Validation of f-calprotectin assay by ELISA

Transkript

1 - As well as comparison of collection- and extraction procedures. Karina Jensen BEP 2000 Advance ScheBo Quick-prep Quantum Blue

2 Validation of f-calprotectin assay by ELISA - As well as comparison of collection- and extraction procedures. Validering af f-calprotectin-analysen ved ELISA - samt sammenligning af opsamlings- og ekstraheringsmetoder. Karina Jensen, bn10s021, UCSJ. Professionsbachelorprojekt Klinisk vejleder: Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser, Klinisk Biokemisk Afdeling Køge. Institutionsvejleder: Kim Blanksø Pedersen. Bioanalytikerunderviser, UCSJ Campus Næstved. Antal anslag i rapporten: Reference til billeder på forside: Billeder af BEP 2000 Advance fra Siemens og Quantum Blue fra Bühlmann er taget på KBA, Køge i perioden: okt.-dec Billede med ScheBo Quick-prep blev lokaliseret på: calprotectin.aspx 1

3 Resumé Baggrund: Region Sjælland udfører, som den eneste region i Danmark, ikke f-calprotectinanalysen, i stedet sendes patientprøver til Randers for analyse. Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge Sygehus vil gerne imødekomme kliniske ønsker, fra blandt andet gastromedicinske afdelinger og specialister i regionen, og kunne tilbyde flere og bedre diagnostiske analyser. Formål: I dette projekt valideres f-calprotectin-analysen ved ELISA-metoden fra Bühlmann ved sammenligning med andre valideringer/studier til eventuel implementering samt vurdering af egnethed af forskellige ekstraheringsmetoder. Desuden vil hurtigtesten Quantum Blue fra Bühlmann blive undersøgt. Materialer og metoder: 47 patientprøver blev analyseret på BEP 2000 Advance med f-calprotectin ELISA-reagenskit. Afvejning og ekstrahering samt ScheBo Quick-prep fra Bühlmann blev anvendt som opsamlingsmetode. Hurtigtesten Quantum Blue blev ligeledes anvendt til analyse af f- calprotectin. Resultater: Metodesammenligning mellem ekstraheringer fra KBA, Randers og egne resultater på samme prøver gav en korrelationskoefficient (R 2 ) på 0,9646. Sammenligning af prøver opsamlet/ekstraheret ved afvejning og opsamlet/ekstraheret med ScheBo Quick-prep med ELISAreagenskit på BEP gav en R 2 på 0,9899. Intra- og intermediær præcision havde en gennemsnitlig CV % på 6,2 og 32,8. Resultatsammenligning af ELISA-reagenskit på BEP og ScheBo Quick-prep på Quantum Blue gav en R 2 på 0,9646. Konklusion: Der var en rigtig god overensstemmelse mellem resultaterne fra KBA, Køge og KBA i Randers. Implementering af analysen kan derfor anbefales i høj grad. Dog anbefales det, at analysere den intra- og intermediære præcision igen inden analysen implementeres. Der var også en god overensstemmelse mellem ELISA-reagenskit på BEP og ScheBo Quick-prep på Quantum Blue. Hurtigtesten anbefales dog ikke, da den ikke er bedre end ELISA på BEP. 2

4 Indholdsfortegnelse Resumé... 2 Forord... 4 Introduktion Afgrænsning Problemformulering Metodiske overvejelser... 7 Materialer og metoder Materialer Metoder Resultater Diskussion Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilag 1 - Analyseskema over anvendte referencer/ressourcer Bilag 2 - Protokoller Bilag 3 - Rådata

5 Forord Denne rapport er skrevet i forbindelse med det afsluttende professionsbachelorprojekt (PBP) på bioanalytikeruddannelsen fra oktober 2013 til januar Projektet blev udført i samarbejde med professionshøjskolen UCSJ og Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) på Køge Sygehus. Formålet med PBP er selvstændigt at kunne udvælge, tilrettelægge og gennemføre et udviklingsarbejde indenfor det bioanalytiske arbejdsområde med anvendelse af relevant videnskabelig tilgang (1). Professionsbachelorprojekt demonstrerer dette ved at udføre en validering af en biokemisk analyse samt en vurdering af egnet ekstraheringsprocedure. Den praktiske del af projektet blev udført på KBA, Køge. i samarbejde med medstuderende Mia Kühl Laursen og Trine Marie Jensen. Ligeledes er materiale- og metode- samt resultatafsnittene i rapporten skrevet i samarbejde med Mia Kühl Laursen og Trine Marie Jensen. En særlig stor tak til Kim Blanksø Pedersen. Bioanalytikerunderviser på UCSJ Campus Næstved, Heidi Hvid Nielsen. Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Anja F. Frederiksen. Specialist i specielanalyser på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Pierre Bouchelouce. Ledende overlæge på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Majken M. Jansen. Laborant på Klinisk Biokemisk Afdeling Køge, Signe Wildt. Overlæge på Gastromedicinsk Afdeling, Køge Sygehus samt KBA i Randers og hele KBA på Køge. Karina Jensen, bioanalytikerstuderende, januar

6 Introduktion Region Sjælland udfører, som den eneste region i Danmark (DK), ikke f-calprotectin-analysen, som anvendes til diagnosticering af kronisk inflammatoriske tarmsygdomme, på engelsk inflammatory bowel disease (IBD). Dette betyder for gastroenterologiske afdelinger, specialister m.v. må sende patientprøver ud af regionen for at få foretaget en analyse (2). På Gastromedicinsk Afdeling, Køge Sygehus sendes patientprøverne til KBA Randers Sygehus. Dette er både langsommeligt, på grund af at svar fra Randers kun sendes hver 14. dag, og omkosteligt da det er dyrere at få analyseret prøverne i en anden region (3). På opfordring af Signe Wildt, Overlæge på Gastromedicinsk Afdeling, Køge og i forbindelse med, at KBA, Køge gerne vil kunne imødekomme kliniske ønsker i form af flere og bedre analyser, blev det besluttet at validere f-calprotectin-analysen på apparatet BEP 2000 Advance (BEP) fra Siemens til eventuel implementering på KBA, Køge. Afgrænsning Fokus i opgaven vil ligge på egnethed af reagenskit og ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann ved ELISAsandwich metoden analyseret på BEP 2000 Advance fra Siemens samt hurtigtesten Quantum Blue ligeledes fra Bühlmann. Med hensyn til patientmateriale, har vi valgt kun at samle ind fra patienter (ptt.) tilknyttet Gastromedicinsk Afdeling, Køge, da vi vil være sikre på at have materiale indeholdende calprotectin. Patientprøver fra eksempelvis praktiserende læger udelukkes, da der er en risiko for at modtage for få patientprøver og prøver med manglende indehold af calprotectin. Årsagen til valg af disse reagenskit og apparaturer er, at vi har størst mulighed for at finde resultater foretaget af andre afdelinger og i litteraturen til sammenligning med egne producerede resultater. Dermed afgrænses der fra, om der er andre apparaturer, reagenskit fra andre producenter etc. der kunne være interessante at undersøge i forhold til f-calprotectin. Desuden vil fokus være rettet på om, analysen sætter andre krav til bioanalytikeren eller afdelingen i form af økonomi, ændret arbejdsgange eller efteruddannelse af personale. 5

7 Problemformulering Hvilke resultater fås ved at analysere f-calprotectin på BEP 2000 Advance fra Siemens med reagens fra Bühlmann, og stemmer disse resultater overens med resultater produceret på samme apparat og med samme reagens anvendt på KBA Randers? Hvordan er overensstemmelsen mellem resultater fra fæces-ekstrahering med reagens fra Bühlmann og ekstrahering med ScheBo Quick-Prep fra Bühlmann, og vil ScheBo Quick-Prep være velegnet som opsamlingsmetode for patienten? Hvordan stemmer resultater fra ScheBo Quick-Prep produceret på BEP 2000 Advance overens med resultater opnået ved anvendelse af hurtigtesten Quantum Blue fra Bülhmann, og kunne denne være et alternativ til analyse af f-calprotectin på BEP? IBD dækker over sygdommene Crohns sygdom (Morbus Crohn, på engelsk: Crohn s Disease, CD) og blødende tyktarmsbetændelse (colitis ulcerosa, på engelsk: Ulcerative colitis, UC). Incidensen for CD er firedoblet de sidste 20 år (4) og ligger på 600 ppt. (5). Tilfælde af UC er fordoblet de sidste 20 år (4), og ligger på 500 ptt. årligt (6). I DK er prævalensen for både CD og UC ptt. (5,6). Ætiologien bag IBD er stadig ukendt, men man mener blandt andet, at den kronisk inflammatoriske tilstand skyldes et autoimmunt respons, især hos genetisk disponerede. Desuden ses CD hyppigere hos rygere, og UC hos eksrygere (5,6). Sygdommen viser sig oftest i års alderen i form af mavesmerter, diarré, vægttab samt pus og blod i afføringen (5,6). Symptomerne skyldes inflammation opstået i colon ved UC (6). Ved CD kan inflammation opstå et eller flere steder, og hvor som helst, i gastrointestinalkanalen, men oftest ses inflammation i den sidste del af ileum, colon og rectum (5), se figur 1 (7). Figur 1: Illustration af hvor i mave-tarmkanalen IDB forekommer ved henholdsvis CD og UC (7). Diagnosticering af IBD kan stilles ved hjælp af biopsier fra rectum, koloskopi af og biopsi fra colon samt kapselendoskopi og MR-skanning til undersøgelse af tyndtarmen. Blod- og fæcesprøver kan også indikere sygdomsaktivitet. Måling af calprotectin i fæces kan differentiere mellem raske og syge samt mellem IBD og irritabel tarmsyndrom (på engelsk Irritable Bowel Syndrome, IBS), som er 6

8 en funktionel lidelse og altså ikke en sygdom, men oftest med lignende symptomer (8). IBD er kronisk, sygdomsaktiviteten kan dog nedsættes med anti-inflammatoriske og immunsupprimerende lægemidler. I svære tilfælde kan en operation være nødvendig, hvor dele af eller hele tarmen fjernes (5,6). Til behandlingsmonitorering af IBD er f-calprotectin-analysen også velegnet (8,9). Calprotectin: Calprotectin er en akut fasereaktant, som deltager i immunresponset ved inflammation. Calprotectin findes i især neutrofile granulocytter, men også i makrofager, monocytter mm. (10). Molekylet er opbygget af to underenheder kaldet myeloid-related protein-8 (MRP8) og myeloidrelated protein-14 (MRP14), se figur 2 (11). Disse giver calprotectin en særlig evne til at binde calcium og zink, afhængig af bindingen får calprotectin forskellige egenskaber. Figur 2: Calprotectinmolekyle med de to underenheder MRP8 (til venstre) og MRP14 (til højre). MRP8 består af 93 aminosyrer, og MRP14 består af 114 aminosyrer og er bundet sammen med ikke-kovalente bindinger. MRP8 er den aktive del af molekylet, mens MRP14 regulerer MRP8 (10), (11). Ved binding til calcium ændres molekylets form og de hydrofobe flader vendes ud mod proteiner såsom casein kinase, der regulerer blandt andet transduktionssignaler, DNA-reparation og - transkription mm. Zink er også med til formation af calprotectin og spiller en stor rolle ved at hæmme vækst af blandt andet B.burgdorferi ( Borrelia-bakterie) og C.albicans (candidagærsvamp). Desuden hæmmes calprotectinets cytotoksiske aktivitet (10). Metodiske overvejelser Én af årsagerne til at f-calprotectin ikke er blevet analyseret på KBA i Køge er, at der ikke findes noget korrekthedsmateriale, altså en golden standard, som vi kan referere til og sammenligne resultater med (2,11,13). KBA i Randers udførte en validering af f-calprotectin på BEP 2000 Advance i 2012 (13) og har fulgt producenten af ELISA-reagenskittet Bühlmann s vejledning for f- 7

9 calprotectin-analysen (12). I mangel på metrologisk sporbarhed valgte KBA i Randers at kontrollere analysens korrekthed ved at medtage eksterne kontroller, som skulle ligge indenfor en standarddeviation (SD) på 2 (13). Til validering af f-calprotectin-analysen skal der undersøges hvorvidt f-calprotectin kan analyseres på BEP 2000 Advance ved brug af ELISA-sandwichmetoden (se figur 3) ved siden af de daglige rutineprøver, hvorvidt vi får de samme resultater på analysen, som dem vi har valgt at sammenligne os med, i dette tilfælde Klinisk Biokemisk Afdeling på Randers sygehus (12,13). Desuden undersøges der om implementeringen af analysen medfører ændringer for personale, apparatur, økonomi og afdeling. Ydermere vil opsamlings- og ekstraheringsmetode med ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (15) blive undersøgt, vurderet og sammenlignet med afvejning og ekstrahering. ScheBo Quick-prep vil desuden blive undersøgt både i forhold til egnethed af analyse på BEP, holdbarhed af ekstraheringsbuffer samt selve opsamlingen af fæcesprøve af pt. Point of Care Testing (POCT) - apparaturet Quantum Blue fra Bühlmann (15) til hurtig test af f-calprotectin, vil også blive sammenlignet med ELISA-metoden, både egne resultater og resultater fra KBA, Randers. F-calprotectin - Analyseprincip: Til måling af calprotectin i fæces anvendes enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) på BEP. ELISA er en sandwichmetode, som anvendes til at detektere antigener eller bestemmelse af antistoffer ved enzymer (12), se figur 3. Figur 3: Illustration af de forskellige trin i en ELISA-analyse. Karina Jensen På calprotectin-komplekser bindes antigenerne til de specifikke, monoklonale antistoffer coatet på overfladen af brøndene i mikrotiterpladen. Et andet antistof konjugeret med enzymet horseradish peroxidase (HRP) tilsættes og reagerer med antigen. Substratet tetramethylbenzidin (TMB) tilsættes og reagerer med enzymet HRP, som herved 8

10 udvikler et blåt farvestof. Ved tilsætning af stopreagens forskydes ph-værdien og substrat/enzymreaktionen blokeres således. Herved skifter farven fra blå til gul. Intensiteten af farvesignalet er proportionalt med mængden af calprotectin i fæces. Absorbansen aflæses fotometrisk ved 450 nm (12). For at målesignalerne kan omregnes til koncentrationer, skal der udarbejdes en kalibreringskurve. Målesignalerne udtrykkes i OD-værdier (optical density) og er den værdi, der registreres af ELISAreaderen. Kalibratorerne, medfølgende reagenskittet fra Bühlmann, har en kendt koncentration på 30, 90, 300, 900 og 1800 μg/g (12). Kalibreringskurven dannes således ud fra OD-værdien hen ad x-aksen og koncentrationer af calprotectin i kalibratorer op ad y-aksen i en semilogaritmisk graf ved at benytte en 4-parametrisk datamodel. Denne model benyttes for at få en mere lineær graf, som ligner kalibreringskurven i produktvejledningen fra Bühlmann (2). Ud fra kalibreringskurven kan der nu angives koncentrationer på prøver med ukendt koncentration af calprotectin. Ifølge Bühlmann har f-calprotectin-analysen en sensitivitet og en specificitet på henholdsvis 84,4 % og 94,5 %. Andre studier viser samme tendens ved måling af f-calprotectin ved ELISA-metoden, dog ikke med reagenskit fra Bühlmann, men fra andre producenter og på forskelige apparaturer (8, 12, 16, 17). Denne undersøgelse viste foruden, at analysen er sensitiv og specifik, også at den er egnet til differentiering af IBD og IBS. ScheBo Quick-prep fra Bühlmann er et opsamlingsrør med en doseringstip til opsamling af fæces, se figur 4 til højre (18). Røret indeholder ekstraheringsbuffer, som fæces kommes direkte i. Figur 4: ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (18). Denne metode skulle gøre det nemmere at opsamle fæces for pt. og nemmere/hurtigere for bioanalytikeren at analysere på BEP eller Quantum Blue, idet trin i ekstraheringsproceduren springes over (12, 14). 9

11 Quantum Blue (figur 5) fra Bühlmann er en hurtigtest hvis princip også er et sandwich immunoassay. Her er de monoklonale antistoffer coatet på testmembranen. Calprotectin-antigener binder sig til Figur 5: Hurtigtesten Quantum Blue fra Bühlmann. Billede taget på KBA i Køge i perioden okt.-dec Figur 6: Testkassette tilhørende Quantum Blue. Fortyndede fæcesekstraheringer tilsat brønd yderst til højre på kassetten. Stregerne i det ovale felt er henholdsvis kontrolstreg og teststreg. Billede taget på KBA i Køge i perioden okt.-dec antistofferne, hvorefter et andet detektions-antistof konjugeret med guld kolloider binder sig til komplekset på membranen. Intensiteten af testlinjen afhænger af, hvor meget calprotectin der er bundet, se figur 6, og måles og kvantificeres af Quantum Blue Readeren (15). Litteratur til sammenligning af apparaturet med BEP vil den fundne litteratur blive vurderet i diskussionen (19, 20). Patientmateriale: Der skal indsamles fæcesprøver med ukendt koncentration af calprotectin fra ptt. tilknyttet Gastromedicinsk Afdeling, Køge Sygehus fra ptt. tilknyttet afdelingen. Ptt. herfra afleverer to fæcesprøver, hvoraf den ene bliver sendt til analyse på KBA, Randers, og den anden modtager vi til analyse. Disse prøver bliver ekstraheret efter Bühlmann s procedure (12). Ved modtagelse opsamles og ekstraheres prøverne og opbevares ved -18 C indtil analysering. Pools blandes af patientmateriale og anvendes til udregning af den intra- og intermediære præcision. Pools inddeles efter lav-, middel- og høj koncentration af calprotectin efter anbefalingerne fra Bühlmann (12). Anvendt statistik Til validering af f-calprotectin-analysen anvendes de samme parametre, som KBA, Randers. Korrekthed er målesandheden, altså hvor tæt egne resultater ligger på den sande (vedtagne) værdi og er et udtryk for den systematiske variation. Korrektheden beregnes og vurderes ved sammenligning af egne og andre laboratoriers resultater samt analysering af certificerede eksterne kontroller og sammenligning af disse resultater med andre laboratorier (21). Korrekthed 10

12 udtrykkes i bias og er den gennemsnitlige afvigelse i forhold til den sande værdi. Vi vil sammenligne resultater med KBA, Randers, måle på kalibratorer samt lav- og høj kontrol fra Bühlmann og eksterne kontroller fra Equalis (22) og sammenligne disse resultater med Randers. Til metodesammenligningen vil der blive udarbejdet et x-y plot med lineær regression og et differensplot i Excel. X-y plottet er udtryk for den lineære sammenhæng mellem to variabler, i dette tilfælde mellem egne resultater og resultater fra KBA, Randers. Sammenhængen mellem de to variabler udtrykkes i R - korrelationskoefficienten, og den skal ligge så tæt på 1 som muligt (21). Differensplottet udtrykker gennemsnittet af egne og Randers målte værdier hen ad x-aksen og differenser mellem egne og Randers målte værdier op ad y-aksen. Værdier fordelt tæt på nullinjen (x-aksen) udtrykker et perfekt differensplot (21). Der blev valgt at anvende samme måleområde som KBA, Randers på μ/g. Måleområdet er fastsat ud fra anbefalingerne fra Bühlmann (12). Bias er den målte gennemsnitlige afvigelse fra den sande værdi, eller targetværdi. I dette projekt er vores targetværdi bl.a. resultaterne fra de eksterne kontroller fra Equalis målt i Randers. Præcision er udtryk for den tilfældige præ-, post- og analytiske variation. Her vil det være den analytiske variation der vil blive fokuseret på. Der vil altid være små variationer i analyseapparaturets målinger. På laboratoriet udtrykkes variationerne som impræcision og beregnes ud fra spredningen (SD) og variationskoefficienten (CV %) (21). SD er spredningen mellem gentagne målinger på samme prøve, altså hvor langt resultaterne spreder sig fra den målte middelværdi. CV % anvendes til at vurdere hvor meget resultaterne spreder sig fra hinanden, og er altså et udtryk for den gennemsnitlige variation i forhold til middelværdien (23). Impræcisionen beregnes ud fra intraseriel impræcision (repetérbarhed), hvor der foretages 5 dobbeltbestemmelser på den samme prøve (pools) med henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration i samme serie. Der beregnes også intermediær præcision, hvor der foretages dobbeltbestemmelse på samme prøve (pools) med lav- middel- og høj koncentration over minimum 10 forskellige serier med forskellige reagenslot. Bühlmann opgiver en intramediær præcision på 4 % og intermediær præcision på < 15 %. Randers fik en intramediær CV % på 9,87 %, 4,26 % og 3,24 % for henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration og en intermediær CV % på < 20 %, som de har fastlagt som krav til analysen (13). 11

13 Parret t-test fortæller om forskellen i de målte middelværdier i to grupper af data, der hører sammen parvis. Der vurderes hvorvidt der er en signifikant forskel på det målte eller ej (H1- eller H0-hypotesen). Er teststørrelsen stor, indikerer det en signifikant forskel i opsamlingsmetoderne. Er teststørrelsen lille, skyldes det blot tilfældigheder, og metoderne vil derfor være lige gode at anvende (23). Den parrede t-test vil blive anvendt til sammenligning af afvejnings- og ekstraheringsmetode ved ELISA-procedure og ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann og til vurdering af bufferens holdbarhed i ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann både ved C og ved 5 C. Dette er for at se om temperatur påvirker resultaterne, når ptt. får opsamlingskittet ScheBo Quick-prep med hjem. Bühlmann anbefaler, at prøven tages, opbevares ved 2-8 C og analyseres indenfor 6 døgn (15). Projektet deles op i 4 forsøg. Her er hvad vi vil gøre med forsøgene præsenteret nedenfor i tabel 1 for at gøre det mere overskueligt: Forsøg Formål Prøvemateriale Beregninger 1 Metodesammenligning - korrekthed Sammenligning af resultater produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP med resultater fra KBA, Randers produceret ved ELISAreagenskit fra Bühlmann. Sammenligning af egne resultater produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP med resultater fra eksterne kontroller fra Equalis, interne kontroller og kalibratorer fra Bühlmann produceret ved ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP. Apparaturets analytiske præcision Intramediær præcision på henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration i samme serie. Intermediær præcision på henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration fordelt på 10 serier. 2 Egnet ekstraheringsmetode Sammenligning af afvejnings- og ekstraheringsmetode ved ELISA-procedure og ekstraheringsmetoden ScheBo Quick-prep fra Bühlmann 3 Holdbarhed af ekstrakt Vurdering af holdbarheden af fæces efter ekstrahering. Prøverne analyseres yderligere efter 24, 48 og 72 timer. 4 Quantum Blue Sammenligning af resultater ved ELISA-reagenskit på BEP med resultater produceret med ScheBo Quick-prep på Quantum Blue fra Bühlmann. 30 patientprøver med calprotectinkoncentrationer indenfor måle-området ( μg/g). Opsamlet, afvejet og ekstraheret med hænderne og med ScheBo Quick-prep. 2 Eksterne kontroller fra Equalis med ukendt koncentration af f-calprotectin. 2 Interne kontroller med en lav og en høj værdi samt 5 kalibratorer (A-E) fordelt på henholdsvis 30, 90, 300, 900 og 1800 μg/g calprotectin. 5 dobbeltbestemmelser på den samme prøve (pool). 10 dobbeltbestemmelser på den samme prøve (pool). 10 udvalgte patientprøver fordelt i måleområdet (resultater fra forsøg 1). 20 patientprøver fordelt i måleområdet (fra protokol 1). 30 patientprøver ekstraheret med ScheBo Quick-prep. Differensplot og lineær regression. Bias %. Middelværdi, SD og CV %. Standardkurve ved 4- parametrisk logistikprogram. Middelværdi, SD og CV %. Middelværdi, SD og CV %. Parret t-test. Parret t-test. Differensplot og lineær regression. 12

14 Materialer og metoder Materialer Reagenser/utensilier/apparatur Til forsøg 1 blev der anvendt kit fra Bühlmann (lot nr. 1945, 1552, ) indeholdende ekstraheringsbuffer, mikrotiterplade coatet med anti-calprotectin, vaskebufferkoncentrat, inkubationsbuffer, kallibratorer A til E, en lav og en høj kontrol, mærket enzymkonjugat, TMBsubstrat og stopopløsning. Af apparaturer blev der anvendt BEP 2000 Advance fra Siemens til analysering af prøverne, centrifuge til centrifugering af prøver og pools og mini-rotator til homogenisering af suspensionerne. Til forsøg 2. De samme reagenser blev anvendt som i forsøg 1. Derudover blev der anvendt ScheBo Quick-prep fra Bühlmann til ekstrahering af fæces (lot nr. 2313), spidsrør med skruelåg, 82 x 13 mm afpipetteringsglas med låg fra Sarstedt og 2 ml rør. Af apparaturer blev der anvendt BEP 2000 Advance fra Siemens til analysering af prøverne, centrifuge til centrifugering af prøver og pools, mini-rotator og mini-shaker til homogenisering af suspensionerne, analysevægt ( mg) til afvejning af fæces og brug af stinkskab under ekstraheringen. Til forsøg 3 blev der anvendt fem ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (lot nr. 2313) fra forsøg 1 til ekstrahering af patientprøve 5 med en calprotectinkoncentration på 243 μg/g (resultat fra KBA, Randers). Her blev BEP 2000 Advance fra Siemens også anvendt til analysering samt centrifuge. Til forsøg 4 blev der anvendt et kit fra Bühlmann indeholdende ekstraheringsbuffer, Chase-buffer, som er en fortyndingsbuffer (15), test cartridge og RFID chip card (lot nr XHR). Yderligere blev der anvendt ScheBo Quick-prep fra Bühlmann (lot nr. 2313) fra forsøg 3 og spidsrør med låg. Apparaturet Quantum Blue fra Bühlmann blev anvendt til analysering af prøverne. Herudover anvendtes mini-shaker til homogenisering af prøverne. 13

15 Metoder I november 2012 blev der indsamlet 18 patientprøver i form af fæces fra ptt. tilknyttet Medicinsk Gastroenterologisk Afdeling, Køge i perioden. Ptt. afleverede to fæcesprøver hver, én blev sendt til Randers, og den anden modtog vi på KBA, Køge. Desuden modtog vi fæcesprøver og ekstraheringer til analyse i Køge fra 29 ptt., som allerede var analyseret i Randers. Vi kendte altså koncentrationerne på alle patientprøver, som var fordelt mellem μg/g, inden vi selv analyserede prøverne (se bilag 2 for detaljeret fremgangsmåde og bilag 3 for analyseresultater). Ved forsøg 1 blev ekstraheringerne fra Randers analyseret. Inden analysering på BEP 2000 Advance, blev Calprotectin ELISA-kittet stuetempereret. Prøverne blev optøet og vendt på mini-rotator i 10 minutter. Derefter overført til afpipetteringsglas med låg og centrifugeret i 5 minutter ved 3000 g. Alle reagenser, kalibratorer og kontroller blev vendt for homogenisering. Reagenser, patientprøver, kontroller og kalibratorer blev placeret på apparatet ifølge reagens/kontrol oversigten. Efterfølgende blev BEP 2000 Advance igangsat ved hjælp af afdelingens D4-procedure (24), og de opnåede data blev udskrevet og bearbejdet som beskrevet i metodiske overvejelser. Der blev desuden fremstillet pools til præcisionsforsøg (intermediær og intramediær præcision) ud fra først nævnte ekstraheringsmetode fra flere patientprøver med kendte koncentrationer. Disse blev centrifugeret og 300 µl blev udportioneret til 2 ml rør. Koncentrationerne til pools på henholdsvis lav, middel og høj blev valgt ud fra indlægssedlen til ELISA-kittet fra Bühlmann, for at kunne sammenligne resultater (12). Ved forsøg 2 blev prøverne mærket med prøvenummer. Et stativ, et tomt 10 ml rør og en podepind blev placeret på præcisionsvægten, hvorefter denne blev tændt. Der blev afvejet mellem 50 og 100 mg fæces. Vægten på prøven blev vurderet og noteret i et skema. Et stykke af podepinden blev klippet af og ekstraheringsbuffer blev tilsat (49 X vægtvolumenet), hvorefter låget blev skruet på røret. Prøven blev homogeniseret på mini-rotator i 30 minutter, og efterfølgende blev 1 ml af ekstraktet overført til et 2 ml rør mærket med prøvenummer. Prøven blev frosset ved -20 C. 14

16 ScheBo Quick-prep blev mærket med samme prøvenummer. Doseringstippen blev dyppet i røret med fæcesprøven til rillerne i tippen var fyldt op med prøvematerialet og blev derefter placeret i røret. Røret lukkes ved at trykke podepinden ned og dreje med urets retning. Herefter blev ekstraktet homogeniseret på mini-shaker i 30 sekunder. Efter prøven havde hvilet i 10 minutter, blev den igen homogeniseret på mini-shaker til fæces var fuldstændig væk fra doseringstippen. Prøven blev frosset ved -20 C. Prøverne blev optøet og klargjort til analysering som i forsøg 1. Ved forsøg 3 blev der udvalgt en fæcesprøve med en kendt koncentration af calprotectin. Denne prøve blev ekstraheret (som ved forsøg 1) til 5 ScheBo Quick-Prep mærket med køl og 5 ScheBo Quick-prep, som derefter hver især blev overført til et afpipetteringsglas og disse blev mærket med stuetemperatur. Prøverne blev natten over opbevaret henholdsvis i køleskab og ved stuetemperatur. Efterfølgende blev prøverne analyseret på BEP 2000 Advance ved henholdsvis 0, 24 og 48 timer. Ved forsøg 4 blev de ekstraherede ScheBo Quick-prep fra Bühlmann analyseret på Quantum Blue. Ekstraktet blev fortyndet i forholdene 1:150 ved at blande 3 ml fortyndingsbuffer med 20 µl af ekstraktet i et spidsrør med låg. Herefter blev prøven homogeniseret på mini-shaker i ca. 10 sekunder og hvilte efterfølgende i 10 minutter. 80 µl af det fortyndede ekstrakt blev afpipetteret til brønden i testkassetten og efter 15 minutter blev denne aflæst i Quantum Blue (15). Resultaterne blev nedskrevet i et skema til videre bearbejdning. 15

17 Resultater Forsøg 1 De 5 kalibratorer (A-E, i skema S1-S5) fordelt på henholdsvis 30, 90, 300, 900 og 1800 μg/g calprotectin havde en CV % 5 % bortset fra målingerne på kalibrator A (S1), som havde en CV % på 59,2, se tabel 2. Tabel 2: Oversigt over targetværdier, målte middelværdier samt SD og CV %. Standard Target Middel SD CV % S ,5 59,2 S ,8 4,7 4,9 S ,4 14,2 5,0 S ,8 11,5 1,3 S ,1 354,1 21,0 Ud fra de målte værdier blev der dannet en standardkurve med et 4-parametrisk logistikprogram, hvorfra målinger på ukendte prøver kan beregnes, se tabel 3. Tabel 3: Standardkurve fra kørsel 4 på BEP. 16

18 % Bias (egne målinger på BEP) Egne målte middelværdier Validation of f-calprotectin assay by ELISA Resultater fra ekstraheringer foretaget på KBA, Randers og egne producerede resultater på de samme prøver på KBA, Køge gav en korrelationskoefficient (R 2 ) på 0,9646. Den lineære sammenhæng er illustreret i tabel 4 nedenfor, se desuden rådata anvendt til metodesammenligning i bilag 3. Tabel 4: Den lineære regression mellem ekstraheringer fra Randers og egne målte middelværdier af samme ekstraheringer fra Randers. Metodesammenligning Værdier fra Randers y = 0,9898x + 6,6024 R² = 0,9646 Metodesammenligning Lineær (Metodesammenligning) Differensplottet i tabel 5 udtrykker gennemsnittet af egne og Randers målte værdier hen ad x- aksen og differenser mellem egne og Randers målte værdier op ad y-aksen. Bortset fra de 2 værdier liggende på -27,0 og 29,5 holder de andre målte værdier sig indenfor en bias % på 20. Tabel 5: Differensplot over ekstraheringer fra Randers og egne målte middelværdier af samme ekstraheringer fra Randers. 40,0 % Bias (differensplot) 30,0 20,0 10,0 0,0-10,0-20,0-30, Randers % Bias (differensplot) 17

19 % Bias ScheBo Quick-prep Validation of f-calprotectin assay by ELISA Sammenligning af målinger på prøver opsamlet og ekstraheret ved afvejning og opsamlet og ekstraheret med ScheBo Quick-prep med ELISA-reagenskit fra Bühlmann på BEP. Den lineære sammenhæng mellem de 9 prøveresultater havde en R 2 på 0,9899, se tabel 6. Tabel 6: Den lineære regression mellem opsamling og ekstrahering ved afvejning og ved ScheBo Quick-prep foretaget på KBA, Køge. Metodesammenligning y = 1,1636x - 19,055 R² = 0, Metodesammenligning Lineær (Metodesammenligning) Afvejning Differensplottet i tabel 7 udtrykker gennemsnittet af resultater opnået på opsamling og ekstrahering ved afvejning og opsamling og ekstrahering med ScheBo Quick-prep foretaget på KBA, Køge. I differensplottet ses de målte værdier hen ad x-aksen ved afvejning og differenser mellem de målte værdier af afvejning og ScheBo Quick-prep op ad y-aksen. Der ses en bias % mellem - 38,9 og 52,3, se bilag 3 for rådata. Tabel 7: Differensplot over opsamling og ekstrahering ved afvejning og ved ScheBo Quick-prep foretaget på KBA, Køge. 60,0 40,0 20,0 % Bias (differensplot) 0,0-20,0-40,0-60, Afvejning % Bias 18

20 Til måling af korrekthed med eksterne kontroller fra Equalis blev differencen (bias %) målt til at være -33,3 % for kontrol 36A og -22,2 % for kontrol 36B. For kontrol 47A og B fik vi en bias % på henholdsvis -20,6 og -25,2. Målingerne på de 2 eksterne kontroller viste altså en forskel på over 20 bias %, som vist i nedenstående tabel 8. Der ses desuden en stor spredning (SD) og en høj CV % i de målte værdier i forhold til target opgivet af Equalis (22). Tabel 8: Resultater af målinger på eksterne kontroller. Equalis Middelværdi Target Bias % SD CV % middelværdi 36A 28,5 42,7-33,3 10,0 35,2 36B ,2 24,0 20,2 47A ,6 36,0 18,4 47B 432, ,2 102,9 23,8 De 2 interne kontroller medfølgende reagenskit fra Bühlmann havde en lav og en høj calprotectinkoncentration. Target, altså den værdi, vi burde få ved analysering, er opgivet i reagenskittets datasheet, se tabel 9. Analysen gav en SD på 7,1 og en CV % på 6,6 for den lave kontrol. Analysering af den høje kontrol gav en SD på 14,1 og en CV % på 3,6. I tabel 8 ses en middelværdi for LOW og HIGH på 108,25 og 395,875 μg/g. Middelværdien angivet i tabel 8 er middelværdien for alle analyseserierne, hvor både kontroller og kalibratorer blev analyseret. Tabel 9: Resultater fra analyser af kitkontroller fra Bühlmann. Kit kontroller Target Middel Bias % SD CV % LOW ,25 0,2 7,1 6,6 HIGH ,875-13,8 14,1 3,6 Beregning af intramediær præcision på 5 dobbeltbestemmelser på samme pool med henholdsvis lav-, middel- og høj koncentration i samme serie gav en intramediær præcision på 3,7 SD for pool med lav koncentration, 23,4 SD for pool med middel koncentration og en SD på 197,1 for pool med høj koncentration. CV % var Tabel 10: Skema over middel- og SD-værdi samt CV % ved den intramediære præcision. Middel SD CV% 70,1 3,7 5,3 756,5 23,4 3,1 1933,5 197,1 10,2 på henholdsvis 5,3, 3,1 og 10,2, se tabel 10 til højre. For detaljeret dataoversigt se, bilag 3. 19