Tidsbesparende præanalyse med hybrid SPE plader til analysering af 25-Hydroxy- Vitamin D på UPLC-MS/MS

Transkript

1 Tidsbesparende præanalyse med hybrid SPE plader til analysering af 25-Hydroxy- Vitamin D på UPLC-MS/MS Professionsbachelorprojekt Forfattere: Ása í Dímun Højgaard ( ) 18/07-92 William Lund Christensen ( ) 14/05-89 Oktober 2016 Januar 2017 Bioanalytikeruddannelsen Professionshøjskolen Metropol Vejledere: Lektor, Cand. Scient. Søren Frank Jørgensen Professionshøjskolen Metropol Sheila Perez Rovsing Koch Klinisk Biokemisk Afdeling, KB , Rigshospitalet Antal tegn (uden mellemrum):

2 Forord Dette bachelorprojekt havde til formål at finde en alternativ præanalyse til Waters Oasis HLB til oprensning af D-vitamin serumprøver til analysen på LC-MS/MS. Projektet blev udarbejdet på Klinisk Biokemisk afdeling, KB , Diagnostisk Center på Rigshospitalet i tidsperioden oktober 2016 til januar Vi ønsker at takke dem der har gjort udførelse af dette projekt muligt ved hjælp og vejledning: Klinisk vejleder fra KB Sheila Perez Rovsing Koch og vejleder fra Professionshøjskolen Metropol Søren Frank Jørgensen. Derudover ønsker vi at takke bioanalytikerne fra KB Peter Dørk Villsen, Søren Senniksen og ansvarshavende bioanalytiker for LC-MS/MS Marianne Østergaard, samt afdelingens biokemiker Svend Høime Hansen og ledende biokemiker Anders Holten Johnsen. Abstract Background: The Department of Clinical Biochemistry, KB Center of Diagnostics, Rigshospitalet uses Water Oasis HLB SPE columns for pre-analysis of 25(OH)D 2 and D 3 on Waters ACQUITY UPLC/TQD. The method is very time consuming and the purpose of this project is therefore to reduce the time spent on pre-analytical procedures by replacing Waters Oasis HLB with one of the following alternatives: Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro or Phenomenex Phree. Method: Phase 1: the choice of solvent and dilution of the samples are optimized for each of the alternatives. This is limited to the use of acetonitril and methanol, with or without formic acid, in dilutions from 1+3 to Phase 2: The methods ability to measure 25(OH)D 2 and D 3 in human serum and control material are compared to Water Oasis. Additionally the methods imprecision and linearity are determined and compared. Results: Biotage Isolute was found to have an acceptable imprecision (CV% = 11,3) and linearity (R 2 = 0,9989), along with a non-clinically relevant systematic higher measurement of samples, compared to Water Oasis. There are furthermore signs of instability when measuring samples with low concentrations (<30 nmol/l). Waters Ostro showed similar results, (CV% = 7,0 and R 2 = 0,9983), but did not meet the criteria set for the control material. Phenomenex Phree had the worst imprecision and linearity (CV% = 30,6 and R 2 = 0,9678), and did meet the criteria in this project. None of the alternatives met the criteria for the comparison of human serum or control material for 25(OH)D 2. Conclusion: All three alternatives reduced the time spent on pre-analytical procedures by at least two hours. Out of these, Biotage Isolute PLD+ was found to be the best, but further optimization and the introduction of an internal standard for 25(OH)D 2 is recommend before implementation of Biotage Isolute. Side 1 af 68

3 Indholdsfortegnelse Indholdsfortegnelse Introduktion Indledning Formål Problemformulering Teori D3- og D2-vitamin SPE oprensning af 25(OH)D3 og D UPLC-MS/MS Metodevalg og afgrænsning Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Pilotforsøg Delforsøg 2 Metodesammenligning Databehandling Kriterier for accept af en ny metode som alternativ til Waters Oasis HLB Materialer og Metode Materialer Udstyr og apparatur Plader til 25(OH)D3 og D2 oprensning Kontroller, kalibratorer og Intern Standard Kemikalier og reagenser Kolonner Prøvemateriale Side 2 af 68

4 2.2 Metode Fremstilling af kontroller, kalibratorer, serumpool og reagenser Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Pilotforsøg af udvalgte metoder Delforsøg 2 Metodesammenligning Resultater Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Delforsøg 2 Metodesammenligning Procestiden for metoderne Delforsøg 2 Interne kvalitetskontroller Delforsøg 2 25(OH)D Delforsøg 2 25(OH)D Diskussion Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Biotage Isolute PLD Waters Ostro Phenomenex Phree Delforsøg 2 Metodesammenligning Interne kvalitetskontroller Metodesammenligning af 25-Hydroxy-Vitamin D Impræcisionsbestemmelse Eksterne kvalitetskontroller Hydroxy-Vitamin D3 7-punktskalibrator linearitetsbestemmelse Metodesammenligning af 25-Hydroxy-Vitamin D Hydroxy-Vitamin D2 7-punktskalibrator linearitetsbestemmelse Side 3 af 68

5 4.3 Samlet vurdering af Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree som alternativ til Waters Oasis HLB Konklusion Perspektivering Referencer Bilag Ordliste Oasis Waters Oasis HLB Isolute Biotage Isolute PLD+ Ostro Waters Ostro Phree Phenonemex Phree 25(OH)D3 25-Hydroxy-Vitamin D3 25(OH)D2 25-Hydroxy-Vitamin D2 IS Intern standard (26,27-hexadeuterium-25-hydroxy vitamin D3) Metode Henviser til Waters Oasis HLB, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro eller Phenomenex Phree. Procedure Henviser til det anvendte solventsammensætning og fortyndingsforhold til en metode. Side 4 af 68

6 1. Introduktion 1.1 Indledning D-vitamin findes i to former; kolecalciferol, 25-hydroxy-vitamin D3, og ergocalciferol, 25-hydroxyvitamin D2. Den fysiologiske effekt er bl.a. påvirkning af calcium-homeostasen og sammen med PTH, regulering af knogle-turnover. (1) Forskere har de seneste år ydermere kædet D- vitaminmangel sammen med en række sygdomme som cancer, type-2-diabetes, kredsløbslidelser og autoimmune sygdomme. (1 4) Af overstående grunde bliver analyser for D-vitamin derfor hele tiden mere relevante. De fleste analysemetoder måler summen af begge analytter og skelner ikke mellem D3 og D2, men da den fysiologiske effekt af D3-vitamin er tre gange større end for D2-vitamin, bliver det relevant at kunne skelne de to analytter fra hinanden. (2) Der er mange principper og metoder til måling af D-vitamin med hver deres fordele og ulemper. Klinisk Biokemisk afdeling, Diagnostisk Center KB3011, anvender bl.a. en UPLC-MS/MS til analysering af stofkoncentration for P-25-hydroxy-Vitamin D3 og P-25-hydroxy-Vitamin D2. Metoden er meget tidskrævende for afdelingen, men har fordelen at kunne skelne mellem D3 og D2- vitamin, og anses desuden af de fleste som golden standard. (5,6) Analysering af D-vitamin på afdelingens UPLC-MS/MS kræver en omfattende præanalytisk forberedelse af prøvematerialet for at undgå matrix effekt der nedsætter den analytiske sensitivitet og reproducerbarheden. D-vitamin transportproteiner, samt øvrige proteiner, skal derfor udfældes og interfererende phospholipider fjernes. (6) Fjernes disse ikke, sænker de reproducerbarheden og den analytiske sensitivitet og giver falsk forhøjede eller for lave resultater. (7 9) 1.2 Formål Den nødvendige præanalyse for D3- og D2-vitamin serumprøver til UPLC-MS/MS udføres i dag ved proteinfældning efterfulgt af solid-phase extraction på Waters Oasis HLB og er utrolig tidkrævende, da denne procedure tager omkring 4 timer. Afdelingen har derfor ledt efter et mindre tidskrævende alternativ. Dette projekt har derfor til formål at undersøge tre plader: Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro 96-well plate og Phenomenex Phree Phospholipid Removal plate, som alternativer til Waters Oasis HLB. De nye metoder skal optimeres med hensyn til valg af solvent, samt fortyndingsforholdet mellem Side 5 af 68

7 solvent og prøvemateriale. Derefter ønskes det undersøgt hvorvidt ét at de tre alternativer kan nedsætte arbejdstiden, uden at ændre den kliniske vurdering af resultaterne. 1.3 Problemformulering Ved hvilken solventsammensætning og hvilket fortyndingsforhold fungerer de præanalytiske procedurer Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenonemex Phree, optimalt til oprensning af serumprøver til måling af P-25-Hydroxy-Vitamin D 3 og D 2? Kan et af disse alternativer erstatte Waters Oasis HLB til måling af stofkoncentration af P-25-Hydroxy-Vitamin D 3 og D 2 på Waters UPLC-MS/MS-system, således at arbejdstiden forkortes uden at ændre den kliniske vurdering af resultaterne? Side 6 af 68

8 1.4 Teori D3- og D2-vitamin D-vitamin er et secosteroid med en brudt steroidkerne og er dermed et meget hydrofobt molekyle, som transporteres i blodbanen bundet til et transportprotein med høj affinitet. (1) Da D-vitamin forekommer bundet til transportproteiner i blodbanen, kræver dette en præanalytisk procedure til frigivelse af D-vitamin, samt fjernelse af øvrige proteiner og phospholipider, inden analysering på LC-MS/MS. Som Bylda et al. (7) beskriver, så er matrix-effekt et stort problem når biologiske prøver analyseres på LC-MS/MS. I mange tilfælde skyldes matrix-effekten tilstedeværelse af endogene komponenter som metabolitter af analytten, proteiner og lipider i prøven. (7,10) For D- vitamin er det derfor specielt vigtigt at frigive dette fra transportproteiner, da analytten ellers vil blive tilbageholdt under præanalysen med SPE (Solid Phase Extraction) kolonnen. Der beskrives også exogene komponenter der kan påvirke, men det vigtigste er at fjerne komponenter fra matrix som co-eluerer med analytten under væskekromatografien, da disse kan påvirke ioniseringen af denne. (7) Der findes to typer af D-vitamin, den ene er kolecalciferol, 25(OH)D3, dannes endogent i kroppen via sollysets UVB stråler og fås fra animalske fødevarer. Den anden er ergocalciferol, 25(OH)D2, som ikke dannes endogent i kroppen og derfor kun kan optages fra vegetabilske fødevarer, og kun i meget små mængder. (1) (11) Figur 1 viser de to inaktive prohormoner af D-vitamin, 25(OH)D2 og 25(OH)D3, som ses til venstre. Til højre ses den aktive form, 1,25(OH)2D. (11) Side 7 af 68

9 Disse er begge inaktive prohormoner, som skal hydroxyleres to gange for at være fysiologisk aktive, figur 1. Dette foregår henholdsvis i leveren og nyrerne. Den fysiologisk aktive form af D- vitamin er 1,25(OH)2D, hvis plasmahalveringstid er omkring 15 timer, hvorimod de inaktive prohormoner, 25(OH)D3 og D2, har halveringstider på henholdsvis dage og 2-3 dage, grundet deres forskellige affinitet til transportproteinet. (1) Der analyseres derfor på Rigshospitalets Klinisk Biokemisk afdeling, KB3011, kun på prohormonerne, da disse afspejler kroppens depot af D-vitamin. Måling af det fysiologisk aktive 1,25(OH)2D foretages kun ved sjældne genetiske defekter og undertiden ved kronisk nyreinsufficiens. (12) Rigshospitalets referenceinterval for P-25-Hydroxy-Vitamin D3;stofk. er >50 nmol/l. Det er vigtigt at kunne angive den specifikke stofkoncentration, da D-vitaminmangel inddeles og behandles alt efter om der er let D-vitaminmangel; nmol/l, moderat D-vitaminmangel; nmol/l eller alvorlig D-vitaminmangel; <13 nmol/l. (13) Der findes ikke noget referenceinterval for D2-vitamin, da forekomst af denne hovedsageligt vil ses ved tilskudsbehandling med D2-vitamin. (13) Lyngbye skriver dog at andre studier har vist at allerede ved værdier <75 nmol/l kan der observeres et øget niveau af PTH og nedsat absorption af calcium i tarmene, og det klinisk relevante område defineres derfor som 80 nmol/l. (14) SPE oprensning af 25(OH)D3 og D2 For at analysering af 25(OH)D3 og D2 serumprøver på UPLC-MS/MS kan muliggøres, kræves en oprensningsprocedure til fjernelse af proteiner og phospholipider. Til dette anvendes i fleste tilfælde en hybrid SPE (Solid Phase Extraction) oprensningsplade. (7) En hybrid SPE oprensningsplade er en plade der kan tilbageholde udfældede proteiner samtidig med at den også tilbageholder phospholipider. (7) Waters Oasis HLB, der anvendes på Klinisk Biokemisk afdeling, KB3011, på Rigshospitalet er dog en almindelig SPE plade hvor proteinfældning foregår inden oprensning på SPE pladen, hvor 25(OH)D tilbageholdes i pladen og elueres efter fjernelse af interfererende stoffer. Disse mangfoldige trin er illustreret i figur 2. Hvorimod de nye metoder der undersøges i dette projekt er hybrid SPE plader hvor proteinfældning og tilbageholdelse af phospholipider, begge finder sted på hybrid SPE pladen. Proceduren for oprensning med hybrid SPE er illustreret i figur 2, hvor der ses hvor stor forskel der er på de to procedurer og dermed også tidsforbruget. (15) Side 8 af 68

10 Figur 2. Til venstre ses samtidig proteinfældning og fjernelse af phospholipider med en Biotage Isolute PLD+ hybrid SPE, som er princippet bag de tre alternative metoder der undersøges i dette projekt. Øverst til højre ses princippet bag den metode der anvendes på KB3011 i dag. Øverst ses proteinfældning med organisk solvent, hvorefter supernatant overføres til Waters Oasis HLB for fjernelse af phospholipider med SPE, hvor analyt tilbageholdes mens phospholipiderne skylles ud. Derefter elueres analytten og analyseres på LC-MS/MS. (15) Proteinfældningen kan foretages ved tilsætning af et organisk solvent til serum, f.eks. acetonitril, (7,16) hvorved de kan isoleres fra analytten via et filter. Udfældning af proteiner vha. organisk solvent, skyldes at vandet der befinder sig inde i og omkring proteinerne erstattes af det mere hydrofobe acetonitril hvorved proteinet åbner sig, da de hydrofobe grupper ikke længere har en fordel af befinde sig inde i proteinet. Blotlæggelse af de hydrofobe grupper og nogle af de reaktive grupper gør at de kan interagere med andre proteiner hvorved de udfælder. (17) Selve SPE oprensningen anvender en stationær fase som i de fleste tilfælde består af porøse silicapartikler eller polymerer. Til silica-partiklerne er der ofte påsat Zirkonium, Zr, Titan, Ti, eller C18. C18 udgør en hydrofob overflade hvorved den stationære fase binder molekyler med hydrofob affinitet. Zr og Ti fungerer som Lewis-syrer hvorved de tilbageholder phospholipider der fungerer som Lewis-baser. (7,18,19) Side 9 af 68

11 Til dette projekt anvendes der reversed-phase SPE, hvor den stationære fase er hydrofob og der skylles igennem med et polært solvent, hvorimod en normal-phase SPE består af en polær stationær fase og skylles igennem med et non-polært solvent. For Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree er dette princippet bag oprensningen, mens det for Waters Oasis HLB er analytten der tilbageholdes og først elueres efter phospholipider og andet interferens er skyllet ud. Hall et al. (19) beskriver i deres bog, at en reversed-phase SPE metode anvendes til analytter der er lav til moderat polære og hydrofobe: D-vitamin er meget hydrofobt og et lavt til moderat polært molekyle (20), som understøtter brugen af reversed-phase SPE. Hall et al. beskriver yderligere at disse analytter kan elueres med både non-polære og polære organiske solventer; acetonitril er medium-polært. Derved tilbageholdes phospholipider og proteiner i pladen, mens molekyler som D-vitamin elueres UPLC-MS/MS Efter præanalysen med SPE analyseres prøverne på Waters ACQUITY UPLC/TQD (Ultra Performance Liquid Chromatography/Tandem Quadrupole mass spectrometers Detector). UPLC-MS/MS-analysen kan deles i tre faser; UPLC, elektrospray ionisering (ESI) og tandem massespektrometri (MS/MS eller TQD), se figur 3. (8) Figur 3. Figuren viser prøvematerialets vej gennem tandem massespektrometeret. Yderst til venstre ses ESI, hvorefter materialet trækkes igennem det første massefilter, MS1 efterfulgt af kollisionscellen og til sidst ses MS2. Yderst til højre ses detektor-enheden hvor datter-ionerne registreres via energi fra fotoner der multipliceres i et photomultiplikatorrør, hvorefter oplysninger overføres til softwareprogrammet QuanLynx i form af chromatogrammer. (8) Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) På Klinisk Biokemisk afdeling, KB3011, på Rigshospitalet findes der to Waters ACQUITY UPLC/TQD der kan analysere 25(OH)D3 og D2. Dette er apparat 3 og apparat 1, som under dette Side 10 af 68

12 projekt anvendes til henholdsvis delforsøg 1 og delforsøg 2. Det oprensede prøvemateriale injiceres i UPLC-delen hvor det separeres i en C18 reversed phase kolonne, som er de mest anvendte kolonner i dag, hvor molekyler med affinitet for denne, f.eks. 25(OH)D, adsorberes og tilbageholdes. (18) Kolonnen skylles igennem med den mobile fase, A1, som er en vandig polær opløsning, og B1, som er en upolær methanol opløsning. Til dette forsøg anvendes en lineær gradient af solventerne A1 og B1. (12,18) Der skylles først igennem med et polært solvent, A1, hvorved komponenter uden affinitet for kolonnen skylles væk, hvorefter der gradvist skiftes over til det upolære solvent, B1. 25(OH)D3 og D2 elueres når bindingen til kolonnen brydes. (12,18) Affinitetsforskellene for de forskellige molekyler betyder at bindingen til kolonnen brydes ved forskellige tidspunkter hvorefter de detekteres i MS-delen. Dette kaldes retentionstiden, som er en del af identificeringen af analytten og angives i minutter. (8,12,21) Elektrospray ionisering (ESI) Elektrospray ionisering er mellemleddet fra UPLC til massespektrometeret (MS/MS), hvor analytten ioniseres og væsken fordamper, hvorved detektion på massespektrometeret kan udføres. For at analysere analytten på massespectrometeret kræves det at analytten er på gasform og ioniseret, da MS detekterer forskellen i masse/ladnings-ratioen af molekyler. (18) Netop ESI er særlig følsom overfor matrix effekt, specielt phospholipiders påvirkning. Dette skyldes at phospholipidernes retentionstid overlapper med analytternes og at de konkurrer med analytten om ioniseringen. Dermed hæmmer phospholipiderne ioniseringen af 25(OH)D3 og D2. (7) Oprensningen af prøvematerialet med SPE til proteinfældning og fjernelse af phospholipider er derfor specielt vigtigt for denne del af analysen, hvor en utilstrækkelig oprensningsmetode vil medføre forkerte 25(OH)D3 og D2 resultater. Tandem massespektrometri (MS/MS) Det er nu kun de ladede molekyler der trækkes igennem massespektrometeret vha. elektrisk tiltrækning og undertryk. (8,19) Tandem massespektrometeret består af to quadrupoler (massespektrometre), MS1 og MS2. Disse quadrupoler fungerer som massefiltre der kun tillader molekyler med en forudbestemt molekylevægt at passere. MS1 tillader moder-ioner at passere, som for dette projekt er 25(OH)D3 og D2, hvorefter moder-ionerne fragmenteres i en kollisionscelle. For at denne fragmentering kan finde sted skal der tilføres energi, således at 25(OH)D3 og D2 støder ind i kollisionsgassen, argon, og fragmenteres til karakteristiske fragmenter, kaldet datter-ioner. Udvalgte karakteristiske datter- Side 11 af 68

13 ioner passerer derefter MS2. (8) UPLC-MS/MS slutter med at en detektor registrerer det der kommer igennem systemet via elektronernes energi der konverteres til fotoner der passerer et photomultiplaktorrør, hvorefter data om den indkomne energi overføres til softwareprogrammet QuanLynx på en computer i form af chromatogrammer hvor intensiteten er sat som funktion af tiden, se figur 4. Den højeste målte intensitet sættes til 100 % hvorved øvrige toppes størrelse bliver relativ i forhold til dette signal. UPLC-MS/MS analyser kan dermed opnå høj specificitet via de tre selektive trin og øget følsomhed ved større intensitet af datter-ioner. (8,22) Figur 4. Figuren viser integrering af en prøves chromatogram på softwareprogrammet QuanLynx. Det skraverede område angiver analyttens top (areal under kurven), hvorved koncentrationen kan beregnes ud fra en kalibreringskurve. Integreringen af chromatogrammerne for hver prøve og den tilsvarende interne standard vurderes derefter af afdelingens personale. Integreringen anvendes til at bestemme arealet under kurven, hvorved det samlede signal for analytten kan beregnes. Koncentrationen bestemmes derefter via en kalibreringskurve, hvor signalet er proportionalt med koncentrationen af analytten, se figur 4. Denne proces er en stor ulempe som kan forårsage stor interseriel variation af resultaterne, da personalets individuelle erfaringer har stor indflydelse på integreringen og dermed resultaterne. Det er derfor væsentligt at chromatogrammerne er af høj kvalitet, med veldefinerede toppe og et lavt interferensniveau, således at denne variation mindskes mest muligt. Side 12 af 68

14 1.5 Metodevalg og afgrænsning Waters Oasis HLB, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree analyseres på Waters ACQUITY UPLC/TQD, apparat nr. 3 og 1 i henholdsvis delforsøg 1 og 2. Forskellen imellem disse apparater er, at apparat 3 anvender en Phenomenex Kinetex C18 kolonne, mens apparat 1 anvender en mere følsom Waters ACQUITY UPLC HSS T3 kolonne, begge er C18 kolonner. Der anvendes to apparater grundet tekniske problemer opstået under udførelsen af projektet. Alle analyser benytter afdelingens normale opsæt af samtlige parametre: Solvent sammensætning og gradient, temperatur, tryk og flow-hastighed. (12) Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Alle producenter anbefaler at bruge acetonitril med 1 % myresyre som organisk solvent hvorimod Biotage også anbefaler acetonitril uden myresyre til Isolute PLD+. Phenomenex anbefaler desuden også brugen af methanol med 1% myresyre. De tre procedurer, anbefalede af producenterne, inkluderes i delforsøg 1, se bilag 1. (23 25) Fra litteraturen (23 27) udvælges der desuden andre velegnede procedurer for metoderne, hvor større fortyndingsforhold, end dem anbefalet af producenterne, og en 85%/15% acetonitril/methanol solventsammensætning undersøges. Derudover er der valgt at inkludere 1% myresyre i denne acetonitril/methanol solventsammensætning, da alle producenter anbefaler anvendelsen af myresyre, se figur 5 i afsnit På grund af tidsbegrænsning, af hensyn til den prøvemængde der er til rådighed og det begrænsede antal plader, begrænses optimeringen til solventsammensætning og fortyndingsforholdet mellem solvent og prøvemateriale. Dermed optimeres der ikke på centrifugeringen af pladerne, ej heller undersøges effekten af flere skyl eller inddampning med nitrogen. Det besluttes at centrifugere alle plader ved 519 g i 10 min på baggrund af producenternes anbefaling. (23,24) Der anvendes centrifugering, da det ikke er muligt at benytte vakuum eller positivt tryk på KB3011. Der fremstilles to serumpools med koncentrationer på ~30 nmol/l og ~70 nmol/l, dermed optimeres metoderne ved to koncentrationer i det klinisk relevante område. (13,14) De to serumpools koncentrationsbestemmes af afdelingens Oasis HLB metode. Der udføres desuden Side 13 af 68

15 dobbeltbestemmelser, således at procedurernes reproducerbarhed kan bedømmes. Afvigelsesgrænserne for dobbeltbestemmelserne sættes til 10 %, ud fra afdelingens afvigegrænser for interne kontroller. (12) Der medtages kontroller og kalibratorer som beskrevet i analysevejledningen (12). Der medtages ikke kalibrator eller kontroller for hvert solvent og fortynding af hensyn til økonomien og det begrænsede antal plader. Grundet manglende kalibrator for de enkelte fortyndingsforhold kan der ikke laves en præcis koncentrationsbestemmelse og resultaterne kan dermed ikke sammenlignes med dem fra afdelingens Oasis metode. Den bedst egnede procedure for hver metode kan derfor kun vurderes ud fra chromatogrammernes udseende, niveauet af interferens, dobbeltbestemmelsernes overensstemmelser og signalstyrken Pilotforsøg Efter udvælgelse af den bedste procedure for de tre nye metoder, udføres et pilotforsøg for hver metode. Her medtages der kalibrator og en normal kontrol først og sidst i serien, sammen med en firdobbeltbestemmelse af hver af de to serumpools. Pilotforsøget giver dermed mulighed for at vurdere den enkelte procedure, inden metodesammenligningen i delforsøg 2 og udføre eventuelle justeringer Delforsøg 2 Metodesammenligning Oasis HLB analyseres efter afdelingens analysevejledning, mens de tre nye metoder ensartes med hensyn til rystning og centrifugering grundet tidsmangel. (12,23 25) Der ønskes også undersøgt hvorvidt metoderne tilbageholder analytten, og der udføres derfor et ekstra skyl, 2. gennemskyl, af pladerne. Efter første centrifugering tilsættes yderligere 500 µl acetonitril til hver brønd og pladen centrifugeres igen med ny opsamlingsplade. Dette eluat kan således undersøges for hvorvidt D-vitamin er blev tilbageholdt ved 1. gennemskyl. Grundet tidsmangel er disse plader ikke blevet analyseret, men er frosset ned til eventuel senere analysering. Til 2. gennemskyl er der valgt at anvende 500 µl organisk solvent i forhold til 1000 µl, da det i en undersøgelse udført af den ene producent (26), hvor begge voluminer testes, påvises at ved 1000 µl er der et gennembrud af phospholipider som er >1 %, hvor dette ikke ses ved 500 µl. Til metodesammenligningen af alle fire metoder medtages kalibrator, kontroller, en 7- punktskalibrator, eksterne kontroller, en serumpool, prøver indeholdende D3- og D2-vitamin og prøver kun indeholdende D3-vitamin. Side 14 af 68

16 Interne kontroller og kalibrator Der medtages interne kontroller og kalibrator som beskrevet i afdelingens analysevejledning. (12) Dette sikrer et stabilt grundlag for sammenligning af afdelingens Oasis metode med de nye metoder. 7-punktkalibrator Der medtages en 7-punktkalibrator der dækker hele måleområdet, således at lineariteten for alle fire metoder kan undersøges. Eksterne kontroller Der medtages fem 25(OH)D3 eksterne kontroller som tidligere er blevet analyseret af afdelingen. De målte værdier for hver kontrol sammenholdes med LC-MS/MS method mean. (28) Dermed fås en bias for de fire metoder i forhold til gennemsnittet af flere LC-MS/MS opsæt for 25(OH)D3. Det var ikke muligt at medtage eksterne kontroller indeholdende 25(OH)D2. Den beregnede bias % vurderes ud fra afdelingens acceptgrænser for interne kontroller, hvor 1 SD = 8 %. (12) Serumpool Der fremstilles en serumpool til impræcisionsbestemmelse med en ønsket koncentration på ~50nmol/L. Serumpoolen tilsættes i seks brønde, som herefter koncentrationsbestemmes på UPLC- MS/MS og gennemsnitlig koncentration, SD og CV% beregnes. Koncentrationen sættes til ~50 nmol/l da dette er referenceintervallets grænse. Det er, grundet manglende plads på pladen, begrænset antal plader og mangel på serum, ikke muligt at medtage serumpools i flere niveauer. Serumprøver indeholdende 25(OH)D3 og D2 Alle patientprøver omnummereres og dermed anonymiseres de i forhold rapportskrivning og databehandling. Antallet af serumprøver til metodesammenligningen fastsættes ud fra afdelingens Standard Operating Procedure, SOP028 vejledning til validering af analysemetoder (29) og Gerdes (30). Afdelingens SOP028 beskriver 60 prøver passende fordelt over måleområdet bør anvendes, og Gerdes beskriver prøver dog helst over 75. Der ønskes derfor at have prøver indeholdende begge analytter i metodesammenligningen. Halvdelen af prøverne i området nmol/l og den anden halvdel i området nmol/l, Side 15 af 68

17 således at hele måleområdet, nmol/l, dækkes. (12) Der vælges at have særlig fokus på den nedre del af måleområdet, da det kun sjældent er relevant at undersøge for forhøjet D-vitamin. (14) Udvalget af serumprøver er begrænset og overstående målsætning, om antallet af prøver, kan derfor ikke opnås. For at komme så tæt på som muligt, pooles serumprøver med lav volumen, således at den samlede volumen af ønskede koncentrationer bliver tilstrækkelig. Dermed øges antallet af prøver. For at dække måleområdet bedst muligt, fortyndes serumprøver der er over måleområdet og der fremstilles en fortyndingsrække af en høj kalibrator. Det ønskes at foretage dobbeltbestemmelse, da dette kunne afsløre tilfældige fejl, men grundet lav kapacitet er dette ikke muligt, hvis det høje antal af prøver skal opnås. Afdelingens SOP028 beskriver at resultaterne helst skal opnås over flere analyseserier (ca. 5), med hver deres kalibrering. Dette nedprioriteres grundet de høje omkostninger på pladerne og dermed et begrænset antal af disse, samt mangel på prøvemateriale og tid. Intern standard Til alle prøver tilsættes der en kendt mængde intern standard (IS), 26,27-hexadeuterium-25-hydroxy vitamin D3. IS har samme retentionstid og tilnærmelsesvis samme masseovergang som 25(OH)D3, dermed vil et tab af IS være lig med et tab af 25(OH)D3. Signalet for IS bruges i den endelige udregning af koncentrationen for begge analytter, selvom masseovergangene for 25(OH)D2 varierer fra IS. (12) Afdelingen har indkøbt 25(OH)D2-IS, men da denne ikke benyttes af afdelingen tages den heller ikke med i dette projekt Databehandling Hver enkelt ny metode sammenlignes med afdelingens Oasis HLB metode. Dette gøres i udgangspunkt med differensplot, x/y-plot og parret t-test. Resultater opnået med Oasis under dette projekt sammenlignes med resultater opnået på de samme prøver af afdelingen. Differensplottet i form af Bland-Altman plot vil fremstille forskellene i resultaterne grafisk mellem de enkelte nye metoder og Oasis. Desuden kan afvigelser for de enkelte prøver bedre vurderes, da deres størrelser og dermed kliniske relevans bedre kan illustreres. Bland-Altman plottet er valgt, grundet at differensen vises i forhold til middelværdien af resultaterne fra to metoder, da middelværdien er det bedre bud på en sand værdi end en enkelt resultatafgivelse af en metode. (31,32) Side 16 af 68

18 X/y-plottet giver mulighed for at kunne vurdere sammenhængen forskellige steder i måleområdet via lineær regression, såvel som at give mulighed for at vurdere sammenhængen matematisk ud fra regressionsligningen. Den parrede t-test vil give et tydeligt billede af om der er statistisk signifikant forskel mellem Oasis og de nye metoder, dog vil denne påvise selv meget små forskelle. α sættes til at være 0,05, hvorved p-værdier <0,05 vidner om statistisk signifikant forskel. Der beregnes CV% for serumpoolen, som vil give mulighed for at sige noget om metodens impræcision til koncentrationen ~50 nmol/l. (32) De fire metoders bias er afvigelsen fra method mean for de 5 eksterne kvalitetskontroller. (28) Dette giver et billede af metodernes korrekthed. 7-punktskalibratoren vil fortælle om metodens linearitet, og derved fortælle om metoden giver resultater lineært i hele måleområdet. 1.6 Kriterier for accept af en ny metode som alternativ til Waters Oasis HLB For at en ny metode kan accepteres, er der udarbejdet kriterier for denne at overholde. Disse tre kriterier er overholdelse af alle kontroller, en CV % for impræcisionsbestemmelsen der ligger indenfor afdelingens CV %accept, (13), og at variation af et resultat ikke varierer mere end én sværhedsgrad for D-vitaminmangel, som er angivet i afsnit Overholdelse af kontroller At alle kontroller overholdes, er et kriterie fra afdelingen for at en analyseserie kan godkendes. Derfor er dette medtaget i kriterier for accept af en ny metode. Impræcisionsbestemmelsen Til validering af den anvendte metode i dag, er der angivet en CV % accept på 12 %, hvorved en ny metode også skal kunne overholde dette. Impræcisionsbestemmelsen som er medtaget i alle fire metoders opsæt, skal derfor overholde CV% accept. Ikke klinisk relevante afvigelser fra Oasis HLB Da der altid vil være spredning af resultater der måles flere gange, er det valgt at koncentrationer opnået ved en ny metode ikke må afvige mere end én sværhedsgrad for D-vitaminmangel, se afsnit 1.4.1, i forhold til Oasis. Dette er begrundet i at afvigelser på én sværhedsgrad ikke vurderes til at have en betydelig påvirkning af behandlingen, da behandling af moderat D-vitaminmangel med en tilskudsdosis Side 17 af 68

19 beregnet til en let D-vitaminmangel stadig ville have en effekt. Denne afvigelse vurderes derfor til ikke at være klinisk relevant. (13) Overholder metoderne disse acceptkriterier, vurderes de til at kunne anvendes som alternativ til Waters Oasis HLB på Klinisk Biokemisk afdeling, KB3011 Diagnostisk center, på Rigshospitalet. 2. Materialer og Metode 2.1 Materialer Udstyr og apparatur Hamilton ML STARline prøveforberedelsesrobot Waters ACQUITY TQD Tandem Quadrapole UPLC-MS/MS System, apparat 1, bestående af: UPLC-del: Waters ACQUITY UPLC System MSMS-del: ACQUITY TQD Tandem Quadrapole mass spectrometers Detector Centrifuge: Rotana 460 RF, r = 150mm. Heat Sealer DWP Firkant Mikrotiterplade Masterblok 2 ml firkantet hul, 96 well, polypropylen, ufarvet. DWP Rund Mikrotiterplade Masterblok 1 ml rundt hul, 96 well, polypropylen, ufarvet. Rysteapparat til mikrotiterplader: MixMate 5353 fra eppendorf Plader til 25(OH)D3 og D2 oprensning Waters Oasis HLB Extraction Plate, 96-well Plate 30 µm (30mg). Lot nr.: 127A34303A Isolute Biotage PLD+, 50 mg, 96-well Plate. Lot nr.: KA-C Phenomenex Phree Phospoholipid Removal, 30mg/well, 96-well Plate. Lot nr.: S Waters Ostro, 96-well Plate, 25 mg 1/Pkg. Lot nr.: A Kontroller, kalibratorer og Intern Standard Serum Calibration Standard 25-OH-vitamin D 2/D 3: Chrom Systems. Lav Kontrol D 2/D 3: UTAK Quality control materials CLINICAL/FORENSIC. Normal Kontrol D 2/D 3: Recipe, ClinChek Control Level I. Høj Kontrol D 2/D 3: Recipe, ClinChek Control Level II. 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set D 2/D 3: Chrom Systems. Eksterne Kvalitetskontroller: 25-Hydroxyvitamin D. Samples: Lab No. 845 er LCMS-MS. Intern standard [ 2 H 6]-25OH vitamin D3. Synthetica AS, Norge, 99,7% isotop purity, 424,7 g/mol. Brugsopløsning 200 nmol/l (DVIT ISTD A1) Kemikalier og reagenser Til Hamilton SPE oprensning: SPE A2 (60% 2-Propanol / 40% Acetonitril). SPE A3 (21% 2-Propanol + 14% Acetonitril + 2% Myresyre). SPE B1 (21% 2-Propanol + 14% Acetonitril + 0,5% Ammoniak). SPE B2 (48% 2-Propanol + 32% Acetonitril + 0,5% Ammoniak). Side 18 af 68

20 Til LC-MS/MS: Solvent A1-Immuno (2mM ammoniumacetat, 0,1% myresyre I H 2O). Solvent B1-Immuno (2mM ammoniumacetat, 0,1% myresyre i methanol). Weak Wash needle, seal wash 90% Acetonitril. Strong Wash (Methanol 99,9%). Andre reagenser og kemikalier: Methanol 99,9% LC-MS Chromasolv. Acetonitril. 2-Propanol. 25% Ammoniak opløsning. Myresyre. Formic acid, ~ 98%. Ammonium acetat min. 99%. Type I H 2O (Fra Millipore anlæg Synergy UV ) Ethanol (Absolut alkohol 99,9%) Stamopløsning og brugsopløsning til tuning af udstyr mht. Vitamin D 2 og D mg/L nr.1. 26,27-Hexadeutericem-25-Hydroxy. Til IS D 3- vitamin. Argon gas (Kollisions gas til MS/MS) Kolonner UPLC kolonne. Waters Acquity UPLC HSS T3 kolonne. UPLC kolonne. Phenomenex Kinetex 2,6 µm C18 kolonne Prøvemateriale Prøvemateriale ifølge Analysevejledning for P-25- Hydroxy-vitamin D2 og P-25-Hydroxy-vitamin D3(12), er 1 ml serum taget med eller uden gel. Efter centrifugering og afpippetering er det opbevaret ved < - 20 C i ukendt tid. Side 19 af 68

21 2.2 Metode I de følgende afsnit beskrives hvordan fremgangsmåden for fremstilling af reagenser, kalibratorer, kontroller og optimeringer er foregået for udarbejdelse af delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold. Dernæst beskrives pilotforsøgets opsætning. Til sidst beskrives fremgangsmåden for delforsøg 2 Metodesammenligning Fremstilling af kontroller, kalibratorer, serumpool og reagenser Eksterne kontroller De 5 eksterne kontroller, Sample , findes i cryorør med et volumen på ~600 µl. Kontrollerne er analyseret af KB3011 i og derefter opbevaret ved -20 C i 4 mdr. Disse fortyndes med type I H2O i forholdet 1:2 for at opnå tilstrækkelig volumen af prøvematerialet. 7-punktskalibrator 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set D2/D3 fra Chrom Systems fremstilles ifølge indlægssedlen og rekonstitueres med 1,0 ml type I H2O, se bilag 2. Serumpool 30 nmol/l 25(OH)D3 serumpool: Patientprøver indeholdende 25(OH)D3 udvælges i området 18 til 60 nmol/l og pooles til at give en minimum volumen på 6,4 ml. 70 nmol/l 25(OH)D3 serumpool: Patientprøver indeholdende 25(OH)D3 udvælges i området 60 til 84 nmol/l og pooles til at give en minimum volumen på 6,4 ml. Resterende prøvemateriale fra begge serumpools pooles senere sammen til én serumpool på ~ 50nmol/L til delforsøg 2. Fortyndingsrække af høje serumprøver Serumprøver med ønskede koncentrationer men manglende materiale volumen, pooles sammen med andre serumprøver af tilsvarende koncentration til den ønskede volumen er opnået. Der fremstilles to fortyndede 25(OH)D3 serumprøver med koncentrationer på henholdsvis 200 og 250 nmol/l ud fra 25(OH)D3 serumprøve >500 nmol/l. Kontroller, kalibratorer og serumprøver opbevares i fryser ved -20 C. Reagenser Acetonitril, methanol og type I H2O fremstilles alle med intern standard, 26,27-hexadeuterium-25- hydroxy vitamin D3, i forholdet 1:625 ifølge analysevejledningen. (12) Side 20 af 68

22 Alle reagenser opbevares i Blue Cap solvent flasker i kølerum ved 2-5 C Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Figur 5 viser de valg der er taget til optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold for prøvematerialet. Producentens egne anbefalinger er også medtaget i forsøget, angivet med blåt. Figur 5 viser de solvent og fortyndingsforhold for serumpools, der er udvalgt for alle metoder; Waters Oasis HLB, Biotage Isolute PLB+, Waters Ostro og Phenomenex Phree. De felter der er markeret med blå er producentens anbefaling. De felter der er markeret med et kryds er den solventsammensætning og det tilsvarende fortyndingsforhold der undersøges på den angivne nye metode. (23 27) Fortyndingsforholdene er angivet som del prøvemateriale + del solvent. Reagenser fremstilles på forhånd. Der medtages kalibrator og kontroller i alle niveauer som følger afdelingens opsætning af Oasis metoden. (12) Prøvematerialet er de fremstillede 30 og 70 nmol/l serumpools. Der foretages dobbeltbestemmelse af hver solventsammensætning og fortyndingsforhold, hvorved der forekommer to identiske brønde for hvert optimeringssæt af de nye metoder, som ses i bilag 3. Side 21 af 68

23 Al afpippetering for de nye metoder foregår manuelt hvorimod opsætning af standard Oasis metoden foregår på Hamilton ML STARline prøveforberedelsesrobot. Præanalyse med de nye metoder, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree For Isolute og Phree afpippeteres der først solvent til alle brønde, hvorefter prøvemateriale tilsættes. For Ostro afpippeteres først prøvemateriale hvorefter solvent tilsættes. Dette er ifølge producenternes vejledninger. Alle nye plader fastsættes på en opsamlingsplade til analysering på LC-MS/MS med elastik og sættes på rysteapparatet, Mixmate 5353, til at rystes ved 700 RPM i 10 min. Derefter centrifugeres alle plader i Rotana 460 RF ved 1760 RPM, svarende til 519 g i 10 min. Efter centrifugering forsegles opsamlingspladerne for hver af de nye metoder med Pierce-it-Lite folie-ark på Heat sealer og er klar til analysering på LC-MS/MS. Analysering på UPLC-MS/MS apparat 3 Analysering på UPLC-MS/MS følger betjeningsvejledningen til Waters ACQUITY UPLC/TQD (8). Apparat 3 anvender en Phenomenex Kinetex C18 kolonne og har disse forudindstillede masseovergange: Masseovergangen der benyttes til måling af 25(OH)D3: 401,4 159,1 Masseovergangen der benyttes til måling af Intern Standard: 407,4 159,1 Retentionstiden for 25(OH)D3 er 1,73-1,74 minutter. Udvælgelse af mest optimale solventsammensætning og fortyndingsforhold til delforsøg 2 Den mest optimale solventsammensætning og fortyndingsforhold vælges ud fra en samlet vurdering af chromatogrammernes top, niveauet af interferens, dobbeltbestemmelserne og signalets styrke Pilotforsøg af udvalgte metoder Der medtages kalibrator og én normal kontrol i starten og slutningen af opsætningen. Der anbringes 4x 30 nmol/l serumpool og 4x 70 nmol/l serumpool i de resterende brønde på Isolute, Ostro og Phree pladerne fra delforsøg 1, som derefter rystes ved 700 RPM i 10 min. og centrifugeres ved 519 g i 10 min. Derefter analyseres pladerne på UPLC-MS/MS Delforsøg 2 Metodesammenligning Til alle metoder medtages der kalibrator og kontroller i alle tre niveauer som følger afdelingens Oasis HLB opsætning. (12) Der medtages en 7-punktskalibrering, 6PLUS1 Multilevel Serum Side 22 af 68

24 Calibrator Set D2/D3 fra Chrom Systems, og fem eksterne kontroller, sample Der medtages derudover en serumpool på ~50 nmol/l i seks brønde. Der findes 14 serumprøver indeholdende 25(OH)D2 med koncentrationer >10 nmol/l, som alle medtages uanset deres 25(OH)D3 indhold, hvorefter de resterende 54 brønde indeholder serumprøver af 25(OH)D3 med koncentrationer >10 nmol/l. Pladeopsætningen for delforsøg 2 kan ses i bilag 4. Biotage Isolute PLD+ Den udvalgte procedure, Acetonitril i fortyndingsforholdet 1+5, anvendes til alle brønde. Waters Ostro Den udvalgte procedure, Acetonitril i fortyndingsforholdet 1+3, anvendes til alle brønde. Phenomenex Phree Den udvalgte procedure, Acetonitril i fortyndingsforholdet 1+3, anvendes til alle brønde. Rysteapparat og centrifugering Alle plader fastsættes på deres respektive opsamlingsplade med elastik bånd og rystes på rysteapparatet, Mixmate 5353, ved 1200 RPM i 10 min. Derefter centrifugeres disse i Rotana 460 RF med 1760 RPM, svarende til 519 g, i 10 min. Efter endt centrifugering forsegles opsamlingspladerne med Pierce-it-Lite folie-ark på Heat sealer og er klar til analysering på UPLC-MS/MS. 2. gennemskyl af alle metoder Der foretages et ekstra skyl, 2. gennemskyl, af alle metoderne. Alle plader anbringes og fastsættes på deres respektive 2. gennemskyls opsamlingsplader og der tilsættes 500 µl Acetonitril til alle brønde og centrifugeres med 1760 RPM, svarende til 519 g, i 10 min. Tiden mellem tilsætningen af acetonitril og centrifugeringen forkortes mest muligt, da membranen allerede er blevet porøs og acetonitril vil derfor hurtigt passere igennem. Efter endt centrifugering forsegles opsamlingspladerne med Pierce-it-Lite folie-ark på Heat sealer og sættes i fryser ved -20 C. Analysering på UPLC-MS/MS apparat 1 Analysering på UPLC-MS/MS følger betjeningsvejledningen til Waters ACQUITY UPLC/TQD (8). Apparat 1 anvender en Waters Acquity UPLC HSS T3 kolonne og har disse forudindstillede masseovergange: Masseovergangen der benyttes til måling af 25(OH)D3: 401,4 365,4 Side 23 af 68

25 Masseovergangen der benyttes til måling af 25(OH)D2: 413,4 355,4 Masseovergangen der benyttes til måling af Intern Standard: 407,4 371,4 Retentionstiden for 25(OH)D3 er 1,77-1,78 minutter og for 25(OH)D2 er den 1,93 minutter. Der foretages ekstra målinger af de første fire brønde for alle fire metoder, som ikke medtages i vurderingen af resultaterne. Derefter analyseres alle metoder efter pladeopsætningen i bilag 4. 3 Resultater 3.1 Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Figur 6 viser vurderingen af chromatogrammerne fra delforsøg 1. For hver metode, Waters Oasis HLB, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree, er der fundet en procedure der er optimal i forhold til solventsammensætning og fortyndingsforhold, og er markeret med grøn. Disse procedurer arbejdes der videre med i delforsøg 2. Det ses at for alle metoder der anvender en procedure med methanol, er rækkerne markeret med grå, da disse procedurer ikke gav anvendelige chromatogrammer. Chromatogrammerne for den udvalgte procedure for hver metode ses i bilag 5-7. Side 24 af 68

26 Figur 6 viser vurdering af chromatogrammerne fra UPLC-MS/MS for alle tre metoder, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree fra delforsøg 1. Tallene og bogstaverne i yderste venstre kolonne, angiver fortyndingsforhold og solventsammensætning. A: Acetonitril My: 1% Myresyre Me: Methanol For dobbeltbestemmelserne angiver et + at metoden overholder max 10% afvigelse, mens et - angiver at metoden ikke overholder de max 10%. Den grønne række angiver hvad der er vurderet til at være den mest optimale solventsammensætning og fortyndingsforhold, som arbejdes videre med i delforsøg 2. Den grå række angiver solventsammensætning og fortyndingsforhold der ikke gav anvendelige chromatogrammer. Side 25 af 68

27 3.2 Delforsøg 2 Metodesammenligning Delforsøg 2 består af resultater for alle fire metoder: Waters Oasis HLB, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree. Chromatogrammer for tre udvalgte prøver med 25(OH)D3 koncentrationerne 31,7 nmol/l, 66,8 nmol/l og 97,4 nmol/l for hver af de fire metoder ses i bilag Procestiden for metoderne Under forsøgsperioden er forskellene i metodernes procestid blevet tydelige. Oasis HLB tager 4-5 timer at afvikle, efter reagenser og prøver har opnået stuetemperatur. De tre nye metoder tager sammenlagt 2-3 timer at afvikle, efter reagenser og prøver har opnået stuetemperatur. Dette giver en procestid på minutter for den enkelte nye metode. De enkelte procestrin for afdelingens Oasis metode og de tre alternative metoder er illustreret i figur 7. Side 26 af 68

28 Waters Oasis HLB Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree Tilsætning af acetonitrile m. intern standard til mikrotiterpladen Tilsætning af acetonitrile m. intern standard til hybrid SPE-pladen Tilsætning af kalibrator, kontroller og prøvemateriale til mikrotiterpladen Tilsætning af kalibrator, kontroller og prøvemateriale Mikrotiterpladen forsegles med folieark Mixing (10 min) Mixing (5 min) Opsamling i opsamlingsplade vha. Centrifugering (10 min) Centrifugering (25 min) Opsamlingspladen forsegles med folieark Konditionering af Waters Oasis HLB (2 trin) SPE A2 -> H 2 O Klar til analysering på UPLC-MS/MS Supernatanten fra mikrotiterpladen overføres til Waters Oasis HLB Vask (3 trin) SPE A3 -> H 2 O -> SPE B1 Eluering til opsamlingspladen (1 trin) SPE B2 Opsamlingspladen forsegles med folieark Klar til analysering på UPLC-MS/MS Figur 7 viser oprensningsprocessen for Waters Oasis HLB, metoden der anvendes i dag, sammenlignet med oprensningsprocessen med de nye hybrid SPE metoder der undersøges i dette projekt, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree Phospholipid Removal Plates. Side 27 af 68

29 Afvigelse i % Afvigelse i % Delforsøg 2 Interne kvalitetskontroller Til metodesammenligningen medtages 2 kontrol lav, 4 kontrol normal og 2 kontrol høj. For at analyseserierne kan godkendes, skal disse ligge indenfor 2 SD, dog må én værdi for hver type kvalitetskontrol ligge mellem 2 og 3 SD, ifølge de Westgard-baserede regler. (32) Afvigelsesgrænserne er indsat i nedenstående kontrolkort (figur 8.1-2), hvor 1 SD er svarende til 10 % afvigelse for lav kontrol, mens den for normal og høj kontrol er 8 %. Det skal bemærkes at et punkt i figur 8.1 og tre punkter i figur 8.2 ikke fremgår af figurerne, da disses afvigelser er >80 %. De nævnte punkter er alle relaterede til Phree og beskrives nærmere i figurteksten. Kontrolkort 25(OH)D 3 Kontrolkort 25(OH)D 2 48,0 40,0 32,0 24,0 16,0 8,0 0,0-8,0-16,0-24,0-32,0-40,0-48,0 Oasis Isolute 80,0 64,0 48,0 32,0 16,0 0,0-16,0-32,0-48,0-64,0-80,0 Oasis Isolute Ostro Phree Ostro Phree Oasis lav kontrol Isolute lav kontrol Oasis lav kontrol Isolute lav kontrol Ostro lav kontrol Phree lav kontrol Ostro lav kontrol Phree lav kontrol +/- 2SD +/- 3SD +/- 2SD +/- 3SD +/- 2SD lav kontrol +/- 3SD lav kontrol +/- 2SD lav kontrol +/- 3SD lav kontrol Figur 8.1 Kontrolkort for 25(OH)D3 for Waters Oasis HLB, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree. Der er 8 punkter for hver metode, svarende til 2 Kontrol Lav, 4 Kontrol Normal og 2 Kontrol Høj i nævnte rækkefølge. Punkt nr. 1 for Phenomenex Phree fremgår ikke grundet afvigelse på -100 %. 1 SD = 10 % for Kontrol Lav 1 SD = 8% for Kontrol Normal og Kontrol Høj n=8 for hver metode Figur 8.2 Kontrolkort for 25(OH)D2 for Waters Oasis HLB, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree. Der er 8 punkter for hver metode, svarende til 2 Kontrol Lav, 4 Kontrol Normal og 2 Kontrol Høj i nævnte rækkefølge. Punkt nr. 3, 5 og 6 for Phenomenex Phree fremgår ikke grundet afvigelser på henholdsvis -88,9, 204,7 og 98,3 %. 1 SD = 10 % for Kontrol Lav 1 SD = 8 % for Kontrol Normal og Kontrol Høj n=8 for hver metode Side 28 af 68

30 3.2.3 Delforsøg 2 25(OH)D3 Bland-Altman og x/y-plot for 25(OH)D3 Figur 9 viser Bland-Altman plot og x/y-plot for de fire sammenligninger for 25(OH)D3. Øverst ses sammenligningen af resultater afgivet af Waters Oasis HLB af KB3011 (Oasis R) og resultater målt under delforsøg 2 (Oasis P). Nedenunder ses de tre sammenligninger af de nye metoder, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree med Waters Oasis HLB fra delforsøg 2. Afvigelsesgrænserne er sat til 8, 16 og 24 %, svarende til henholdsvis 1, 2 og 3 SD, og er bestemt ud fra afdelingens afvigelsesgrænser for interne kontroller. På Bland-Altman plottet for Oasis ses at punkterne er jævnt fordelt på hver side af x-aksen og størstedelen af differensen ligger indenfor 16 %-afvigegrænsen. Dog ses der punkter >24 %- afvigelsesgrænsen, hvor Oasis har givet højere koncentration ved delforsøg 2 end af KB3011. På x/y-plottet for Oasis ses at tendenslinjens hældning er 1,01 og at den skærer y-aksen ved +4 nmol/l. Størstedelen af punkterne på Bland-Altman plottet for Isolute ligger under x-aksen, hvilket vidner om en tendens til at Isolute giver højere koncentrationer end Oasis. Det er hovedsageligt prøver med koncentrationer imellem nmol/l der ligger >24 % afvigelsesgrænserne, dog ses der en enkelt prøve >30 nmol/l der også ligger >24 %. På x/y-plottet for Isolute er tendenslinjens hældning 1,08, og skærer y-aksen ved 0,8 nmol/l. Det omvendte ses på Bland-Altman plottet for Ostro, hvor der er tendens til at give lavere koncentrationer end Oasis. Her ses afvigelser >24 % i hele måleområdet. Tendenslinjens hældning for Ostro er 0,82 og der ses at denne skærer y-aksen ved +4,3 nmol/l, desuden ses at tendenslinjen krydser identitetslinjen omkring 20 nmol/l. Phree er den eneste af de tre nye metoder der har p > 0,05, dog ses der langt flere og større afvigelser end ved de andre metoder på Bland-Altman plottet. Phree ser ikke ud til at give konsekvent højere eller lavere koncentrationer. På x/y-plottet ses at punkternes spredning for Phree er meget større end for de andre metoder, som også ses ved at tendenslinjen skærer y-aksen ved +18 nmol/l, men at hældningen er 0,9. Her ses at tendenslinjen krydser identitetslinjen omkring 160 nmol/l. Korrelationskoefficienten for Phree er kun 0,60 hvor de andre metoders korrelationskoefficient alle er 0,95. Side 29 af 68

31 Difference (nmol/l) (Oasis-Phree) Phree (nmol/l) Difference (nmol/l) (Oasis-Ostro) Ostro (nmol/l) Difference (nmol/l) (Oasis-Isolute) Isolute (nmol/l) Diff. (nmol/l) (Oasis R - Oasis P) Oasis P (nmol/l) 70,0 50,0 30,0 10,0-10,0-30,0-50,0-70,0 Oasis 25(OH)D 3 Bland-Altman plot Middelværdi (nmol/l) 200,0 150,0 100,0 50,0 Oasis 25(OH)D 3 x/y-plot y = 1,01x + 4,16 R² = 0,95 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 Oasis R (nmol/l) 70,0 50,0 30,0 10,0-10,0-30,0-50,0-70,0 Isolute 25(OH)D 3 Bland-Altman plot Middelværdi (nmol/l) 200,0 150,0 100,0 50,0 Isolute 25(OH)D 3 x/y-plot y = 1,08x + 0,81 R² = 0,98 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 Oasis (nmol/l) 70,0 50,0 30,0 10,0-10,0-30,0-50,0-70,0 Ostro 25(OH)D 3 Bland-Altman plot Middelværdi (nmol/l) 200,0 150,0 100,0 50,0 Ostro 25(OH)D 3 x/y-plot y = 0,82x + 4,33 R² = 0,97 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 Oasis (nmol/l) 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0-50,0-100,0-150,0-200,0 Phree 25(OH)D 3 Bland-Altman plot Middelværdi (nmol/l) 200,0 150,0 100,0 50,0 Phree 25(OH)D 3 x/y-plot y = 0,89x + 18,03 R² = 0,60 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 Oasis (nmol/l) Side 30 af 68

32 Figur 9. Bland-Altman plot og x/y-plot for 25(OH)D3. Øverst ses Bland-Altman plot og x/y-plot for sammenligningen af Waters Oasis HLB Projekt (P) og Oasis KB3011(R) (n=62). Nedenunder ses sammenligningerne af Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phnomenex Phree med Waters Oasis (P) (n=68). Bland-Altman plottene har indsat afvigelsesgrænser, hvor Grøn = 8 % afvigelse, Gul = 16 % afvigelse og Rød = 24 % afvigelse. Der er udført lineær regression på x/y-plottene. Alle tendenslinjer og deres forskrifter, korrelationskoefficienter og identitetslinjer fremgår af figuren. Punkter med koncentrationer >200 nmol/l fremgår ikke af figurerne, men kan ses i bilag 8. P-værdier: Waters Oasis HLB: P=0,0004 Biotage Isolute PLD+: P=0, Water Ostro: P=0, Phenomenex Phree: P=0,09 Impræcisionsbestemmelse Impræcisionen er bestemt for de fire metoder ved at analysere serum fra samme serumpool i 6 forskellige brønde, tabel 1. Der ses at Phree er den eneste metode der ikke overholder CV%accept=12%. (13) Tabel 1. Impræcisionsbestemmelse for Waters Oasis, Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree af 25(OH)D3 serumpool. n=6 for hver metode Side 31 af 68

33 Afvigelse fra Method Mean i % Afvigelse fra Method Mean i % Eksterne kvalitetskontroller De fire metoders bias er bestemt ved at måle på 5 eksterne kvalitetskontroller, med kendt koncentration af 25(OH)D3. Bias er beregnet ved at sammenholde det målte resultat og LC-MS/MS method mean. (28) Det ses på figur 10 at Phree har en høj bias % for samtlige kontroller, mens Oasis, Isolute og Ostro alle ligger tættere på method mean. Kun en enkelt prøve for Isolute ligger udenfor 16 %, svarende til mellem 2 og 3 SD for kontrollernes acceptintervaller. (12) Method Mean Bias % Oasis, Isolute, Ostro og Phree Method Mean Bias % Oasis, Isolute og Ostro 100,0 75,0 50,0 25,0 0,0-25,0-50,0-75,0-100,0 Oasis Isolute Ostro Phree +/- 2 SD +/- 3 SD 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0-5,0-10,0-15,0-20,0-25,0 Oasis Isolute Ostro +/- 2 SD +/- 3 SD Figur 10. De to diagrammer viser begge bias % for de 5 eksterne kvalitetskontroller, hvis koncentrationer ligger i området 32,8 til 144,0 nmol/l. I diagrammet til venstre fremgår alle fire metoder, mens Phree er fjernet i diagrammet til højre for bedre at illustrere forskellene i de øvrige tre metoders bias %. n=5 for hver metode Side 32 af 68

34 Ostro (nmol/l) Phree (nmol/l) Oasis (nmol/l) Isolute (nmol/l) 25(OH)D3 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set Lineariteten undersøges via x/y-plot for de fire metoder ved brug af en 7-punkts kalibrator med kendte koncentrationer af 25(OH)D3 (figur ). Tendenslinjens forskrift og identitetslinje er indsat i samtlige figurer. Der ses på figurerne at tendenslinjerne for Oasis og Isolute har en hældning på henholdsvis 0,98 og 1,05 og en god lineær sammenhæng med en korrelationskoefficient på 1,00. Ostro har også en korrelationskoefficient på 1,00, men en hældning på 0,89. Phree har en korrelationskoefficient på 0,97 og en hældning på 1,11. Korrelationskoefficienten for Phree viser en dårligere lineær sammenhæng imellem resultaterne end de andre tre metoder. Desuden ses det at Phree har punkter der ligger længere væk fra tendenslinjen i det lave måleområde, som dermed viser en dårligere linearitet i dette område. Oasis 25(OH)D 3 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 300,0 Isolute 25(OH)D 3 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 300,0 200,0 100,0 y = 0,98x + 2,17 R² = 1,00 200,0 100,0 y = 1,05x - 0,83 R² = 1,00 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) Figur 11.1 x/y-plot for Oasis ved brug af 7-punkts kalibrator med kendte værdier. n=7 Figur 11.2 x/y-plot for Isolute ved brug af 7-punkts kalibrator med kendte værdier. n=7 Ostro 25(OH)D 3 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 300,0 200,0 100,0 y = 0,89x + 4,08 R² = 1,00 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) Phree 25(OH)D 3 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 300,0 200,0 100,0 y = 1,11x - 8,02 R² = 0,97 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) Figur 11.3 x/y-plot for Ostro ved brug af 7-punkts kalibrator med kendte værdier. n=7 Side 33 af 68 Figur 11.4 x/y-plot for Phree ved brug af 7-punkts kalibrator med kendte værdier. n=7

35 3.2.4 Delforsøg 2 25(OH)D2 Bland-Altman og x/y-plot for 25(OH)D2 Figur 12 viser Bland-Altman plot og x/y-plot for de fire sammenligninger for 25(OH)D2. Øverst ses sammenligningen af resultater afgivet af Waters Oasis HLB af KB3011 (Oasis R) og resultater afgivet under delforsøg 2 (Oasis P). Derunder ses de tre sammenligninger af de nye metoder med Oasis. Afvigelsesgrænserne er sat til 8, 16 og 24 %, svarende til henholdsvis 1, 2 og 3 SD, og er bestemt ud fra afdelingens afvigelsesgrænser for kontroller. Bland-Altman plottene for Oasis, Isolute og Ostro har alle flere afvigelser >24 % i måleområdet 0-50 nmol/l, hvor de alle har en tendens til at give lavere koncentrationer. Phree har afvigelser >24 % i hele måleområdet. I x/y-plottene for Isolute og Ostro ses en stor spredning af resultaterne i måleområdet <50 nmol/l, mens der for Oasis ses en stor spredning i hele måleområdet og dermed også en korrelationskoefficient på 0,56. Phree har den laveste korrelationskoefficient på 0,18. Side 34 af 68

36 Difference (nmol/l) (Oasis-Phree) Phree (nmol/l) Difference (nmol/l) (Oasis-Ostro) Ostro (nmol/l) Difference (nmol/l) (Oasis-Isolute) Isolute (nmol/l) Diff. (nmol/l) (Oasis R - Oasis P) Oasis B (nmol/l) 50,0 25,0 0,0-25,0 Oasis 25(OH)D 2 Bland-Altman plot 150,0 100,0 50,0 Oasis 25(OH)D 2 x/y-plot y = 0,92x + 4,32 R² = 0,56-50,0 0,0 50,0 100,0 150,0 Middelværdi (nmol/l) 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 Oasis R (nmol/l) 50,0 25,0 Isolute 25(OH)D 2 Bland-Altman plot 150,0 Isolute 25(OH)D 2 x/y-plot 0,0-25,0 100,0 50,0 y = 1,11x - 9,80 R² = 0,95-50,0 0,0 50,0 100,0 150,0 Middelværdi (nmol/l) 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 Oasis (nmol/l) 50,0 25,0 Ostro 25(OH)D 2 Bland-Altman plot 150,0 Ostro 25(OH)D 2 x/y-plot 0,0-25,0 100,0 50,0 y = 1,20x - 7,63 R² = 0,97-50,0 0,0 50,0 100,0 150,0 120,0 80,0 40,0 0,0-40,0-80,0 Middelværdi (nmol/l) Phree 25(OH)D 2 Bland-Altman plot -120,0 0,0 50,0 100,0 150,0 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 150,0 100,0 50,0 Oasis (nmol/l) Phree 25(OH)D 2 x/y-plot y = 0,43x + 47,38 R² = 0,18 0,0 0,0 50,0 100,0 150,0 Middelværdi (nmol/l) Oasis (nmol/l) Side 35 af 68

37 Figur 12 Bland-Altman plot og x/y-plot for 25(OH)D2. Øverst ses Bland-Altman plot og x/y-plot for sammenligningen af Waters Oasis HLB Projekt (P) og Oasis KB3011(R) (n=11), nedenunder ses sammenligningerne af Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phnomenex Phree med Waters Oasis (P) (n=14). Bland-Altman plottene har indsat afvigelsesgrænser, hvor Grøn = 8 % afvigelse, Gul = 16 % afvigelse og Rød = 24 % afvigelse. Der er udført lineær regression på x/y-plottene. Alle tendenslinjer og deres forskrifter, korrelationskoefficienter og identitetslinjer fremgår af figuren. P-værdier: Waters Oasis HLB: P=0,71 Biotage Isolute PLD+: P=0,16 Water Ostro: P=0,57 Phenomenex Phree: P=0,15 Side 36 af 68

38 Ostro (nmol/l) Phree (nmol/l) Oasis (nmol/l) Isolute (nmol/l) 25(OH)D2 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set Lineariteten undersøges for de fire metoder ved brug af en 7-punktskalibrator med kendte koncentrationer af D2-vitamin, figur Tendenslinjens forskrift og identitetslinje er indsat i samtlige figurer. Figurerne viser alle en god lineær sammenhæng for metoderne Oasis, Isolute og Ostro, for D2-vitamin, hvor tendenslinjen ligger parallelt med identitetslinjen og korrelationskoefficienten er høj, 0,99. Phree har en dårligere lineær sammenhæng end de øvrige metoder. Oasis 25(OH)D 2 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 Isolute 25(OH)D 2 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 300,0 300,0 200,0 100,0 y = 0,93x + 0,38 R² = 1,00 200,0 100,0 y = 0,97x - 8,52 R² = 0,99 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) Figur 13.1 X/y-plot for resultater af en 7-punktskalibrator med kendte værdier, afgivet fra Oasis. Figur 13.2 X/y-plot for resultater af en 7-punktskalibrator med kendte værdier, afgivet fra Isolute. Ostro 25(OH)D 2 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 300,0 Phree 25(OH)D 2 x/y-plot 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set 400,0 300,0 200,0 100,0 y = 1,01x + 5,31 R² = 0,99 200,0 100,0 y = 0,84x + 12,00 R² = 0,98 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 Target Value (nmol/l) Figur 13.3 X/y-plot for resultater af en 7-punktskalibrator med kendte værdier, afgivet fra Ostro. Figur 13.4 X/y-plot for resultater af en 7-punktskalibrator med kendte værdier, afgivet fra Phree. Side 37 af 68

39 4. Diskussion I den følgende diskussion indgår integrering af chromatogrammer som er underlagt en vis usikkerhed. Integreringen besværliggøres ved højt interferensniveau, da det bliver uklart hvor analyttens top starter og slutter, og i nogle tilfælde fremstår analyttens top relativt mindre på grund af høje toppe fra ukendte interfererende stoffer. Et eksempel på dette ses på figur 14. Denne del af arbejdet er derfor meget præget af individuelle erfaringer. Chromatogrammerne for de nye procedurer i dette projekt bliver derfor vurderet ud fra toppens udformning og niveauet af interferens. 4.1 Delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold I figur 6 fremgår vurderingerne af de nye procedurer: Biotage Isolute, Waters Ostro og Phenomenex Phree. Procedurerne er vurderet mht. toppenes udformning, niveauet af interferens og dobbeltbestemmelsernes overensstemmelse. Med til udvælgelsen af den endelige procedure for de enkelte metoder indgår også signalstyrken for både prøve og IS Biotage Isolute PLD+ Den udvalgte procedure for Isolute er fortyndingsforholdet 1+5 og solventet acetonitril uden myresyre. Dette er bl.a. grundet de veldefinerede toppe for den lave og høje serumpool. Der ses dog også at flere af de andre procedurer har veldefinerede toppe. Proceduren med methanol m. 1 % myresyre og den lave serumpool for proceduren acetonitril (85 %) m. 1 % myresyre + methanol (15 %) m. 1 % myresyre har dog ingen toppe ved retentionstiden og derfor ekskluderes procedurer indeholdende ren methanol. Figur 14 er et eksempel på integrering af et chromatogram med dårligt defineret top og højt interferensniveau. Øverst ses chromatogrammet for 25(OH)D3 og nederst ses chromatogrammet for intern standard. En anden grund til at der er valgt at arbejde videre med 1+5 acetonitril er den lave interferens for begge serumpools, som kun ses for én anden procedure, 1+8 acetonitril. Denne procedure undersøges også af en af producenterne, (26) med gode resultater. Proceduren fravælges dog til dette projekt da det store volumen kan give problemer ved rystningen af prøven for at opnå Side 38 af 68

40 tilstrækkelig proteinfældning, samt påvirkning af reproducerbarheden af prøver med lave koncentrationer (<50 nmol/l) grundet det store fortyndingsforhold. Den fastslåede 10 % afvigelsesgrænse for dobbeltbestemmelserne er kun overholdt ved to procedurer: 1+5 acetonitril og 1+4 acetonitril m. 1 % myresyre. Da 1+4 acetonitril m. 1% myresyre har en lidt større interferens ved den lave serumpool, foretrækkes 1+5 acetonitril proceduren. Den udvalgte procedure for Isolute er 1+5 acetonitril uden myresyre, på trods af at det ifølge Ahmad et al. (33) er en meget vigtig komponent i SPE. Brugen af myresyre fravælges grundet den generelt lavere signalstyrke der ses for procedurer indeholdende myresyre sammenlignet med procedurer uden myresyre. Dette burde ikke være tilfældet, da Ahmad et al. (33) beskriver, at myresyren skal forhindre at analytten tilbageholdes af zirkonium-ionerne og dermed øge signalet, men da der ses det modsatte, uden nogen forklaring om hvorfor, fravælges brugen af 1 % myresyre. I et andet studie lavet af Neville et al. (34), finder de frem til, at tilstedeværelsen af syre ikke gør nogen forskel i forhold til ekstrahering af phospholipider, og dette bruges derfor som endnu et argument for at ekskludere brugen af myresyre Waters Ostro Den udvalgte procedure for Ostro er fortyndingsforholdet 1+3 med solventet acetonitril uden myresyre. Denne plade giver veldefinerede toppe for alle procedurer, undtagen ved anvendelse af ren methanol hvor der ikke fremkommer nogen top ved retentionstiden, og ren methanol fravælges derfor. Der ses også, at interferensmængden for chromatogrammerne er medium til lav eller ikke tilstede for alle øvrige procedurer og det gør det derfor svært at udvælge én procedure at arbejde videre med. Der ses dog at den udvalgte procedure, er den eneste procedure der overholder 10 % afvigelsesgrænserne sat for dobbeltbestemmelserne ved begge serumpools. Den udvalgte procedure er også anbefalet af Ostros producent, Waters, og det giver derfor godt grundlag for at vælge denne procedure at arbejde videre med, da den også overholder de tidligere beskrevne krav. mht. veldefineret top, lav interferens og overholdelse af afvigelser for dobbeltbestemmelser i begge serumpools. Med hensyn til om proceduren skal være med eller uden myresyre, ses der også for Ostro at procedurer med myresyre giver et lavere signal sammenlignet med proceduren uden myresyre. Myresyre fravælges derfor også for Ostro. Side 39 af 68

41 4.1.3 Phenomenex Phree Den udvalgte procedure for Phree er fortyndingsforholdet 1+3 med solventet acetonitril uden myresyre. Denne plade giver generelt veldefinerede toppe for alle procedurer undtagen dem indeholdende ren methanol, hvor kvaliteten af chromatogrammerne er utilstrækkelig og brug af denne fravælges derfor. Chambers et al. (35) undersøger tilstedeværelsen af lipider efter proteinfældning, hvor de sammenligner methanol og acetonitril. Her finder de at proteinfældning med methanol giver 40 % flere lipider i ekstraktet sammenlignet med acetonitril. Dette forklarer hvorfor anvendelse af methanol som organisk solvent giver øget matrix effekt og chromatogrammer med mere interferens, således at der opstår problemer med integrering af chromatogrammer. Producenten for Phree er dog den eneste af de tre pladers producenter (23 25) der anbefaler brugen af methanol som organisk solvent, derfor kunne det forventes at få resultater fra denne procedure. Udover den udvalgte procedure, har proceduren 1+5 acetonitril (85 %) + methanol (15 %) også en lav interferens og vurderes derfor til at være den næstbedste. Dette forsøg handler dog om at finde en hurtigere og enklere procedure, hvorved 1+5 acetonitril (85 %) + methanol (15 %) fravælges, da den kræver mere arbejde mht. reagensfremstilling. Den udvalgte procedure og proceduren 1+8 acetonitril m. 1 % myresyre er de eneste procedurer hvis dobbeltbestemmelse overholdes, dog kun for den høje serumpool. Da det høje fortyndingsforhold ved 1+8 vil give problemer mht. ryst af pladen, fravælges denne procedure. Den udvalgte procedure er også en af producentens anbefalinger (23) og giver derfor godt grundlag for at arbejde videre med denne. 4.2 Delforsøg 2 Metodesammenligning Interne kvalitetskontroller Af kontrolkortene på figur 8.1 og 8.2 fremgår afvigelserne for alle interne kvalitetskontroller i delforsøg 2 for henholdsvis 25(OH)D3 og D2. Af figurerne ses det at samtlige kontroller for Oasis ligger indenfor acceptgrænserne, dog ses at én 25(OH)D2 kontrol lav ligger imellem 2 og 3 SD, men godkendes da dette er indenfor de anvendte Westgard-baserede regler. (36) Da analyseserien med afdelingens Oasis metode dermed kan godkendes uden forbehold, bør et alternativ til Oasis ligeledes have samtlige kontrolmålinger indenfor acceptgrænserne. Side 40 af 68

42 Isolute kan godkendes for 25(OH)D3. Sammenlignes punkterne for Oasis og Isolute i figur 8.1 ses det at punkterne for Isolute er fordelt omkring 0, mens alle kontroller for Oasis, med undtagelse af én, er højere end target value. Da det er ønskværdigt at interserielle kontrolmålinger netop fordeler sig på begge sidder af 0, kan dette tyde på at Oasis har en systematisk fejl som Isolute ikke har. For 25(OH)D2 er billedet anderledes, her ligger punkterne for Oasis pænt fordelt omkring 0, mens Isolute har afgivet samtlige kontroller til at være lavere end target value. Isolutes analyseserie for 25(OH)D2 kan ikke godkendes da to kontrolmålinger, en kontrol lav og en kontrol normal, ligger udenfor 3 SD. Dog skal følgende bemærkes når figur 8.2 vurderes: KB3011 har oplevet at analysen for 25(OH)D2 har været præget af større usikkerhed end 25(OH)D3, specielt for prøver og kontroller med lave koncentrationer. Endnu vigtigere er det at bemærke at der i analyseopsætningen ikke indgår en IS for 25(OH)D2, men at koncentrationsbestemmelsen af denne analyt benytter sig af IS for 25(OH)D3. Afdelingen har indkøbt IS til 25(OH)D2, men denne er aldrig blevet taget i brug, hvorved sporbarheden forringes. Af disse to grunde mener vi, at 25(OH)D2 målinger og dermed figur 8.2 i dette projekt generelt må tilskrives en vis usikkerhed. Ostro kan ikke godkendes for 25(OH)D3, da begge kontrol lav ligger udenfor 2 SD. Det ses endvidere at alle kontroller er målt til at være lavere end target value, som tyder på systematiske fejl. Da analysen benytter sig af en 1-punktkalibrator kan det ikke udelukkes at en sådan fordeling af kontrolmålinger skyldes en bias fremkommet af kalibreringen. En 1-punktkalibrering kan kun vurderes ud fra afvigelsen mellem de to målinger af den samme kalibrator, dermed kan lineariteten ikke vurderes. Lineariteten kunne have været vurderet hvis en kalibrator med flere niveauer var blevet benyttet. Afdelingen har indkøbt en 7-punktkalibrator, men denne er aldrig blevet taget i brug. Ostro kan heller ikke godkendes for 25(OH)D2, da tre kontrolmålinger, her iblandt begge kontrol lav, ligger udenfor 3 SD. Phree kan ikke godkendes for 25(OH)D3. Kun to af de otte kontrolmålinger ligger indenfor 2 SD, endvidere ses at den ene kontrol lav har en afvigelse på -100 %. Dette skyldes at der på chromatogrammet ikke kunne udpeges nogen veldefineret top ved retentionstiden 1,77-1,78 min. Phree kan heller ikke godkendes for 25(OH)D2. Igen ses det at kun to ud af otte kontrolmålinger ligger indenfor 2 SD, endvidere ses afvigelser fra -88,9 % til 204,7 %. Da Phree generelt havde en Side 41 af 68

43 høj grad af interferens i delforsøg 2, se bilag 9-11, kan en del af størrelsen på disse afvigelser skyldes interferensens påvirkning af integreringen af chromatogrammerne. Udelukkende ud fra kontrolkortene for interne kontroller, vurderes Isolute til at være det bedste og måske eneste alternativ til Oasis Metodesammenligning af 25-Hydroxy-Vitamin D3 Waters Oasis HLB Der ses på Bland-Altman plottet, figur 9, at resultater fra Oasis målt under delforsøg 2 på apparat 1 ligger lavere end tilsvarende resultater fra Oasis målt af KB3011 på apparat 3. Dette er dog ikke nok til at tyde på en systematisk variation af apparaterne, da der også er mange resultater der ligger over 0. Størstedelen af disse punkter ligger indenfor 16 % afvigelse, dog ses der seks punkter (n=62) som ligger >24 % afvigelse. En forklaring på dette kan være, at apparat 1 anvender en mere følsom kolonne, hvormed den øgede følsomhed gør at apparatet måler højere koncentrationer sammenlignet med apparat 3. Der er dog også resultater der måles lavere på apparat 1, som ligeledes kan skyldes den øgede følsomhed. Dette kan skyldes at den øgede følsomhed medfører et øget signal af analyt samtidig med at andre signaler også øges, hvorved chromatogrammer kan blive mere præget af interferens. Den øgede mængde af interferens bevirker at der ses flere toppe tæt på retentionstiden og at signalet for analytten bliver maskeret under interferensen, dermed påvirkes integreringen og den følgende koncentrationsbestemmelse. Variationen på resultaterne kan også skyldes opbevaringen af prøverne, da afpippeterede serumprøver kun har en holdbarhed på 6 måneder ved <-20 C (3,12), og prøverne i dette projekt kan have været opbevaret længere end 6 måneder. Den egentlige grund til disse afvigelser kendes ikke og betragtes derfor som et udtryk for metodens reproducerbarhed. Tendensen til at de to apparater ikke måler ens ses også på p-værdien 0,0004, dermed ses statistisk signifikant forskel. I x/y-plottet for disse målinger ses der en korrelationskoefficient på 0,95 og dermed en god lineær sammenhæng. Der ses at tendenslinjen har en hældning på 1,01, hvormed de to metoder har givet meget ens resultater. Da skæringen af y-aksen er over 0 nmol/l, understøtter dette at delforsøg 2 har givet højere resultater end KB3011. Side 42 af 68

44 Biotage Isolute PLD+ I Bland-Altman plottet for Isolute, figur 9, ses der en tendens til at Isolute giver højere koncentrationer end Oasis, da størstedelen af punkterne ligger under x-aksen. Størstedelen af disse afvigelser er dog <16%. Isolutes tendens til at give højere koncentrationer end Oasis ser ud til at være en systematisk fejl, som også ses i x/y-plottet, hvor tendenslinjens hældning er 1,08, der ses dog en god lineær sammenhæng med en korrelationskoefficient på 0,98. P-værdien ligger også langt under det fastsatte α=0,05 og der konkluderes at Isolute giver koncentrationer statistisk signifikant forskelligt fra Oasis. Ved koncentrationerne nmol/l ses der flere afvigelser >24 % end i resten af måleområdet. Da disse afvigelser ses på begge sider af 0, tyder det ikke på en systematiske fejl i dette område. Der forventes også større variationer i dette område da chromatogrammer her er svære at vurdere grundet relativt højere interferensniveau. Disse afvigelser kan også skyldes den høje fortynding af prøvematerialet med organisk solvent, der anvendes ved Isolute hvor fortyndingsforholdet er 1+5 til forskel fra Oasis hvor forholdet er 1+2. Det er vist at analyseusikkerheden stiger ved lavere koncentrationer. (12) Der ses kun to punkter (n= 68) med afvigelser >24 % i måleområdet over 30 nmol/l som tilskrives tilfældige fejl. Waters Ostro I Bland-Altman plottet for Ostro, figur 9, ses at Ostro i næsten alle tilfælde giver resultater lavere end Oasis. Denne tendens til at give lavere resultater sås også ved kontrolmålingerne. Forskellene her menes at skyldes en systematisk fejl ved metoden, da tæt på alle målinger ligger lavere end ved Oasis. Dette underbygges også af tendenslinjens hældning på 0,82 i x/y-plottet. Dog ses en god lineær sammenhæng med en korrelationskoefficient på 0,97. Disse variationer menes at kunne forårsages af to ting: Som tidligere nævnt kan det skyldes fejl i kalibreringen. Hvis begge målinger af kalibratoren ved tilfældige fejl har givet et højt signal, vil dette have medført at samtlige resultater i analyseserien vil blive falsk for lave, selvom afvigelsen mellem de to målinger er overholdt. En anden grund til at Ostro giver lavere resultater kan være at analytten bliver tilbageholdt i pladen da signalstyrken for prøverne her er halveret, sammenlignet med tilsvarende prøver på Oasis. Da signalstyrken for IS på Ostro er uændret, sammenlignet med tilsvarende prøver på Oasis, kan dette dog ikke være tilfældet, da IS ikke er bundet til et transportprotein men ellers gennemgår samme oprensning med Ostro pladen. Dermed burde dens signalstyrke også falde hvis pladen tilbageholder Side 43 af 68

45 analytten. En utilstrækkelig frigivelse af 25(OH)D3 fra transportproteinet og derfor en utilstrækkelig proteinfældning eller rystning af pladen, kan derimod forklare disse resultater. Den endelige grund til denne systematiske fejl kan dog ikke fastslås ud fra resultater fra dette projekt. At de to metoder giver statistisk signifikant forskellige koncentrationer ses også ved at p-værdien er langt under 0,05. I forhold til Isolute hvor de største afvigelser, >24 %, ses i det lave måleområde, ses store afvigelser på Ostro i hele måleområdet, hvilket fortæller at det ikke kun er analyseusikkerheden i det lave måleområde som forårsager det. Det tyder på at oprensning af 25(OH)D3 med denne metode, med den anvendte procedure, ikke er tilstrækkelig. Phenomenex Phree Bland-Altman plottet for Phree, figur 9, viser differensen imellem resultater givet fra Phree og Oasis, hvor der i forhold til de tidligere to metoder med systematiske fejl, ikke ses noget systematisk men rettere tilfældige fejl igennem hele måleområdet. Dette ses ud fra, at en stor del af resultaterne ligger udenfor 24 % afvigelsesgrænserne uden at der ses nogen sammenhæng for om dette skyldes koncentrationen, som ved Isolute. I x/y-plottet ses der ligeledes at den lineære sammenhæng er dårlig, med en korrelationskoefficient på 0,60, som her understøtter den tilfældighed der ses på Bland-Altman plottet. Tendenslinjens forskrift viser at linjen skærer y-aksen ved +18 nmol/l, som vidner om at Phree giver højere koncentrationer end Oasis, men grundet den dårlige lineære sammenhæng kan der ikke siges noget konkret om hvordan metoden giver koncentrationer ud fra tendenslinjens hældning. Phree er dog den eneste plade der giver en p-værdi >0,05, hvorved de to metoder ikke giver statistisk signifikant forskellige resultater. De tidligere metoder har haft en p-værdi <0,05 da de har givet resultater forskelligt fra Oasis, Isolute højere og Ostro lavere, men i Bland-Altman plottet ses der at en stor del af resultaterne fra Phree afviger imellem ± % og nogle endda op imod 200 %. Denne store spredning bevirker at p-værdien bliver >0,05. I Bland-Altman plottet ses der nogle punkter der tilsammen udgør en linje der starter ved 0 nmol/l og stiger lineært til omkring 100 nmol/l til en afvigelse på 200 nmol/l. Disse punkter ses også i x/y-plottet liggende på x-aksen, og er alle resultater hvor Phree har givet koncentrationen til 0 nmol/l, imens Oasis har givet koncentrationer fra 0 nmol/l til omkring 100 nmol/l. Der ses generelt meget større og flere afvigelser for Phree end de andre to metoder. Side 44 af 68

46 Signalstyrken for prøver fra Phree er omkring 5 gange lavere end Oasis, derfor har det været svært at integrere chromatogrammerne, da disse var præget af meget baggrundsstøj og interferens. Dette har været medvirkende til de store og mange tilfældige fejl, da det for mange prøver ikke kunne vurderes hvor analyttens top befandt sig og dermed heller ikke hvor den startede og sluttede. I modsætning til Ostro er signalstyrken givet fra Phree, lav for både analyt og IS. Dette kan indikere at selve pladen har tilbageholdt analyt og IS og at der derfor er en systematisk fejl med metoden der forklarer de store afvigelser. Grunden til at Phree muligvis har tilbageholdt 25(OH)D3 og IS er ukendt. Det er også en mulighed at Phree ikke har tilbageholdt phospholipiderne som den burde, hvorved den store interferens kan forklares. Tilstedeværelsen af phospholipider i prøven kan medføre falsk for lave resultater grundet hæmmet ionisering af 25(OH)D3 ved ESI, samtidig med at deres retentionstider overlapper 25(OH)D3, hvorved det bliver svært at adskille disse i et chromatogram. (7) Impræcisionsbestemmelse For impræcisionsbestemmelsen af serumpoolen, tabel 1, benyttes en CV% accept på 12 %, da dette er hvad Oasis HLB er valideret ud fra. (13) Med en CV% på 2,8 overholder Oasis dette CV% accept, som er hvad de tre alternativer vil blive sammenlignet med. Både Isolute PLD+ og Ostro overholder dette, med en CV% på henholdsvis 11,3 og 7,0 %. Phree overholder ikke CV% accept, med en CV% på 30,6. Ud fra impræcisionsbestemmelsen alene, vurderes Isolute og Ostro til at være brugbare alternativer. Yderligere ses at gennemsnittet af de seks målinger er 57,2 nmol/l for Oasis. Gennemsnittet for Ostro afviger -8,9 nmol/l fra Oasis, igen ses det altså at Ostro giver lavere koncentrationer end det forventede. Til sammenligning afviger Isolute kun -1,1 nmol/l fra Oasis Eksterne kvalitetskontroller Figur 10 viser den procentvise bias (Bias %) fra method mean for Oasis, Isolute, Ostro og Phree. (28) Oasis har en bias fra -8,5 til 10,7 %, som de tre alternativer sammenlignes med. Isolute har bias fra -15,6 til 16,5 % og Ostro fra -15,5 til 5,5 %. Phree har en væsentlig større bias fra -100,0 til 70,9 %. Den store bias % for Phree vidner om en høj grad af tilfældige fejl. Acceptintervallerne for KB3011 for interne kvalitetskontroller overføres til de eksterne kvalitetskontroller fra DEKS. Dermed kan de eksterne kontroller for Oasis og Ostro godkendes, Side 45 af 68

47 med alle indenfor +/-2SD. De eksterne kontroller for Isolute godkendes også, da alle ligger indenfor +/-2SD med undtagelse af en, som ligger imellem 2 3SD. Phree godkendes ikke, da kun én kontrol ligger indenfor 3 SD Hydroxy-Vitamin D3 7-punktskalibrator linearitetsbestemmelse Waters Oasis HLB På figur 1.1 ses en linearitetsbestemmelse for Oasis ved måling af 7 forskellige kendte koncentrationer. Det fremgår tydeligt af figuren at Oasis linearitet er nær perfekt i hele måleområdet for 25(OH)D3, med en korrelationskoefficient på 1,00. Grafisk er der ingen forskel mellem tendenslinjen og identitetslinjen, og tendenslinjens forskrift er 0,98x+2,17. Oasis sætter dermed en høj standard som de tre alternative metoder skal måle sig op imod. Biotage Isolute PLD+ På figur 11.2 ses samme linearitetsbestemmelse for Isolute. Det ses her at Isolute s lineære sammenhæng, for 25(OH)D3, er lige så god som Oasis med en korrelationskoefficient på 1,00. Den øgede tendens til at lave tilfældig fejl i området nmol/l, som sås i Bland-Altman plottet, figur 9, fremgår ikke af linearitetsbestemmelsen. Da Bland-Altman plottet er fremkommet ved at sammenligne resultater fra Oasis og Isolute, mens linearitetsbestemmelsen er fremkommet ved at sammenligne Isolute med sande værdier, kan nogle af de tilfældige fejl i Bland-Altman plottet skyldes tilfældig fejl fra Oasis. Dog skal det bemærkes at linearitetsbestemmelsen kun har tre målinger i området 0-47 nmol/l. I modsætning til Oasis ses der en forskel mellem tendenslinjen og identitetslinjen, da tendenslinjens hældning er 1,05. Det tyder på at Isolute giver lidt forhøjede værdier ved høje koncentrationer. Det skal bemærkes at analysens måleområde kun dækker nmol/l, mens linearitetsbestemmelsen går fra 0-368,0 nmol/l. I det klinisk relevante område, 80 nmol/l, viser Isolute en god overensstemmelse mellem de målte og sande værdier, og linearitetsbestemmelsen giver ingen anledning til ikke at anvende denne metode som et alternativ til Oasis. Ostro Den lineære sammenhæng mellem punkterne i figur 11.3, er med en korrelationskoefficient på 1,00, lige så god som ved Oasis. Dog ses der, som i Bland-Altman og x/y-plottet, figur 9, at Ostro giver for lave værdier og at denne forskel øges når koncentrationen af 25(OH)D3 stiger. Det skal dog bemærkes at målinger i det klinisk relevante område ikke afviger i forhold til den sande værdi. Side 46 af 68

48 Der ses altså afvigelser i det høje område både for Isolute og Ostro, som henholdsvis giver koncentrationer for højt og for lavt. Sammenlignes disses hældninger fra figur 11.2 og 11.3, ses at Isolute s tendenslinjes hældning er forskellig fra 1 med +0,05, mens samme forskel for Ostro er -0,11. Hældningsforskellen er altså dobbelt så stor for Ostro. Ses der udelukkende på linearitetsbestemmelsen af de to metoder, vurderes Isolute til at være det bedste alternativ til Oasis. Phree Phree s linearitet vurderes ud fra figur 11.4, hvor de syv punkter, med en korrelationskoefficient på 0,97, har en dårligere lineær sammenhæng end Oasis. Selvom korrelationskoefficienten ikke er meget forskellig fra 1, ses alligevel at punkterne i det klinisk relevante område afviger meget fra tendenslinjen. Sammenlignet med Oasis er lineariteten for Phree dårlig, og derfor vurderes Phree endnu en gang til ikke at kunne anvendes som alternativ til Oasis Metodesammenligning af 25-Hydroxy-Vitamin D2 Figur 12 er Bland-Altman plots der viser afvigelserne for de fire metoder. Der ses på figuren at Oasis, Isolute og Ostro alle har de største afvigelser, >24 %, i det lave måleområde op til 50 nmol/l. Der ses ikke afvigelser >24 % over dette område. Denne højere forekomst af afvigelser for 25(OH)D2 resultater er forventet, da der ikke medtages nogen 25(OH)D2-IS og der i stedet anvendes 25(OH)D3-IS. Integrering af chromatogrammer starter normalt med integrering af 25(OH)D3, hvorved arealet under kurven for 25(OH)D3-IS fastsættes. Derefter foretages integrering af 25(OH)D2 ud fra 25(OH)D3-IS, som grundet det tidligere fastsatte areal under kurven for 25(OH)D3-IS og analytternes forskellige retentionstid, besværliggør den subjektive integrering af chromatogrammerne og forekomsten af tilfældige fejl stiger. Da 25(OH)D2-IS ikke medtages forringes sporbarheden, derfor bliver mængden af tabt analyt og dermed koncentrationsbestemmelsen svær vurdere og et reelt problem. Som tidligere diskuteret, har KB3011 indkøbt IS til 25(OH)D2, men denne er ikke taget i brug endnu. Der vurderes dermed at integrering af 25(OH)D2 chromatogrammerne og dermed koncentrationsbestemmelsen ikke kan forventes at være bedre uden anvendelse af 25(OH)D2-IS. X/y-plottene viser også at resultaterne afviger mere i det lave måleomåde og at Oasis har en korrelationskoefficient på 0,56, hvorimod Isolute og Ostro har en god lineær sammenhæng, korrelationskoefficient 0,95. Side 47 af 68

49 Den dårlige lineære sammenhæng for Oasis og afvigelserne ved lave koncentrationer på figur 12 kan skyldes forskellene i de to apparater der benyttes, se metodeafsnittet. P-værdien for alle fire metoder er >0,05, hvorved der ikke er statistisk signifikant forskel på resultaterne. Med udgangspunkt i disse resultater, vurderes Isolute og Ostro til at være acceptable alternativer til Oasis til oprensning af 25(OH)D2, men for at opnå tilstrækkelig reproducerbarhed og for at minimere den analytiske usikkerhed, anbefales det at der medtages 25(OH)D2-IS til denne analyse. 25(OH)D2 resultater afgivet fra Phree vurderes til at være uacceptable grundet en korrelationskoefficient på 0, Hydroxy-Vitamin D2 7-punktskalibrator linearitetsbestemmelse Lineariteten i området nmol/l er grafisk fremstillet i x/y-plottene i figur Figur 13.1 er for Oasis og viser at denne metode har en korrelationskoefficient på 1,00 og tendenslinjens forskrift er 0,93x+0,38. Som for linearitetsbestemmelsen for 25(OH)D3, ses der ikke store afvigelser i det lave måleområde. Dette tyder på at forskellene der ses i Bland-Altman og x/y-plottet skyldes forskel på apparaterne. Figur viser lineariteten for de tre nye metoder der alle har en korrelationskoefficient 0,98. Isolute skærer y-aksen ved -8,5 nmol/l, men afvigelserne vurderes til at være så små at de ikke er klinisk relevante, med følgende begrundelse: En spredning på 8,5 nmol/l varierer ikke mere end én sværhedsgrad for D-vitaminmangel, hvorved det ikke vil have en betydning for behandlingen af patienten og dermed ikke er klinisk relevant, nærmere beskrevet i afsnit 1.6 Kriterier for accept af en ny metode som alternativ til Waters Oasis HLB. Lineariteten for Isolute og Ostro vurderes dermed til at være acceptable. Selvom linearitetsundersøgelsen for 25(OH)D2 i figur 13.4 ikke giver en direkte anledning til at afskrive Phree som alternativ til Oasis, skal det bemærkes at lineariteten for Phree er ringere end for nogen af de øvrige tre metoder. Side 48 af 68

50 4.3 Samlet vurdering af Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree som alternativ til Waters Oasis HLB For at opfylde målet med projektet skal de nye metoder først og fremmest være tidsbesparende i forhold til den nuværende metode. På figur 7 ses et flowchart over processen for Oasis HLB sammenlignet med processen for de tre nye metoder. Af figuren fremgår det tydeligt at de nye metoder er langt hurtigere end den nuværende. Oasis bruger sammenlagt 20 minutter mere på mixing og centrifugering og dertil kommer to trin for at klargøre SPE kolonnen, overførsel af supernatanten til SPE-pladen, tre vaske-trin og et eluerings-trin. Udover at selve processen er forkortet ved de tre nye metoder er klargøringen og reagensfremstillingen også langt nemmere. Til Oasis benyttes der samlet tre forskellige plader og seks forskellige reagenser, hvorimod det kun er nødvendigt med to plader og ét enkelt reagens ved de nye metoder. Udover selve procestiden, spares der altså også tid ved klargøringen, samtidig med at omkostningerne til reagenser er lavere. Alle tre nye metoder er derfor gode alternativer til Oasis, hvis målet alene er at forkorte procestiden. Det er dog også et klart mål for projektet at forskellen på resultaterne fra de nye metoder og Oasis ikke må være så store at de ændrer den kliniske konklusion ud fra resultaterne, samt at chromatogrammerne for alternativet er af en sådan kvalitet at arbejdet med disse ikke besværliggøres unødvendigt. I bilag 9-11 ses eksempler på chromatogrammer fra alle fire metoder. Oasis HLB, Isolute PLD+ og Ostro producerer i alle tilfælde veldefinerede toppe ved den forventede retentionstid (+/- 0,01 min). Toppene for disse tre metoder er desuden nemme at adskille fra den interferens der forekommer. Chromatogrammerne for Isolute er generelt præget af mere interferens end Oasis og Ostro, dog besværliggør dette på intet tidspunkt integreringen af disse. Phree har et meget højere niveau af interferens end nogen af de øvrige metoder, derudover er retentionstiden ofte forskellig fra det forventede (>0,04 min). I visse tilfælde er der to toppe tæt omkring den forventede retentionstid hvilket i høj grad besværliggør integreringen af chromatogrammerne. Desuden ses det i flere tilfælde at interferensen er så høj at der ikke kan lokaliseres en top for analytten. Det overstående, samt utilstrækkelig overholdelse af kriterierne om overholdelses af kontroller, overholdelses af CV% accept og ikke klinisk relevante afvigelser fra Oasis HLB fastsat i afsnit 1.6, Side 49 af 68

51 gør at Phree udelukkes som et alternativ til Oasis, mens både Isolute s og Ostro s chromatogrammer vurderes til at være af tilpas høj kvalitet til ikke at påvirke resultatafgivelsen. Phree kan dog kun afskrives for den udvalgte procedure, da det ikke kan udelukkes at proceduren kan optimeres, således at de tilfældige fejl fjernes. I et studie af Tulipani et al. (37) vurderes Phree og Ostro til at være lige gode til at fjerne phospholipider. Studiet havde til formål at etablere en tidseffektiv metode til fjernelse af phospholipider fra plasma til analyse på LC-MS/MS via hybrid SPE. I studiet optimeres Phree og Ostro s fortyndingsforhold, og det beskrives at dette gøres ud fra producenterns anbefalinger ved forholdene 1+5, 1+8 og At dette er ud fra producenternes anbefaling, modstrider det der er oplyst af producenterne i bilag 1. Tulipani et al. finder at fortyndingsforholdet 1+11 med acetonitril m. 1 % myresyre er optimalt for både Ostro og Phree. De konkluderer desuden at Ostro kun er marginalt bedre til at fjerne phospholipider end Phree. Dette viser at Phree kan optimeres yderligere for at give et tilfredsstillende resultat. Der sås for metodesammenligningen af Ostro og Oasis for 25(OH)D3, at Ostro for interne og eksterne kontroller, impræcisions- og linearitetsbestemmelsen, giver lavere resultater end forventet. Denne forskel vurderes ud fra de opstillede kriterier i afsnit 1.6, til ikke at være klinisk relevant, dog medfører den at de interne kvalitetskontroller for 25(OH)D3 ikke kan accepteres. Af den grund afskrives Ostro også som alternativ til Oasis. Det skal bemærkes at Ostro afskrives som brugbart alternativ på grund af de interne kontroller alene, og at alle øvrige kriterier er overholdt. I dette projekt afskrives Ostro muligvis grundet en tilfældig fejl i kalibreringen, derfor kan det ikke afvises at metoden kan benyttes som et alternativ til Oasis. I et studie af Neville et al. (34) sammenlignes flere forskellige metoder til at fjerne phospholipider fra plasma til analyse på LC- MS/MS, heriblandt Ostro og Oasis. For Ostro benyttes der acetonitril m. 1 % myresyre i forholdet 1+3, altså meget tæt på den procedure der anvendes i dette projekt, hvorimod proceduren for Oasis HLB er anderledes ved at anvende methanol til proteinfældning. Desuden benytter de inddampning med nitrogen med efterfølgende rekonstituering, for at ensarte deres målinger på LC-MS/MS. I studiet måles der kun på phospholipider med cholin hoveder, hvor de finder at Ostro fjerner 100 % af de undersøgte phospholipider, mens Oasis HLB kun tilbageholder 87 %. Her vises det altså at Ostro fjerner phospholipider bedre end Oasis, under lignende betingelser som i dette projekt. Dette underbygger teorien om at der er sket en tilfældig fejl i kalibreringen eller at Side 50 af 68

52 proteinfældningen har været utilstrækkelig, således at 25(OH)D3 ikke er blevet frigjort fra transportproteinerne. En utilstrækkelig proteinfældning vurderes dog til at være usandsynlig, da den er tilstrækkelig for Oasis og Isolute. Det sidste alternativ til Oasis HLB i dette projekt er Isolute PLD+. Denne metode overholder acceptintervallerne for 25(OH)D3, ved de interne og eksterne kontroller samt CV% accept. Desuden har metoden en god linearitet i hele måleområdet. I sammenligningen med Oasis ses at Isolute generelt giver for høje koncentrationer, denne forskel vurderes kun til at være klinisk relevant for to ud af 68 resultater. Disse to resultater ligger i det lave måleområde, 10 30nmol/L, hvor afvigelserne vurderes til at være potentielt klinisk relevante, figur 9. Deres afvigelser på henholdsvis +13,8 og -14,5 nmol/l, er store nok til at variere mere end én sværhedsgrad for D-vitaminmangel. Dog er målte koncentrationer afgivet fra både Oasis og Isolute enten i moderat eller alvorlig D-vitaminmangel, og kriterierne for afsnit 1.6 kan dermed vurderes til at være overholdt, da variationen af resultaterne i dette tilfælde ikke har klinisk relevans. Denne store usikkerhed i det lave måleområde menes at skyldes det høje fortyndingsforhold (1+5), hvilket bevirker at den relative koncentration der måles af LC-MS/MS bliver betydeligt lavere end ved Oasis (1+2). Denne mistanke menes at være begrundet i at KB3011 netop har erfaring med at der er større usikkerhed ved lave koncentrationer. Tulipani et al. (37) siger at de ikke finder tegn på at deres høje fortyndingsforhold (1+11) bevirker et signifikant tab af analytten. Det skal dog bemærkes at deres studie ikke inkluderer 25(OH)D. Isolute PLD+ er det eneste alternativ der overholder alle kriterier for 25(OH)D3, og vurderes dermed til at være et brugbart alternativ til Oasis HLB for denne analyt. Mens Oasis overholdt interne kontrollerne for 25(OH)D2, har vi i dette projekt ikke kunnet godkende de interne kontroller for 25(OH)D2 for de tre nye metoder. Da der ingen 25(OH)D2-IS er med i dette projekt, og dermed meget lav sporbarhed for denne analyt, er det begrænset hvor godt projektet kan konkludere på de tre nye metoders evne til at oprense 25(OH)D2. Side 51 af 68

53 5. Konklusion Projektet har vist at følgende solventer og fortyndingsforhold er optimale til oprensning af serumprøver til måling af P-25-Hydroxy-Vitamin D3 og D2 på Waters UPLC-MS/MS-system: Biotage Isolute PLD+ med 1+5 acetonitril, Waters Ostro med 1+3 acetonitril og Phenomenex Phree med 1+3 acetonitril Alle tre alternativer forkorter arbejdstiden med mere end 2 timer. Af disse tre findes Biotage Isolute PLD+ til at være den metode, hvis resultater afviger mindst fra Waters Oasis HLB, og dermed det bedste alternativ hertil. Metoden ændrer ikke den kliniske vurdering af resultaterne, sammenlignet med Waters Oasis HLB, men har en usikkerhed >24 % i måleområdet nmol/l for 25(OH)D3 og 25(OH)D2. Derfor konkluderes det at yderligere optimering er nødvendig, før metoden kan implementeres på Klinisk Biokemisk Afdeling, KB , Diagnostisk Center på Rigshospitalet. 6. Perspektivering Yderligere undersøgelse af Biotage Isolute PLD+, Waters Ostro og Phenomenex Phree kunne tage udgangspunkt i at analysere 2. gennemskyl, som grundet tidsbegrænsning ikke er foretaget under dette projekt. Dette kunne vise eventuel tilbageholdelse af analyt grundet for svag centrifugering da centrifugeringskraften for dette forsøg er valgt ud fra anbefalinger fra Phenomenex. Yderligere undersøgelse af en optimal centrifugering eller vakuum ville være oplagt, da vakuum og positivt tryk fra Phenomenex var tilnærmelsesvis det samme som anbefalet af Biotage og Waters. Derfor blev centrifugeringskraften ensartet for alle tre plader. Med hensyn til implementering af 25(OH)D2-intern standard til 25(OH)D2 analyser, ville dette være fordelagtigt da sporbarheden for 25(OH)D2 øges, og der på nuværende tidspunkt er for stor analytisk usikkerhed for denne analyt. Ibrugtagning af en 7-punktskalibrator ville minimere risikoen for tilfældige fejl, som der i dette projekt sås for Ostro, og dermed forbedre kalibreringen. Endvidere ville der forekomme en kalibrering i hele måleområdet for 25(OH)D3 og D2. Inddampning med nitrogen efterfulgt af rekonstituering foretages af fleste studier der optimerer og undersøger analyser på LC-MS/MS. Da det fundne alternativ, Biotage Isolute PLD+ med fortyndingsforholdet 1+5, anvender en høj fortyndingsfaktor, kan implementering af dette minimere eventuelle problematikker der opstår ved fortynding af serumprøver der befinder sig i det lave Side 52 af 68

54 måleområde. Da Hamilton ML STARline prøveforberedelsesrobot kan anvendes til automatisering af al afpipetering og dermed forkorte procestiden for den alternative Biotage Isolute PLD+ yderligere, muliggør dette inddampning med nitrogen uden forlængelse af procestiden. Side 53 af 68

55 7. Referencer 1. Borup, V. D. Biokemi. 2. udg. FADL; Armas, L. A. G., et al. Vitamin D2 Is Much Less Effective than Vitamin D3 in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2004; 89(11): Zhang, S., et al. Development and validation of an LC-MS/MS based method for quantification of 25 hydroxyvitamin D2 and 25 hydroxyvitamin D3 in human serum plasma. Journal of Chromatography B. 2014; 961: Musteata, M. L., Musteata, F. M. Overview of extraction methods for analysis of vitamin D and its metabolites in biological samples. Department of Pharmaceutical Sciences, Albany College of Pharmacy & Health Sciences Rigshospitalets Labportal, tilgængelig hos: [ henvist 11. oktober 2016, Hollis, B.W. Editorial: The Determination of Circulation 25-Hydroxyvitamin D: No Easy Task. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2004; 89(7): Bylda, C., et al. Recent advances in sample preparation techniques to overcome difficulties encountered during quantitative analysis of small molecules from biofluids using LC-MS/MS. Analyst 2014; 139: Senniksen, S., et al. Betjeningsvejledning til Waters ACQUITY UPLC/TQD. 3. udg. Klinisk Biokemisk Afdeling, KB , Diagnostisk Center; Lindegardh, N., et al. Development and validation of a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric method for determination of piperaquine in plasma Stable isotope labeled internal standard does not always compensate for matrix effects. Journal of Chromatography B. 2008; 862: Carmical J., Brown, S. The impact of phospholipids and phospholipid removal on bioanalytical method performance. Wiley Online Library: Biomedical Chromatography Examine - Vitamin D, tilgængelig hos: [ henvist 08. december Andreasen, L. Analysevejledning: P-25-Hydroxy-vitamin D2; stofk., NPU26810 og P-25- Hydroxy-vitamin D3 stofk., NPU udg. Klinisk Biokemisk Afdeling, KB , Diagnostisk Center; Bartels, E. D. Valideringsrapport: P-25-Hydroxy-vitamin D2; stofk., NPU26810 og P-25- Hydroxy-vitamin D3 stofk., NPU udg. Klinisk Biokemisk Afdeling, KB , Diagnostisk Center; Lyngbye, J., et al. Lyngbyes laboratoriemedicin. Nyt Nordisk Forlag; Side 54 af 68

56 15. Biotage Product Note PPS335.V.1; Sample Pretreatment for HPLC, tilgængelig hos: [ henvist 08. december Holm, I. L. Kompendium i KBA. Histokemi: Vævspreparation og vævsfarvning; The LC Handbook: Guide to LC Columns and Method Development, tilgængelig hos: [ mns], henvist 29. november 2016, Hall, T. G., et al. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles, tilgængelig hos: henvist 11.november 2016, Smith, J. E., Goodman, D. S. The turnover and transport of vitamin D and of a polar metabolite with the properties of 25-hydroxycholecalciferol in human plasma. J Clin Invest 1971; 50(10): Waters. Atlantis T3 and ACQUITY UPLC HSS T3 Columns. Waters Corporation; Waters. Waters TQ Detector - Quick Start Guide. Waters Corporation; ( /Revision A). 23. Phenomenex. Phree Phospholipid Removal Solutions; Biotage. How to use ISOLUTE PLD+ Protein and Phospholipid Depletion Plates; Waters. Ostro sample preparation plate basic instructions; Leung, S. H., et al. Maximizing Analyte Recoveries using Phree Phospholipid Removal Plates. Phenomenex Lodder H., et al. Evaluation of 25-hydroxy Vitamin D Extraction using Phospholipid Depletion Plate Technology and Method Comparison using Automated Sample Preparation. Biotage Ekstern kvalitetskontrol Kristensen, H. I., et al. SOP028 Vejledning til validering af analysemetoder. Klinisk Biokemisk Afdeling, KB , Diagnostisk Center; Gerdes, U. Metodesammenligning. Klinisk Biokemisk Laboratorium - Center for Psykiatrisk Grundforskning; Altman, D. G., Bland, J. M. Measurement in Medicine: the Analysis of Method Comparison Studies. The Statistician 1983; 32: Bendsen, T. Noter i statistik, tilgængelig hos: [ henvist 31. oktober 2016, Side 55 af 68

57 33. Ahmad, S., et al. HybridSPE: A novel technique to reduce phospholipid-based matrix effect in LC ESI-MS Bioanalysis. J Pharm Bioallied Sci 2012; 4(4): Neville, D., et al. Efficacy of plasma phospholipid removal during sample preparation and subsequent retention under typical UHPLC conditions. Bioanalysis 2012; 4(7): Chambers, E., et al. Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2007; 852(1 2): Westgard Sigma Rules, tilgængelig hos: [ henvist 8. december 2016] 37. Tulipani S, et al. New and Vintage Solutions To Enhance the Plasma Metabolome Coverage by LC-ESI-MS Untargeted Metabolomics: The Not-So-Simple Process of Method Performance Evaluation. Anal Chem. 3. marts 2015;87(5): Side 56 af 68

58 8. Bilag Bilag 1. Indlægssedler fra alle metoders producenter Side 57 af 68

59 Side 58 af 68

60 Side 59 af 68

61 Bilag 2. 6PLUS1 Multilevel Serum Calibrator Set D2/D3 fra Chrom Systems Side 60 af 68

62 Side 61 af 68

63 Bilag 3. Pladeopsæt for delforsøg 1 Optimering af solventsammensætning og fortyndingsforhold Bilag 1 viser pladeopsætningen af den nye metode, Isolute. Solventsammensættet er angivet med bogstaver i de gule og grønne brønde, mens fortyndingsforholdet er angivet med tal. Kalibrator = Rød, Kontroller = Blå, 30 nmol/l serumpool = gul, 70 nmol/l serumpool = grøn. A = Acetonitril, A+My = Acetonitril m. 1% myresyre, A+Me = Acetonitril (85%) + Methanol (15%). A+Me+My = Acetonitril m. 1% myresyre (85%) + Methanol (15%). Bilag 4. Pladeopsæt for delforsøg 2 - Metodesammenligning Side 62 af 68