvordan heterokromatin (den kondenserede udgave af DNA) ser ud. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside B]. Man har dog fundet ud af, at bestemte sekvenser skal være til stede på Xist, før transkriptionen af Xist-RNA kan starte. Inden for de seneste år har man nemlig opdaget sekvenser ved 5 - enden af Xist, som indeholder 7,5 gentagelser af et motiv, der menes at folde sig til en RNAstruktur bestående af to stem loop. Disse sekvenser er nødvendige for start af silencing, og de er bevaret i alle pattedyr, hvilket indikerer, at de måske fungerer som en slags platform for Side 12 af 78

13 faktorer, der medvirker til genrepression. Hvis Xist-RNA mangler det omtalte motiv, vil det stadig akkumuleres omkring X-kromosomet, men det vil ikke længere være i stand til at starte silencing [Karen et al., 2006]. Udover stem loop-strukturen har man også opdaget nogle andre sekvenser, de såkaldt long interspersed nuclear elements (LINEs), som højest sandsynligt medvirker til, at Xist-RNA et spredes. LINE-sekvenserne findes i større antal på X-kromosomerne end på autosomerne, hvilket forstærker ideen om, at de har en speciel rolle på dette kromosom. Det tyder på, at LINE-sekvenserne, som er fordelt over hele X-kromosomet, indeholder mange svage bindingssteder, til hvilke Xist og andre faktorer kan binde sig (se figur 3) [Karen et al., 2007]. Figur 3. Denne figur viser, hvordan LINE-sekvenserne menes at virke. Øverst på figur A kan man se, hvordan Xist-RNA et spredes fra Xic-loci et i midten, og derefter hjælpes videre langs kromosomet vha. LINEsekvenserne. På figur B kan man se, hvordan LINE-sekvenserne er fordelt over kromatinet, samt hvordan Xist-- RNA et binder sig til disse, når det spredes. Kilde: Modificeret udgave. [Karen et al., 2006]. En nuværende hypotese går ud på, at bindingen til LINE-sekvenserne foregår på en kooperativ måde, idet man har foreslået at binding af én faktor letter bindingen af den næste. Man har endnu ikke lavet forsøg, som har vist, at denne kooperative binding af Xist-komplekser finder sted, men alt peger i den retning [Karen et al., 2006]. Udover LINE-sekvensernes mulige kooperative effekt ved inaktiveringen, er det også sandsynligt, at de beskytter gener mod inaktivering, idet man har opdaget at bestemte oligomere i LINE-sekvenserne, er associeret med gener, som undgår X-inaktiveringen [Reviewed af Salstrom, 2007]. Det er desuden muligt at LINE-sekvenserne spiller en rolle i opretholdelse af X-inaktiveringen. Hvis dette er tilfældet, kan det være, at aktive gener på det ellers inaktiverede X-kromosom, i virkeligheden bare Side 13 af 78

14 midlertidigt har undgået inaktiveringen. I sådan en situation står det klart, at en høj koncentration af LINE-sekvenser, så vil gå hånd i hånd med en effektiv opretholdelse af gen-silencing ved X-inaktivering [Reviewed af Salstrom, 2007]. Ligesom Xic findes Xist også på begge X-kromosomer, og man har fundet ud af, at der foregår kommunikation mellem de to Xist-alleler i trans, idet man har bevist, at en deletion af Xist på X a (det aktive X-kromosom) ændrer timingen af replikationen på begge X-kromosomer [Salstrom et al., 2007]. Timingen af replikationen spiller en vigtig rolle i forbindelse med X- inaktivering, idet man har vist, at det inaktive X-kromosom altid replikeres sent i replikationsfasen. En deletion af Xist på X a vil, udover at ændre replikationstidspunktet, også ændre kromatinstrukturen på X i (det inaktive X-kromosom). I en normalt fungerende celle, hvor begge Xist-alleler er til stede, vil Xist-allelen på X a påvirke gensilencing på X i, og de to alleler arbejder således sammen om at opretholde inaktiveringen af X i [Salstrom, 2007]. Dette indikerer, at Xist-allelen på X a har biologisk aktivitet, selvom den ikke bliver transkriberet [Salstrom, 2007]. Tsix, det andet gen som Xic-loci et indeholder, transkriberes i modsat retning af Xist, og er en negativ regulator af dette, hvilket betyder at så længe Tsix bliver udtrykt, så vil Xist ikke blive det (se figur 4 nedenfor). Inden det bliver bestemt, hvilket et af X-kromosomerne der skal inaktiveres, vil Tsix derfor være til stede på begge kromosomerne, men når beslutningen er taget, nedreguleres Tsix på det kromosom, som skal inaktiveres. Når Tsix nedreguleres, får Xist-genet mulighed for at komme til udtryk, og dermed startes silencing af kromosomet. Figur 4. Denne figur viser Xic-regionen på X-kromosomet. Her kan man se, at Tsix, som er en negativ regulator af Xist-genet, transkriberes i modsat retning af dette. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside C]. Side 14 af 78

15 Kort opsummering Xist-genet, som koder for Xist-RNA, befinder sig i inaktiveringscentret Xic på begge X- kromosomer. Når Xic-loci erne på de to X-kromosomer parrer, bestemmes det hvilket et X- kromosom der skal inaktiveres, og Xist-RNA et vil herefter brede sig over dette. Silencingen afhjælpes af en stem loop-struktur, som befinder sig nær 5 -enden af Xist-RNA et, og selve spredningen af RNA et menes at ske vha. LINE-sekvenserne, som indeholder mange svage bindingssteder for Xist. Udover Xist-RNA ets samarbejde med LINE-sekvenserne, mener man også at Xist, idet det spredes, er i stand til at rekruttere andre faktorer til X i, som skal afhjælpe inaktiveringsprocessen ved at ændre kromatinstrukturen. I næste afsnit fokuseres derfor på kromatinstrukturen og dens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering. Kromatinstrukturens rolle i forbindelse med X-kromosom-inaktivering Man har fundet ud af, at der sker en række epigenetiske modifikationer af DNA og histoner, når Xist-RNA et spreder sig over kromosomet. Disse modifikationer er hypermethylering og hypoacetylering af DNA og histoner samt sen replikation i replikationsfasen [Wutz, 2007]. Hypermethyleringen på X i sker i høj grad ved de såkaldte CpG-dinukleotider og CpG-øer, som er DNA-sekvenser, hvor indholdet af cytosin og guanin er særlig højt [Tang & Ho, 2007]. Forskere mener, at de nævnte modifikationer bl.a. sker, fordi Xist-RNA et rekrutterer de såkaldte Polycomb-proteiner til X i. Helt specifikt er der her tale om de Polycomb repressive komplekser 1 og 2 (PRC1 og PRC2) [Wutz, 2007]. Inden vi går i dybden med funktionen af Polycomb-komplekserne og betydningen af CpGøerne, vil vi gøre rede for, hvad methylering og acetylering er, og hvorfor det finder sted. Endvidere vil vi redegøre for, hvad histoner er, og hvorfor de er vigtige i denne sammenhæng. Methylering og acetylering er påsætning af henholdsvis en methylgruppe og en acetylgruppe til f.eks. et nukleotid i DNA-strengen eller en aminosyre i en histone. Methylgrupper påsættes af de såkaldte methyltransferaser (se figur 5), og acetylgrupper påsættes af acetyltransferaser. Side 15 af 78

16 Figur 5. Denne figur viser hvordan cytosin får påsat en methylgruppe vha. en DNAmethyltransferase. Kilde: [Internetside D]. Hypermethylering og hypoacetylering er forbundet med tæt pakket/kondenseret kromatin, også kaldet heterokromatin. Omvendt er hypomethylering og hyperacetylering forbundet med eukromatin, som er den løst pakkede udgave af kromatin (se figur 2). Som tidligere nævnt inaktiveres X-kromosomet, når kromatinet bliver mere kondenseret. Det der sker når X- kromosomet inaktiveres, er netop en hypermethylering samt en hypoacetylering af DNA og histoner, så kromatinstrukturen ændres til heterokromatin, og kromosomets gener bliver utilgængelige for cellens transkriptionsfaktorer. Man mener, at de modifikationer der er tale om her, har til opgave at opretholde den kromatinstrukur, der er dannet [Salstrom, 2007; Karen et al., 2007]. Histoner er den vigtigste proteinkomponent i kromatin, da det er dem, der pakker cellens DNA. Histonerne H2A, H2B, H3 og H4 kaldes for core histoner idet de med to kopier af hver klasse, går sammen og danner en oktamer. Sådan en oktamer udgør et nukleosom. Et nukleosom kan derfor beskrives som en bold bestående af 8 histoner, rundt om hvilke cellens DNA er viklet to gange. Histoner har en såkaldt hale, som er deres amino-terminal-ende, hvor posttranslationelle modifikationer såsom acetylering, methylering, fosforylering m.m. kan finde sted (se figur 6 nedenfor). Side 16 af 78

17 Figur 6. Denne figur viser, hvordan histonerne er organiseret i et nukleosom. På figur a kan man se, at histone-halerne stikker ud fra nukleosomet, så deres aminosyrer er tilgængelige for methylering, acetylering og fosforylering m.m.. Figur b viser, hvordan histonerne er organiseret, når de er acetylerede og ikke-acetylerede. Når histonerne acetyleres, bliver kromatinstrukturen mindre kondenseret, og dermed kan generne på kromatinet transkriberes. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside E]. Helt specifikt er det bestemte lysin-rester på histone-halerne, som kan ændres ved at en methylgruppe eller lignende, binder sig kovalent til disse [Griffiths et al., 2008]. Idet kromatin består af histoner, og det bl.a. er histonerne som methyleres ved inaktivering af det ene X- kromosom, er det også dem, som sørger for, at kromatinet foldes op til en heterokromatinstruktur. Grunden til at de danner denne struktur, er, at deres affinitet for anioniske molekyler som DNA øges, når deres haler methyleres. Gener der er aktive, har derfor færre bundne histoner, mens inaktive gener har flere. Forskere mener, at ovennævnte histone-modifikationer kan etablere og opretholde transkriptionelt inaktivt heterokromatin ved at blokere bindingsstederne for transkriptions-aktivatorer, eller ved at skabe bindingssteder for proteiner som hæmmer transkription (her Polycomb- Side 17 af 78

18 proteinerne) [Reviewed af Salstrom, 2007]. Histone-halerne kan også rekruttere de føromtalte proteiner, nemlig methyltransferaser, som medvirker til at opretholde heterokromatinstrukturen. Deacetylaser som fjerner acetylgrupper fra histone-halerne, medvirker også hertil. Nu da vi kort har introduceret læseren for den vigtigste teori i forbindelse med kromatinstrukturens betydning for genekspressionen på X-kromosomet, vil vi fokusere på de føromtalte Polycomb-protein-komplekser samt de såkaldte CpG-øer og deres betydning for genekspressionen. De to Polycomb-repressive komplekser PRC1 og PRC2 rekrutteres som nævnt af Xist-RNA som et af de første led i inaktiveringsprocessen. Man ved endnu ikke, hvordan denne rekruttering foregår, men man ved, at Polycomb-proteinernes lokalisering til X i er fuldt ud afhængig af Xist, uanset hvilket udviklingsmæssigt stadie cellerne befinder sig i [Reviewed af Karen et al., 2007]. PRC1 og PRC2 har katalytisk aktivitet, idet de henholdsvis medierer histone H2A Lys119 ubiquitylering (H2aK119ub1) og histone H3 Lys27 trimethylering (H3K27me3). Man har opdaget, at sidstnævnte modifikation fremmer bindingen af PRC1 til kromatin, så det er blevet foreslået at PRC2 måske rekrutterer denne til kromosomet (se figur 7). Man har desuden fundet ud af, at Xist alene ikke er nok, når X-inaktiveringen skal opretholdes. Her har man fundet en faktor, den såkaldte memory -faktor som er påkrævet, for at X i kan forblive inaktivt [Reviewed af Karen et al., 2007]. Man kender endnu ikke memory-faktorens molekylære natur, men man ved, at Xist-ekspression etablerer denne i den tidlige differentiation, og at både Xist og memory-faktoren er påkrævet, for at H3K27me3 og H2A119ub1 kan finde sted på X i senere i differentiationen [Reviewed af Karen et al., 2007]. Nedenfor ses en figur, som viser, hvordan histone H3 på X i bliver methyleret. Side 18 af 78

19 Figur 7. Denne figur viser, hvordan de to Polycomb-repressive komplekser PRC1 og PRC2 samarbejder om at methylere histone H3. Helt ude til venstre kan man se, at histonerne er acetylerede, hvilket bevirker at kromatinet er aktivt. Den tredje histone fra venstre bliver metyleret af PRC2, og dette resulterer i, at PRC1-komplekser rekrutteres til kromatinet. Idet de rekrutteres, methylerer de samtlige H3-histoner langs kromatinet, så X-kromosomet inaktiveres. Kilde: Modificeret udgave. [Internetside F]. Etableringen af memory-faktoren er observeret, når gen-silencing er blevet stabil og irreversibel, hvilket indikerer, at denne måske spiller en rolle i overgangen mellem start og opretholdelse af X-inaktiveringen [Karen et al., 2006]. Methyleringen af cellens DNA sker primært omkring de såkaldte CpG-dinukleotider, som er cytosiner der sidder på 5 -enden af guanin. CpG-dinukleotiderne er generelt underrepræsenteret i genomet, men der findes de føromtalte CpG-øer, der er defineret som værende DNAsekvenser, hvor cytosin og guanin-indholdet er større end 55 % [Waggoner, 2007]. Disse øer er bevaret i 1-2 % af genomet, og de varierer i længder fra 200 basepar (bp) til 5 kilobasepar (kb) [[Tang & Ho, 2007] et al., 2007]. Under normale omstændigheder er de fleste af disse øer umethylerede. Dette er dog ikke tilfældet i gener, som er genstand for X-kromosominaktivering. ca. 70 % af CpG-øerne, er associerede med DNA-sekvenser, som er mellem 200 bp og 2 kb lange. Disse DNA-sekvenser befinder sig i promoter-regionerne på ca. 40 % af generne i pattedyr [Waggoner, 2007], hvilket indikerer, at CpG-øerne er en vigtig del af genregulationen. Man har også opdaget en tydelig sammenhæng mellem genernes transkriptionshyppighed og mængden af methylerede CpG-øer i reguleringssekvenserne [[Tang & Ho, 2007] et al., 2007]. Det er især husholdningsgenernes promoter-regioner, som er genstand for methylering på X i, da disse gener normalt udtrykkes i særlig høj grad. Modsat, er de sam- Side 19 af 78

20 me gener på X a hypomethylerede, da ekspression af disse er nødvendige, for at kroppen kan fungere. Det forholder sig imidlertid omvendt med hensyn til methylering af gen body. Her er methylering nemlig observeret i større grad på X a end på X i [Salstrom, 2007]. X-reaktivering Efter en nærmere gennemgang af hvordan X-kromosom-inaktiveringen forløber, vil vi nu fokusere på et andet fænomen, nemlig reaktivering. Vi har valgt at præsentere dette emne i et afsnit for sig, da det vil gøre processerne bag inaktivering og reaktivering så enkle og forståelige som muligt. Hvorfor er der nogle gener på X i, som ikke er inaktiveret? Der er ikke fuldstændig klarhed over hvad der præcist sker, når nogle af generne på det inaktive X-kromosom viser sig at være aktive igen. Det er muligt at de undslipper inaktiveringen og derved forbliver aktive, men det kan også være, at de reaktiverer efter inaktiveringen og derved igen bliver aktive [Brown & Robinson, 2002; Brown & Greally, 2003]. Artiklerne omtaler dette fænomen forskelligt. Nogle beskriver det som en reaktivering, og andre mener, at de undslipper inaktiveringen. Der er dog bred enighed om at 15 % af generne på det inaktive X-kromosom er aktive. Vi vil i dette afsnit generelt beskrive disse 15 % af aktive gener som reaktiverede, dog med undtagelser de steder hvor artiklerne specifikt har beskrevet dem som undslupne gener. Inaktiveringsprocessen er meget stabil i de somatiske celler, og det er kun i fosterets kønsceller, at der findes et udviklingsprogram, der kan gøre processen reversibel [Migeon et al., 2005]. Interessant er det, at nogle X-bundne gener, ca. 15 %, undslipper X-inaktiveringen og derfor er udtrykt i både det aktive og det inaktive X [Franco & Ballabio, 2006; Brown & Greally, 2003]. Der er her tale om gener der stykvis udtrykkes fra det ellers inaktive X- kromosom, da det ikke er hele kromosomet der undslipper, men kun enkelte gener. Undersøgelser har vist, at det i forskellige individer, ikke er fuldstændig de samme gener der er aktive på det ellers inaktive X-kromosom. Nogle gener bliver udtrykt hos én og er inaktive hos en anden, og dette fortæller, at der er et relativt stort antal gener, der har mulighed for at Side 20 af 78

21 blive udtrykt på begge kromosomer [Brown & Greally, 2003]. De gener der er udtrykt på begge kromosomer varierer altså en smule fra individ til individ, men mange af generne der udtrykkes på det inaktive X-kromosom, er de samme. Dette kommer sig af, at nogle gener er nødvendige at have i to kopier for at man kan være rask, og det er sandsynligvis også gener vi deler med Y-kromosomet [Brown & Greally, 2003]. Dette bliver understøttet i en artikel af Carrel og Willard fra 2005, hvor de har fundet ud af at mange af de gener, der undslipper X- inaktiveringen har Y-homologer. Dette er dog ikke alene forklaringen på reaktivering, da det ikke er alle de undslupne gener, der har disse Y-homologer [Carrel & Willard, 2005 og Invernizzi, 2007]. Havde vi kun et aktivt X-kromosom, ville det resultere i "Turner syndrom". Turner piger har kun et X-kromosom, og ovariesvigt er bl.a. et af symptomerne på sygdommen. Da raske kvinder ikke har dette symptom, er det netop pga. reaktivering af nogle af de gener der sidder på det inaktive X-kromosom. Reaktivering associeres med mangel på methylerede CpG-øer på det X-kromosom der skal inaktiveres. Manglende methylering på disse "øer" resulterer i en ustabil inaktivering af X- kromosomet, hvilket betyder, at nogle af generne igen kan blive aktive. De reaktiverede gener replikeres synkront med autosomerne [Migeon et al., 2005]. Som nævnt i inaktiveringsafsnittet spreder Xist sig ud over X-kromosomet og forandrer kromatinstrukturen, så DNA et bliver utilgængeligt for cellens transkriptionsfaktorer. Fejl ved spredning af dette inaktiveringssignal kan muligvis forklare, hvorfor nogle gener undslipper inaktiveringen [Brown & Robinson, 2002]. De gener der undslipper inaktiveringen mangler DNA-methylering, histone-acetylering, histone-methylering og de replikeres desuden tidligt. Der er dog regioner af det inaktive X- kromosom, der synes at være mere eukromatine (aktiv del af kromatinet), end dem der undslipper, og disse regioner burde ifølge teorien være mere tilbøjelige til at blive reaktiveret. Dette fortæller, at det ikke er genernes specifikke egenskaber men nærmere deres placering, der har betydning for, om de undslipper inaktiveringen [Brown & Greally, 2003]. Side 21 af 78

22 Undersøgelser af det humane X-kromosom viser, at nogle gener udviser et varieret inaktiveringsmønster Udover de 15 % der undslipper inaktiveringen og fremstår som fuldt udtrykte gener på det inaktive X, findes der også 10 % X-bundne gener, der udviser et varieret X- inaktiveringsmønster. Dette betyder, at de hverken er fuldstændig inaktiverede eller fuldstændig udtrykte [Carrel & Willard, 2005]. Carrel og Willard har i deres artikel X-inactivation profile reveals extensive variability in X-linked gene expression in females præsenteret en omfattende X-inaktiveringsprofil af det menneskelige X-kromosom, hvor de har undersøgt ca. 95 % af generne i fibroblast (bindevæv). De præsenterer flere forsøg i artiklen, hvoraf en af disse undersøger, hvordan fordelingen af udtrykte gener på det inaktiverede X-kromosom ser ud. Interessant nok var kun 65 % af generne i alle prøverne fuldt inaktiverede. Til gengæld viste ca. 20 % af generne varieret mønster, hvor generne i nogle prøver var inaktiverede, mens de i andre prøver var udtrykte. De resterende 15 % var undslupne gener og var derfor fuldt udtrykte i alle prøverne [Carrel & Willard, 2005]. Deres forsøg gav altså resultater hvor 10 % flere gener end anslået, viste varieret mønster. Nedenfor ses en figur som viser, i hvilken grad de forskellige gener på det inaktive X-kromosom udtrykkes. Side 22 af 78

23 Figur 8. Generne på det inaktive X-kromosoms ekspressionssniveau. Til venstre på figuren ses det inaktive X-kromosom og til højre ses et farveskema. Farveskemaet angiver den procentvise aktivitet af de forskellige gener, og her repræsenterer de røde prikker de mest inaktive gener mens de lilla prikker repræsenterer de mest udtrykte. Det ses på figuren at størstedelen af prikkerne er røde (65 %), hvilket stemmer overens med at størstedelen af generne på det inaktive X- kromosom er inaktive. Ifølge Carrel og Willard udgør de aktive gener de estimerede 15 %, mens de resterende 20 % udgør gener, der er delvist aktive. Kilde: Modificeret udgave. [Carrel & Willard, 2005] Figuren viser genernes ekspressionsniveau på det inaktive X-kromosom. Det er klart, at det ikke er ens i alle væv, og at der kan være afvigelser fra individ til individ, men figuren giver et realistisk billede af, hvordan aktiviteten af generne på det inaktive X-kromosom kan variere. Det er ikke klart hvornår i cellecyklus reaktiveringen foregår, men den menes at finde sted før de oprindelige kønsceller, PGC er (Primordial Germ Cells), kommer ind i meiosen [Migeon et al., 2005]. Side 23 af 78

24 Reaktivering og ICF-syndrom En sygdom, der har forbindelse til reaktivering er den sjældne autosomale recessive sygdom ICF (immunodefieciency centromeric instable facial syndrom), som kun er beskrevet i omkring 50 patienter verden over. Symptomerne på denne sygdom er et deformt ansigt. Derudover er symptomerne væksthæmning, trivselssvigt og "psychomotor retardation", som er en forsinkelse af mentale og fysiologiske processer, der ofte ses i forbindelse med klinisk depression. Desuden består immundefekten, ifølge Ehrlich et al. til internetsiden pubmed, i en centromerisk ustabilitet i kromosomerne 1, 9 og 16 [Ehrlich et al.]. I en artikel af Barbara R. Migeon lægger hun vægt på at ICF er en kromatinsygdom, hvilket vil sige, at det er forstyrrelser på kromatinet, der giver sygdommen. Hun beskriver her, at sygdommen skyldes mutationer på kromosom nr. 20, og disse mutationer påvirker de gener, der koder for DNAmethyltransferase [Migeon, 2007]. Der er bred enighed om at ICF altid involverer begrænset hypomethylering samt mutationer på DNA-methyltransferasegenet DNMT3B. Netop dette gen menes at være ansvarlig for etableringen af CpG-methylering på det inaktive X, og på grund af mutationen på dette gen, mangler patienter med ICF, methylering af CpG-øerne på det inaktive X-kromosom [CsanKovski et al., 2001]. Ifølge Migeon, 2007 har patienter med ICF-syndrom således ikke kun sygdommen pga. mutationen på kromosom nr. 20, men også fordi de udtrykker gener fra det inaktiverede X- kromosom. Hun mener altså at reaktiveringen af ellers inaktiverede gener på X-kromosomet, er medvirkende til at sygdommen opstår. X-inaktiveringsmønster I dette afsnit vil vi fokusere på X-inaktiveringens rolle i forbindelse med X-bundne sygdomme. Inaktiveringsmønsteret er forskelligt fra person til person, og i nogle mennesker kan det være skævt. Dette skæve mønster vil vi komme nærmere ind på efter en kort introduktion til emnet, da det er vigtigt at kende grunden til at sådan et mønster kan opstå. Som beskrevet i de indledende afsnit har kvinder to kopier af X-kromosomet i hver celle, og de betegnes derfor som cellulære mosaikker, da den ene halvdel af deres celler udtrykker proteiner, der er kodet af det maternelle X-kromosom mens anden halvdel udtrykker proteiner, der er kodet af det Side 24 af 78

25 paternelle X-kromosom [Migeon, 2007]. Kvinder har derved en biologisk fordel i forhold til mænd, da de kan inaktivere uønskede gener på det ene X-kromosom. Genetisk baggrund Der foregår rigtig mange interaktioner mellem henholdsvis den maternelle og den paternelle cellepopulation. F.eks. er der et fænomen kaldet metabolic cooperation, hvor normale celler deler genprodukter med andre celler, der mangler dette produkt. Dette ses bl.a. i de X-bundne lysosomale sygdomme Hunter syndrom og Fabry s disease, hvor mænd med disse sygdomme ikke danner nok lysosomale enzymer. I kvindelige bærere af disse sygdomme vil de normale celler udskille de lysosomale enzymer, som herefter kan optages af de muterede celler ved pinocytose. Den metaboliske cooperation gør derved, at kvinden i de fleste tilfælde beskyttes mod at udvikle symptomer på sygdommen [Migeon, 2007]. Det omvendte gør sig gældende i cellulær interferens, som er en negativ konsekvens af at cellepopulationerne deler genprodukter. Den interaktion vi i dette projekt har valgt at fokusere på, er celle-elimination, som også er den mest almindelige måde hvorpå cellerne interagerer. Celle-elimination er et fænomen, hvor en cellepopulation elimineres til fordel for en anden [Migeon, 2007]. Ofte kan der ske en celle-elimination, hvis der i kroppen er to cellepopulationer, hvor den ene bærer på en mutation og den anden population er rask. Her vil de raske celler i langt de fleste tilfælde få en vækstfordel, der gør, at den pågældende cellepopulation vokser. Man har dog også observeret tilfælde, hvor celle-selektionen ikke er til fordel for de normale celler. I sygdommen Adrenal Leukodystrophy har de mutante gener en udviklingsfordel, så de udvikler sig hurtigere end de normale celler. Det samme gør sig gældende for de hurtigtvoksende cancerceller [Migeon, 2007]. Skæv X-inaktivering For det meste hvis kvinder i nogle af deres celler har en mutation på det ene X-kromosom, vil celle-selektionen virke til deres fordel, og det er dette fænomen, vi har valgt at fokusere på i dette projekt. Fænomenet benævnes skewing of X-inactivation, hvilket på dansk kan oversættes til skæv X-inaktivering. Skævheden består i, at der i cellepopulationen vil være en ulige fordeling af aktive og inaktive X-kromosomer fra faderen og moderen. Nedenfor ses en Side 25 af 78

26 figur, der illustrerer henholdsvis den primære tilfældige og den sekundære ikke-tilfældige X- kromosom inaktivering. I den tilfældige X-kromosom inaktivering vil der være en ligelig fordeling af celler med enten det maternelle eller paternelle X-kromosom som værende aktivt. I den ikke-tilfældige X-kromosom inaktivering kan der forekomme en selektion til fordel for det paternelle X-kromosom. De maternelle X-kromosomer vil da blive inaktiveret og inaktiveringsmønsteret vil blive skævt. I nogle tilfælde betegnes skævheden som ekstrem, da kvinderne her vil have det samme X-kromosom aktivt i mindst 90 % af cellerne. Skævheden kan være et resultat af tilfældigheder, men der er større sandsynlighed for, at skævheden skyldes at celler med X-kromosomer der ikke bærer en mutation, får udviklings- og vækstfordele, hvorved den ene cellepopulation reduceres (se figuren nedenfor). Figur 9. Skæv X-kromosom-inaktivering i kvinder. Figuren illustrerer at skæv X-kromosom inaktivering kan forekomme enten fra en primær tilfældig inaktivering eller en sekundær ikke-tilfældig inaktivering. Der er to aktive X-kromosomer i hunkønsembryonet, et fra moderen og et fra faderen (maternel eller paternel; X m (rød) og X p (blå)) Efter inaktivering, vil det ene X kromosom formes til et heterokromatint inaktivt X-kromosom vist på figuren med en mørk farvet cirkel. Cellerne er farvet enten blå eller røde for at vise hvilket X-kromosom der er aktivt. Selektiv vækst af enten den paternelle eller den maternelle cellepopulation fører til skæv X-inaktivering. Hvis der er en mutation i en allel på ét af de to X-kromosomer, så vil X-inaktiveringen ske til fordel for den raske allel. X-inaktiveringen kan dog også ske til fordel for den muterede allel. Kilde: Modificeret udgave. [Minks et al, 2008]. Side 26 af 78

27 I sjældne tilfælde kan skævheden skyldes en mutation i selve Xist-genet, hvilket resulterer i en ustabil inaktivering. Det kan også ske, at et af de to X-kromosomer slet ikke bliver inaktiveret [Migeon, 2007]. Det kan som nævnt både være godt og dårligt, at have et skævt inaktiveringsmønster, da en sådan skævhed både kan være til fordel for den syge og den raske allel på X-kromosomet. Hvis størstedelen af cellerne har valgt at inaktivere X-kromosomet med den raske allel, så vil det være det X-kromosom, som bærer på mutationen, der vil blive udtrykt i langt de fleste celler, og kvinden vil dermed have en større risiko for at udvikle sygdomme, der normalt kun udtrykkes i mænd [Migeon, 2007]. Det er formentlig dette der gør sig gældende, når flere undersøgelser peger på at bærere af X-bundne sygdomme, ofte udviser et skævt X- inaktiveringsmønster [Plenge et al, 2002; Wada et al, 2005 et al.]. Resultater fra disse undersøgelser tyder desuden på, at den skæve X-inaktivering kan være forskellig fra væv til væv, hvilket vi vil komme nærmere ind på senere. I følge Plenge et al er det ikke alle bærere af X-bundne sygdomme der har skæve inaktiveringsmønstre, og Andrew Sharp et al har desuden i en artikel fra år 2000 påvist, at det er helt almindeligt, at normale kvinder kan have skæve og også ekstremt skæve (90:10) inaktiveringsmønstre uden at være bærere eller vise tegn på sygdom. Deres forsøg indikerer desuden, at ældre kvinder har tendens til at være mere skæve end yngre kvinder. Disse opdagelser vil vi vende tilbage til i vores diskussion. Bestemmelse af X-inaktiveringsmønstre Den mest anvendte metode til bestemmelse af X-inaktiveringsmønstre i kvinder, er den androgene receptor-inaktiveringsanalyse. Det er helt essentielt, at man forstår principperne i denne forsøgsmetode, før man kan analysere de opnåede resultater, og vi har derfor valgt at medtage dette afsnit, hvor vi kort præsenterer den vigtigste teori i forbindelse med emnet. På X-kromosomet sidder det androgene receptor-gen HUMARA, hvis primære opgave er at fungere som DNA-bindende transkriptionsfaktor. Genet for den androgene receptor er mere end 90 kb langt, og befinder sig på position Xcen-q13 på kromosomet [Reviewed af Allen et al., 1992]. Genet indeholder en polymorf CAG-gentagelse i det første exon [Reviewed af Al- Side 27 af 78

28 len et al., 1992], og dette udnytter man, når man vil teste, om personer har et skævt inaktiveringsmønster i et bestemt væv (se figuren nedenfor) [Reviewed af Chitnis et al, 2000]. Det at genet er polymorft, betyder at den omtalte CAG-gentagelse i langt de fleste tilfælde, vil variere mellem de to X-kromosomer. CAG-sekvensen på det ene X-kromosom vil derfor oftest være lidt længere end den tilsvarende sekvens på det andet X-kromosom, og dette betyder, at man kan kende forskel på de to kromosomer. Der er dog tilfælde, hvor gentagelserne er identiske, og her må man opgive at teste inaktiveringsmønsteret, da man ikke kan adskille de to kromosomer ud fra de resultater man får. Disse tilfælde bliver af forskere kaldt for uninformative cases [Ozcelik et al., 2006]. Som tidligere nævnt er det inaktive X-kromosom methyleret flere forskellige steder, og et af de steder er ved CAG-gentagelserne i genet for den androgene receptor. Når DNA et er methyleret, kan det ikke klippes i stykker af methyleringssensitive restriktionsenzymer, og dette er en anden ting, man benytter sig af, når inaktiveringsmønsteret skal bestemmes. Første led i metoden hvor genet for den androgene receptor benyttes, er, at det DNA man vil undersøge, klippes i stykker af Hpa II og Hha I - to enzymer der netop er methyleringssensitive. Enzymerne er oplagte at bruge til dette forsøg, da de genkender CpG-dinukleotider, som de kun klipper i stykker, når disse er umethylerede. På denne måde kan man finde ud af, hvilket et X-kromosom der er aktivt og hvilket et, der er inaktivt, da det altid vil være det aktive, ikke-methylerede X-kromosom der klippes i stykker [Allen et al., 1992]. Nedenfor ses en figur som illustrerer, hvordan man med den omtalte metode udnytter, at genet for den androgene receptor er polymorft. Side 28 af 78

29 Figur 10. Denne figur illustrerer, hvordan man opformerer DNA vha. den androgene receptor inaktiveringsanalyse. Øverst kan man se de to alleler, X a og X i. X i er methyleret, og kan dermed ikke klippes i stykker af restriktionsenzymer. X a derimod er umethyleret og denne allel vil derfor blive klippet i stykker. Dette betyder at X a -allelen ikke kan opformeres vha. PCR, fordi DNA-polymerasen ikke kan lave et nyt DNA-stykke, som er langt nok til at blive opformeret. Når man er færdig med at køre PCR på det DNA man vil undersøge, vil det således kun være den inaktive allel som er blevet opformeret. Kilde: Modificeret udgave. [Minks et al., 2008]. Når enzymerne har gjort deres arbejde, skal DNA et opformeres vha. PCR (Polymerase Chain Reaction). Princippet i denne metode er kort fortalt, at man først udsætter DNA et for 95 grader så det denatureres. Herefter nedkøles blandingen, og der tilsættes primere, som er lavet således, at de vil binde sig til enderne af det DNA, der skal opformeres. Nu tilsættes polymerasen og nukleotiderne, så opformeringen kan gå i gang. De forskellige trin sker ved bestemte temperaturer, og hele processen gentages indtil man har nok DNA at arbejde med [Campbell & Reece, 7. udgave]. Når DNA et er blevet klippet i stykker af de omtalte restriktionsenzymer, og man har kørt PCR tilstrækkelig mange gange, kan man vælge at loade PCR-produktet på en gel eller man Side 29 af 78