Genetiske faktorer og for tidlig ovariealdring et forsknings års projekt Formål og perspektiver Formålet med undersøgelsen er at belyse behovet for en genetisk screening for FMR1 mutationer og cytogenetiske forandringer af kvinder med poor ovarian response/nedsat ovarierespons ved fertilitetsbehandling (<3 æg udtaget ved IVF trods sufficient hormonstimulation) med henblik på afklaring af behov for screening af denne gruppe, behov for prænatal diagnostik i en eventuel graviditet og rådgivning af familiemedlemmer. Baggrund Infertilitet er en folkesygdom, der rammer ca. 15-25 % af befolkningen og problemet er stigende bl.a. grundet kvinders tiltagende sene reproduktion[1, 2]. Således skønnes det, at ca. 8-10 % af en børneårgang i Danmark bliver til ved hjælp af assisteret befrugtning. Kvinder har fra fosterlivet et "lager" af æg-anlæg (primordialfollikler) af en vis størrelse, og antallet af follikler aftager fra 6-7 mio ved fostertilstanden til omkring 400.000 ved puberteten og falder derefter til ca. 1000 ved menopausen. Størrelsen af dette lager og hastigheden, hvormed antallet aftager er individuel, og de faktorer, der påvirker disse forhold er dårligt beskrevet [3, 4]. En lille ovariereserve og fremskreden ovariealdring kan vise sig ved fertilitetsbehandling, hvor der trods massiv hormonstimulation udtages få æg ( 3). Det lille ægudtag kaldes poor ovarian response eller nedsat ovarie respons og er formentligt det mest valide mål for ovariealdring[5]. Risikoen for nedsat ovarie respons stiger med alderen grundet den naturlige aldring af ovarierne, men ses også som et patologisk fund hos yngre kvinder ( 35 år) som ikke blot har nedsat fertilitet, men også øget risiko for tidlig overgangsalder[6]. Yngre kvinder (<35 år) med nedsat ovarie respons repræsenterer således formentlig en væsentlig del af de kvinder, der går for tidligt i overgangsalder. En række undersøgelser har vist, at kvinder med for tidlig overgangsalder (ophør af menstruationer i en alder <40 år) har øget forekomst af mutationer i et gen (FMR1) på X kromosomet, samt øget hyppighed af cytogenetiske forandringer [7, 8]. Således har American Society for Obstetricians and Gynecologists (32) anbefalet screening af kvinder med for tidlig overgangsalder for Fragilt X. "If a woman has a personal or family history of ovarian failure or an elevated follicle-stimulating hormone level before age 40 years without a known cause, fragile X premutation carrier testing should be offered"[9]. FMR1 mutationen Mutationer i FMR1-genet kan føre til Fragile-X syndrom, den hyppigste årsag til arvelig mental retardering[11]. Fragile-X syndrom skyldes et triple repeat af baserne CCG og antallet af repeats er medvirkende til i hvor svær grad sygdommen kommer til udtryk. De normale antal repeats defineres lidt forskelligt, men ligger i området 1
6-41 op til 53. Et repeat antal > 200 giver den fuldmuterede sygdom mens et repeat antal mellem 55-200 betegnes præmutation[7]. Ved over 200 CCG repeats bliver FMR1 genet hypermethyleret og dermed komplet nedreguleret. Dette medfører at der ikke produceres fragilt X mental retardation protein (FMRP), et mrna-bindende protein, der regulerer transport af mrna. Hyppigheden af FMR1 mutationen blandt yngre kvinder med nedsat ovarierespons kendes ikke. Kvinder, der er bærer af præmutation har øget risiko for at gå for tidligt i overgangsalderen [12, 13]. Studier har således fundet, at kvinder med præmutation går 5 år tidligere i overgangsalder end kvinder uden FMR1 mutation [14, 15]. Fuldmutationen ses hos 1/1000 [16]. Præmutationsbærere er fundet hos op til 13% af kvinder med familiær for tidlig overgangsalder, lavere hos kvinder med sporadisk forekommende [17-20]. Blandt kvinder med FMR1 præmutationen har 13-26% tegn på for tidlig ovariealdring [14, 21, 22]. Arvegangen er X-bunden dominant men med mildere fænotype hos kvinder. Ved maternel videregivelse er repeatet ustabilt, oftest resulterende i en ekspansion af repeatet i næste generation[23]. Risikoen for at barnet får en fuldmutation er mindre end 50%, hvis moderen har et repeatantal mellem 59 og 79 men 90% hvis der er >90 repeats (præmutation)[9]. Kendskab til evt. mutationsstatus har således konsekvenser i forhold til genetisk rådgivning og behov for prænatal diagnostik. Cytogenetiske forandringer Det er i en række undersøgelser fundet, at op til 10 % af kvinder med for tidlig overgangsalder har cytogenetiske forandringer dvs. ændringer i struktur og antal af kromosomer hos kvinder med for tidlig overgangsalder. Især forandringer i X- kromosomet er en hyppig medvirkende årsag til for tidlig overgangsalder[24-26]. Der er rapporteret en hyppighed på 3,8% af 47,XXX blandt kvinder der går for tidligt i overgangsalderen [15], kasuistiske meddelelser om 48, XXXX og dicentrisk isokromosom, øget forekomst af celler med X-monosomi, dvs. mosaicisme, og øget hyppighed af X rearrangements [27]. Der er således fundet 4% med Xq chromosome deletion blandt 146 kvinder der går for tidligt i overgangsalderen [24]. I en undersøgelse af 227 kvinder der går for tidligt i overgangsalderen fandt man endvidere 27 med kromosomfejl i form af strukturelle og antalsfejl [25]. Det må således formodes, at yngre kvinder der går for tidligt i overgangsalderen udgør en højrisikogruppe med hensyn til cytogenetiske forandringer, men prævalensen i denne gruppe bør afklares, førend der tages stilling til behov for screening med henblik på genetisk rådgivning og afklaring af behov for prænatal diagnostik. Hypoteser 2
Der findes en øget hyppighed af cytogenetiske forandringer og FMR1 præmutationer hos kvinder 35 år med nedsat ovarierespons sammenlignet med en reference gruppe. Materiale Hypotesen påtænkes belyst ved et retrospektivt studie med en kohorte af kvinder med nedsat ovarierespons og en referencegruppe, som begge undersøges for hyppighed af FMR1-præmutationer og cytogenetiske forandringer. Patienter - Poor ovarian response/nedsat ovarierespons Inklusionskriterier: Kvinder, som er 35 år på ægudtagningstidspunktet og som har fået taget 3 æg ud i mindst to cykli og som er sufficient hormonstimuleret, dvs. med mindst 250 IE FSH. Der inkluderes også kvinder med aflyst behandling, hvor der ikke var follikeludvikling. Eksklusionskriterier: Kvinder, der opfylder ovenstående kriterier, men hvor der er en anden forklaring på lille ovariereserve: tidligere ovarie kirurgi, kemoterapi, stråleterapi eller anden iatrogen ovarieskade. Kvinder med endometriose, kendt Turner syndrom samt kendt FMR1 allel expansion. Referencegruppe til undersøgelse af FMR1-præmutation: Inklusionskriterier: Kvinder, som i mindst to på hinanden følgende cykli har fået udtaget > 8 æg og som er 35 år på ægudtagningstidspunktet. Eksklusionskriterier: Kvinder med polycystisk ovariesyndrom. Referencegruppe til undersøgelse af cytogenetiske forandringer Inklusionskriterier: Kvinder til mænd med dårlig sædkvalitet og en abnormal karyotypering. Disse data udtrækkes fra Dansk Cytogenetisk register. Eksklusionskriterier: Kvinder med polycystisk ovariesyndrom. I denne retrospektive serie inviteres patienter, der har afsluttet behandlingsforløb på en af de tre offentlige fertilitetsklinikker i Region Midt til at deltage i studiet. Potentielle kandidater identificeres i fertilitetsdatabaserne på de tre fertilitetsklinikker i Region Midt, og inviteres pr. brev til at deltage, og gives mulighed for at aftale en tid for et møde, hvor der gives mundtlig information om projektet. Såfremt de ønsker at deltage, tages der blodprøver, måles waist-hip ratio samt blodtryk. Såfremt der fra fertilitetsbehandlingen forefindes data vedr. AMH og antral follikel antal i journal eller anden database om, vil dette blive registreret og inkluderet i undersøgelsen, da disse parametre giver supplerende information om ovariereserven. Metoder 1. Diagnostikken af FMR1 foretages med PCR teknologi ved hjælp af Fragilease -kit (Perkin Elmer). Metoden kan identificere kvinder med 3
normale-, præ-muterede- samt fuldmuterede repeat antal på op til 900 repeats. Ved fund af præmutation/fuld mutation verificeres diagnosen med certificeret Fragil-x standard analyse på Klinisk Genetisk Afdeling, Aarhus Universitetshospital. 2. Cytogenetiske forandringer undersøges vha. standard kromosom analyse der foretages på perifere lymfocytter fra blodet. Der analyseres 10 metafaser (tælling) i Q-båndsfarvning (quinacrine) hvoraf 2 metafaser karyotyperes. Ved abnorme fund analyseres yderligere 100 celler ved hjælp af fluorescens in situ hybridisering (FISH). De abnorme fund ved den cytogenetiske undersøgelse danner grundlag for udvælgelse af FISH-prober. Statistiske overvejelser FMR1: Hvis det antages at risikoen for FMR1 præ-mutationer hos kvinder med nedsat ovarierespons er tilsvarende den der er fundet hos kvinder med for tidlig overgangsalder (13%) og at risikoen hos referencegruppen er tilsvarende risikoen for præmutation hos kvinder med normal menopause (0%), er der 80 % chance for at finde en statistisk signifikant forskel (p<5 %) hvis der inddrages 70 personer i hver gruppe. Antages det, at risikoen for FMR1 præmutation skulle være mindre, eksempelvis halveret hos POR (6,5%), skal der anvendes 145 personer i hver gruppe for, med 80 % chance, at finde en statistisk signifikant forskel (p< 5 %). Det vurderes derfor, at det er tilstrækkeligt at rekruttere 200 personer i hver gruppe. Cytogenetik: Hvis det antages at risikoen for cytogenetiske forandringer hos kvinder med nedsat ovarierespons er tilsvarende den risiko der er fundet hos kvinder med for tidlig overgangsalder (10 %) og at risikoen hos referencegruppen er tilsvarende risikoen for cytogenetiske forandringer hos kvinder med normal menopause (0 %), skal der inddrages 93 personer i hhv. kvinder med nedsat ovarierespons og referencegruppen for at der 80% chance for at finde en statistisk signifikant forskel (p<5%). Hvis det antages at risikoen for cytogenetiske forandringer, mod forventning, skulle være halvt så stor (5%) hos kvinder med POR, er der 80 % chance for at finde en statistisk signifikant forskel (p<5%) på de to grupper, hvis der inddrages 190 personer i hver gruppe. Det vurderes derfor, at det er tilstrækkeligt at rekruttere 200 personer i hver gruppe Datadokumentation Patientdata registreres primært på et dataskema og lægges sekundært ind i databaseprogrammet Epidata. Dataskemaer mærkes med unikt behandlingsnummer, der tildeles hver enkelt fertilitetsbehandling, samt et fortløbende projektnummer. 4
Skemaerne opbevares i aflåst lokale på Fertilitetsklinikken, Aarhus Universitetshospital. Data indlagt i Epidata vil være anonymiserede med et fortløbende projektnummer. Der oprettes en biobank bestående af blodprøver, som mærkes med det fortløbende projektnummer. Ved projektets afslutning slettes eller anonymiseres alle data. Der vil blive søgt om tilladelse til at bevare biobanken. Organisation Dette projekt vil blive udført på Fertilitetsklinikken, Aarhus Universitetshospital, Skejby under ledelse af Professor, overlæge, dr. med Hans Jakob Ingerslev og med daglig supervision fra Cand. Scient. San, Mette Wulf Christensen. De praktiske tiltag og arbejde vil blive udført af Stud. Med. Vibe Poulsen. Etik Der er tale om kvinder, som har gennemgået fertilitetsbehandling. Kvinderne vil have mulighed for at få en forklaring på, hvorfor de havde få æg ved de gennemgåede behandlinger. I fald den genetiske undersøgelse viser præmutation eller FMR1 expansion, bliver kvinden tilbudt genetisk rådgivning på Klinisk Genetisk Afdeling, Aarhus Universitetshospital. Kvinden får hermed mulighed for at agere med hensyn til sin eventuelle egen reproduktion (valg af prænatal diagnostik/ præimplantationsdiagnostik), og der vil være mulighed for rådgivning af familiemedlemmer i forhold til deres reproduktion. Der er ingen direkte behandlingsmæssige fordele for patienterne ved at deltage i studiet. Blodprøvetagning er forbundet med meget lille ulempe for kvinden, og må skønnes at være risikofri. Der er indhentet godkendelse fra Videnskabsetisk Komite til projektet. Tidsplan 01.09.15 til 01.12.15: Oplæring i analyser, rekruttering af patienter, litteraturlæsning, kurser. 01.12.15 til 01.04.16: Rekruttering og analyser 01.04.16 til 01.09.16: Analyser 01.09.16 til 01.12.16: Udarbejdelse af forskningsårsrapport Referencer 1. Schmidt, L., et al., Demographic and medical consequences of the postponement of parenthood. Hum Reprod Update, 2012. 18(1): p. 29-43. 2. Baird, D.T., et al., Fertility and ageing. Hum Reprod Update, 2005. 11(3): p. 261-76. 3. E.R. te Velde *, M.D., F.J. Broekmans, Age at menopause as a marker of reproductive ageing. Maturitas, 1998. 30: p. 119 125. 4. L.Pearson, E.R.t.V.a.P., The variability of female reproductive ageing. Human Reproduction Update, 2002. Vol.8(No.2 ): p. pp. 141±154. 5. Ferraretti, A.P., et al., ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria. Hum Reprod, 2011. 26(7): p. 1616-24. 5
6. Tarek El-Toukhy, Y.K., Roger Hart, Alison Taylor and Peter Braude, Young age does not protect against the adverse effects of reduced ovarian reserve an eight year study. Human Reproduction 2002. Vol.17( No.6 ): p. pp. 1519 1524. 7. Allen, E.G., et al., Examination of reproductive aging milestones among women who carry the FMR1 premutation. Hum Reprod, 2007. 22(8): p. 2142-52. 8. Karimov, C.B., et al., Increased frequency of occult fragile X-associated primary ovarian insufficiency in infertile women with evidence of impaired ovarian function. Hum Reprod, 2011. 26(8): p. 2077-83. 9. Wittenberger, M.D., et al., The FMR1 premutation and reproduction. Fertil Steril, 2007. 87(3): p. 456-65. 10. Soini, S., et al., The interface between assisted reproductive technologies and genetics: technical, social, ethical and legal issues. Eur J Hum Genet, 2006. 14(5): p. 588-645. 11. Genetics, C.o., Carrier Screening for Fragile X Syndrome. The American College of Obstetricians and Gynecologists, 2010. VOL. 116(NO. 4). 12. Welt, C.K., P.C. Smith, and A.E. Taylor, Evidence of early ovarian aging in fragile X premutation carriers. J Clin Endocrinol Metab, 2004. 89(9): p. 4569-74. 13. Murray, A., et al., Reproductive and menstrual history of females with fragile X expansions. Eur J Hum Genet, 2000. 8(4): p. 247-52. 14. Sullivan, A.K., et al., Association of FMR1 repeat size with ovarian dysfunction. Hum Reprod, 2005. 20(2): p. 402-12. 15. Goswami, R., et al., Prevalence of the triple X syndrome in phenotypically normal women with premature ovarian failure and its association with autoimmune thyroid disorders. Fertility and Sterility, 2003. 80(4): p. 1052-1054. 16. Sherman, S.L., Premature ovarian failure in the fragile X syndrome. Am J Med Genet, 2000. 97(3): p. 189-94. 17. Gerard S.Conway, N.N.P., James Webb, Anna Murray and Patricia A. Jacobs, Fragile X premutation screening in women with premature ovarian failure. Human Reproduction 1998. vol.13 (no.5 ): p. pp.1184 1187. 18. Anna Murray, J.W., Sarah Grimley, Gerard Conway, Patricia Jacobs, Studies of FRAXA and FRAXE in women with premature ovarianfailure. J Med Genet, 1998. 35: p. 637-640. 19. Gersak, K., Fragile X premutation in women with sporadic premature ovarian failure in Slovenia. Human Reproduction, 2003. 18(8): p. 1637-1640. 20. Bussani, C., et al., Premature ovarian failure and fragile X premutation: a study on 45 women. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 2004. 112(2): p. 189-191. 21. Diane J. Allingham-Hawkins, R.B.-H., David Chitayat, Jeanette J.A. Holden, Kathy T. Yang, C. Lee, R. Hudson, H. Gorwill, Sarah L. Nolin, Anne Glicksman, Edmund C. Jenkins, W. Ted Brown, Patricia N. Howard-Peebles, Cindy Becchi, Emilie Cummings, Lee Fallon, Suzanne Seitz, Susan H. Black, Angela M. Vianna-Morgante, Silvia S. Costa, Paulo A. Otto, Regina C. Mingroni-Netto, Anna Murray, J. Webb, F. MacSwinney, N. Dennis, Patricia A. Jacobs, Maria Syrrou, Ioannis Georgiou, Phillipos C. Patsalis, Maria L. Giovannucci Uzielli, S. Guarducci, E. Lapi, A. Cecconi, U. Ricci, G. Ricotti, C. Biondi, B. Scarselli, and F. Vieri, Fragile X Premutation Is a Significant Risk Factor for Premature Ovarian Failure. J Med Genet, 1999. 83(4): p. 322 325. 22. M.L. Giovannucci Uzielli, S.G., E. Lapi, A. Cecconi, U. Ricci, G. Ricotti, C. Biondi, B. Scarselli, F. Vieri, P. Scarnato, F. Gori, and A. Sereni, Premature Ovarian Failure (POF) and Fragile X Premutation Females: From POF To Fragile X Carrier Identification, From Fragile X Carrier Diagnosis To POF Association Data. American Journal of Medical Genetics 1999. 84: p. 300 303. 23. Willemsen, R., J. Levenga, and B.A. Oostra, CGG repeat in the FMR1 gene: size matters. Clin Genet, 2011. 80(3): p. 214-25. 24. Marozzi, A., et al., Molecular definition of Xq common-deleted region in patients affected by premature ovarian failure. Human Genetics, 2000. 107(4): p. 304-311. 6
25. Baronchelli, S., et al., Cytogenetics of premature ovarian failure: an investigation on 269 affected women. J Biomed Biotechnol, 2011. 2011: p. 370195. 26. Fimiani, G., et al., Heterozygosity mapping by quantitative fluorescent PCR reveals an interstitial deletion in Xq26.2-q28 associated with ovarian dysfunction. Hum Reprod, 2006. 21(2): p. 529-35. 27. Lakhal, B., et al., Cytogenetic analyses of premature ovarian failure using karyotyping and interphase fluorescence in situ hybridization (FISH) in a group of 1000 patients. Clin Genet, 2010. 78(2): p. 181-5. 7