Holdbarhed af Kortisol i urin til analysen U-cortisol for Cushings syndrom Præanalytisk håndtering af prøvematerialet med henblik på tid og temperatur, samt bakterievækst under opbevaring. K-vejleder: Helle Hyldgaard Schmidt; Bioanalytikerunderviser I-vejleder: Jesper Voldby; Cand.scient. Lektor Studerende: Dennis Vad Brüel; 155691 Antal tegn: 43.042 D. 27/05 2014
Indhold Resume... 4 Forord...Error! Bookmark not defined. 1 Introduktion... 6 1.1 Baggrund... 6 1.2 Formål... 7 1.3 Problemformulering... 7 1.4 Målformulering... 7 2 Teori... 8 2.1 Cortisol... 8 2.1.1 Referenceintervaller... 8 2.2 Cushings syndrom... 8 2.3 U-cortisol... 10 2.4 Radioimmunoassay... 10 2.5 Wizard 2 2470 automatic gamma counter... 10 2.5.1 Kalibrering af gammatælleren... 10 2.6 Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA.... 11 2.6.1 Standardkurve... 11 2.6.2 125 I-labeled cortisol tracer... 11 2.7 Kontroller... 11 2.8 Gammastråling... 12 2.9 strålesikkerhed... 12 2.10 Bakterier... 12 2.10.1 Escherichia Coli... 12 3 Materialer og metode... 13 3.1 Forsøgsdesign... 13 3.2 Prøvemateriale... 13 3.3 Præanalyse... 13 3.3.1 Materialer... 13 3.3.2 Metode... 14 3.4 Analyse... 14 3.4.1 Materialer... 14 3.4.2 Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA. D. 13/5-2014, Lot: 140303F... 14 3.4.3 Kontroller... 15 Side 2 af 35
3.4.4 Apparatur... 15 3.4.5 Metode... 15 3.5 Statisiske metoder... 15 3.5.1 Hypoteser... 15 3.5.2 ANAVA... 16 3.5.3 TEa % og Bias %... 16 3.6 Etik... 17 3.7 Litteratursøgning... 18 4 Resultater... 18 4.1 Holdbarhedsforsøg... 19 4.1.1 X-Y plot... 19 4.1.2 TEa % plot... 21 4.1.3 Bias % plot... 23 4.1.4 ANAVA... 24 4.2 Bakterie forsøget... 25 4.2.1 X-Y plot... 25 4.2.2 TEa %... 26 5 Diskussion... 27 5.1 Præanalytisk Metoden... 27 5.2 Analysen... 27 5.2.1 Kontroller... 27 5.3 Resultater... 28 5.3.1 ANAVA... 28 5.3.2 TEa og Bias plot... 29 5.3.3 Bakterier... 30 5.3.4 Klinisk betydning... 30 6 Konklusion... 30 7 Perspektivering... 31 8 Referenceliste... 33 9 Bilag... 35 Side 3 af 35
Forord Dette Bachelorprojekt er udarbejdet Klinisk Biokemisk afdeling på Aalborg universitetshospital syd, i forbindelse med bioanalytikeruddannelsen på VIA university college Aarhus. Projektet er udarbejdet i perioden 24/3 2014-27/5 2014. Det praktiske arbejde er udført i samarbejde projektgruppen bestående af Camilla Schibler Nielsen og Jacob Jens Würtz. Tak til denne gruppe for et godt samarbejde og et godt arbejdsmiljø. Tak til Gitte Seidler afsnitsledende bioanalytiker, og Jens Alrø Johnsen bioanalytiker, for deres ekspertise og behjælpelighed i forbindelse med analysen U-cortisol. Tak til Åse Handberg overlæge, for sin kliniske ekspertise i forbindelse med udredning af Cushing s syndrom. Tak til Klinisk Biokemisk afdeling, Aalborg universitetshospital syd for et godt arbejdsmiljø og et stort engagement i forbindelse med projektet, samt finansieringen af dette projekt. Studerendes underskrift Side 4 af 35
Resume Baggrund Analysen U-cortisol anvendes på KBA, Aalborg universitetshospital syd som et led i diagnosticering af Cushing s syndrom. Patienten opsamler døgnuriner over 2-3 konsekutive døgn, herefter indsendes disse til analysering på KBA. Dette betyder at der går minimum 3 døgn før disse modtages til analysering. Ifølge KBA Aalborg har Biomarkøren U-kortisol en holdbarhed på 2 døgn ved 2-8 C. Dette betyder at, ved analysetidspunktet er døgnurinen for gammel. Patientvejledningen anbefaler at døgnurinerne opbevares så køligt så muligt. Temperaturen ved opbevaring kan have yderligere konsekvenser for holdbarheden. En anden problemstillinger er om bakterier kan have indflydelse holdbarheden. Formål KBA Aalborg ønsker at undersøge holdbarheden af biomarkøren U-Cortisol i døgnuriner over 4 døgn. Holdbarheden undersøges i forhold til opbevaring af døgnuriner ved stuetemperatur og på køl, samt bakterie arters indvirkning på analysen. Materialer og metoder Analysen er udført på Wizard 2 2470 ved brug af analysekittet Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA. Til dette forsøg anvendes 10 urinprøver fra patienter med kendt opsamlingstidspunkt, samt fire urinprøver som indeholder bakterievækst. De 10 patientprøver deles i to og opbevares ved henholdsvis stuetemperatur og på køl. Fra hver af disse prøver samt bakterieprøverne, udtages en prøve som udgør 0-værdien og frysen ned, herefter udtages en prøve hvert døgn i 3 døgn som fryses ned til analysering. Resultater Til at vurdere resultatet af holdbarhedsforsøget anvendes ANAVA, samt X-Y plots hvor grænser for TEa og Bias er lagt ind. ANAVA for stuetemperatur giver at F-krit er 2,96 og F er 1,95. ANAVA for køl giver at F-krit er 2,96 og F er 0,74. TEa og Bias plottene viser at prøver opbevaret ved stuetemperatur er holdbar i 24 timer, prøver opbevaret på køl er holdbar i minimum 72 timer, og bakterier kan have stor indflydelse på analyseresultatet. Konklusion Dette projekt har vist at opbevaringstemperaturen har indflydelse på holdbarheden af biomarkøren U-cortisol, og bakterievækst kan have indvirkning på analyseresultatet. Dette bør føre til en ændring af patientvejledningen, hvor opbevaringstemperaturen specificeres. Side 5 af 35
1 Introduktion 1.1 Baggrund På Aalborg universitetshospital analyseres døgnuriner for biomarkøren cortisol fra patienter i hele Region Midt og Nord (1). Patienter indsamler urin over 2-3 konsekutive døgn som efterfølgende indsendes til Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) Aalborg universitetshospital (1). Kvantificering af U-Cortisol af døgnuriner via kittet Cortisol RIA (RIA-4511) på 2470 Wizard² anvendes som screeningsmetode for Cushing s syndrom på KBA Aalborg universitetshospital (bilag 1,2). Cushing s syndrom er en endogen sygdom ofte forårsaget af en tumor i hypofysen som forårsager overproduktion af cortisol (1,2,3). Symptomerne er ofte vægtstigning, infektioner, dårlig sårheling, hypertension og ubehandlet dør patienter ofte af hjertesvigt (3). Biomarkøren U-Cortisol har ifølge forskriften en holdbarhed på 2 døgn ved 2-8 C (1). Indsamling af urin og forsendelse kan betyde at der fra indsamlingsstart til modtagelse vil der gå 3 døgn. Døgn urinerne har dermed inden modtagelse overskredet biomarkørens holdbarhed. Hertil kommer det at man ikke kan være sikker på, hvorvidt patienten har opbevaret prøverne på køl. I patientvejledningen opfordres der til at prøven skal stå på køl (bilag 2). Konsekvensen af dette kan i værste fald for patienten betyde en mulig fejldiagnosticering og eller en ekstra økonomisk omkostning for patienten og sekundærsektoren hvis holdbarheden fordrer at døgnuriner skal indsendes dagligt. Det er derfor relevant at undersøge om holdbarheden af biomarkøren U-Cortisol ændres signifikant over 3 døgn ved stuetemperatur og på køl samt om denne ændring er klinisk relevant. En anden problemstilling er hvorvidt tilstedeværelsen af bakterier i urinprøver påvirker analysesvaret. I forskriften nævnes det at bakteriel vækst kan have en indflydelse på analysen U-Cortisol. For at kvalitetssikre analysen, vil det derfor være fordelagtigt for afdelingen og patienten, hvis man kan få vished om hvorvidt bakteriel vækst har en signifikant påvirkning af analysesvaret eller ej. I forsøget inkluderes derfor urinprøver med bakterierne Proteus Vulgaris og Hæmolytiske Streptokokker gruppe B samt den mest almindelige urinvejspatogen Escherichia Coli(4). Side 6 af 35
1.2 Formål Formålet med projektet er at undersøge holdbarheden af biomarkøren U-Cortisol i døgnuriner over 3 døgn. Holdbarheden undersøges i forhold til opbevaring af døgnuriner ved stuetemperatur og på køl, samt bakteriearters indvirkning på analysesvaret. 1.3 Problemformulering Hvilke konsekvenser har det for biomarkøren U-Cortisol, KBA Aalborg universitetshospital og patienten, hvis døgnurin opbevares i op til fire døgn før analysering? Samt hvilken indvirkning opbevaringstemperaturen og bakterievækst har herpå? 1.4 Målformulering For at belyse problemstillingen vil vi: Undersøge holdbarheden af 10 urinprøver, som er testet negative for bakterier ved urinstix, opbevaret ved stuetemperatur i op til 3 døgn. o Prøverne nedfryses ved -20C hvert konsekutive døgn i 4 døgn Undersøge holdbarheden af 10 urinprøver, som er testet negative for bakterier ved urinstix, opbevaret på køl i op til 3 døgn. o Prøverne nedfryses ved -20C hvert konsekutive døgn i 4 døgn Alle prøverne analyseres efter Radio immuno Assey (RIA) princippet.. Benytte X-Y plot til visuel fremvisning af resultaterne. Benytte variansanalysen ANAVA til at se om resultaterne varierer statistisk signifikant fra dag til dag.. Benytte X-Y plot hvor i grænser for TEa og Bias er indlagt til at vurdere holdbarheden. Belyse bakteriearters indvirkning på analysesvaret for 4 urinprøver opbevaret ved stuetemperatur i op til 3 døgn. o Prøverne nedfryses ved -20C hvert konsekutive døgn i 4 døgn Alle prøverne analyseres efter radioimmunoassay (RIA) princippet.. Benytte X-Y plot til visuel fremvisning af resultaterne.. Benytte X-Y plot hvor i grænser for TEa indlagt til at vurdere bakteriers indvirkning på analysen. Side 7 af 35
2 Teori 2.1 Cortisol Cortisol tilhøre gruppen glykokortikoider. Cortisol stimulere nedbrydningen af fedt og proteiner, dette har indvirkning på glykoneogenesen samt forbrændingen af fedtsyre. Dette betyder at glukose koncentrationen i blodet vil stige, samt glykogendepoterne i vævet. Dette gør at kortisol er et vigtigt stresshormon for kroppen, da dette sikre et højt glukose niveau og dermed energi til kroppen. Herudover hæmmer kortisol DNA-syntesen dette sikre at kroppens resourser bruges på energi og ikke regeneration i stressede situationer (5). Kortisol produceres i binyrebarken, denne produktion stimuleres af Adrenokortikotropt hormon (ATCH). ATCH produceres i hypofysen, produktionen af dette stimuleres af hormonet corticotropin releasing hormone (CRH) der produceres i hypothalamus. Dette system bliver reguleret ved negativ feedback (6). Kortisol transporteres via plasma som enten frit kortisol eller bundet til transcortin og albumin. Kortisol nedbrydes i leveren til Metabolitter og frit kortisol i urinen (6). Kortisoludskillelsen følger en døgnrytme, der ses en kraftig stigning af kortisol niveauet om morgenen som følger af opvågning, cortisol awakening response (7). Kortisol niveauet falder stødt som dagen skrider frem. Kortisol niveauet når et minimum omkring midnat. Dette er forudsat af en normal døgnrytme med normale sovevaner, hvis disse ændres kan kortisoludskillelsen også ændres som følge af dette (8). Stress kan midlertidigt også påvirke kortisol niveauet. 2.1.1 Referenceintervaller Niveauet af fri kortisol i serum forventes at ligge mellem 10-45 nmol/l, dette gælder for prøver taget mellem kl. syv og ni. Niveauet af frit kortisol i døgnurin forventes for kvinder at ligge imellem 8-125 nmol/dg, for mænd 12-150 nmol/dg, børn (9-12 år) 7-100 nmol/dg, børn (3-8 år) 4-55 nmol/dg ifølge Lyngbyes labortoriemedicin(9). KBA anvender referenceintervallet: 18 år - 37-300 nmol/dg (1). 2.2 Cushings syndrom Cushings dyndrom er en overordnet betegnelse for den tilstand der opstår, når kroppen igennem en længere periode, udsættes for en forhøjet koncentration af kortisol eller andre glykokortikoider(3). Side 8 af 35
Symptomer på Cushings syndrom optræder efter en længere periode med forhøjet kortisol niveau. Disse symptomer består i central fedtophobning dvs. ophobning af fedt på maven og i nakken, rundt og oppustet ansigt (Moonface), hypertension, Diabetes Mellitus og Osteoporose (10). Samt nedsat muskelkraft, tynd hud, tendens til blå mærker, dårlig sårheling, psykiske forstyrrelser og menstruationsforstyrrelser hos kvinder (3). Mange af disse symptomer kan opstå som følge af andre sygdomme som optræder hyppigere. Ud over disse symptomer kan et forhøjet kortisol niveau føre til hjertesvigt, cerebrale attakker og interkurrente infektioner(3). Ved mistanke om Cushings syndrom udføres en screeningsundersøgelse og de kliniske fund, samt patientens sygehistorie betragtes. Hvis disse giver en begrundet mistanke om at patienten har Cushings syndrom udføres der en supressionstest. Supressionstesten består i en måling af urinkortisol efter indgift af Dexametason. Hvis en abnorm kortisolprodution påvises, begynder udredelsen af hvilken underliggende tilstand som er skyld i den abnorme produktion. Tilstande som giver øget kortisolproduktion(3). - Hypofyse-ACTH afhængig bilateral binyrebarkhyperplasi - Ektopisk produktion af ACTH - Ektopisk produktion af CRH - Binyrebarkadenom - Binyrebarkkarcinom - Primær bilateral hyperplasi - Iatrogent ved indgift af farmakologiske doser af glukokortikoid Under denne udredning spiller plasma ACTH værdien en vigtig rolle sammen med en CTeller MR-scanning. Behandlingsmulighederne afhænger af hvilken underliggende tilstand der er tale om. Hvis et adenom ligger til grund for diagnosen forsøges adenomet fjernet ved en operation. Hvis der er tale om et karcinom vil behandlingen afhænge af hvilket stadie canceren befinder sig på, og behandlingen vil blive tilpasset der efter(2). Det er også muligt at hæmme binyrebarkens produktion af kortisol med medikamenter. Dette kan gøres ved at hæmme binyrebarkens enzymer eller ved en receptorblokade. Side 9 af 35
2.3 U-cortisol Bestemmelsen af frit kortisol I urin giver et godt billede fraktionen af det frie kortisolniveau i patientens plasma. Ved et højt niveau af frit kortisol i plasma vil udskillelsen af frit kortisol i urinen stige (2). Kortisolniveauet i urin er afhængig af diuresen hvor i mod vægt, køn og alder har minimal indvirkning på denne(3). Dette gør at denne biomarkør er oplagt at bruge til screening for Cushings syndrom. Denne analyse benytter RIA analyseprincippet, og udføres på Wizard 2 2470 automatic gamma counter ved brug af Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA. 2.4 Radioimmunoassay Radioimmunoassay (RIA) er baseret på analyseprincippet om at specifikke antistoffer kan binde specifikke antigener. Til U-cortisol anvendes kompetitiv antigen antistof reaktioner. Dette bygger på et antigen som ønskes kvantificeret skal konkurrere med et antigen, som er mærket med et radioaktivt stof om at binde til en begrænset mængde antistoffer eller receptorer. Andelen af radioaktive antigen-antistof komplekser kan måles med en gammatæller eller scintillationsdetektor. Her efter kan andelen af ikke radioaktive antigenantistof komplekser beregnes(11). 2.5 Wizard 2 2470 automatic gamma counter Wizard 2 2470 automatic gamma counter er en fuldautomatisk 10-kanals gammatæller. Dette apparat anvendes på KBA til analysen U-cortisol. Gammatællerens detektorer består af Thallium-aktiveret natriumjodidkrystaller, disse er forseglet sammen med en fotomultiplier i en luftæt kappe. Krystallen absorbere gammastråling og omdanner strålingsenergien til lys. Dette registreres af fotomultiplieren som omdanner lyset til elektriske signaler, der herefter forstærkes (Bilag 3). Målingen bliver fortaget i en detektorbrønd som prøven sænkes ned i. Denne brønd er omgivet af bly for at minimere baggrundsstrålingen, samt stråling fra andre prøver på maskinen. 2.5.1 Kalibrering af gammatælleren Ifølge laboratorieforskriften skal gammatælleren kalibreres mindst en gang i kvartalet. Denne kalibrering består i at sikre at hver kanal måler ens. Dette gøres ved at måle på samme prøve som indeholder 125 I i hver kanal. Ud fra resultaterne beregner MultiCalc den faktor der skal tillægges hver kanal så disse får den samme tælleeffekttivitet (Bilag 1). Yderligere kvalitetssikring består af en ugentlig måling af baggrundståling fra racks apparatet bruger til analysering. Årligt efterses apparaturet af en servicemedarbejder fra firmaet PerkinElmer som har leveret apparaturet. Side 10 af 35
2.6 Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA. På KBA anvendes Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA til U-kortisol analysen. Kittet indeholder Anti-kortisol monoclonal antistof coatet rør, 125 I kortisol tracer, 6 standarder og en kit kontrol (Bilag 2). 2.6.1 Standardkurve For hver serie at prøver som analyseres laves en standardkurve ud fra de 6 standarder. Standarderne indeholder kortisol i en buffer bestående af bovin serumalbumin og natriumazid (Bilag 2). Standard Kortisol (nmol/l) 0 0 1 20 2 70 3 200 4 700 5 2000 Skema 1: standard 0-5 med korresponderende kortisol koncenrationer. Standardkurven bestemmes ud fra standarderne som dobbeltbestemmes ved hver analyse. Ved at bestemme denne for hver analyse tages der højde for 125 I s halveringstid, samt at minimere en eventuel ændring af baggrundsstrålingen fra analyse til analyse. Standardkurven fremstilles i et semilogaritmisk-plot (bilag 5). 2.6.2 125 I-labeled cortisol tracer 125 I-labeled cortisol tracer indeholder 185 kbq 125 I-labeled cortisol i en buffer bestående af bovine serum ablumin, natrium azid og et farvestof. 125 I er en radioaktiv isotop med en halveringstid på 59,4 døgn. Denne isotop udsender γ-stråling og henfalder ved indfangning af en elektron fra K-skallen (12). 2.7 Kontroller Til at kvalitetssikre U-cortisol bruges en række kontroller hver gang analysen anvendes. Kit DRG Diagnostica Cortisol indeholder en kit kontrol. Herudover anvendes RANDOX kontroller level 2 og 3. Kontrolkort føres for disse tre kontroller. Kit kontrollens SD 14,37 og CV % er 10,1, RANDOX level 2 s SD er 8,59 og CV % er 6,7, RANDOX level 3 s SD er 18,32 og CV % er 6,2 (Bilag 8). Herudover anvendes HK 12 som et langtidsholdbart eksternt kontrolmateriale. HK 12 er kontrol materiale fremstillet af humant serum, som er spiket for at opnå passende koncentrationer af forskellige komponenter (bilag 6). Side 11 af 35
2.8 Gammastråling γ-stråling kommer af at eksiterede atomkerner udsender fotoner. Dette sker typisk fordi en given atomkerne er henfaldet fra et andet grundstof enten ved α- eller β-henfald og derved har opnået en eksiteret tilstand. For at nå et lavere energiniveau udsendes γ-stråling. Da γ- stråling er energi i form af fotoner og derved ikke har nogen masse, gør dette det meget svært at skærme af for denne type ioniseret stråling (13). 2.9 strålesikkerhed Radioaktive materialer opbevares i et køleskab. Ved brug bør 125 I opbevares bag et 3 mm tykt blyskjold. Håndtering af 125 I udføres med handsker på og arbejdspladsen dækkes med papir. Radioaktive stoffer bør ikke håndteres længere en højest nødvendigt. Ved spild fjernes underlægningspapir, og det område som er kontamineret rengøres med sæbevand, til aktiviteten ikke længere kan sænkes. Hvis tøj kontamineres tages dette af og kommes i en beholder til det kan sendes med til normal tøjvask. Hvis huden kontamineres vaske området grundigt til forureningen er væk. Uheld indrapporteres som utilsigtet hændelse. Til monitorering af enten kontaminering eller ugentlig kontrol af laboratoriet anvendes en monitor med en probe egnet til 125 I (Bilag 4). 2.10 Bakterier 2.10.1 Escherichia Coli Escherichia Coli (E. Coli) er den bakterie som hyppigst forårsager en urinvejsinfektion. E coli er en del af tarmens normalflora og kan derfor let introduceres til urinvejen i sær hos kvinder(14). 2.10.2 Streptokker gruppe B Steptokker gruppe B (SGB) består af arten Streptococcus agalactiae. SGB kan findes som en del af normalfloraen i pharynx, rectum og vagina. SGB kan give anledninger til infektioner hos nyfødte, kvinder som har født og hos personer med svækket immunforsvar(15). 2.10.3 Proteus vulgaris Proteus vulgaris er en bakterie som bl.a. kan findes i tarmen og er derfor også en hyppig årsag til urinvejsinfektioner. Proteus vulgaris har evnen til at nedbryde urea til NH 3 (16). Side 12 af 35
3 Materialer og metode 3.1 Forsøgsdesign Dette forsøg er designet med henblik på at kvalitetssikre holdbarheden af bioarkøren u- kortisol i forhold til analysen U-Cortisol. Forsøget undersøger hvilken indvirkning tid og temperatur har på holdbarheden. Disse faktorer undersøges ud fra ti urinprøver fra KBA, urinprøverne deles ud i to gange ti prøver som opbevares ved stuetemperatur og på køl. Prøverne opbevares i fire døgn hvor, der løbende tages fire prøver med et døgns mellemrum. Disse prøver fryses ned og samles til analysn efter RIA princippet. Til at vurdere holdbarheden statistisk anvendes variansanalysen to siddet ANAVA. Da forsøget har et parret design, dette nødvendiggøre en vurdering af om holdbarheden afhænger af måleniveauet. Herudover anvendes grænser for TEa % og Bias % til at vurdere holdbarheden af frit kortisol i urin. Sideløbende undersøges bakteriers indvirkning på holdbarheden. For at undersøge dette indhentes ti prøver fra KMA. Af disse prøver indeholdte 4 prøver bakterievækst, og de resterende seks prøver kasseres. 3.2 Prøvemateriale - ti patient prøver fra KBA der er blevet negativ for bakterievækst ved urin stix. - fire patientprøver med urinvejsinfektioner fra Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Aalborg Universitetshospital. Bakteriearterne ved dyrkning. To prøver med Escherchia Coli, en prøve med Proteus vulgaris og en prøve med streptococcus agalactiae. 3.3 Præanalyse Præanalysen består I at fremstille prøver således at de giver et billede af holdbarheden af Kortisol over fire dage. Urinprøverne henstilles i fire døgn ved stuetemperatur eller på køl. Fra disse prøver udtages nye prøver der fryses ned med 24 timers mellemrum. 3.3.1 Materialer - 5 ml Polystyrenrør med tilhørende propper. - Engangspippetter. - Stativer til prøver. - Køleskab, 4⁰C. - Fryseskab, -20⁰C. Side 13 af 35
3.3.2 Metode - Fra 10 patientprøver afpippeteres ca 4,5 ml urin til 20 polystyrenrør med engangspippetter. Disse rør mærkes stue 1 10 og køl 1 10 og henstilles ved henholdsvis stuetemperatur og på køl. - 10 prøver er blevet afhentet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Aalborg Universitetshospital Syd. Hvor der afpippeteres ca. 4,5 ml urin til 10 polystyrenrør. Disse rør mærkes bak 1 10 og henstilles ved stuetemperatur. - Alle prøverne står i 4 døgn ved deres respektive temperatur, med ca. 24 timers mellemrum udtages der ca. 1 ml urin fra hver prøve med engangspippette til et nyt polystyrenrør som mærkes og fryses ned. Dette bliver til i alt 4 nye prøver. - De negative bakterie prøver sorteres fra og kasseres. 3.4 Analyse Analysen er en RIA analyse, i dette forsøg udføres analysen af en erfaren bioanalytiker. Urinprøverne analyseres som enkeltbestemmelser i dette forsøg. Prøver som har stået ved stue temperatur er analyseret i en serie, og prøverne som har stået på køl og prøverne som indeholder bakterier er analyseret i en serie. 3.4.1 Materialer - Thermo Scientific Finnpipette 10-100µL, med tilhørende spidser. - Eppendorf Multipette stream, med tilhørende spidser. Bilag 1. 3.4.2 Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA. D. 13/5-2014, Lot: 140303F - Kit-kontrol. P1102: kontrollen indeholder kortisol i en buffer bestående af bovin serum albumin og natrium azid. - Cortisol kalibratorer 6 stk. P1102: kalibratorerne indeholder fra 0-2000 nm - kortisol i en buffer bestående af bovin serum albumin og natrium azid. 125 I-labeled cortisol tracer. 2152: traceren indeholder 185 kbq 125 I-labeled kortisol i en buffer bestående af bovin serum ablumin, natrium azid og et farvestof. - Rør coated med monoklonalt kortisol antistof. 3095. Bilag 2. Side 14 af 35
3.4.3 Kontroller - RANDOX URN ASY CONTROL level 2 og 3: Kontrol materiale som indeholder komponenter til kvalitetskontrol af analyser for urin. Heriblandt direkte RIA på kortisol. - HK-12: Kontrol materiale fremstillet af humant serum som er spiket for at opnå Bilag 1,6 passende koncentrationer af forskellige komponenter(bilag 6). 3.4.4 Apparatur - Perkin Elmer Wizard 2 2470 automatic gamma counter. Sygehus nr. AAS47817 - Behring shaker, sygehus nr. AAS46342. - Eppendorf centrifuge 5810R, sygehus nr. AAS30270. Bilag 1,3 3.4.5 Metode - Urinprøverne optøs. Standarder, kontroller og tracers klargøres og bringes til Bilag 1 stuetemperatur. Coatede rør til standarder, kontroller og prøver mærkes. To Polystyrenrør mærkes total. - Urin prøverne centrifugeres på program 1 (15C, i 3 min ved 4000 rpm) - 50µL standard, kontrol eller urinprøve afpippeters til deres respektive mærket rør. 50µL 0-standard tilsættes til prøver og RANDOX kontroller. 500µL tracer tilsættes til alle prøver, standarder, kontroller og total. - Prøver, standarder og kontroller blandes og sættes derefter på ryster i 1 time og 15 min, dog ikke total rørende. Efter rystning suges overskydende reagenser op af rørene. Prøver, kontroller og standarder indtastes på Wizard gamma tælleren og analysen startes. 3.5 Statistiske metoder 3.5.1 Hypoteser Dette forsøg er baseret på en hypotese om, at holdbarheden af kortisol ikke ændres væsentligt ved opbevaring af prøver i op til 96 timer. H 0 og H 1 kommer således til at lyde. Side 15 af 35
H 0 = 48-, 72-, 96-timers prøvernes koncentration er ikke signifikant forskellig fra koncentrationen af 0-prøven, og derved har holdbarheden af kortisol ingen indvirkning på resultatet inden for 72 timer. 0 : µ1 = µ2 = µ3 = µ4 H 1 = 48-, 72-, 96-timers prøvernes koncentration er signifikant forskellig fra koncentrationen af 0-prøven. Denne ændring af koncentrationen kan tilskrives at kortisol ikke er holdbar i 72 timer. : µ1 µ2 µ3 µ4 3.5.2 ANAVA Til at undersøge de ovenstående hypoteser anvendes variansanalysen tosidet ANAVA. Fordelen ved denne test frem for en T-test er, at den kan anvendes til at sammenligne mere end to populationer. I dette forsøg ønskes 4 populationer sammenlignet. I dette tilfælde har forsøget et parret design, dette stiller krav som skal være opfyldt før ANAVA testen kan anvendes. Der ikke må være vekselvirkning mellem måleniveauet og holdbarheden af kortisol (17). Til at vurdere om disse krav er opfyldte fremstilles et XY-plot. 3.5.3 TEa % og Bias % Til at vurdere holdbarheden af frit kortisol i urin, sættes et krav om at koncentrationen af kortisol for en enkelt prøveserie målt over tre døgn må ikke ændres med mere 22,8 %. Dette krav stammer fra Westgards anbefalinger for TEa % af kortisol i serum(18). TEa er et udtryk for den totale variation analysen er beheftet med, altså den tilfældige variation og den analytiske variation. TEa beregnes som(19): % = 1,65 æ + Westgard anbefaler at præcisionen er 7,6 % og Bias er 10,26 %. % = 1,65 7,6% + 1,26 = 22,8 % Herudover anvendes krav Bias % på 10,26, som stammer fra Westgards anbefalinger for kortisol i serum. I formlen anvendes den intra- og interserielle variation. Bias beregnes som(19): % =,25 + 0, Side 16 af 35
Westgard anbefaler at den intraserielle variation er 15,2 og at den interserielle variation er 38,1(18). % =,25 (15,2 + 38,1 ) 0, = 1,26 Til at vurdere om dette krav for bias er overholdt, tages middelværdien af målingerne for et givet tidspunkt og sættes i forhold til middelværdien for 0-prøverne. For middelværdien udregnes et 90 % konfidensinterval. middelværdierne med det indlagte konfidensinterval må ikke overskride kravet om bias på 10,26 % (19). 3.6 Etik Da dette er et kvalitetssikringsforsøg skal det ikke indmeldes til Den Centrale Videnskab Komite (20). Side 17 af 35
3.7 Litteratursøgning Til litteratursøgningen i dette projekt er der anvendt tre forskellige søgemaskiner, Pubmed, Google scholar og Google. For at danne overblik over denne litteratursøgning stilles søgetermer og resultater af søgninger op ved hjælp af PICO metoden. PICO står for patient eller problem, Intervention, comparison intervention og outcome. PICO stilles op for søgninger på Pubmed. Der ses bort fra artikler som er fra før 2000 hvis søgningen gav et overvældende antal artikler. Cushing s Syndrom Patient Intervention Comparison Outcome AND Cushing Syndrome Hydrocortisone OR Urine Hydrocortisone And Radioimmunoassay Saliva Hydrocortisone Urine = 75869 97761 6263 Samlede resultater = 2607 Vurdering af artikler: Overskrifter (203) Abstract (39). Dato: d. 24/04-2014 Bakteriearter Patient Intervention Comparison Outcome AND Proteus Vulgaris Hydrocortisone And Urine Streptococcus Group B Hydrocortisone AND Urine Escherichia Coli Hydrocortisone And Urine OR Infection, urinay tract Hydrocortisone And Urine = 272039 95643 Samlede resultater = 2 Vurdering af artikler: Overskrifter (1) Abstract (0). Dato: d. 24/04-2014 Side 18 af 35
4 Resultater 4.1 Holdbarhedsforsøg 4.1.1 X-Y plot På figur 1.1 og 1.2 ses resultatet af de prøver som under holdbarhedsforsøget blev opbevaret ved stuetemperatur og køl præsenteret i et X-Y plot. Disse har til formål at præsentere resultaterne fra holdbarhedsforsøget visuelt. 600 X-Y plot Stuetemperatur 500 Koncentrationen i nmol/l 400 300 200 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 100 0 0 1 2 3 Tid i dage Figur 1.1: X-Y plot som viser sammenhængen mellem koncentrationen og tiden for de 10 prøver opbevaret ved stuetemperatur. Der er målt fire gange på hver enkelt prøve over fire døgn, tendenslinjerne illustrerer ændringer i koncentrationen over de fire døgn. Side 19 af 35
X-Y plot - Køl 600 500 Koncentration i nmol/l 400 300 200 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 100 0 0 1 2 3 Tid i dage Figur 1.2: X-Y plot som viser sammenhængen mellem koncentrationen og tiden for prøver opbevaret på køl. Der er målt fire gange på hver enkelt prøve over fire døgn, tendenslinjerne illustrerer ændringer i koncentrationen over de fire døgn. Side 20 af 35
4.1.2 TEa % plot Til at vurdere om der er vekselvirkning mellem måleniveauet og holdbarheden, opstilles et krav om at tendensen af koncentrationsændringen må ikke afvige mere end 22,8 % fra 0- prøven. 22,8 % er den TEa % Westgard anbefaler for kortisol i serum (18). Figur 2.1 og 2.2 er X-Y plots hvor grænserne for TEa % er lagt ind som illustrerer den procentvise ændring af koncentrationen af prøveserierne i forhold til 0-prøverne. 140 TEa % - Stuetemperatur Ændring i procent 120 100 80 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Øvre grænse Nedre grænse 60 0 1 2 3 Tid i dage Figur 2.1: X-Y Plot som viser den procentvise ændring af koncentrationen for prøverne opbevaret ved stuetemperatur. Den øvre grænse ligger på 122,8 % og den nedre grænse ligger på77,2 %. 0-prøverne er sat til 100 %. Side 21 af 35
TEa % - Køl 140 120 Ændring i procen 100 80 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 Prøve 5 Prøve 6 Prøve 7 Prøve 8 Prøve 9 Prøve 10 Øvre grænse Nedre Grænse 60 0 1 2 3 Tid i dage Figur 2.2: X-Y Plot som viser den procentvise ændring af koncentrationen af prøverne opbevaret på køl. Den øvre grænse ligger på 122,8 % og den nedre grænse ligger på77,2 %.0-prøverne er sat til 100 %. På figur 2.1 ses det at prøveserie 1 ligger måling efter 72 og 96 timer uden for grænsen på 22,8 %. Side 22 af 35
4.1.3 Bias % plot Til at vurdere holdbarheden af kortisol anvendes et X-Y plot hvor grænsen Bias % er lagt ind. Denne Bias er på 10,26 %, og stammer fra Westgards anbefalinger for Kortisol i serum (18). 140 Bias % - Stuetemperatur 130 120 110 Procent 100 90 middelværdi ifht 0 værdi Linear (Bias %) 80 70 60 0 1 2 3 4 Tid i dage Figur 3.1: X-Y Plot som viser middelværdien af alle målinger hvert døgn for prøverne opbevaret ved stuetemperatur. Middelværdien af 0-prøverne er til 100 %. Ud fra middelværdierne er der lagt et 90 % konfidens interval ind vist som rød linje der skære punktet for middelværdierne. Øvre grænse er 110,26 % og den Nedre grænse er 89,74 %. Side 23 af 35
140 Bias % for køl 130 120 Procent 110 100 90 middelværdi ifht 0 værdi Linear (Bias %) 80 70 60 0 1 2 3 4 Tid i dage Figur 3.2: X-Y Plot som viser middelværdien af alle målinger hvert døgn for prøverne opbevaret på køl. Middelværdien af 0-prøverne er til 100 %. Ud fra middelværdierne er der lagt et 90 % konfidens interval ind vist som rød linje der skære punktet for middelværdierne. Øvre grænse er 110,26 % og den Nedre grænse er 89,74 %. 4.1.4 ANAVA Til at vurdere om der er sket en statistisk ændring af kortisolkoncentrationen anvendes variansanalysen tosidet ANAVA. Denne variansanalyse er udført i Excel med et signifikansniveau på 0,05. Resultatet kan ses i skema 1.1 og 1.2. ANAVA Variationskilde F P-værdi F krit Kolonner 1,949944 0,145372 2,960351 Skema 1.1: Resultatet ANAVA analyse af prøverne opbevaret ved stuetemperatur. ANAVA Variationskilde F P-værdi F krit Kolonner 0,737063 0,539113 2,960351 Skema 1.2: Resultatet ANAVA analyse af prøverne opbevaret på køl. Begge ANAVA tests viser at der ikke sker en signifikant ændring af kortisolkoncentrationen, da F er mindre end F krit og P-værdien er større end signifikansniveauet. Side 24 af 35
4.2 Bakterie forsøget 4.2.1 X-Y plot På figur 4 ses resultatet af prøver med bakterievækst som blev opbevaret ved stuetemperatur i et X-Y plot. Dette har til formål at præsentere resultatet af forsøget med bakterievækst visuelt. 3000 X-Y plot - Bakterier 2500 Koncentration i nmol/l 2000 1500 1000 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 500 0 0 1 2 3 Tid i dage Figur 4: X-Y plot som viser sammenhængen mellem koncentrationen og tiden for de 4 prøver opbevaret med bakterievækst. Der er målt fire gange på hver enkelt prøve over fire døgn, tendenslinjerne illustrerer ændringer i koncentrationen over de fire døgn. Prøve 1 indeholder E. Coli, prøve 2 indeholder Proteus Vulgaris, prøve 3 indeholder streptokokker gruppe B, prøve 4 indeholder E. Coli. Som det ses i figur 4 har prøveserie 4 en kortisol koncentration på over 2500 nmol/l. et koncentrationsniveau så højt ligger uden for analyseområdet som kittet til u-cortisol analysen er designet til. Derfor vil prøveserie 4 blive ekskluderet fra videre databehandling. Side 25 af 35
4.2.2 TEa % Til at vurdere bakteriernes indvirkning på analysen er der fremstillet et X-Y plot hvor TEa % grænserne for kortisol i serum er lagt ind. TEa er 22,8 % og stammer fra Westgards anbefalinger (X). 180 TEa % - Bakterier 160 140 Ændring i procent 120 100 Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Øvre grænse Nedre grænse 80 60 0 1 2 3 Tid i dage Figur 5: X-Y Plot som viser den procentvise ændring af koncentrationen af prøverne med bakterievækst. Den øvre grænse ligger på 122,8 % og den nedre grænse ligger på77,2 %.0-prøverne er sat til 100 %. Prøve 1 indeholder E. Coli, prøve 2 indeholder Proteus Vulgaris, prøve 3 indeholder streptokokker gruppe B. Figur 5 viser at prøveserie 1 og 3 efter 24 timer stiger med mere end 22,8 %, altså overskrider disse to prøveserier TEa % grænsen (18). Side 26 af 35
5 Diskussion 5.1 Præanalytisk Metoden Prøverne har henstået et døgn ved henholdsvis stuetemperatur og på køl, før 0-prøverne er blevet frosset ned. Dette er grundet i at prøverne er modtaget i et tidsrum som spænder over et tidsrum fra kl. 8:40 til 13, samt at prøverne fra mikrobiologisk afdeling side har henstået i 24 timer før de er blevet inkluderet i dette forsøg. For at kunne behandle prøverne samlet blev de derfor henstillet i 24 timer før nedfrysning af 0 prøverne. Da 0- prøven sættes om startværdien i dette forsøg kan der ses bort fra ændringer i dette tidsrum. De bakteriearter som indgår i forsøget kommer af fra mikrobiologisk afdeling kunne tilbyde 10 uriner hvoraf 4 var med vækst. Forsøget omkring bakteriers indvirkning på analysen kommer af en tvivl om hvor vidt bakterier kan have en indvirkning på analysen, dette stammer fra en gammel indlægseddel. Derfor laves forsøget med bakterievækst som et sideforsøg, og derfor er der ikke indhentet flere prøver med bakterievækst. 5.2 Analysen Selve analysen er blevet udført af en erfaren bioanalytiker, da U-cortisol er en manuel analyse vil det kræve en hvis oplæringstid for at kunne udføre analysen tilfredsstillende. Til dette forsøg tildelte KBA halvanden prøvekit, altså 150 antistofcoatet rør samt tilhørende reagenser. med et prøveantal på 96 var vi nød til at lave analysen med enkeltbestemmelser. Herudover er der fra afdelingens side vurderet at analysen har en god nok præcision, til dette forsøg kan udføres med enkeltbestemmelser. Det at forsøget er lavet i enkeltbestemmelser gør at de enkelte resultater er beheftet en tilfældig variation som ikke kan kvantificeres. Da resultaterne i dette forsøg sammenlignes med 0-prøven må den tilfældige variation for både 0-prøven og det pågældende resultat medtages. 5.2.1 Kontroller Analysen U-kortisol vurderes til at have en god præcision ud fra kontrolkortene for RANDOX level 2 og 3, samt kit kontrollen. Disse kontrolkort viser at langt de fleste målinger af kontrollerne ikke overskrider ±1 SD. Der ses ingen brud på reglerne for SD, altså at fire konsekutive målinger ikke må overskride ±1 SD og en måling ikke må overskride ±3 SD. Dette illustrer at analysen er stabil. CV % er for RANDOX level 2 6,7 %, for RANDOX level 3 6,2 % og for Kit kontrollen 10, 1 %, som udtrykker størrelsen af denne SD (bilag 8). I henhold til Kit DRG Diagnostica Cortisol RIA kitinsert er den Side 27 af 35
intraserielle præcision 8,9 % (bilag 2). Dette understreger at afdelingens vurdering af at analysen er præcis nok til at udfører forsøget med enkeltbestemmelser. Da prøverne i forsøget er blevet analyseres i to serier overskrider RANDOX kontrollerne Level 2 og 3 i serie to ±1 SD. RANDOX 2 er blevet målt til 114,7 og ±1 SD er 119-137. RANDOX 3 er blevet målt til 275,3 og ±1 SD er 279-315. I samme kørsel er kit-kontrollen blevet målt til 145,5 og ±1 SD er 128-156, altså overholder Kit-kontrollen ±1 SD. Herudover betragtes de målinger af RANDOX kontrollerne før og efter denne måling og da disse ligger inden for ±1 SD er der ikke noget brud på Westgards reglerne om SD (21,22). Dette gør at de to serier kan sammenlignes. 5.3 Resultater Til at vurdere resultaterne anvendes TEa % og Bias % fra Westgards anbefalinger for kortisol i serum. Der ikke forlægger specifikationer af krav for analysen U-cortisol på afdelinge da disse ikke endnu er udarbejdet, eller anbefalinger fra Westgard om biologiske data for urin kortisol. Da kittet også kan anvendes til analysere kortisol i serum, samt at der tilsættes bovin serumalbumin til urinprøverne. Derfor anvendes disse krav til vurdering af resultaterne for holdbarheds- og bakterieforsøget. I denne opgave anvendes både ANAVA, TEa % og Bias % til at vurdere resultaterne. ANAVA tager udgangspunkt i middelværdierne og udtaler sig om der er signifikant forskel på disse(23). TEa % og Bias % sættes op som krav til resultaterne af forsøget og disse krav tager udgangspunkt i analysen og den tilfældige variation. Det er også disse krav som (Prøvematerialets holdbarhet Kriterier og vurderinger) anbefaler, samt KBA anvender disse krav til at vurdere biomarkøres holdbarhed. 5.3.1 ANAVA Til at vurdere om der er vekselvirkning mellem holdbarheden og måleområdet anvendes Figur 1.1 og 1.2 samt figur 2.1 og 2.2. Som krav anvendes en Tea % på 22,8 % fra Westgards anbefalinger(18). TEa % er valgt som krav, fordi den forholder sig til den tilfældige variation og den systematiske variation, altså den totale variation en måling kan behæftes med(24). Figur 2.1 og 2.2 viser at lang de fleste målinger lever op til dette krav. Men som det ses i Figur 2.1 overskrider prøveserie 1, måling på dag 2 og dag 3 med en procentvis stigning fra 0-prøven på henholdsvis 37,9 % og 38,3 %. Da koncentrationen af kortisol ikke burde stige, denne stigning kan til dels være forårsaget af den tilfældige variation og analysevariationen. Stigningen af koncentrationen er ca. 9 nmol/l og 0-prøven Side 28 af 35
har en koncentration på 24,9. Altså er der her tale om en lille koncentrationsændring og denne ændring har ikke nogen klinisk relevans. Da denne prøveserie befinder sig i den lave ende af måleområdet, siger dette resultat alene ikke noget om vekselvirkningen mellem koncentrationen og holdbarheden, fordi denne vekselvirkning ikke kommer til udtryk i det lave måleområde, samt at koncentrationen af denne prøveserie stiger over tid. Til vurdering af tendensen for koncentrationsændringerne over tid betragtes figur 1.1 og 1.2. Ved betragtning af disse figurer, er der ikke nogen tendens som taler for, at der skulle være vekselvirkning mellem koncentrationen og tiden, da der både ses stigninger og fald i koncentrationen, og der ses ikke en tendens til at disse koncentrationsændringer er markant støre i de højere måleområder. Resultaterne fra holdbarhedsforsøget opfylder derved kravet om at der ikke må være vekselvirkning mellem koncentration og holdbarheden, dette gør at tosidet ANAVA med parret design kan anvendes som variansanalyse(17). Ifølge skema 1.1 og 1.2 kan H 0 accepteres for både stuetemperatur og køl. Dette betyder at der ikke er signifikant forskel på meddelværdierne i populationerne, med andre ord er der ikke forskel på koncentrationerne i de forskellige prøveserier. Derved viser ANAVA analysen at kortisol er holdbar i op til 72 timer ved opbevaring på køl og ved stuetemperatur. 5.3.2 TEa og Bias plot Figur 2.1 og Figur 3.1 viser, at kortisol er holdbar i 24 timer under opbevaring ved stuetemperatur. Figur 2.1 viser at det kun er prøveserie 1 som overskrider kravet om TEa. Figur 3.1 viser at, efter 24 timer overskrider konfidensintervallet for middelværdierne af prøverne for tiden dag 2, Bias % grænsen på 10,26 %. Dette stemmer over ens med Lyngbyes anbefalinger som skriver at kortisol er holdbar i 24 timer hvis opbevaret ved 20 C o (9). Figur 2.2 og 3.2 viser at alle prøver ligger inden for kravene om TEa % og Bias %, altså er kortisol holdbar i minimum 72 timer. Dette stemmer over ens med Lyngbyes anbefalinger, som siger kortisol er holdbar i en uge hvis opbvaret ved 4 C o (9). Hvorimod laboratorievejledningen for KBA Aalborg universiteshospital skriver at kortisol i urin er holdbar i 48 timer ved 2-8 C o (1). Side 29 af 35
5.3.3 Bakterier Til vurderingen af resultatet af bakterieforsøget ekskluderes prøveserie 4, dette er en E. Coli. Der ses bort fra denne prøveserie, fordi koncentrationen af denne serie ligger uden for standardkurven i analysen 0-2000 nmol/l. Figur 5 viser at bakterier kan have indvirkning på analysen. Bakterieforsøget viser at prøveserie 1 (E. Coli) og 3 (Streptokokker gruppe B), påvirker analysen tilstrækkeligt til at resultatet overskrider TEa %. Hvis kurverne for disse to prøveserier betragtes, viser plottene at disse bakterier forårsager en stigning af kortisolkoncentrationen over de fire målinger. TEa % beskriver den totale variation som kan tillægges analysen, og da begge disse prøveserier overskrider TEa % antages det at disse bakterier har påvirket analyseresultatet. Der forlægger ikke litteratur som beskriver denne stigning, og da dette forsøg kun indeholder tre prøver med tre forskellige bakterier, er dette ikke tilstrækkeligt til at kunne drage en endelig konklusion. 5.3.4 Klinisk betydning Der ses både stigninger og fald i resultatet af holdbarhedsforsøget, og derfor er det nødvendigt at vurdere hvilken klinisk betydning dette har for patienten. Når screenings testen U-cortisol udføres i forbindelsen med mistanke om cushings syndrom, er dette sket på baggrund af de kliniske fund samt patientens anamnese (3). Altså er der tale om en patient der er under udredning. Hvis en patient med forhøjet kortisol på baggrund af et fald i koncentrationen på grund af holdbarheden ænder ud med et falsk negativ svar, vil patienten fortsat være under udredning. Hvis der kan være tvivl om et resultat er abnormt bør analysen gentages, da der er mange faktorer der spiller ind på kortisolniveauet i kroppen(2). Hvis en patient på baggrund af holdbarheden ænder ud med et falsk negativ resultat, bør analysen gentages på grund af det abnorme resultat, herefter følger en videre udredning. Her vil et falsk negativ resultat opdages. Der stilles altså ikke nogen diagnose på baggrund af U-kortisol alene. 6 Konklusion Patienten opsamler døgnurin over 3 døgn, i bedste fald betyder at prøverne opbevares i minimum 3 døgn før de analyseres, men sandsynligvis længere. Dette holdbarhedsforsøg viser, hvis prøverne opbevares ved stuetemperatur er holdbarheden af kortisol 24 timer. Hvis prøverne opbevares på køl viser holdbarhedsforsøget at kortisol er holdbart i minimum 72 timer og ifølge lyngbyes anbefalinger op til en uge. I patientvejledningen Side 30 af 35
anbefales det at den opsamlede urin opbevares køligt. I vejledningen bør dette specificexres til 4-5 C o, hvis dette ikke er en mulighed kan alternativer som at indsende døgnurinerne dagligt. For både patienten og KBA Aalborg universitetshospital og den sekundere sektor, vil dette give en arbejdsmæssig og økonomisk byrde og er i sidste ende nok ikke en reel løsning. Bakterieforsøget viser at E. coli og streptokokker gruppe B har en indvirkning på analysen. Men da der er i dette forsøg kun er inddraget tre prøver med tre forskellige bakteriearter, samt at der ikke forlægger nogen forklaring på resultatet, vil bakteriers indvirkning på analysen skulle undersøges nærmere. 7 Perspektivering Dette kvalitetssikringsprojekt er opstået på baggrund af holdbarheden af frit kortisol i urin opbevaret ved stuetemperatur er 24 timer og udsigten til analysen kan påbegyndes er i bedste fald 3 døgn. Dette kommer af at patienten skal opsamle døgnurin over 3 døgn til analysen U-cortisol. Et alternativ til screeningsanalysen U-cortisol kunne være at måle frit kortisol i spyt. Ifølge The Endocrine Society s clinical guidelines kan måling af frit kortisol i spyt mellem kl. 23 og 24, anvendes som screeningsmetode for Cushings syndrom. Den store fordel ved at anvende denne metode at kortisol i spydt er holdbart i flere uger ved opbevaring på enten køl eller stuetemperatur(25). Dette vil løse problemstillingen omkring holdbarheden og analysefristen. Dette vil dog kræve en ændring af metoder for både prøvetagning og analysering. Herudover er der en række fordele og ulemper ved begge metoder som bør overvejes. Kortisolkoncentrationen i kroppen er delvist underlagt en døgnrytme, denne har ikke betydning for opsamlingen af døgnurin men da prøvetagningen af spyt er underlagt et specifikt tidspunkt kan dette have indvirkning på resultatet(26). Herudover kan det også få indvirkning resultatet hvis ikke patienten overholder prøvetagningstidspunktet. Kortisoludskillelsen i urin og spyt er også underlagt forskellige præmisser. Kortisol udskildes med urinen og derved akkumuleres over tid. Kortisol i spyt diffundere fra blodbanen over epitellaget i glandula parotis, submandibularis og sublingualis. Denne proces tager ca. 20 min. Derved kan en ændring af kortisolniveauet op til prøvetagningen have stor indflydelse på resultatet. Dette kan give problemer da indtagelse af mad og drikke, samt rygning, fysisk aktivitet og stress påvirker kortisolniveauet i kroppen (26). Prøvetagningen, opbevaringen og indsendelsen af spytprøver er noget nemmer end Side 31 af 35
døgnurin for patienten. Dette er grundet forskel i mængden af prøvemateriale, samt prøvematerialet i sig selv da det for mange er grænseoverskridende at skulle opbevare urin især da det bør opbevares på køl. Side 32 af 35
8 Referenceliste (1) Aalborg Universitetshospital. Laboratorievejledning - Pt(U)-Cortisol. 2013; Available at: http://www.laboratorievejledning.dk/prog/view.aspx?afsnitid=103&kapitelid=26&ukap itelid=90. Accessed 27/05, 2014. (2) Vestergaard H, Sachs C, Hansen B. Cushingssyndrom. 2012; Available at: https://www.sundhed.dk/sundhedsfaglig/laegehaandbogen/endokrinologi/tilstande-ogsygdomme/binyresygdomme/cushings-syndrom/#headerdaxa. Accessed 27/05, 2014. (3) Schaffalitzky de Muckadell OB, Haunså S, Vilstrup H. Cushingssyndrom. MedicinskKompendium. 17. udgave ed. København: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck; 2009. p. 2101-2104. (4) Degré M, Hovig B, Rollag H. Medisinskmikrobiologi. 3. udgave ed. Oslo: Gyldendal; 2008. (5) Sand O, Sjaastad ØV, Haug E, Bjålie JG, Toverud KC. Detendokrine system. Mennesketsanatomiogfysiologi. 2. udgave ed. København: Gads Forlag; 2008. p. 201-202. (6) Ødum L, Hansen-Nord G, Hansen AB, Kjeldsen HC. Kortisol. 2014; Available at: https://www.sundhed.dk/sundhedsfaglig/laegehaandbogen/undersoegelser-ogproever/klinisk-biokemi/blodproever/kortisol/. Accessed 27/05, 2014. (7) Roa SLR, Elias PCL, Castro M, Moreira AC. The cortisol awakening response is blunted in patients with active Cushing's disease. 2013 2013;Volume 168(European Journal of Endocrinology):657-664. (8) Løvås K, Cooper JG, Thorsen T, Thordarson H, Husebye ES. Døgnrytmetilbesvær. 2003 26/06;Volume 123(Tidsskrift for Den norskelegeforening):20/05 2014-1858-1859. (9) Lyngbye J, Kjær A, Ladefoged S, Nissen PH. Nuklearmedicin. LyngbyesLaboratoriemedicin. 2. udgave ed. København: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck; 2010. p. 170. (10) Raverot G, Wierrinckx A, Jouanneau E, Auger C, Borson-Chazot F, Lachuer J, Pigeat M, Trouillas J, Clinical, hormonal and molecular characterization of pituitary ACTH adenomas without (silent corticotroph adenomas) and with Cushing s disease. 2013; Volume 163 (European Journal of Endocrinology):35-43. (11) PerkinElmer; available at: http://www.perkinelmer.com/resources/technicalresources/applicationsupportknowled gebase/radiometric/radioimmunoassay.xhtml. Accessed 27/05, 2014. (12) Andersen E.S, Jespersgaard P, Østergaard O.G, Databog fysik kemi 11. Udgave en. F og K forlaget; 2009. p. 200. Side 33 af 35
(13) Løvschall-Jensen E. Gammastråling. Available at: http://fysikleksikon.nbi.ku.dk/g/gammastraaling/. Accessed 27/05, 2014. (14) Degré M, Hovig B, Rollag H. Enterobacteriaceae. MedisinskMikrobiologi. 3. udgave ed. Oslo: GyldendalNorskForlag; 2010. p. 167. (15) Statens Serum Institut. Hæmolytiske streptokokker. 2013; Available at: http://www.ssi.dk/forskning/forskningsomraader/infektioner/infektiose%20agens/bakteri er/haemolytiske%20streptokokker.aspx. Accessed Accessed 27/05, 2014. (16) Degré M, Hovig B, Rollag H. Enterobacteriaceae.. 3. udgave ed. Oslo: GyldendalNorskForlag; 2010. p. 171. (17) Bendsen T. En- ogtosidetvariansanalyse. 2014; Available at: http://statnoter.biolyt.dk/index.php?pageid=141. Accessed 27/05, 2014. (18) Westgard. Desirable Specifications for Total Error, Imprecision, and Bias, derived from intra- and inter-individual biological variation. 2009; Available at: http://www.westgard.com/biodatabase1.htm. Accessed 27/05, 2014. (19) Åsberg A, Solem K.B, Mikkelsen G, Prøvematerialets holdbarhet Kriterier og vurderinger, 2011. (20) Vejledningomanmeldelsem.v. af et biomedicinskforskningsprojekttildetvidenskabsetiskekomitésystem. Available at: http://cvk.sum.dk/forskere/~/media/files/cvk/forskere/vejledning/vejledning050511.ashx Accessed 27/05, 2014. (21) Bendsen T. Kontrolkort. 2014; Available at: http://statnoter.biolyt.dk/index.php?pageid=111. Accessed 27/05, 2014. (22) Bendsen T. Westgard-regler. 2014; Available at: http://statnoter.biolyt.dk/index.php?pageid=110. Accessed 27/05, 2014. (23) Bendsen T. Variansanalyse. 2014; Available at: http://statnoter.biolyt.dk/index.php?pageid=44. Accessed 27/05, 2014. (24) Westgard. The meaning and application of Total Error. Available at: http://www.westgard.com/essay111.htm. Accessed 27/05, 2014. (25) Nieman LK, Biller BMK, Findling JW, Newell-Price J, Savage MO, Stewart PM, et al. The Diagnosis of Cushing's Syndrome: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. 2008 Maj;Volume 93(The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism):20/05. (26) Sarak P.L, Zeng L, Chen Y, Salvabte K.G, Nepomnaschy P.A, A Longitudinal Evaluation of the Relationship Between First Morning Urinary and Salivary Cortisol: AMERICAN JOURNAL OF HUMAN BIOLOGY: 2013. volume 25. P. 351 358. Side 34 af 35