Forbedring af fødevaresikkerhed gennem eliminering af patogene bakterier i blandede biofilm

Transkript

1 Forbedring af fødevaresikkerhed gennem eliminering af patogene bakterier i blandede biofilm Lone Gram, Karen Kiesbye Dittmann og Virginie Oxaran gram@bio.dtu.dk

2 Et projekt støttet af DSF/IF Samarbejde med Brasilien/São Paulo Faculty of Animal Science and Food Engineering, USP Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, USP Faculty of Pharmacy, Federal University of Goiás Professor Elaine C.P. De Martinis Professor Carlos Augusto Fernandes de Oliveira Professor Carlos Humberto Corassin Ass. Professor Virginia Alves 2

3 Baggrund, mål, work-in-progress (Brasilianske) oste associeret med sygdom forårsaget af Staphylococcus aureus og Listeria monocytogenes Spørgsmål: De patogene bakterier koloniserer og persisterer i produktions-anlægget? De patogene bakterier er vanskelige at fjerne i blandede biofilm? 3

4 4

5 5

6 Minas cheese Frisk ost; fra både rå og pasteuriseret mælk Kan modnes, kort/lang tid 6

7 Rå mælk Minas cheese Starterkultur, løbe, CaCl 2 Filtrering (pasteurisering) Ostemasse (32 C, min) Opskæring af ostemasse Fjernelse af valle Overføres til forme, dræning, saltning Eventuel modning Plastpakning Kølelagring 7

8 Persistens? Prøver af råvarer, miljøprøver, færdigvarer analyseres for L. monocytogenes og S. aureus (og normal mikrobiologi) Isolater sendes til DK Identificeres (fænotype, 16S rrna gen) Sub-types (multilocus sequence typing, MLST) 8

9 Loci for MLST-typning L. monocytogenes abcz (ABC transporter) bgla (beta glucosidase) cat (catalase) dape (succinyl diaminopimelate desuccinylase) dat (D-amino acid aminotransferase) ldh (L-lactate dehydrogenase) lhka (histidine kinase) Inst. Pasteur MLST base S. aureus arc (Carbamate kinase) aroe (Shikimate dehydrogenase) glpf (Glycerol kinase) gmk (Guanylate kinase) pta (Phosphate acetyltransferase) tpi (Triosephosphate isomerase) yqil (Acetyle coenzyme A acetyltransferase) MLST data base (mlst.net) 9

10 L. monocytogenes persistens 8-10 prøveindsamlinger: eet isolat ST2 Tidligere ( ): 3 virksomheder 393 prøver 28 positive (to virksomheder) 85 isolater 10

11 L. monocytogenes MLST Antal isolater Pulsotype ST 9 52 XXV, XXVI, XXVII, XXVIII, XXIX XIV, XV, XVII XVIII XIX, XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV I, II, III, IV, XVI 3 8 VIII, IX, X, XI, XII, XIII VI, VII XXX 9 1 V New 1 XXI New 11

12 L. monocytogenes persistens Dominans af lineage 1 (ikke lineage 2) Sekvenstype 2 re-isoleres hyppigt (30-40% af isolater); ofte i kølerum/gulv Inst. Pasteur MLST-base: ST2 er primært humane isolater PFGE giver bedre opløsning Sekvenstyper tillader sammenligning med andre indsamlinger og sub-typninger 12

13 S. aureus persistens Første indsamling Eet isolat Sekvenstypet: ST398 ST398 MSSA hos mennesker har fået MetR og TetR I grise og er blevet MRSA [Price et al. 2012] Anden indsamling 64 isolater (43 sekvenstypet) 13

14 S. aureus persistens (43 stammer) # S. aureus isolater ST ? Ingen nye isolater af ST398 Alle stammer antibiotika-resistens-testes 14

15 S. aureus ST1? ST1 tilhører clonal complex (CC) 1, der inkluderer community-associated MRSA (CA-MRSA) også kaldet USA400 MRSA spa type t127, ST1 er først for nylig fundet hos grise Muligvis ny MRSA-infektion hos mennesker Omtales ofte sammen med ST398 15

16 Kontrol af persistens Forhindre kolonisering (bakterie-biofilm) Fjernelse (rengøring / desinfektion) Er persistente stammer bedre til at danne biofilm? Er persistente stammer mere tolerante overfor rengøring / desinfektion? 16

17 L. monocytogenes biofilm Crystal violet (OD590) 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 M103-1 N53-1 La111 H13-1 LO EGD R479a 6895 O No La V518a persisterende andre 17 Jensen et al JFP

18 L. monocytogenes desinfektions-tolerance log10 reduction (cfu/ml) b,c b b b b b b a a b,d b,d b c,d b 0 La111 N53-1 V518a La22 N22-2 3R1 Br22 EGD 2315 LO28 Scott A Reduktion i celletal ved behandling med Incimaxx 18 Kastebjerg og Gram 2009 JAM

19 Biofilm/desinfektion afhænger af miljø Naturlig snavs (mælk, protein, fedt, salt) og mikrobiologi Biofilmdannelse hos fire jordbakterier i monokultur eller blandet kultur Ren et al ISME J 19

20 Isolering af microbial community L. monocytogenes BZ001 S. aureus BZ007 S. aureus BZ012 BZ002 - Klebsiella sp BZ003 - Escherichia coli BZ004 - Comamonas sp BZ006 - Acinetobacter sp BZ008 - Macrococcus caseolytens BZ009 - Lactococcus lactis BZ010 - Kurthia gibsonii BZ011 - Acinetobacter sp BZ013 - Aeromonas sp BZ014 - Lactococcus lactis BZ017 - Candida tropicalis BZ018 - Lactobacillus sp 20

21 Elimineres den patogene bakterie af andre? 1,2E+10 1E+10 8E+09 6E+09 4E+09 2E+09 0 Total S. aureus 21

22 Mere biofilm i blanding (L.m.) Ratio Biofilm mass (CV OD 595nm )/ Biomass (OD 600nm ) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 72H biofilm mass in microplate -Static, Cristal violet L. monocytogenes Mixed community L. monocytogenes udgør 6-34% af den blandede biofilm 22

23 (Foreløbige) konklusioner og planer L. monocytogenes kontaminering (i Minas osterier) er reduceret markant Sekvens-typning af L. monocytogenes tillader sammenligning på tværs, men PFGE giver bedre opløsning S. aureus isoleres hyppigt fra Minas osterier Muligvis hyppig forekomst af MRSA 23

24 (Foreløbige) konklusioner og planer Blandede bakteriebiofilm er etableret Kvantificering af den patogene i blandede biofilm er en udfordring (selektive plader el qpcr) Test af desinfektions-tolerance følger Undersøgelse af virulens-egenskaber efter dyrkning i blandede biofilm følger 24