Linda Kjærgaard Professionsbachelorprojekt

Transkript

1 Kortisol i spyt Af Linda Kjærgaard

2 Bioanalytikeruddannelsen, University College Sjælland Campus Næstved Kortisol i spyt Af Linda Kjærgaard Modul 14 Professionsbachelorprojekt I-vejleder: Tina Elley, Lektor UCSJ Campus Næstved K-vejleder: Heidi Hvid Nielsen, Bioanalytiker underviser Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge Sygehus Antal anslag: Forsidebilledet er fundet [ ] på: w=1280&bih=685&tbm=isch&tbnid=07uvvzjstbypym:&imgrefurl= 520to%2520draw%2520hypothalamus&docid=TNeWJCW26JYW0M&itg=1&imgurl= cancersisterhood.com/brenda_blog_photos/women-and-their- Doctors.jpg&w=320&h=420&ei=nXjdUNvmN8WM4ATGXA&zoom=1&iact=rc&dur=210&sig= &page=5&tbnh=151&tbnw=119&ndsp=36&ved=1t:429,r:68,s:100,i:208&tx= 72&ty=58 Figur ved sidetal er fundet [ ] på: 2

3 3

4 Resumé Baggrund Borderline Personality Disorder (BPD) er en psykisk lidelse, der hovedsagligt rammer kvinder. Studier har vist at personer med BPD har forhøjet kortisolniveau, som muligvis skyldes en dysregulering af hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen. Formål Psykiatrien Region Sjælland ønsker en validering af metoden til måling af kortisol i spyt til denne patientgruppe, derfor udføres en del-validering af denne metode. Herunder indgår præanalytisk vejledning i forbindelse med indsamling af prøvematerialet. Materiale og metode Inter- og intramediær præcision, genfinding samt metodesammenligning blev testet med kittet til måling af kortisol fra Calset på Cobas e411. Til metodesammenligning blev 20 spytprøver analyseret på Cobas e411 sammenlignet med Rigshospitalet hvor samme 20 prøver blev analyseret på Cobas Modular 170. I alt blev 31 spytprøver indsamlet med Salivetter (Sarstedt). Til de forskellige forsøg blev der udvalgt prøver i både lavt, middel og højt kortisolkoncentration. Resultater Metodesammenligning mellem Køge sygehus og Rigshospitalet, viser en med et måleområde på 4,1-15,3 nmol/l for Køge sygehus, og 7,7 nmol/l med et måleområde på 4,2-15 nmol/l for Rigshospitalet. Ved genfindingsforsøget ses en på 8,8 nmol/l genfindingsprocent varierende fra 4,50 % til 10,30 %. Ved intermediær præcision er fundet CV % på 10,49 %, 8,66 % og 8,12 % ved 3 pools med forskellig kortisolkoncentration. Samme forhold gør sig gældende for intramediær præcision hvor CV % er 6,88 %, 5,03 % og 5,32 %. Konklusion Dette er kun dele af en validering, det vil derfor være nødvendigt at udføre flere forsøg for, at kunne implementere metoden på Biokemisk afdeling, Køge Sygehus. Resultaterne viser bedre værdier end dem der opgivet fra producenten. 4

5 Indholdsfortegnelse Resumé... 4 Baggrund... 4 Formål... 4 Materiale og metode... 4 Resultater... 4 Konklusion... 4 Indholdsfortegnelse... 5 Forord... 7 Introduktion... 8 Indledning og problembaggrund... 8 Borderline Personality Disorder Stress og kortisol Hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen Problemformulering Elektrokemiluminescensimmunassay Afgrænsning Metodiske overvejelser Metodesammenligning Intermediær præcision Intramediær præcision Genfindingsforsøg Præanalyse Indsamling af prøver Materialer og metoder Materialer Apparatur Reagenser Forsøgsmaterialer Metode

6 Prøvetagning Kontroller Kalibrator Korrekthedstest Præcision Resultater Forsøg A: Metodesammenlinging Forsøg B: Genfindingsforsøg Forsøg C: Intramediær præcision Forsøg D: Intermediær præcision Diskussion Metodesammenlinging Genfindingsforsøg Intramediær præcision Intermediær præcision Serum/plasma og spyt Udviklingsperspektiv Holdbarhed BPD patienten Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag Bilag 1: Analyseskema over anvendt litteratur Bilag 2: Rådata til resultater Metodesammenligning Genfindingsforsøg Kontroller kalibrering Bilag 3: Vejledning til prøvetagning af spyt

7 Forord Jeg har i samarbejde med Rie Rokbøl Larsen og Kathrine Bungaard udført det praktiske arbejde på Klinisk Biokemisk afdeling, Køge sygehus som et led i afslutningen på uddannelsen til bioanalytiker på UCSJ Campus Næstved. Projektet henvender sig endvidere til medstuderende, bioanalytikere, vejledere samt andre med interesse for validering af analysemetoder, som i dette projekt omhandler kortisol i spyt. I forbindelse med det praktiske forløb, vil jeg gerne sige tak til Klinisk Biokemisk Afdeling Køge sygehus for, at have taget godt imod os på afdelingen og stillet de nødvendige interesser til rådighed for os, samt tak til personalet for den vejledning og hjælp de har givet os. Især i forbindelse med indsamling af spytprøver. Tak til Lisbeth Andreasen, afdelingsbioanalytiker på Klinisk Biokemisk Afdeling på Rigshospitalet, samt personalet på Klinisk Biokemisk Afdeling på Rigshospitalet, for analysering af vores spytprøver til metodesammenligning. Til sidst vil jeg gerne rette en stor tak til mine vejledere. I-vejleder Tina Elley, klinisk uddannelseskoordinator og underviser, UCSJ Campus Næstved og K-vejleder Heidi Hvid Nielsen, bioanalytiker underviser på Klinisk Biokemisk Afdeling, Køge Sygehus, for vejledning igennem projektforløbet både den praktiske del såvel som rapportskrivningen. 7

8 Introduktion Indledning og problembaggrund Kortisol er det vigtigste glukokortikosteroid, da det har betydning i forhold opretholdelsen af flere forskellige kropsfunktioner. Kortisol har længe været brugt ved psykobiologiske studier, da kortisol er en markør for stress, angst og depression (1). Ved transport af kortisol i blodet, bindes kun 90 % til kortikosteoridbindende globulin (CBG) og albumin. De resterende 10 % cirkulerer ubundet rundt i blodbanen, og kan reagere frit med receptorerne (2). Kortisol virker ved hjælp af en negativ-feedback mekanisme på hypofysen og hypothalamus (3). Stress syntetiserer til øget udskillelse af kortisol. Normalt måles kortisol i serum fra blodprøver, eller urinprøver. Der ses en tydelig døgnvariation i udskillelsen af kortisol. Koncentrationen af kortisol er højest om morgenen og faldende i løbet af dagen, heraf er den oprindelige koncentration fra morgenstunden, cirka halveret om aften (4). Det er derfor vigtigt, at tage højde for prøvetagningstidspunkt ved indsamling af prøver til kortisolmålinger (2). Patienters kortisolniveau bruges til diagnosticering af binyrernes, hypofysens og hypothalamus funktion. Koncentrationen af kortisol i serum kan bruges til monitorering af en række sygdomme, som skyldes over- eller underproduktion af kortisol eller til monitorering af forskellige behandlingsformer. Måling af kortisolniveau i urin benyttes til påvisning af Cushings syndrom 1, da udskillelsen af kortisol i urin ikke er påvirket af kortisoludskillelsens døgnrytme. Nyere studier har vist, at ved diagnosticering for Cushings syndrom er det bedre at foretage nat målinger på kortisol i spyt, end målinger af kortisol i urin, da en række stressfaktorer kan give øgede koncentration af kortisol (3). Denne metode, hvor spytprøver anvendes, har vist sig at være effektiv i forhold til prøvetagning på børn, psykiatriske patienter og personer, hvor stressfaktorer kan påvirke binyrebarken og øge 1 Cushings syndrom er en sjælden sygdom som skyldes overproduktion af binyrebarkhormonet kortisol. 8

9 koncentrationen af binyresteorider (3). Dette projekt omhandler en del-validering af metoden til kortisolmålinger i spyt, da analysen muligvis kan anvendes for forskellige patientgrupper. En aktuel patientgruppe er personer med Borderline Personality Disorder (BPD), som er en psykisk lidelse. Psykiatrisk Forskningsenheden i Region Sjælland arbejder med projekter omhandlende sindslidelser, med det formål at forbedre diagnosticering og behandling. Resultaterne for disse projekter skal forbedre kvaliteten i forhold til patientbehandling, og være til gavn for det enkelte individ og samfundet (5). Projektet indebærer et specialiseret tilbud, som er nødvendigt for at opnå stabile forandringer hos de hårdest ramte BPD-patienter. Behandlingen består i mentaliseringsbaseret terapi, som er en kombination af individuel- og gruppeterapi. BPD patienternes evne til at forstå og fortolke egne og andre følelser, tanker og intentioner måles ved hjælp af neuropsykologiske testmetoder i forbindelse med, at udvikle og stabilisere patienterne. Dette projekt omhandler metodevalidering til måling af kortisol i spyt, da det i denne sammenhæng er vigtigt at undersøge biologiske markører, fordi det kan have betydning for BDP patienter i forhold til prøvetagning og behandling med henblik på individets ønsker samt behov. Patienter med BPD vil derfor have lettere ved, at tage prøverne uden alt for mange psykiske forstyrrelser (6). Hvis valideringen af metoden til måling af kortisol i spytprøver lykkedes, vil metoden blive brugt i forskningsprojektet ved Psykiatrisk Forskningsenheden i Region Sjælland. BPD patienter skal tage én spytprøve på 7 forskellige tidspunkter af døgnet for, at måle døgnvariationen af stresshormonet kortisol. Prøverne tages hjemmefra og opbevares i eget køleskab. Efterfølgende afleveres prøverne på psykiatrisk afdeling, hvor de køle centrifugeres og fryses til 80 grader på Psykiatrisk Center Sct. Hans Hospital, Forsknings Instituttet for Biologisk Psykiatri, indtil prøverne skal analyseres (5). 9

10 Borderline Personality Disorder Borderline Personality Disorder(BPD) er en lidelse der tidligere blev betegnet som en psykose eller neurose. BPD er en undergruppe af emotionel ustabil personlighedsforstyrrelse i ICD 10-diagnose-systemet. Den korrekte betegnelse for BPD er emotionel ustabil personlighedsstruktur, borderline type. Den anden undergruppe hedder emotionel ustabil personlighedsstruktur, impulsiv type. Disse psykiske sygdomme ligner meget hinanden, dog er BPD en alvorligere psykisk sygdom, idet BPDpatienter er usikre på deres egen identitet og har en meget impulsive adfærd. Man regner med at ca. 1-2 % af befolkningen lider af BPD, og hyppigheden er dobbelt så stor hos kvinder som hos mænd. Personer med BPD har ofte skiftende intense forhold til andre, og en gensidig afhængighed af venner og familie, men kan hurtigt blive såret og tage konsekvent afstand. For at kunne blive diagnosticeret med BPD, skal sygdommen have været til stede fra barndommen eller ungdommen. Sygdommen er ikke beslægtet med velkendte psykiske sygdomme eller skizofrene, og heller ikke stemningslidelserne mani og depression. BPDpatienter har tendens til stress, da de føler et pres fra omgivelserne, hvilket kan fører til voldsomme humørsvingninger (6). Undersøgelser af BPD-patienter omhandlende årsagen til sygdommen, har resulteret i en teori, hvor faktorer i opvæksten skulle spille en central rolle. Patienter med BPD har typisk være udsat for fysisk eller psykisk overlast i løbet af deres barn- eller ungdom, som for eksempel seksuelt misbrug, omsorgssvigt eller adskillelse fra forældrene. De omtaler derfor ofte deres forældre negativt og undersøgelser har vist at BPD er den lidelse hvor patienterne har det mest negative syn på deres forældre, hvilket kan hænge sammen med deres manglende evne til at opfatte omgivelserne. Dog har undersøgelser vist at BPD-patienter har tendens til bedring jo ældre de bliver, dette kan hænge sammen med at deres personlighed modnes i løbet af årerne. 10

11 Mange BPD-patienter har tendens til depression, disse depressioner har deres eget særpræg og kan derfor skelnes fra andre depressionslignende-tilstande, og det har desuden været foreslået, at BPD skyldes hjerneskade eller en fejlfunktion ved hjernen, men det er der endnu ikke belæg for. Nyere undersøgelser på tvillinger viser at arv kan spille en rolle. Når den ene tvilling lider af BPD, er der større chance for at den anden tvilling også får den psykiske lidelse, når de er enæggede end tveæggede (6). Stress og kortisol Stress er en belastningstilstand, idet tilstanden afhænger af dels den belastning man får fra omgivelserne, en selv, den individuelle følsomhed og den måde man selv reagerer på. Stress kan opleves på mange forskellige måder og stadier, for eksempel kortvarig, akut stress som nogle får når de lider af eksamensangst, hvor der sker en øget dannelse af noradrenalin i kroppen. Noradrenalin er vores kamphormon. Langvarig, kronisk stress, som kan skyldes en længerevarende følelse af for meget pres for omgivelserne. Ved denne form for stress sker en øget produktion af kortisol, som er vores stresshormon. Det er især den sidstnævnte, der har konsekvenser for vores helbred. Stress kan komme til udtryk både ved psykiske symptomer i form af træthed, angst, dårlig koncentrationsevne og ubeslutsomhed. Fysiske symptomer i form af hovedpine, uro i kroppen og røsten og til sidst også symptomer i form af adfærdsændringer, som søvnløshed og misbrug. I løbet af de seneste år er de biologisk mekanismer ved stress blev klarlagt i vidt omfang. Stress skyldes nogle komplicerede ændringer i vores hormoner, dette ses især ved stigning af kortisol og ved signalsubstanser, som især adrenalin, noradrenalin og serotonin. Det er vigtigt at forebygge stress, da det både kan have fysiske og psykiske følger, dette kan være ved vejledning og terapi, som folk skal have kendskab til ved hjælp af deres uddannelsesinstitution eller arbejdsplads, så man allerede på de tidspunkter kan tænke over hvor meget man belaster sin krop og sind. Derudover har det også betydning for 11

12 samfundsøkonomien i form af flere sygedage, hospitalsophold, misbrug og pensionering (7). Kortisol er et fedtopløseligt steroidhormon, som binder en receptor i cytoplasma hvorefter komplekset translokeres til cellekernen, hvor det regulerer gentransskriptionen. Ved kronisk stress øges udskillelsen af kortisol fra binyrebarken. Denne nye metabolisme medfører som regel en langvarig krise, som stimuleres til øget syntese af de enzymer der benyttes i glykoneogenesen (8). Glykoneogenesen finder sted i leverens og i mindre grad nyrernes celler, hvor den har en afgørende betydning for tilførsel af glukose, til væv og andre organer, når der ikke tilføres nok kulhydrat fra tarmen (9). Studier viser at nogle psykiske sygdomme, som for eksempel depression og posttraumatisk stress skyldes en dysregulering af HPA-aksen, og derfor kan det tænkes at en dysregulering af HPA-aksen også kan spille en rolle hos BPD-patienter. Hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen Hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen som forkortes HPA-aksen efter det engelske navn Hypothalamic-Pituitary-adrenal, er det centrale styrings og reguleringssystem i organismen der forbinder det centrale nervesystem med det hormonelle system. HPA-aksen spiller en central rolle i forbindelse med kroppens psykologiske respons til stress. HPA-aksen er en feedback-mekanisme der omfatter hypothalamus, hypofysen og binyrerne. De vigtigste hormoner som spiller ind på HPA-aksen er kortikotropin-frigivende hormon(crh), arginin-vasppressin (AVP) og adenokortikotropin (ACHT). Når kroppen udsættes for stress frigives kortikotropin fra hypothalamus, dette hormon får hypofysen til at frigive adenokortikotropin (ACTH), som efterfølgende frigives til blodbanen, hvor det transporteres til binyrebarken som frigiver stresshormoner, især kortisol. Frigivelsen af kortisol til kredsløbet har en række effekter, herunder forhøjelse af blodglukose, samt en negativ påvirkning af immunsystemet idet kortisol forhindrer frigivelsen af immunotransmitter (10)(11). 12

13 Figur 1 viser HPA-aksen (10) Problemformulering Er det muligt at implementere analysen for spyt-kortisol på Klinisk biokemisk afdeling, Køge sygehus. Implementeringen forudsætter: Godkendt del-validering af analysen, hvor korrekthed og præcision undersøges eksperimentielt. Samt fremstilling af vejledning til indsamling og efterfølgende korrekt håndtering og opbevaring af prøvematerialet. Elektrokemiluminescensimmunassay Elektrokemiluminescensimmunassay (ECLIA) bygger på et kompetitivt analyseprincip. Prøvemateriale inkuberes med kortisol specifikt biotinyleret antistof, mærket med Ruthenium. Ruthenium er en effektiv markør, da det har høj følsomhed, og derfor udviser lysglimt selv ved lave koncentrationer. Kortisol fungerer i denne sammenhæng som anti-gen. Kortisol i prøven vil binde sig til det kortisol specifikke biotinyleret antistof. Derefter tilsættes biotin til prøven hvorpå der er bundet kunstig kortisol. Den kunstige 13

14 kortisol vil binde til de ledige pladser på anti-stoffet, hvor kortisol fra patientprøven ikke har bundet. Derefter tilsættes paramagnetiske mikropartikler coated med streptavidin. Biotin og streptavidin har stor affinitet overfor hinanden, og derfor opstår en stærk binding mellem disse, hvis de kommer i kontakt med hinanden. Figur 2: viser ECLIA-analyseprincip, hvor kortisol fra patienten konkurrer med kunstigt kortisol på biotin via et kompetitivt analyseprincip. Efter denne binding af biotin til streptavidin, bliver prøvematerialet trukket igennem en flowcelle indeholdende Procell (TPA). Denne flowcelle består af elektroder, en magnet samt en fotomultiplikator. Fotomultiplikatoren sørger for at signalet bliver forstærket. Elektroderne sørger for at elektronerne vandrer gennem flowcellen og magneten tiltrækker de paramagnetiske mikropartikler, hvortil der er bundet biotin. Alt andet skylles væk, dette betyder at kortisol fra patientprøven forsvinder. Ruthenium mister en elektron pga. strøm tilslutning, og da det hele er opløst i TPA afgiver TPA en elektron til ruthenium. Ruthenium har nu overskud af energi, og denne energi afgives via et lyssignal. 14

15 Figur 3 : viser processen fra prøven komme ind til fotomultiplikatoren til der udsendes signal. Da apparatet kender mængden af kunstig kortisol samt hvor meget ruthenium der er tilsat, kan der beregnes hvor stort et lyssignal der kan forventes at komme. Da kortisol fra patientprøven har optaget pladser på antistoffet mærket med ruthenium, har biotin ikke bundet til disse pladser og de vil derfor ikke udsende lyssignal. Derfor er det vigtigt at tilsætte patientprøven først, så det når at binde sig til ruthenium, inden biotin optager pladserne. Da patientprøven bliver vasket væk med Cleancell til sidst i processen, vil disse bindingssteder forblive tomme og ikke udsende noget signal (12). Signalet kan derefter omregnes til nmol/l vha. en masterkurve der er fremstillet fra producentens side. Afgrænsning Ved dette forsøg er der ikke foretaget en fuld validering, da dette indebærer alt fra indsamling af prøver på patienter, vejledning til prøvetagning, opstilling af måleinterval, måleområdets øvre og nedre grænse, måleusikkerheder, svarafgivelse samt anden klinisk relevans. Dette studiets formål er at dokumentere, at metoden opfylder de krav der er til den ønskede anvendelse. På grund af begrænset tidshorisont og økonomi er der derfor i denne opgave kun beskrevet dele af en validering. Da kittet til måling af kortisol i spyt er CE-mærket, er dette i overensstemmelse med fælleseuropæiske krav til sikkerhed, sundhed og miljø (13). Det har derfor ikke været nødvendigt at foretage en fuld validering, da man ved denne mærkning har lov til at benytte andres resultater hvis samme CE-mærket kit er anvendt. Der afgrænses fra de mange muligheder der er i forbindelse med spytprøver, men kun lagt vægt på de fordele og ulemper der er i forbindelse med prøvetagning og analysering 15

16 i forhold til Borderline patienter. Der ses bort fra svarafgivelse, som kun vil blive nævnt kort i diskussion og perspektivering, da det ikke er det bærende element i denne opgave hvordan svarene afgives. Metodiske overvejelser For at kunne implementere analysen for måling af kortisol i spyt på klinisk Biokemisk afdeling i Køge, skal der udføres en række eksperimentalt arbejde. I dette projekt skal fire forsøg udføres, som en forudsætning for implementering af analysen. De fire valgte forsøg lever op til krav, som er opstillet til validering af analysemetoder på D4, som er gældende for Klinisk Biokemisk afdeling i Køge (14); metodesammenligning med Rigshospitalet, Præcisionforsøg, hvorunder to del forsøg skal udføres; Intramediær præcision og intermediær præcision samt et genfindingsforsøg. Metodesammenligning Metodesammenligning skal ske i samarbejdes med Klinisk biokemisk afdeling på Rigshospitalet. Ifølge krav for validering fra biokemisk afdeling i Køge og statistisk litteratur bør patientprøver sammenlignes med en allerede godkendt og veldokumenteret metode, hvor niveauerne bør være fordelt mellem lav, middel og høj(14). Efter krav fra Rigshospitalet er der i dette forsøg benyttet 20 spytprøver til sammenligning. Efter analysering af prøverne skal relevant statistik, som Bland-Altman plot og XY-plot udføres på rådata. Ud fra disse statistiske beregninger kan der dannes et overblik over hvor meget niveauerne flytter sig i forhold til apparaterne indbyrdes (14). Bland-Altman plot som også kaldes et differensplot benyttes, når man vil skabe et hurtigt overblik over sine resultater, og se om de to metoder måler samme værdier. Ud fra Bland-Altman plot vil det være muligt at vurdere om variationer på resultaterne er systematisk afhængig af apparaturet. F.eks. vil det være muligt at se om prøveresultaterne er enten systematisk højere eller lavere på Rigshospitalet end på Køge sygehus. Dette kan have betydning for opstilling af referenceinterval, for hvis 16

17 målingerne f.eks. er generelt lidt højere på Rigshospitalet skal rigshospitalets referenceinterval ligger lidt højere end på Køge sygehus. Dette overblik kan også skabes ved et XY-plot, dette kan forklares som f(x) skal være det samme som y=f(x). Hvis dette ikke stemmer overens, skyldes det at resultaterne ikke er ens. Hvis XY-plottet viser en lineær sammenhæng mellem resultaterne laves lineær regression, da dette fastlægger sammenhængen mellem de to apparaturer. Ved lineær regression udregnes korrelationskoefficienten, angives med et R, som er et udtryk for variation mellem de to apparaturer. Hvis R 2 giver resultatet 1, betyder dette at der er en lineær sammenhæng mellem apparaturerne. Hvis R 2 derimod giver 0 er det et tegn for at der ikke er nogen sammenhæng mellem apparaturerne. Ved at benytte en parret t-test undersøges hvorvidt fra de to apparaturer er identiske. En forudsætning for at kunne udføre en t-test er dog at resultaterne er normalfordelte (15). Intermediær præcision Ved intermediær præcision ses på repeterbarhenden. Der måles på de 3 samme prøver, med hver især enten lav, middel eller højt niveau flere gange i træk for, at mindske variation af resultat så meget som muligt. Hver måling skal udføres så identisk som muligt. Efter analysering skal, CV % og SD beregnes. Intramediær præcision Ved intramediær præcision ses på reproducerbarheden. Her skal der måles på de 3 samme prøver, med hver især enten lav, middel eller højt niveau flere gange, men over flere dage. Der vil her være variation af faktorer der kan spille ind på apparaturet og derfor også på resultatet. Der skal kalibreres og apparatet genopstartes. Der skal efter analysering udregnes, CV % og SD. Og der vil herved kunne ses, hvor meget resultatet varierer i løbet af dagene (15)(16)(17). Resultaterne fra intermediær- og intramediær præcision skal sammenlignes med resultater fra Cobas Cortisol-vejledning (3). 17

18 Genfindingsforsøg Ved genfindingsforsøg anbefales det fra validering af analysemetoder fra Køge sygehus, at forsøget udføres i 4 analyseserier med 4 forskellige niveauer. Der fremstilles en pool hvori koncentrationen bestemmes. Ud fra denne koncentration kan der beregnes hvad slutkoncentrationen efter analysering er, hvis der tilsættes en kendt kortisolkoncentration fra kontrolmateriale (14). Herefter kan genfindingen beregnes (16). Præanalyse Udover det eksperimentelle arbejde, skal der udarbejdes en præcis vejledning for prøvetagning, da en korrekt prøvetagning kan sikre så korrekt prøvemateriale som muligt. I den forbindelse skal der udarbejdes en QR-kode, som sender patienten direkte til en prøvetagningsvideo ved scanning med smartphone eller iphone. QR-koden skal fremstilles ved hjælp af vejledning fra internettet. QR koden er fremstillet ud: Da denne metode ikke er en udbredt metode til måling af kortisol i spyt, er det nødvendigt med indsamling af empiri. Denne empiri vil blive søgt via forskellige databaser som for eksempel Ncbi Pubmed, Google Scholar, biblioteker.dk hvor relevante videnskabelige artikler vil blive udvalgt. For at komme frem til disse artikel skal forskellige søgeord kombineres som for eksempel; Cortisol in saliva analysis, Saliva and cortisol borderline, HPA-axis depression. Der udover blev der også benyttet fagbøger, websider samt fagblade. Indsamling af prøver Nyere studier viser at spytprøver kan benyttes til måling af kortisol i stedet for blodprøver. Denne metode er hensigtsmæssig i mange tilfælde, da det er en non-invasiv metode. Hvilket også gør det lettere at indsamle prøver, da spytprøverne kan tages hjemmefra og patienterne ikke behøver møde op hos enten egen læge eller på et ambulatorium, for at få taget en blodprøve (3). Patienter med BPD vil derfor have 18

19 lettere ved, at tage prøverne uden alt for mange psykiske forstyrrelser. Patienterne går til konsultation hos egen læge eller på ambulatoriet, hvor de vil få udleveret en pakke, med det antal Salivetter, den pågældende patient skal tage samt en prøvevejledning. Salivetterne er markeret med dato, navn og cpr. Nr. som patienten skal tjekke nøje inden prøvetagning, da det skal stemme overens. Materialer og metoder Materialer Apparatur Efter indsamling af prøvematerialet blev spyttet centrifugeret på centrifuge Eppendort 5810R, serie: 5811AH ved 1000 g i to minutter. Prøvematerialet blev herefter afpipetteret over i en prøve kop med prod. nr og låg nr , med pipette nr , µl. Efterfølgende blev alle prøve analyseret på Cobas e 411 modulet som er fremstillet i Tyskland, serie nr , Roche Diagnostics GmbH. Pipette spidser brugt på Cobas produktion nr. er og kopper (18). Efter centrifugering blev nogle af spytprøverne frosset ned i frys 1, Dometic FR400, Medical system KØ Prøverne til metodesammenligningen blev først benyttet senere og blev derfor frosset ned, da der skulle tages højde for holdbarheden (19) (20). Til metodesammenligningen blev de 20 prøver transporteret til Rigshospitalet i frossen tilstand, hvor de efterfølgende blev analyseret på Cobas Modular E170 (21). Reagenser Til måling af Kortisol blev et kit fra Calset benyttet. Reagenserne fra kit nr som er fremstillet af Cobas, Cortisol Calset, blev anvendt på cobas e411 til analysering af spytprøver. Til kalibrings reagenserne blev der tilsat mili-q vand. Ved analysering på Cobas e411 blev der i forvejen påsat reagenser, disse reagenser benyttes også til andre analyser. Disse reagenser er Procell prod. nr , Cleancell prod. nr , Sysclean prod. nr , holdbarheden for disse reagenser er 4 uger, samt 19

20 Syswash prod. nr , hvis holdbarhed er 1 uge. Control Precicontrol universal , fremstillet I Tyskland (18). Forsøgsmaterialer Prøvematerialet er spyt prøver fra 31 frivillige formodet raske personer. Hver forsøgsperson fik 2 Salivetter til indsamling af spyt. De to spytprøver fra samme forsøgsperson blev senere blandet sammen til en prøve, for at sikre nok prøvemateriale. Alle spytprøver blev taget med Salivette fra Sarstedt med lot nr Holdbarhed for kortisol i spyt er 5 dage ved 2-8 grader og 3 måneder ved -20 grader (3). Metode Til forsøg blev der brugt 31 x 2 spytprøver, som blev indsamlet i Salivetter på klinisk biokemisk afdeling, Køge sygehus. Forud for prøvetagningen blev der udarbejdet en prøvetagningsvejledning samt video så der sikres så korrekt indsamling af materialet som muligt. Der blev lavet QR-kode, som ved scanning med mobiltelefon sender én direkte videre til en film på youtube.com, hvor prøvetagningen vises grafisk. Prøvetagning Spytprøverne blev taget ved at tykke på en bomuldsrulle [4] i 2 min, til den var mættet med spyt. Derefter blev bomuldsrullen anbragt i det indre rør[2] og proppen blev skruet på[1]. Prøven blev centrifugeret i 2 min ved 1000 g for, at spyttet blev separeret fra det øverste rør og til bunden af det store rør[3]. Og prøver sættes på køl. Spytprøven er holdbar 5 dage, ved 2-8 grader og 3 måneder ved 20 grader (3). Prøvetagningsbeholderen består af 3 bestanddele samt en blå prop. 20

21 Salivette (Sarstedt) består af 4 dele. 1. en blå prop. 2. Det indre rør hvori bomuldsrullen ligger. 3. det ydre rør som spyttet overføres til ved centrifugering. 4. bomuldsrullen som skal mættes med spyt. For mere udførlig vejledning og prøvetagningsvideo se bilag nr. 3 eller scan denne QRkode: Kontroller Til fremstilling af kontroller blev der tilsat 3000µl mili-q vand til kontrolreagenset, hvorefter det blev blandet forsigtigt, for ikke at skabe luftbobler. Blandingen henstod på bordet i 15 minutter med låg på. Der blev herefter afpipetteret 200µl kontrolreagens til 15 prøvekopper. 14 af kontrolprøverne blev frosset ned ved -20 grader, mens den 15énde prøve blev benyttet til analysering den pågældende dag. Der blev brugt kontroller hver dag, inden analysering af spytprøverne (18). Kalibrator Til fremstilling af kalibratore blev der tilsat 1ml mili-q vand til kalibratorreagenset, derefter blev indholdet blandede forsigtigt for ikke at skabe luftbobler. Blandingen henstod på bordet i 15 minutter med låg. Der blev herefter afpipetteret 200µl kalibratorreagens til 5 prøve kopper. Derefter blev de 4 lagt på frys ved 20 grader, og den 5. prøve blev benyttet til analysering den pågældende dag (3). 21

22 Korrekthedstest A. Metodesammenligning 200µl spyt blev afpipetteret til en prøve kop, der var nummeret med det korrekte prøve nr. Dette blev gjort med alle 31 prøver. Prøverne blev analyseret på Cobas e411. Da resultater fra alle 31 spytprøver var fremkommet, blev de opdelt efter kortisolkoncentration på lav, middel og høj. 20 spytprøver fordelt på de 3 niveauer blev sendt til rigshospitalet til metodesammenligning, hvor de blev nedfrosset til -80 C indtil analysering på Cobas Modular E170 (21). Data blev behandlet ved at beregne den procentvise afvigelse samt afvigelsen i nmol/l for, at se hvor stor forskel der var på de to resultater. Tallene blev indsat i et histogram for, at vurdere om der var normal fordeling, XY-plot og Bland-Altman plot. B. Genfindingsforsøg Der blev fremstillet en pool af spyt fra 2 forsøgspersoner for, at sikre nok prøvemateriale. 1500µl fra hver spytprøve blev afpipetteret til en prøve kop. Poolen blev analyseret 5 gange i træk på Cobas e411. Herefter blev der udregnet volumen af spyt og kortisol for, at finde den ønskede værdi til prøverne. I alt blev der lavet 4 pools med forskelligt niveau af kortisol. Til den 1 pool blev der tilsat 375 µl spyt og 25µl kortisol. 2 pool blev der afpipetteret 385µl spyt og 15µl kortisol. 3 pool blev der afpipetteret 390µl spyt og 10µl kortisol. 4 pool blev der afpipetteret 395µl spyt og 5µl kortisol. De 4 pools blev analyserede 2 gange i træk på Cobas for at lave dobbeltbestemmelse, for at sikre at præcisionen var høj. Derefter blev der beregnet og genfindingsprocent. 22

23 Præcision C. Intramediære Ud fra de kendte kortisol koncentrationer fra alle prøverne blev der fremstillet tre pools med spyt, som hver især havde enten lav-, middel- eller høj kortisol koncentration. Der blev afpipetteret 500µl spyt fra 4 prøver, så hver pool kom til at indeholde 2000µl prøvemateriale. De tre pools blev nummeret med nr. og niveau, hvorefter de tre pools blev analyseret 10 gange samme dag på Cobas e411. Udfra resultaterne blev der beregnet, SD og CV %. Resultaterne blev derefter sammenlignet med repeterbarhed fra analysevejledning fra Cobas (3). D. Intermediære Ud fra de kendte kortisol koncentrationer fra alle prøver, blev der fremstillet 3 pools med enten lav-, middel- eller høj koncentration. De tre pools indeholdte hver 1000µl prøvemateriale, der blev afpipetteret 250µl spyt fra 4 prøver. Dette blev gjort med alle tre pools. Der blev taget højde for holdbarheden af kortisol i spyt, da der skulle analyseres over flere dage og holdbarheden er 5 dage ved 5-8 grader, idet der blev lavet to pools af hver koncentration, som blev frosset ned indtil analysering. De tre pools blev analyseret på Cobas e411, 10 gange over flere dage. Der blev beregnet, SD og CV %. Disse resultater blev sammenlignet med intermediær præcision fra analysevejledning Cobas (3). Resultater I dette afsnit vil resultaterne fra metodesammenligning mellem Klinisk Biokemisk Afdeling Køge sygehus og Rigshospitalet bliver præsenteret. Derudover vil resultaterne fra intramediær præcision, hvor samme prøve er målt flere gange på samme dag, intermediær præcision hvor samme prøver er målt over flere dage samt genfindingsforsøg hvor en kendt mængde kortisol ønskes at blive genfundet, blive præsenteret. Rådata samt resultater af kontroller og kalibratore er vedlagt i bilag nr

24 Difference (nmol/l) Kortisol konc. efter måling på Køge sygehus (nmol/l) Linda Kjærgaard Professionsbachelorprojekt Forsøg A: Metodesammenlinging På figur 4 ses et XY-plot hvor resultaterne fra 20 forsøgspersoners spytprøver fra klinisk biokemisk afdeling på Køge sygehus er sammenlignet med Rigshospitalet. X-Y plot Kortisol konc. efter månling på Rigshospitalet (nmol/l) Figur 4: Viser et X-Y plot hvor x-aksen er koncentrationen i nmol/l af de 20 målte spytprøver på Rigshospitalet og y-aksen er koncentrationen i nmol/l af de samme 20 spytprøver målt på Køge sygehus. Der er derud over indsat en linje med koordinaterne 0;16, 0;16, for at illustrere hvordan vores resultater fordeler sig i forhold til linjen som skærer i koordinatet 0;0. På figur 5 ses sammenhængen mellem og differencen efter metodesammenligning med Rigshospitalet. Resultaterne er illustreret ved hjælp af et Bland-Altman plot. 5,5 3,5 Bland Altman plot 1,5-0,5-2,5-4, Middelværdi (nmol/l)) 24

25 Figur 5: Viser sammenhængen mellem og differensen efter metodesammenligning med Rigshospitalet. Ud af x-aksen ses som er gennemsnittet af den målte koncentration fra de sammenlignedes spytprøver på hhv. Køge sygehus og Rigshospitalet. Y-aksen viser differensen mellem målingerne på Køge sygehus og Rigshospitalet. Forsøg B: Genfindingsforsøg På tabel 1 ses resultater fra 5 målinger af en pool der er fremstiller ud fra 2 forsøgspersoner. 1 måling 2 måling 3 måling 4 måling 5 måling CV % (nmol/l) (nmol/l) (nmol/l) (nmol/l) (nmol/l) 8,85 9,00 8,63 9,10 9,03 8,92 2,09 Tabel 1: viser beregninger af og CV % til genfindingsforsøg. På Tabel 2 ses den beregnet kortisolkoncentration som prøven forventes at have efter analysering på cobas e411. Måling 1 og 2 viser de målte koncentrationer ud fra dobbeltbestemmelse. Der er ud fra disse målinger, beregnet, SD og CV %. Pool Beregnet Værdi nmol/l Måling 1 nmol/l Måling 2 nmol/l SD CV % 1 29,98 25,53 28,24 26,89 1,91 7, ,56 19,95 21,04 20,45 0,75 3, ,34 15,16 17,17 16,17 1,42 8, ,13 12,16 12,84 12,5 0,48 3,85 Tabel 2: viser beregninger samt resultater fra genfindingsforsøg. Der er her beregnet den forventede koncentrationen af kortisol efter analysering på Cobas e411. På figur 6 ses sammenhængen mellem den beregnede kortisolkoncentration og den målte kortisolkoncentration. Der er målt på 4 forskellige pools med forskellige kortisolkoncentrationer. 25

26 Kortisol Koncentration nmol/l Linda Kjærgaard Professionsbachelorprojekt Genfinding Pool Beregnet værdi nmol/l Målt værdi nmol/l Figur 6. viser sammenhængen mellem beregnet kortisolkoncentration og målt koncentration. På X-aksen ses hvilken pool det er, fra pool 1-4. Og y-aksen viser koncentrationen af kortisol i nmol/l. På tabel 3 ses den procentvise afvigelse mellem den beregnede koncentration og den efterfølgende målte koncentration. For at udregne dette blev formlen for relativ målefejl benyttet Relativ målefejl:. F.eks: = - 10,30 %. Pool nr. Beregnet værdi (nmol/l) Måltværdi (nmol/l) Den sande værdi i % 1 29,98 26,89-10, ,56 20,45-4, ,34 16,17-6, ,13 12,50-4,50 Tabel 3: viser hvor stor en procentvis forskel der er mellem den beregnede koncentration og den efterfølgende analyserede koncentration. Forsøg C: Intramediær præcision På tabel 4 ses resultaterne som er beregnet ud fra 3 pools med hver især enten lav, middel og høj kortisolkoncentration. Disse 3 pools er målt 10 gange på samme dag og, SD og CV % er beregnet ud fra disse 10 x 3 målinger. 26

27 Beregninger Lav Middel Høj 5,37nmol/L 8,50nmol/L 13,68nmol/L SD 0,37nmol/L 0,43nmol/L 0,73nmol/L CV % 6,88 % 5,03 % 5,32 % Tabel 4: viser resultaterne fra intermediære præcisions forsøg. Der er foretaget 10 målinger på 3 forskellige spytprøver. Herefter blev der beregnet, SD og CV %. Forsøg D: Intermediær præcision På tabel 5 ses resultaterne fra intermædiær præcisions forsøg. Her er målt på 3 spytprøver med enten lav, middel eller højt kortisolniveau. Prøverne er analyseret 10 gange over flere dage. Der er ud fra målingerne målt, SD og CV %. Beregninger Lav Middel Høj 5,20 8,26 13,05 SD 0,55 0,72 1,06 CV % 10,49 8,66 8,12 Tabel 5: viser resultaterne fra intermediære præcisions forsøg. Der blev målt på samme 3 prøver med enten lav, middel eller højt niveau over flere dage. Hvorefter der blev beregnet, SD og CV %. Diskussion I dette afsnit vil resultaterne fra metodesammenligning, intermediær- og intramediær præcisions forsøg blive sammenlignet med tidligere projekters samt artiklers resultater. Der ses på fordele og ulemper i forhold til patienten samt udviklingsperspektiver. Metodesammenlinging For at kunne sammenligne resultaterne i denne opgave med noget der i forvejen er valideret, bliver resultaterne sammenlignet med Cobas Cortisol-vejledning. Da resultaterne i denne opgave er lavet ud fra 3 niveauer, lav, middel og høj vil disse værdier sammenlignes med de i forvejen godkendte resultater der ligger nogenlunde i 27

28 samme niveau. Ifølge cobas Cortisol-vejledning sammenlignes Elecsys Cortisol-analysen med en kommercielt tilgængelig analyse for kortisolmåling i spyt. Vogeser et. al.(2006) har foretaget en metodesammenligning, hvor kortisol i spyt sammenlignes med ID-LC-MS/MS på engelsk kaldet isotop dilution liquidchromatography-tandem mass spectrometry (19). Massespektrometri er en metode til meget præcist at bestemme en molekyles masse. Massespektrometri benyttes for det meste til måling proteiner (8). Til denne metodesammenligning blev der benyttet 20 spytprøver og 12 tilfældige prøver fra et forsøg, hvor reference område skulle undersøges. Efter analysering ved både ID-LC-MS/MS og Cobas immunoassay blev der observeret en generelt lavere koncentration af kortisol ved analyse på ID-LC-MS/MS. Cobas immunoassay ID-LC-MS/MS Roche Cobas Køge Sygehus Modular 170, Rigshospitalet 4,4 nmol/l 1,8 nmol/l 8,8 nmol/l 7,7 Måleområde Måleområde Måleområde Måleområde 1,5-12,6 nmol/l 0,6-9,8 nmol/l 4,1-15,3 nmol/l 4,2-15 nmol/l Tabel 6 Tabel 6 viser Vogeser et. al.(2006) resultater fra hhv. ID-LC-MS/MS og Cobas immunoassay samt resultaterne fra Klinisk biokemisk afdeling og Rigshospitalet, hvor 20 spytprøver er målt på Cobas e411 på Køge sygehus og Cobas Modular 170 på Rigshospitalet. Ud fra disse resultater kan der ses forskellige måleområder. Da spytkortisol koncentrationer generelt er meget lave, kan der ud fra ID-LC-MS/MS måleområde og forventes størst præcision, da der ved denne metode måles på den total koncentration. Disse højere koncentrationer ved immunoassay både ifølge Vogeser et. al. (2006), forsøget på Køge sygehus og Rigshospitalet kan skyldes krydsreaktioner. I artiklen af Carrozza R. et. Al. (2012) Assessment of salivary free cortisol levels by liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in patients treated with mitotane (22) er kortisol i spyt sammenlignet ved hjælp af HPLC forbundet med tandem-mass spectrometry (LC-MS/MS) og ECLIA. ECLIA viste i dette forsøg også en højere koncentration end LC-MS/MS, dette begrundes med, at der muligvis kan være sket krydsreaktioner med andre tilstedeværende steroider. Denne påstand bekræftes ligeledes i artikel Measuring Cortisol in human psychobiological studies (1). Da disse to påstande bekræfter hinanden, kan det diskuteres om samme influens af krydsreaktioner 28

29 gør sig gældende i dette forsøg. I vejledningen fra producenten (3) står der, at krydsreaktionsprocenten er lav og derfor burde det ikke have betydning for resultaterne i dette forsøg. Forskellen på Køge sygehus og Rigshospitalet er ikke markant, og hvis eventuelle krydsreaktioner skulle spille ind, betragtes de ikke som væsentlig fejlkilde, da alle de målte kortisol koncentrationer fra både Køge sygehus og Rigshospitalet, ligger indenfor normalområdet i forhold til de angivne intervaller fra producenten (3). Der kan ud fra de to sammenligninger af immunoassay, ses en fordobling af koncentrationen ved måling på Køge sygehus. Dette kan skyldes at prøverne er indsamlet om formiddagen, hvorimod prøverne fra Vogeser et. Al s (2006)(19) forsøg er indsamlet om natten. Som skrevet tidligere i introduktionen kan der ske en halvering af kortisolkoncentrationen fra morgen/formiddag til nat målinger. Det kan være muligt, at ID-LC-MS/MS metoden måler kortisolkoncentrationen mere præcist end immunoassay, men til gengæld er metoden mere omkostningsfuld end immunoassay (19). Resultaterne fra Køge sygehus ligger generelt lidt højere end de målte koncentrationer fra Rigshospitalet, dette kan ses i bilag nr.2 Denne generelt højere måling af kortisolkoncentration kan skyldes at der er benyttet et andet lot nr. end på Rigshospitalet, som kan resultere i en forskydning af analysens resultater. Dette er vigtigt at tage i betragtning, hvis der skal opsættes et referenceinterval. Da dette så skal fremsættes specielt for den pågældende afdeling. Da der ikke på pågældende tidspunkt er fundet noget referenceinterval for målinger af spytkortisol, kan det være svært at bedømme, om selv den mindste stigning i kortisolkoncentrationen kan have fatale konsekvenser for patienten. Dette afhænger af, hvornår koncentrationen af spytkortisol betragtes som forhøjet. Hvis selv små ændringer af koncentrationen har betydning for svarafgivelsen er det nødvendigt med et brugbart referenceinterval for, at bedømme om patientens ligger inden- eller udenfor grænsen. Metodesammenligning er et vigtigt redskab i forhold til korrekthed af analysen, da der her gives et overblik over om analysen er korrekt udført. Resultaterne skal helst være så godt som identiske, men små forskydninger har ikke den store betydning, hvis bare det er muligt at identificere en sammenlignelighed. Ved brug af forskellige apparater og lot. 29

30 Nr, samt andre arbejdsprocedurer, kan 100 % forligelighed ikke forventes. Resultaterne fra Køge og Rigshospitaler forventes derfor at være valide i forhold til analyseforskellene. Og koncentrationsforskellene har signifikant sammenlignelighed. Genfindingsforsøg Vogeser et. al. (2006)(19) har undersøgt reproducerbarheden for analysen til spytkortisol med samme materiale, som brugt i dette forsøg fra Roche til Cobas kortisol assay. Vogeser et al. (2006) har indsamlet spyt fra én formodet rask frivillig person kl. 8 om morgenen. Prøven er derefter fortyndet til de ønskede koncentrationer, hvorefter prøverne er analyseret. Følgende resultater fremkom (19): Forventet koncentration nmol/l 4,1 4,1 2,1 2,1 1,0 1,0 Prøverne er fortyndet ud fra en koncentration på 8,3 nmol/l Tabel 7 Målt koncentration nmol/l Vogeser et. al. (2006) resultater viser sig at have fuldstændig genfindings mellem den forventet koncentration(nmol/) og den målte koncentration (nmol/l)(19). Da der i dette forsøg er en genfinding på 100 % kan det her ud fra bekræftes, at det er muligt genfinde 100 %. I denne validering er der lavet et genfindingsforsøg hvor en spytprøve er analyseret og prøven er derefter fortyndet ud til de koncentrationer ønskes, at finde ved hjælp af en fortyndingsrække. Prøven er derefter analyseret på Cobas e411 og følgende resultater er fundet. Forventet Koncentration nmol/l 29,98 26,89 21,56 20,45 17,34 16,17 13,13 12,50 Tabel 8 Målt koncentration nmol/l 30

31 Ud fra tabel 8 kan der ses meget højere koncentration end dem Vogeser et. al. (2006) benyttede, det kan derfor være svært at bedømme om det er prøvens koncentration der er usikker, når der måles i et højere områder eller om det er usikkerheder ved apparatet. Ved forsøget på Klinisk Biokemisk afdeling, Køge sygehus ses en genfindingsprocent varierende fra 4,50 % til 10,30 % (se tabel 4 i resultat afsnit) og der er derfor ikke 100 % genfinding i dette forsøg. Denne fuldstændige genfinding kunne måske være fremkommet, hvis samme lave måleområder var benyttet. Dette kan dog være svært at vurdere, da præcisionen i de lave måleområder har vist sig at have større CV % i både inter- og intramediær præcisions forsøgene se tabel 9, 10, 11 og 12. Ifølge disse tabeller ses en mindre CV %, jo højere koncentrationerne bliver. Intramediær præcision I intramediær/repeterbarheds forsøg blev der fremstillet 3 pools som blev målt 10 gange, hvor blev udregnet for hver pool. Følgende resultater blev fundet 5,37 nmol/l, 8,50 nmol/l og 13,68 nmol/l. I Cobas Cortisol-vejledning fremkom resultaterne. fra Cobas e411, Køge sygehus CV% Cobas e411, Køge sygehus cobas Cortisolvejledning 5,37 nmol/l 6,88 % 4,68 nmol/l 6,1 % 8,50 nmol/l 5,03 % 11,5 nmol/l 2,7 % 13,68 nmol/l 5,32 % 15,01 nmol/l 4,0 % Tabel 9 15,9 nmol/l 1,5 % 19,8 nmol/l 2,8 % CV% cobas Cortisolvejledning CV % er et udtryk for variationskoefficienten, som udregnes for at se hvor stor spredningen er for de 10 målinger. Aardal E og Holm AE (1995), har foretaget et lignende forsøg hvor der er foretaget 8 målinger på en prøve med høj, og en prøve med lav kortisol koncentration (17). 31

32 Aardal E og Holm CV % AE 0,5-10,0 nmol/l 4,3 10,1-123 nmol/l 3,6 Tabel 10 Ved sammenligning af disse resultater i tabel 9 og 10, ses der i begge forsøg en større afvigelse hos de lave koncentrationer end hos de høje. Det er vigtigt at påpege, at målinger af kortisol i spyt, som regel, har lave koncentrationer og der derfor kan opstå tvivl i analysernes kvalitet. Ifølge Cobas Cortisol-vejledning til analysering af spytkortisol kan denne afvigelse i de lave koncentrationer skyldes apparatets indstillinger. Elecsys fra Roche skulle ifølge Aken O.Van M et. al. (2003) Automated Measurement of Salivary Cortisol (20) have angivelige gode resultater i det lave koncentrationsområde (nmol/l) ved måling på serum. Da kortisol i serum har højere koncentrationer end kortisol i plasma, kan dette have betydning for den generelt højere CV % ved de lave koncentrationer(3). Intermediær præcision Ved intermediær præcisions forsøg udført på Klinisk biokemisk afdeling, Køge sygehus fremkom følgende målt på 3 spytprøver i 3 forskellige kortisolniveauer; 5,20 nmol/l, 8,26 nmol/l og 13,05 nmol/l. Ifølge Cobas Cortisol-vejledning hvor samme forsøg er udført på 5 spytprøver er følgende resultater fundet; 2,08 nmol/l, 8,05 nmol/l, 13,1 nmol/l, 34,6 nmol/l og 42,5 nmol/l. fra Cobas e411, Køge sygehus CV % fra Cobas e411, Køge sygehus Roche Cobas Cortisol-vejledning CV % Cobas Cortisolvejledning 5,20 nmol/l 10,49 % 2,08 nmol/l 33,4 % 8,26 nmol/l 8,66 % 8,05 nmol/l 11,5 % 13,05 nmol/l 8,12 % 13,1 nmol/l 7,1 % Tabel 11 34,6 nmol/l 4,9 % 42,5 nmol/l 4,1 % 32

33 Da det er CV % som illustrerer variationen af prøvens koncentrationer er det her også udregnet i begge forsøg. Da de sidste to koncentrationer fra Cobas Cortisol-vejledning på 34,6 nmol/l og 42,5 nmol/l forekommer sjældent i praksis er disse resultater irrelevante. Vogeser et al. (2006) har udført et lignende forsøg beskrevet i artiklen Measurement of late-night salivary cortisol with an automated immunoassay system (19), hvor intermediær præcision er målt på to forskellige destinationer men på samme prøve koncentrationer. Der er fremstillet 5 pools hvor koncentrationen af kortisol er målt med immunoassay på Cobas. 1 måling nmol/l 1 måling CV % Center 1 nmol/l Center 1 CV % Center 2 nmol/l Center 2 CV % Pool A 12,9 11,6 14,0 6,3 11,4 5,9 Pool B 11,2 11,9 12,1 9,7 10,2 5,1 Pool C 6,3 16,4 7,0 12,8 5,5 5,2 Pool D 3,2 27,1 3,7 22,1 2,6 16,3 Pool E 2,6 40,4 3,2 34,3 1,9 8,1 Tabel 12 Både ved intermediær og intramediær præcision analyse, ses størst afvigelse ved lave koncentrationer. Dette er ikke en tilfældighed da der beskrives i Cobas Cortisolvejledning, at der kan fremkomme variation på 20 % på koncentrationer under 8,5 nmol/l ved intermediær præcision (3). Sammenligning af intermediær præcision påviser en bedre kvalitet ved udførelse af analysen på Klinisk Biokemisk afdeling, Køge sygehus. Dette ses ved den laveste koncentration, hvor CV % ca. to gange mindre end i Cobas Cortisol-vejledningen. Dette er et vigtigt fund, da der i klinisk praksis ofte arbejdes med lave koncentrationer ved måling af kortisol i spytprøver (3). Serum/plasma og spyt I dette afsnit vil fordele og ulemper ved serum/plasma blive sammenlignet med fordele og ulemper ved spytprøver. Kortisol har længe været brugt som en markør for stress, angst og depression (6)(7). Derfor er det vigtigt, at overveje prøvetagningsmetoden man tager i brug overfor den pågældende patient og patientens lidelse og behov. Hvis der 33

34 tages hensyn til dette, kan det i sidste ende have betydning for det resultat der kommer ud fra prøven. Der er fordele og ulemper ved begge prøvematerialer, men i dette tilfælde vil der blive taget udgangspunkt i prøvetagning på patienter med BPD. En ulempe ved blodprøvetagning er, at der skal personale og medicinsk udstyr til at tage prøverne. Dette er ud fra et økonomisk synspunkt en ulempe, da det er omkostningsfuldt i forbindelse med løn til personale og det medicinske udstyr (4). Hvis metoden til måling af kortisol derimod foretages på spyt, kan prøverne tages hjemmefra og samfundet kan spare penge på personale. Ifølge Levine A, et. al. (2007) er kortisol stabile molekyler, som kan opbevares ved stuetemperatur, hvor plasma kræver speciel behandling, da det kan betragtes som potentielt smittefarligt (1). Ifølge producenten for kittet til måling af kortisol i spyt skal spytprøver opbevares på køl, indtil de skal analyseres (3). Der er mange fordele ved spytprøver, det er let at indsamle, det er stress-frit og på den måde opnår man ikke en falsk-forhøjet kortisolkoncentration, det er en non-invasiv metode og det er ikke nødvendigt med personale (1). Da denne validering skal resulterer i måling af kortisol på BPD patienter, hvor prøver skal indsamles 7 gange dagligt, tages der udgangspunkt i udfordringer ved denne metode. Ved BPD påvirkes individet meget hurtigt og stærkt fra omgivelserne, der skal derfor ikke store udslag til før stress-faktoren stiger. Hvis prøvetagningen skal foregå 7 gange om dagen, og patienten skal møde op hos egen læge eller på sygehus for at få taget blodprøver, kan patienten hurtigt opleve stress samt uoverskuelighed og ubehag (5). Det er derfor mere hensigtsmæssigt for patienten at tage spytprøver hjemme, hvor han/hun befinder sig i trykke ramme og vante omgivelser. Ifølge Aardal E og Holm AC (1995), som har udført forsøg med både serum/plasma kortisol og spytkortisol, kan spytkortisol foretrækkes når blodprøvetagning kan have betydning for patienten og prøvens koncentration af kortisol (17). En væsentlig fordel ved, at tage prøver i form af spyt i stedet for urin og blod er tilgængeligheden af spyt. I forhold til BPD patienter har det stor betydning for deres stress niveau, om prøves tages i form af en blodprøve på et ambulatorium eller hos egen læge, eller om prøven kan tages hjemme i trygge rammer. En anden fordel ved, at 34

35 indsamle prøvemateriale i form af spyt kan være på børn eller folk med angst for nåle samt psykisk lidende personer. Det er i den grad også mindre ydmygende at lave en spytprøve frem for, at afgive en urinprøve. Udviklingsperspektiv Hvis metoden til måling af spytkortisol bliver implementeret på klinisk biokemisk afdeling, har bioanalytikeren et stort ansvar med varetagelse af prøven fra den ankommen til afdelingen og til lægen modtager svaret. Implementeringen vil ikke have den store betydning økonomisk for sundhedsvæsenet da analysemetoden/princippet allerede eksisterer til måling af andre biologiske parametre. Det kræver derfor ikke meget oplæring af personalet til at håndtere denne metode. Denne metode kræver heller ingen væsentlig forberedelse af prøverne inden analysering, udover centrifugering. Det vil derfor være let at implementere metoden, da den kan indgå i den daglige rutine sammen med centrifugering og analysering af andre prøver. På rigshospitalet måles der kun spytkortisol i forbindelse med forskningsprojekter og analysen er derfor ikke en del af rutinen, derfor afgives svarene til projektlederen i form af et resultatskema, hvor alle resultater <10 angives med ét decimal, mens resultater >10 angives uden decimal (21). Da patienterne i dette projekt skal tage 7 spytprøver om dagen, ville svarafgives i form af et kurveforløb eller lignende være en mulighed for den pågældende læge at se forandringer i koncentrationen i løbet af de 7 måletidspunkter. Når nye metoder skal implementeres på en afdeling er det vigtigt med et ordentlig og gennemført forarbejde, så alt komme til at gå så let som muligt og uden unødvendige forhindringer. Det er vigtigt at selv de små detaljer er gennemtænkt og at det personale der skal arbejde med metoden er sat ordentlig ind i proceduren. Det er også vigtigt med et godt tværprofessionelt samarbejde for at få alle parter indblandet i de nye ordninger og procedurer. I nogle tilfælde afgiver bioanalytikere svar på analyser direkte til patienten f.eks. ved smear, og prøveresultatet går derfor ikke først igennem en læge, i denne sammenhæng er det vigtigt at det er specialiseret personale der arbejder med proceduren og derfor har ekstra viden indenfor området. Som udviklingsperspektiv kan dette måske blive en 35

36 realitet for denne analyse hvis der bliver opstillet specifikke referenceintervaller og en bestemt svarafgivelses procedure. Med tiden opdages der muligvis flere biologiske parametre, der kan måles ud fra en spytprøve, så ud fra et udviklingssynspunkt har spyt stort potentiale. Holdbarhed Der er en del uvished omkring holdbarheden af spytprøver, i dette forsøg er prøverne opbevaret i henhold til producentens anmærkninger. Prøver som ikke skulle anvendes umiddelbart efter prøvetagning blev frosset ned ved -20 C, hvor de ifølge producenten kan holde sig i 3 måneder. Prøver som skal bruges umiddelbart efter tagning blev sat på køl ved 2-8 C, hvor de ifølge producenten er holdbare i 5 dage (3). Aardal E og Holm AC (1995) har i et studie undersøgt holdbarheden af spytkortisol under forskellige omstændigheder. Studiet er lavet ud fra 3 spytprøver med hver sin kortisol koncentration (nmol/l) (17). Opbevaring Tid (dage) Prøve 1 (nmol/l) Prøve 2 (nmol/l) Prøve 3 (nmol/l) Analysering umiddelbart efter - 2,7 7,1 18,9 prøvetagning Stue temperatur 7 2,8 6,9 19,0 Køleskab (2-8 C) 7 2,7 7,1 18,7 Fryser -20 C 30 2,7 7,0 18,9 Fryser -20 C 270 2,6 7,2 19,6 Gen-frysning ,3 6,6 18,3 Tabel 13 Ud fra tabel 13 ses ingen markante ændringer af koncentrationen ved opbevaring under de forskellige forhold. Dette er et nyttigt fund i forhold til forskningsprojektet med Borderline patienter, da prøverne tages hjemme og efterfølgende bliver hentet eller patienten selv skal sende prøven til det ønskede laboratorium. Den opbevaring der giver størst udslag på resultatet er ved genfrysning. Her har prøverne været tøet op og efterfølgende nedfrosset igen, for til sidst at blive tøet op til analysering. For prøve nr. 1 ses en kortisolkoncentration på 2,7 nmol/l umiddelbart efter prøvetagning, efter genfrysning er denne koncentration faldet til 2,3nmol/l. Prøve nr. 2 viser også et flad i koncentrationen da den går fra 7,1 nmol/l ved første måling til 6,6 nmol/ efter genfrysning. Det sammen gør sig gældende ved prøve nr. 3 som går fra 18,9 36

37 nmol/l til 18,3 nmol/l. Ifølge andre studier har samme udslag været gældende. Samtlige påstande er dog enige i at nedkølning af spytprøven skal se så hurtigt som muligt for at bibeholde kvaliteten af prøven hvad enten om det er på køl eller ved frysning (4). Ud fra Aardal E og Holm AC (1995) holdbarhedsforsøg er der ingen tvivl om, at der sker ændringer i koncentrationen af kortisol ved gen-frysning. Alle koncentrationerne falder en smule, hvilket i sig selv kan have betydning for patients prøvesvar. Hvis patienten ligger lige på grænsen til for højt kortisolniveau, kan der i denne sammenhæng afgives forkert svar, som kan have betydning for patientens diagnose. Patienten bliver enten mindre eller mere sygeligt gjort end den reelle diagnose viser. Det er derfor vigtigt, at overveje prøvetagningstidspunktet i forhold til hvornår analysen skal udføres. Hvis samme prøve skal analyseres op til flere gange, kan det være hensynsmæssigt, at udportionere prøven til flere prøvekopper for at undgå gen-frysning. BPD patienten BPD er en sygdom hvor patienten kan føle uoverskuelighed over selv de mindste ting i hverdagen, det er derfor vigtigt at udføre en kortfattet vejledning til prøvetagning med Salivette, Sarstedt. Det kan i denne sammenhæng diskuteres om det er forsvarligt at overlade prøvetagningen til patienten, da man på den måde mister kontrollen over prøvematerialet. Der kan her rejses spørgsmål omkring patients troværdighed i forhold til overholdelse at prøvetagningstidspunkter. Og om det er ansvarligt at overlade prøvetagningen til en psykisk ustabil person. Ved prøvetagning i dette projekt oplevede mange af de potentielle raske forsøgspersoner ubehag ved at skulle tygge forsigtigt på Salivetten i 2 minutter. Det kan derfor diskuteres om BPD patienter kan få sig selv til det hvis de føler ubehag ved det. 37

38 Konklusion Dette afsnit vil indeholde en sammenfattet konklusion på projektets resultater samt om det er muligt at implementere analysen. Som diskuteret tidligere, har forsøget givet bedre resultater end producenten. I denne forbindelse er korrekthed og præcision undersøgt eksperimentelt ved forskellige delforsøg. Korrekthed er eksperimentelt undersøgt ved metodesammenligning og genfinding. Ud fra resultaterne i disse forsøg samt evidens fra artikler og producenter kan, der konkluderes at kvaliteten af analysen som er udført på Klinisk Biokemisk afdeling, Køge sygehus, har de rette forudsætningen for implementering af metoden. Det samme gør sig gældende for præcisionsforsøgene, hvorunder inter- og intramediær præcision er undersøgt. For at tage hensyn til BPD patienten er der præanalytisk udviklet en kortfattet prøvetagningsvejledning, som kan fremskaffes på forskellig vis. Enten via internettet og QR-kode og derudover er det også tiltænkt at patienten modtager en vejledning når Salivetterne udleveres. Via QR-koden henvises man til Youtube hvor man visuelt kan se hvordan prøven skal tages. På denne måde sikres så korrekt prøvetagning som muligt da denne proces kan mindske falsk forhøjet kortisolkoncentration. Da kortisol er stabile molekyler kan spytprøverne opbevares i køleskab indtil prøverne enten sendes til afdelingen eller bliver hentet. Der er dog forskellige meninger omkring holdbarheden af spytkortisol, ifølge Aardal E og Holm AC (1995) ses ingen store forandringer i kortisolkoncentrationen ved opbevaring under de rette omstændigheder i enten fryser eller køleskab og hvis tidshorisonten overholdes (17). 38

39 Perspektivering Levine A, et. al. (2007) Skriver at spytprøver til måling af kortisol kan opbevares ved stuetemperatur, da kortisol molekyler er stabile molekyler og derfor ikke forårsage ændringer i koncentrationen af kortisol (1). Ifølge kittet fra Roche til måling af kortisol i spytprøver på Cobas e411, skal spytprøver umiddelbart efter prøvetagning opbevares på køl indtil centrifugering og analysering (3). Det kunne derfor være interessant hvis tidshorisonten havde været til det, at undersøge begge påstand for forandringer i koncentrationen af kortisol, så korrekt håndtering af prøverne samt kvaliteten kunne sikres. Aardal E. og Holm AC (1995) har udført et forsøg med holdbarheden af spyt hvor de 3 samme prøver blev opbevaret ved forskellige temperaturer, og koncentrationen af kortisol blev målt over en lang periode (1). Hvis prøverne skal tages hjemme og der skal sikres korrekt prøvetagningstidspunkt, kunne det være en ide at udvikle et system hvor patienten automatisk modtager en påmindelse ved for eksempel smsbesked. Dette kan have betydning for sundhedsvæsenets patientservice. Ved analysering af kortisol i spyt ses en konsekvent lav koncentration. Kittet fra CalSet er fremstillet til måling af kortisol i spyt men ingen kontroller er fremstillet til måling i så lave koncentrationer. Derfor vil det være hensigtsmæssigt at fremstille egne kontroller så disse passer i det måleområde man arbejder med. 39

40 Litteraturliste (1) Levine A, Zagoory-Sharon O, Feldman R, G. Lewis J, Weller A. Measuring cortisol in human psychological studies. Phsysiology & Behavior 90, 2007, (2) Gatti R, Antonelli G, Prearo M, Spinella P, Cappellin E, Palo F. De E. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clinical Biochemistry 42, 2009, (3) Cobas, Cortisol. Elecsys Modular og cobas e-analyseinstrumenter , v. 17 Dansk (4) Chiappin S, Antonelli G, Gatti R,Palo F. De E. Saliva Specimen; A new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clinical Chimica Acta 383, April Italien. (5) Andersen R, Simonsen E- Mentaliseringsbaseret terapi af kvinder med borderline personlighedsforstyrrekse. Protokol v. 4, (6) Handest P, Jansson L, Nielsen J. Fakta om borderline personlighedsforstyrrelse. Uddrag fra psykiatrifondens bog; Skizotypi og borderline, Lokaliseret [ ] på: /Borderline (7) PsykiatriFonden. Fakta om stress. København NV. Lokaliseret [ ] på: (8) Borup VD. Biokemi. 1 udg. København: FADL'S FORLAG; 2010 (9) Gyldendals åbne encyklopædi. Glykoneogenesen. Den Store Danske. Gyldendal Lokaliseret [ ] på: iologi/biokemi/glukoneogenese (10) The Lundbeck Institute. The Hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Skodborg: The Lundbeck Institute. Lokaliseret [ ] på: (11) Kirschbaum Clemens, Kudielka M. Brigitte. Sex differences in HPA axis responses to stress: a review. Germany. December

41 (12) Region Sjælland. Cobas e411 undervisning for bioanalytikere. Klinisk biokemisk afdeling, Køge sygehus. (13) DS, Dansk Standard. CE-mærkning. Lokaliseret [ ] på: (14) D4. Validering af analysemetoder, version 1. NORD Biokemi KOE/FAK. Region Sjælland (15) Thomas Bendsen. Noter i statistik for bioanalytikere , VIA University College Bioanalytikeruddannelsen. Lokaliseret [ ] på: (16) Simonsen F. Analyseteknik instrumentering og metoder. 2. udg. København. Nyt Teknisk Forlag; (17) Aardal E, Holm AC. Cortisol in Saliva reference Ranges and Relation to Cortisol in Serum. Eur J Clin Chem Clin Biochem (18) Cobas. Cortisol Calset. Roche Diagnostics , v. 10. Englesk. (19) Vogeser M, Duner J, Seliger E, Auernhammer C. Measurement of late-night salivary cortisol with an automated immunoassay system. Clin Chem Lab Med Tyskland. (20) Aken M, Romijn A. J, Miltenburg A. J, Lentjes G.M.W E. Automated Measurement of Salivary Cortisol.Clinical Chemistry Clinical Chemistry 49, nr Holland (21) Andreasen L. Afdelingsbioanalytiker. Klinisk biokemisk Afdeling, Rigshospitalet, pers. comm (22) Carrozza C, Lapolla R, Gervasoni J, Antonio R.C, Locantore P, Pontecorvi A, Zuppi C, Persichilli S. Assessment of salivary free cortisol levels by liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in patients treated with mitotane. HORMONES 2012, 11(3): Italien. 41

42 Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peerreviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) Linda Kjærgaard Professionsbachelorprojekt Bilag Bilag 1: Analyseskema over anvendt litteratur Navn: Linda Kjærgaard Studienummer: Bn Modul: 14 Produktionsår: Titel: Kortisol i spyt Problemformulering: Er det muligt at implementere analysen for spyt-kortisol på Klinisk biokemisk afdeling, Køge sygehus. Implementeringen forudsætter: Godkendt del-validering af analysen, hvor korrekthed og præcision undersøges eksperimentielt. Samt fremstilling af vejledning til indsamling og efterfølgende korrekt håndtering og opbevaring af prøvematerialet. Reference Bemærkninger Levine A, Zagoory-Sharon O, Feldman R, G. Lewis J, Weller A. Measuring cortisol in human psychological studies. Phsysiology & Behavior 90, 2007, Gatti R, Antonelli G, Prearo M, Spinella P, Cappellin E, F. De Paolo E. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clinical Biochemistry 42, 2009, Cobas, Cortisol. Elecsys Modular og cobas e-analyseinstrumenter , v. 17 Dansk x x x Producent vejledning 42

43 Reference Bemærkninger Chiappin S, Antonelli G, Gatti R,Palo F. De E. Saliva Specimen; A new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clinical Chimica Acta 383, April Italien. x Andersen R, Simonsen E- Mentaliseringsbaseret terapi af kvinder med borderline personlighedsforstyrrekse. Protokol v. 4, Handest P, Jansson L, Nielsen J. Fakta om borderline personlighedsforstyrrelse. Uddrag fra psykiatrifondens bog; Skizotypi og borderline, Lokaliseret [ ] på: side/psykiske+sygdomme/personli ghedsforstyrrelser/borderline PsykiatriFonden. Fakta om stress. København NV. Lokaliseret [ ] på: side/psykiske+sygdomme/stress Borup VD. Biokemi. 1 udg. København: FADL'S FORLAG; 2010 Gyldendals åbne encyklopædi. Glykoneogenesen. Den Store Danske,. Gyldendal Lokaliseret [ ] på: tur_og_milj%c3%b8/biokemi_og_ molekyl%c3%a6rbiologi/biokemi/g lukoneogenese The Lundbeck Institute, The Hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Skodborg: The Lundbeck Institute. Lokaliseret [ ] på: ank/item/hpa_norm_dpn_3/def ault.aspx Kirschbaum Clemens, Kudielka M. Brigitte. Sex differences in HPA axis x x x x x x x Forskningsprojekt Psykiatrifondens hjemmeside Psykiatrifondens hjemmeside Encyklopædi Webside 43

44 Reference Bemærkninger responses to stress: a review. Germany. December Region Sjælland. Cobas e411 undervisning for bioanalytikere. Klinisk biokemisk afdeling, Køge sygehus Dansk Standard. CE-mærkning. Lokaliseret [ ] på: ce_maerkning/ D4. Validering af analysemetoder, version 1. NORD Biokemi KOE/FAK. Region Sjælland Thomas Bendsen. Noter i statistik for bioanalytikere , VIA University College Bioanalytikeruddannelsen. Lokaliseret [ ] på: p?sectionid=6 Simonsen F. Analyseteknik instrumentering og metoder. 2. udg. København. Nyt Teknisk Forlag; 2006 Aardal E, Holm AC. Cortisol in Saliva reference Ranges and Relation to Cortisol in Serum. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995 Cobas. Cortisol Calset. Roche Diagnostics , v. 10. Englesk Vogeser M, Duner J, Seliger E, Auernhammer C. Measurement of late-night salivary cortisol with an automated immunoassay system. Clin Chem Lab Med Tyskland. Aken M, Romijn A. J, Miltenburg A. J, Lentjes G.M.W E. Automated Measurement of Salivary Cortisol.Clinical Chemistry Clinical Chemistry 49, nr Holland Andreasen L. Afdelingsbioanalytiker. Klinisk biokemisk Afdeling, Rigshospitalet. x x x X x x x x x x Undervisningsmate riale Webside D4-dokument Webside Kit-indlæg Samtale med afdelingsbioanalyti ker. 44

45 Reference Bemærkninger Chiappin S, Antonelli G, Gatti R,Palo F. De E. Saliva Specimen; A new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clinical Chimica Acta 383, April Italien. x 45

46 Bilag 2: Rådata til resultater Metodesammenligning Prøve id Klinisk biokemisk, Køge sygehus (nmol/l) Klinisk Biokemisk, Rigshospitalet (nmol/l) (nmol/l) Afvigelse (nmol/l) Afvigelse I % K3a 13,4 9,5 11,5 3,9 29,1 K4a 6,4 5,3 5,9 1,1 17,2 K5a 8,5 8,6 8,5-0,1 1,2 K6a 6,9 6,2 6,6 0,7 10,1 K7a 9,8 7,5 8,7 2,3 23,5 K10a 6,7 6,1 6,4 0,6 9 K11a 6,9 6,2 6,6 0,7 10,1 K12a 6,4 5,9 6,2 0,5 7,8 K13a 7,4 6,4 6,9 1 13,5 K14a 10,6 8,7 9,65 1,9 17,9 K15a 5,9 5,5 5,7 0,4 6,8 K16a 12, ,5 2,9 22,5 K18a 12, ,9 1,7 13,4 K19a 7,5 5 6,3 2,5 33,3 K20a 8,1 7,1 7,6 1 12,3 K21a 11, ,2 0,4 3,5 K22a 15, ,2 0,3 2 K25a 5,9 5,2 5,6 0,7 11,9 K26a 4,1 4,2 4,2 0,1 2,4 K27a 9,6 9,3 9,5 0,3 3,1 46

47 Genfindingsforsøg 1 måling 2 måling 3 måling 4 måling 5 måling 8,85 9,00 8,63 9,10 9,03 8,88 Pool nr. Beregnet værdi Måling 1 (nmol/l) Måling 2 (nmol/l) (nmol/l) Den sande værdi i % 1 25,53 28,24 26,89-10, ,95 21,04 20,45-4, ,16 17,17 16,17-6, ,16 12,84 12,5-4,50 47

48 Kontroller dato Kontrol 1 Kontrol ,3 872, ,6 873, ,8 815, ,3 820, ,7 835, ,0 831, ,7 835, ,0 831, ,8 960,8 kalibrering Dato Kalibrator 1 Kalibrator 2 1. signal signal Target value 12,80 nmol/l 1010 nmol/l 48

49 Dato Kalibrator 1 Kalibrator 2 1. signal signal Target value 12,80 nmol/l 1010 nmol/l Dato Kalibrator 1 Kalibrator 2 1. signal signal Target value 12,80 nmol/l 1010 nmol/l Dato Kalibrator 1 Kalibrator 2 1. signal signal Target value 12,80 nmol/l 1010 nmol/l Dato Kalibrator 1 Kalibrator 2 1. signal signal Target value 12,80 nmol/l 1010 nmol/l 49

50 Bilag 3: Vejledning til prøvetagning af spyt Trin for trin Du har modtaget en pose som indeholder 6 prøvetagnings rør og en vejledning som kan guide dig igennem prøvetagningen. Du kan også scanne QR-kode med din telefon og se vejledningen som en video. Koden findes nederst på sidste side. Pose med vejledning og prøvetagnings rør 1 Prop. 2 Lille rør. 3 Store rør. 4. bomuldsrulle Prøvetagning 2. Tag røret op fra posen. Tjek at de påsatte mærkater med navn, cpr nr. og tidspunkt stemmer overens. 1. Fjern det blå låg. Vær opmærksom på at det lille rør med bomuldsrollen bliver i det store rør, der er mærkede med navn. 50