Planehormoner syrer planers væks og udvikling Selvom planehormoner produceres i mege små koncenraioner er de cenrale for planers væks og udvikling. Måling af hormoner, speciel cyokininer, i planer har i mange år være en af naursofkemiens sore udfordringer, men nye målemeoder synes a have løs dee problem Af Rikke Nørbæk, Lars Porskjær Chrisensen og Niels Ben Bredmose, Danmarks JordbrugsForskning (DJF), Forskningscener Årslev, Jens Hansen-Møller, DJF, Forskningscener Foulum, Hanne Rasmussen, KVL, Skov og Landskab og Bjarke Veierskov, KVL, Planefysiologi Planehormoner er lavmolekylære organiske forbindelser, der syneiseres i mege lave koncenraioner, og som er essenielle for planens væks og udvikling. Der findes flere grupper af planehormoner, hvis kemiske srukurer og virkemåde kan være vid forskellige. Tilsedeværelsen af væksregulerende soffer i planer blev allerede forudse af Darwin, men de var førs i 1928, a planehormone auxin (indolyleddikesyre, IAA) førse gang blev isolere og karakerisere. Man beskrev auxin som e sof, der fik havren il a krumme mod lyse [1]. Den sidse hormongruppe, der blev idenificere, var cyokininer (figur 1). I 1955 blev cyokinine kinein (N 6 furfuryladenin) isolere og idenificere fra silde- DNA. De vise sig senere a være e arefak danne ved dehydrering af deoxyribose og des migraion fra 9-posiionen af adenin il N 6 posiionen under auoklavering [2]. Kinein forekommer ikke i planer, men andre cyokininer med ilsvarende biologisk akivie har vis sig a være vid udbred i planer. Disse forbindelser blev idligere omal som kininer. Selvom man allerede ved opdagelsen af kinein kende il ilsedeværelsen af cyokininer i planer, var de førs i 1963, a de førse naurlig forekommende cyokinin blev isolere og idenificere. Leham [3] idenificerede i 1963 zeain fra majs og beskrev de som e hormon, der fremmede celledeling. De har senere vis sig a være de mes almindelig forekommende cyokinin i planer. Arbejde med a besemme virkemåden af planehormoner har være vanskelig. De skyldes: (i) a biosynesen ikke foregår i specifikke organer, (ii) a mange af hormonerne findes i forsvindende små mængder og derfor er svære a deekere og kvanificere, (iii) a samme hormon kan have forskellig virkning på forskellige planer og (iv) a der kan være ale om en anagonisisk effek, hvor hormoner påvirker hinanden med en modsaree virkning. Indfaldsviklen har i de flese videnskabelige undersøgelser være a undersøge planehormoners virkning ved anvendelse og observaion. De kan være en planedel, der fjernes og ersaes med kombinaioner af hormoner, e organ eller væv der dyrkes in viro eller ved eksogen ilførsel af e planehormon. De er dog førs med de moderne bioeknologiske meoder, a Figur 1. Kemiske srukurer af udvalge cyokininer fra planer. AAS ICP/MS UV-VIS LC/MS GC/MS FT-IR/NIR Ny Laboraorium? - Så er de også os! 48 16 62 00 Gydevang 17-19 3450 Allerød 1 dansk kemi, 86, nr. 4, 2005
Figur 2. LC-MS/MS af zeain (Z) og fragmeneringsmønsre af dee cyokinin. de er bleve mulig a idenificere de naurlige biosyneseveje il dannelsen af de forskellige planehormoner, herunder især cyokininer og auxiner. I den nyese forskning inroduceres følsomme og selekive målemeoder, der kan deekere og besemme den kemiske srukur af sørsedelen af hormonerne og eferfølgende kvanificere mængden af disse. Man kan i dag deekere hormonkoncenraioner hel ned il 10-9 mol/g planemaeriale. De giver mulighed for a sudere, hvilken beydning hver enkel hormon har og klarlægge, hvilke samspil der er mellem flere hormoner i forbindelse med planens udvikling. Typer af planehormoner De klassiske grupper af planehormoner, som hovedsagelig fremmer væks og udvikling af planer, er cyokininer, auxiner, gibberelliner, abscisinsyre og ehylen (figur 1 og 2). Andre hormonyper er kumarin, jasmonsyre, brassinoseorider, oligosaccharider og salicylsyre [4]. Cyokininer er purinforbindelser, der ofes er derivaer af adenin med en subsiuen ved N 6. Cyokininer, der produceres i planer, er med enkele undagelser derivaer af de frie cyokininer isopenenyladenin (ip), zeain (Z) eller dihydrozeain (DHZ) (figur 1). De frie cyokininer, men også deres respekive ribosider og O-glucosider (nucleosider) anses sammen med nucleoiderne (phosphaesere af nucleosider) for a være akive cyokininformer [5]. Derimod er 7- og 9 C- glucosider af Z og DHZ (figur 1) inakive. Aromaiske cyokininer har hidil kun være kend som syneiske, men er nylig funde i planer [6]. Cyokininer er planehormoner med virkning på celledeling og vævsdiffereniering, og de fremmer bl.a. anlæggelse af planeskud. Auxiner er rypophanforbindelser, som i deres virkemåde minder om indolyleddikesyre (auxin) (figur 1). Auxiner er nødvendige, for a planer kan vokse, ide hormone fremmer cellesrækning og syrer skuddenes drejning mod lyse. Auxiner, der påføres ikke-befrugede blomser, kan sare væks af frugknuden og danne frøløse fruger. Således produceres frøløse omaer og vindruer. Gibberelliner (GA) er eracykliske dierpenoider. Biosynesen følger den sædvanlige biosynesevej for erpenoider via addiion af isopenenylpyrophospha il dimehylallylpyrophospha. Der kendes over 110 forskellige GA-srukurer, men mange af dem er inermediaer i biosynesen af akivsofferne. Der fin- Figur 3. LC-MS kromaogram af hhv. deuerere zeain (m/z 225) og zeain (m/z 220) og af deuerere zeain-ribosid (m/z 356) og zeain-ribosid (m/z 352). Der ses en lille forskel i reenionsid på kolonnen for hhv. den deuererede og naurlige form af cyokinine. dansk kemi, 86, nr. 4, 2005 2
des normal ikke over 15 GA i en plane. De forskellige GAsrukurer har forskellige subsiuener i posiion 10, 13, og 16 og kan have en g-lacon-bro (figur 1, GA 4 ). Gibberelliner kan bl.a. simulere blomsring. Når gibberellin GA 4 og GA 7 ilsæes il nåleræer, blomsrer de efer 4 6 år i sede for de normale 20 år. Abscisinsyre er en sesquierpen (figur 1) med e asymmerisk kulsofaom i 1 -posiionen, hvilke giver mulighed for en S(+) og R(-)-enaniomer. De er S-enaniomeren, der er naurlig forekommende. Abscisinsyre er e sresshormon, der produceres, når planen udsæes for sress, dvs. ved ørke, høje salkoncenraioner eller fros. Ved ørke får abscisinsyre bladenes spaleåbninger il a lukke sig, og rodens hydrauliske ledningsevne øges, hvorved vandbalancen forbedres. Planehormone ehylen afgives især i sore mængder fra modnende fruger og rådnende planedele. De er dog kun ehylen opløs i cellesaf, der udøver hormonvirkning. Ehylen simulerer bl.a. frugmodning, så e moden æble kan inducere modning af andre fruger og få blomser il a visne. De benyes ved modning af bananer, ide bananerne plukkes grønne, afskibes og behandles med ehylen undervejs, så de neop er modne ved ankomsen il modagerlande. Cyokininer og auxiner er uden vivl de væsenligse hormoner i relaion il planers væks og udvikling. De er også disse planehormoner, der er sværes a måle, ide de opræder i forsvindende små mængder. Nye målemeoder har imidlerid give gode resulaer. Figur 4. Biosynese i skud og rod af zeain-ribosid-5 -monophospha (ZRMP) mærke med deuerium efer inkubering i D 2 O. Røde kolonner viser isoopfordelingen efer deueriummærkningen af ZRMP m/z +1 (202) il m/z + 3 (m/z 205). Gule kolonner viser ikke mærke ZRMP (m/z 202) med kun små signaler fra de naurlige isoop oppe m/z + 1 (m/z 203) og m/z + 2 (m/z 204). Nyese målemeoder af cyokininer og auxiner Cyokininer og auxiner oprenses fra planeeksrake på en kolonne indeholdende e C 18 -coaed maeriale. Derved fjernes aminosyrer og sukkere, så de ikke generer analysen. Hver enkel hormon kvanificeres nu vha. LC-MS/MS (højryksvæskekromaografi kombinere med andem massespekromeri). Ved a koble væskekromaografi, hvor hver planehormon fremkommer som en separa op på e kromaogram og massespekromeri, hvor den eksake masse af hver hormon og des overordnede fragmenmønser kan besemmes (figur 2), er de mulig a opnå ilsrækkelig in- Figur 5. Syneisk cyokinin (benzyladenin (BA)) fremmer brydninger og kompakhed. Benzyladenin ilfør kapmargeriplaner i forskellige koncenraioner. 3 dansk kemi, 86, nr. 4, 2005
Figur 6. Småplaner af julekakus. Til højre: Uden behandling med syneisk cyokinin benzyladenin. Til vensre: Med ilførsel af 6,66 x 10-4 M benzyladenin. Begge siklinger er bleve behandle med 10-3 M IBA (syneisk auxin). formaion il a idenificere hver enkel hormon i e planeeksrak. Forholde mellem arealenheder og koncenraion af hver hormon besemmes ud fra en sandardkurve basere på cyokinin- og auxinsandarder, oppens sørrelse viser, hvor mege der er af de pågældende planehormon. Ved a bruge inerne sandarder (de deuererede former af hhv. cyokininer og auxin) kan man finde frem il hormonerne i en kompleks marix af naursoffer i e planeeksrak. Sandarderne ilsæes eksrake og svarer il hver si cyokinin, hvor H-aomerne på de endesillede CH 2 - og CH 3 - grupper i sidekæden er bye ud med deuerium (figur 3). De bevirker en forskel i molekylvægen og derved en lille forskel i reenionsid på HPLC-kolonnen for hhv. den deuererede og naurlige form (figur 3). Herved kan man følge oppene parvis, cyokinin i planeeksrake og des ilsvarende deuererede forbindelse som sandard. Meoden er finindsille il måling af auxin, auxinkonjugae indol-3-aspara og ni forskellige cyokininer. Der kan måles koncenraioner ned il 0,2 12 10-15 mol [7]. Synesesed og ranspor af cyokininer og auxiner Cyokininer syneiseres i eksrem lave koncenraioner (10-9 mol/g planemaeriale). Foresillingen, der sadig ses i planefysiologiske lærebøger, om a cyokinin hovedsagelig dannes i rodsyseme, er ved a blive opgive. Efer a man er begynd a anvende LC-MS/MS il a deekere de små mængder hormoner, har man kunne måle, a der også andre seder i planen sker en opkoncenrering af hormoner, og a cyokininer dannes ganske æ på deres virkningssed. Den nyese forskning viser, a cyokininbiosynesen i gåsemad (Arabidopsis haliana) sker i både rødder og skud [8]. Ved a lade planerne opage e næringsmedium med 30% D 2 O blev de mærkede vandmolekyler indbygge i zeain-ribosid- 5 -monophospha (ZRMP). Denne in vivo mærkning med ung vand kunne deekeres ud i blade og rødder ved brug af LC-MS (figur 4). Auxin produceres i skudspidsen og mange andre seder i planen. Auxin eksiserer i en fri og anagelig akiv form, men kan også forekomme som e konjuga med sukker eller aminosyrer. Konjugaerne er sabile og oplagres eksempelvis i frø. Hormone ransporeres via parenchymaceller med en hasighed af 1 cm i imen [9]. Den polære ranspor er en akiv proces mediere af bærerproeiner. Figur 7. Nordmannsgran, hvor oppen er beskadige, måske som følge af fros. De er karakerisisk, a en eller flere grene søger opad for med iden a ersae opskudde. Især knopplaceringen og nålesillingen vil dog i flere år endnu afsløre de nye»opskuds«grenkaraker, og de er svær a få en harmonisk kronesrukur på ræe efer en sådan skade. mer) og roddannelse hos siklingerne (auxiner fremmer, cyokinin hæmmer) [10]. De nyese resulaer viser, a der ved a ilføre syneisk cyokinin (benzyladenin) opnås dannelse af flere vækspunker hos kapmargeri (figur 5) og novemberkakus (figur 6), men ikke hos poeroser. Auxinbehandling har en posiiv virkning på roddannelse hos alle re yper prydplaner, der danner e bred rodne, når auxin-cyokinkoncenraionsforholde er høj (her vis på julekakus, figur 6). Bedse auxinype og koncenraion af- Cyokininer og auxiner i prydplaner og nåleræer En sor del af de danskproducerede prydplaner formeres ved a e sængelsykke afskæres og induceres il a danne nye rødder (siklingeformering). Der er dog ab under formeringen, fordi en del siklinger ikke danner rødder. Senere i produkionen kan der pga. uens væks og udvikling forekomme spild. Forholde mellem auxiner og cyokininer regulerer sideskudsvæks (cyokininer fremmer, auxiner hæm- dansk kemi, 86, nr. 4, 2005 4
være en god eller en mege dårlig forrening. En udbyeprocen på 85 eller på 50 gør en sor økonomisk forskel. Træerne kasseres ofes pga. defeker i deres kroneform (figur 7). Derfor er de vigig for juleræsproducenen a kunne simulere eller hæmme højdeilvæksen, æheden af sidegrene, eller måske forvandle en sidegren il ny opskud. Forudsæningen er, a man får en forsåelse for, hvordan ræe selv adminisrerer alle sine vækspunker. Inddelingen af knopperne på en Nordmannsgran er skisere i figur 8. De førse resulaer i e igangværende projek viser, a lokaliseringen af cyokinin ændres dramaisk gennem årsiden, sam a cyokininmængden i knopperne afhænger mege af deres placering på ræe. Jo højere posiion på ræe, jo mere cyokinin indeholder knoppen (figur 9). De indikerer, a cyokininhormongruppen syrer knoppernes udvikling og dermed ilvæksfordelingen i rækronen. Tak il Villum Kann Rasmussen Fonden for søe il projek»væksregulering og arkiekur i ræer, med Abies nordmanniana som model«og Saens Jordbrugs- og Veerinærvidenskabelige Forskningsråd. Figur 8. Knophierarki i Nordmannsgran. 1: Topknop, 2: Kransknop, 3-4: Endeknopper på 1 grenkrans, 5-6: Sideknopper, 1 grenkrans. E-mail adresser: Rikke Nørbæk: rnb@ferin.com Lars Porskjær Chrisensen: larsp.chrisensen@agrsci.dk Niels Ben Bredmose: niels.bredmose@agrsci.dk Jens Hansen-Møller: jens.hansen-moeller@agrsci.dk Hanne Rasmussen: hnr@kvl.dk Bjarke Veierskov: bjarke.veierskov@plbio.kvl.dk hænger af planearen [11]. Forsøgene med ilsæning af syneisk cyokinin og auxin il siklinger føre il mere ensarede planer. Juleræer kan afhængig af andelen af førseklasses ræer Figur 9. Fordelingen af cyokinin i Nordmannsgranknopper angive i picomol pr. gram frisk planemaeriale. Z: zeain, ZR: zeain-ribosid, DHZ: dihydrozeain, DHZR: dihydrozeain-ribosid, IP: isopenenyladenin, IPA: isopenenyladenosin. Nummereringen af søjlegrupperne svarer il knopyperne i figur 8. Referencer: 1. Wen, F.W. Wuchssoff und Wachsum. Rec. Trav. Bo. Neerl. 1928; 25: 1-116. 2. Miller, C.O., Skoog, F., von Salza, F.M. & Srong, F.M. Kinein, a cell division facor from deoxyribonucleic acid. J. Amer. Chem. Soc. 1955; 77: 1329-1334. 3. Leham, D.S. Zeain, a facor inducing cell division isolaed from Zea mays. Life Sci. 1963; 8: 569-573. 4. Davies, P.J. The plan hormones: heir naure, occurrence, and funcions. In Plan Hormones: Physiology, Biochemisry and molecular Biology, 2 nd ediion. (Davies, P.J., ed.). Dordrech, he Neherlands: Kluwer Academic Publishers, 1995; 1-12. 5. Leham, D.S., Palni, L.M.S. The biosynhesis and meabolism of cyokinins. Ann. Rev. Plan Physiol. 1983; 34:163-197. 6. Auer, C.A. Cyokinin conjugaion: Recen advances and paerns in plan evoluion. Plan Growh Regulaion 1997; 23: 17-32 7. Rasmussen, H.N., Veierskov B., Nørbæk, R., Hansen-Møller, J. Cyokinin and auxin disribuion in he conifer ree crown. Proceedings of he Plan Growh Regulaion Sociey of America 31 annual Conference, Charleson SC 2004; (i ryk). 8. Nordsröm, A., Tarkowski, P., Tarkowska, D., Nørbæk, R., Åso, C., Dolezal, K., Sandberg, G. Auxin regulaion of cyokinin biosynhesis in Arabidopsis haliana: A facor of poenial imporance for auxin-cyokinin-regulaed developmen. Proceedings of he Naional Academy of Sciences of he USA 2004; 101: 21: 8039-8044. 9. Lomax, T.L., Muday, G.K., Rubery, P.H. Auxin ranspor. Plan Hormones: Physiology, Biochemisry, and Molecular Biology. (ed. Davies, P.J.) Dordrech, Kluwer Academic Publishers. 1995; p. 509-530. 10. Braul, M., Maldiney, R. Mechanisms of cyokinin acion. Plan Physiol. Biochem. 1999; 37: 403-412. 11. Bredmose, N., Krisiansen, K., Nørbæk, R. Rod-Skud-Cyokinin relaioner. Garneridende 2003; 32: 9-11. 12. Hooykaas, P.J.J., Hall, M.A., Libbenga, K.R. (Eds.) Biochemisry and Molecular Biology of Plan Hormones. New comprehensive biochemisry. Elsevier Science B.V. Amserdam, The Neherlands. 1995; p. 1-564. 5 dansk kemi, 86, nr. 4, 2005