Bioethanol et alternativt brændstof SRP i Kemi og Matematik Af Signe Klinting Frederiksborg Gymnasium og HF, 3x Den 17.

Transkript

1 Bioethanol et alternativt brændstof SRP i Kemi og Matematik Af Signe Klinting Frederiksborg Gymnasium og HF, 3x Den 17. December

2 Abstract The paper looks at the production of bioethanol and the problematics with cellosic bioethanol. The paper investigates how the choice of enzymes, the temperature for the enzymatic hydrolysis and the pre-treatment of the biomass affect the profit of glucose. A big profit is important because the glucose is fermented to ethanol. These parameters were experimentally tested on the Faculty of Life Science, University of Copenhagen, on November the 24 th and 25 th. The choice of enzymes and pre-treatment were tested by using three different biomasses with three types of enzymes and different ways of treatment. The concentration of glucose was measured with UV/VIS-spectroscopy. In the experiment testing the optimum temperature for the enzyme, cellulase, this measuring method was used as well. The last experiment tested how the pre-treatment affected the fermentation. On background of the results from the experiments it is possible to conclude that it s easier to extract glucose from carbohydrates like starch and sucrose than from cellulose. Cellulose demands a more powerful pre-treatment and a motley combination of enzymes, which cost resources and energy and makes it hard to produce cellulosic bioethanol profitable. The results also indicated that it is possible to make a too powerful pre-treatment that gives a negative effect on the fermentation and that the temperature for the enzymatic hydrolysis has a big impact on the activity of the enzymes. 2

3 Indholdsfortegnelse Abstract... 2 Indholdsfortegnelse... 3 Indledning... 5 Bioethanol og 2. generations bioethanol... 6 Fremstilling af bioethanol... 6 Udfordringen ved 2. generations bioethanol... 8 Enzymer... 9 Begrebet Q Sakkarider Monosakkerider Oligosakkarider Polysakkarider Biomasser Sukkeroer Hvedemel Halm Mindste kvadraters metode Bestemmelse af standardkurve Forsøg udført på Det Biovidenskabelige Fakultet, KU Enzymatisk nedbrydning, samt bestemmelse af glukoseindhold i hydrolyseprøver Teori Fremgang Observationer Resultater og beregninger Fejlkilder Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer Teori Fremgang Resultater og beregninger Diskussion

4 Gæring af hydrolysater Teori Fremgangsmetode Resultater og beregninger Fejlkilder Opsummering og konklusion Litteraturliste Bøger Artikler Hjemmesider Papirer Vejledere i forbindelse med forsøg på Det Biovidenskablige Fakultet på KU Figuroversigt Bilag 1 Forsøgsvejledning Enzymatisk hydrolyse af forskellige biomasser Bilag 2 Forsøgsvejledning Bestemmelse af glukose i hydrolyseprøver Bilag 3 Forsøgsvejledning Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer Bilag 4 Forsøgsvejledning Gæring af hydrolysater Bilag 5 PowerPoint Enzymer Hvad rager det mig? Bilag 6 PowerPoint Potentiale for bioethanol I Danmark Bilag 7 Artikel Fra Halm til alkolhol Bilag 8 Artikel Fremstilling af bioethanol Bilag 9 Skema for fortynding af standardprøver Bilag 10 Skema for fortynding af hydrolyseprøver Bilag 11 Oversigt iver mikrotiterplade for hydrolyse Bilag 12 Excelformel i forbindelse med udvælgelse af resultat Bilag 13 Holdresultater for hydrolyse prøver Bilag 14 Samlede resultater for hydrolyseprøver Bilag 15 Data for forsøget med reaktionshastighed Bilag 16 Data fra gæringsforsøg Bilag 17 Papirer fra matematik undervisning til gennemgang af Mindste kvadraters metode Bilag 18 Artikel Fra Halm og Affald til morgendagens brændstoffer til biler

5 Indledning Nutidens diskussion omkring olieforsyninger og CO 2 -udslip har øget interessen i produktion af bioethanol. Produktion af bioethanol vil højst sandsynlig blive nødvendig inde for den nærmere fremtid, og det er derfor interessant at se på nutidens produktion af bioethanol samt udfordringerne ved fremstilling af bioethanol. Jeg vil i denne opgave behandle emnet bioethanol med udgangspunkt i forsøgene fortaget på Det Biovidenskablige Fakultet den 24. og 25. november. Forsøgene undersøgte betydningen af forbehandlingen af forskellige biomasser ved enzymatisk nedbrydning, optimaltemperaturen for enzymerne cellulaser samt betydning af forbehandling af sukkerroer ved gæringen. Jeg vil i opgaven først redegøre for hvad bioethanol er og fremstillingen i dag, samt problemerne ved produktion af bioethanol på fiberholdige biomasser. Dernæst vil jeg i et teoriafsnit fortæller om enzymer og faktorer, der påvirker enzymaktiviteten, sakkarider samt de biomasser, der arbejdes med i forsøgene. Derudover vil jeg i teoriafsnittet redegøre for Mindste kvadraters metode samt lave en matematisk udregning af en lineær regression med brugen af Mindste kvadraters metode. Til sidst vil jeg gennemgå de udførte forsøg og på grundlag af teori og forsøgenes udfald konkludere på udfordringerne ved produktion af bioethanol. Bioethanol Bioethanol er ethanol gæret ud fra biomasser med henblik på brug som brændstof. Brændstoffer dannet fra biomasser, dvs. plantemateriale, kaldes for biobrændstoffer. Stigende fokus på CO 2 -udslip, som har resulteret i en række aftaler, hvor verdens lande forpligter sig til reducering af CO 2 -udslippet, samt usikkerheden om forsyningssituationen af olie, har øget interessen for fremstilling af bioethanol til brug som brændstof. Udslippet af CO 2 ved afbrænding af bioethanol, vil svarer til mængden af CO 2 planterne forbruger ved fotosyntese, hvor glukosen dannes. Bioethanol vil derfor være stort set CO 2 -neutralt 1. Alle almindelige biler kan køre på benzin tilsæt 5% ethanol. Specielle FFV-biler (Flexibel Fuel Vehichles) kan køre på benzin iblandet op til 85% ethanol. Bioethanol har en oktantal 2 på 111 og 1 Forbehandling, transport og andre ressourcer til produktionen vil kræve energi, dvs. CO 2 -udslip 5

6 kan derfor ved 5% iblandinger erstatte oktanforhøjer som MTBE og MTBE-alternativer. Tilsætning af bioethanol vil desuden give en renere forbrænding og nedsætte udslippet af fx CO, som en er giftgas 3. Energiindholdet i en liter ethanol er lavere end for en liter benzin, hvilket betyder at man ikke kan køre lige så langt på en liter ethanol som på en liter benzin. Kørsel på benzin med 5% ethanol vil for bilerne i dag betyde 1-2% kortere kørsel pr. liter og 2. generations bioethanol Bioethanol deles op i to kategorier: 1. generations bioethanol og 2. generations bioethanol. 1. generations bioethanol produceres i en gæring på sukkerholdige eller stivelseholdige biomasser, fx sukkerroer, hvede. Dette er nemme kulhydrater at nedbryde ved tilsætning af enzym, hvilket gør dem nemme at gære på. Dog anvendes biomaterialer som sukkerroer og hvede til andre ting end produktion af ethanol, fx fødevarer, og en øget efterspørgsel på biomaterialerne kan derfor øge priserne på pågældende fødevarer og prisen på ethanol, hvilket man ikke interesseret i. Derfor er der interesse i at gære ethanol ud fra fiberholdige materiale, som fx halm, træ, stængler fra majsplanter og haveaffald, som findes i store mængder og ikke anvendes til andet. Bioethanol fra gæring på sådanne biomasser kaldes 2. generations bioethanol. Problemet ved 2. generations bioethanol ligger i tilgængeligheden af cellulosen, som er det kulhydrat der nedbrydes til glukose, der skal gæres til ethanol. Cellulosen er pakket ind i en struktur af lignocellulose 5, som bl.a. består af stoffet lignin og gør planten stærk og modstandsdygtig. Lignin er ikke nemt nedbrydeligt og forhindrer enzymatisk nedbrydning af cellulosen, som danner glukose til gæringen. Udfordringen i 2. generations bioethanol ligger i forbehandling, enzymatisk nedbrydning og gæringen. Fremstilling af bioethanol Uanset typen af biomasse består produktionen af bioethanol af nogle fast trin. Første trin er forbehandling af biomassen. Dette trin varierer afhængig af den valgte biomasse. Det er også i dette trin den største forskel mellem 1. og 2. generation bioethanol ligger. 2 Oktantal er et udtryk for stoffets tilbøjelighed til selvantændelse ved sammenpresning (tændingsbankning). Jo højere tallet er, des mindre er risikoen er der for tændingsbankning. 3 Fremstilling af bioethanol nutidens teknologi og frentudebs udfordringer s Morgendagens Brændstoffer danske perspektiver s Se afsnittet Halm under Biomasser 6

7 Forbehandling af biomassen fortages for at gøre kulhydraterne (di- eller polysakkerider) tilgængelige for enzymerne, som skal nedbryde dem til glukose. Dernæst tilsættes biomassen enzymer, som hydrolyserer (spalter) di-eller polysakkeriderne til glukose. Dette trin kræver enzymer, som passer til kulhydraterne i den valgte biomasse. Efter den Figur 1 Oversigt over trin i produktionen enzymatiske nedbrydning (hydrolysen) kommer gæringen (fermentering), hvor glukosen gæres til ethanol. Dette kræver tilsætning af gær. Ved dette trin bliver der dannet kuldioxid som restprodukt. Når gæringen kommer op på en vis volumenprocent ethanol, dør gærcellerne og gæringen stopper. Som sidste trin i produktionen af ethanol fortages derfor en destillation, så ethanolen fås på ren form. I Brasilien bliver bioethanol i dag produceret på sukkerrør, mens man i USA hovedsagligt benytter majs. Ved brugen af majs som biomasser benyttes ofte tørformalingsproces, hvor majsen formales til små partikler som oplæmmes i vand. Først opvarmes opslæmningen til C, hvor stivelse vil suge vand og folde sig ud (forklistrer/gelatinieres), hvilket gør stivelsen tilgængelig. I dette trin tilsættes varmetolerante enzymer som nedbryder stivelse til mindre kæder (oligosakkarider). For at frigøre resten af stivelsen fra fibre og protein, så det bliver mere tilgængelig for enzymerne, jetkoges blandingen ved C. Varmen får enzymerne til at denaturere og der tilsættes derfor igen en omgang enzymer, som nedbryder den nye tilgængelige stivelse til oligosakkarider. Dernæst startes en forsukring samtidig med gæring. Ved en forsukring nedbrydes oligosakkarider af glucoamylase til glukose, som derefter kan gæres på. Glucoamylaserne hæmmes af øget glukoseindhold. Derfor kan kombinationen af forsukring og glukose optimerer glucoamylasernes arbejde, da gæren løbende vil omsætte glukosen til ethanol. Efter gæring destilleres ethanolen. Uopløselige rester fra destillationen fjernes ved centrifugering og sælges som foder 6. 6 Fremstilling af bioethanol nutidens teknologi og fremtidens udfordringer s. 26 7

8 Udfordringen ved 2. generations bioethanol Forbehandlingen skal gøre cellulosen i biomassen tilgængelig for enzymerne. Lignocellulosen er et stræk materialer, som kræver en hård forbehandling, som fx behandling med fortyndet syre ved høj temperatur ( C), koncentreret syre med stuetemperatur, dampeksplosion, vådoxidation eller ammoniak-fryseeksplosion. Disse forbehandlinger kræver enten en stor mængde energi og/eller forårsager dannelse af restprodukter og stoffer, som hæmmer enzymer og gær, som skal benyttes senere i processen. Ved valget af forbehandling skal der tages højde for omkostninger og energiforbrug i forhold til størrelsen af udbyttet. Ved enzymatisk nedbrydning (hydrolysen) af cellulose skal der bruges en kombination af cellulaser 7. Prisen på enzymer er høje og er et problem i forhold til at gøre produktionen af 2. generations bioethanol rentabel. Den almindelig gær, Saccharomyces cerevisiaem, kan ved anaerobe forhold omsætte hexoser som glukose til ethanol. Ved hydrolyse af hemicellulose bliver der dannet pentoser, som gæren ikke kan omsætte til ethanol. Der forskes derfor i gær-typer, som kan omdanne pentoser til ethanol. Derudover arbejder gær bedst omkring 32 C, mens den enzymatiske nedbrydning foregår bedst ved en temperatur omkring C. Der arbejdes på at udvikle gær, der kan tåle højere temperaturer, så hydrolysen og gæringen kan foregå i samme trin og man på denne måde kan spare ressourcer og penge. Kunsten ved fremstilling af bioethanol er at minimere energiforbrugt til produktionen i forhold til den energi der bliver produceret, dvs. et mindre input end output, således at produktionen er rentabel. Inbicon 8, ejet af DONG Energy, er et demonstrations anlæg, som udvikler og demonstrerer, hvorledes hele bioethanol-processen kan integreres i samme anlæg, og hvordan man kan udnytte hvert trin i proces bedst mulig. Inbicon arbejder hovedsagligt med halm, som biomasse, da dette findes i store mængde i Danmark. Restprodukter brændes til produktion af damp. Dampen konverteres til elektricitet der forsyner hele anlægget samt naboerne. Kuldioxiden 7 Se afsnittet Halm under Biomasser 8 Navnet Inbicon er skabt af Integrated Biomass Conversion 8

9 fra gæringen opfanges og benyttes til bl.a. brus i drikkevarer 9. På denne måde bliver alt fra biomassen udnyttet til produktionen af bioethanol og mindst muligt går til spilde. Enzymer Enzymer er katalysatorer, hvilket betyder at de øger reaktionshastigheden i en reaktion uden selv at blive forbrugt. De nedsætter aktivitetsenergien, der skal til for at få reaktionen til at forløbe 10. Enzymer virker specifikt på én bestemt reaktion eller én specifik reaktionstype. De er opbygget af protein, som består af aminosyrer. Aminosyresekvensen bestemmer strukturen i det aktive område på et enzym, som optræder som en fordybning i enzymets overflade. Ændres bare én af disse aminosyre, ændres det aktive center hos enzymet og det vil miste sin virkning (eller virkningen vil blive nedsat). Figur 3 Enzyms virkning Når enzymer katalyserer en reaktion, bindes et substrat til det aktive center, hvorved der dannes et enzym-substratkompleks. Enzymet katalyserer reaktionen, så substratet omdannes til produkter, hvorefter enzymet frigiver dem. Reaktionerne er ofte reversible, hvilket betyder at enzymet kan få reaktionen til at forløbe begge veje. Enzymer skal nogle gange have hjælp fra co-faktorer. Co-faktorer kan være coenzymer eller enzymaktivatorer. Coenzymer er organiske stoffer, der indgår i det aktive center og hjælper enzymet med at få reaktionen til at forløbe de fungerer som enzymets assistent. De kan fx overføre funktionelle grupper til substratet eller lave elektronoverførsler. Enzymaktivatorer er ofte uorganiske ioner fx Zn 2+, Fe 2+, Mn 2+, som gør det aktive center tilgængeligt for substratet, dvs. enzymaktivatoren hjælper enzymet med at binde substratet. Figur 2 Grafen viser energiniveaut for en reaktion. Den lysegrønne graf er hvor reaktionen er enzymkatalyseret. 9 Biomass Refinery How it works på Inbicons hjemmeside 10 Biokemibogen liv, funktion, molekyle s. 79 9

10 Enzymer inddeles i grupper efter deres virkemåde. Nogle enzymer står fx for at transportere funktionellegrupper fra det ene molekyle til det andet og kaldes transferaser. Den type enzymer, som er relevante i forbindelse med nedbrydning af biomasse til ethanol, hedder hydrolaser. Disse enzymer bryder kovalente bindinger 11 ved optagelse af vand. Dette betyder at enzymerne spalterne større molekyler til mindre molekyler ved en hydrolyse 12. Enzymers struktur er essentiel for dens funktion og evne til at katalysere den specifikke reaktion. Ændres eller påvirkes strukturen, kan enzymets evne ødelægges eller nedsættes. Forskellige paramenter, så som ph, produktkoncentrationen og temperatur kan derfor påvirke enzymaktiviteten. Enzymaktiviteten kan måles som reaktionshastigheden, som er omsat mængde substrat pr liter opløsning pr tidsenhed pr mængde enzym tilstede. ph-værdien påvirker enzymet struktur, idet aminosyrernes ladninger ændres, hvis ph ændres. Ændres aminosyrerne, vil det aktive center blive påvirket og substratet vil have svært ved at binde sig. Da enzymers aktive centre er forskellige, vil alle enzymer have et individuelt ph-optimum, hvor enzymaktiviteten vil være størst og derved reaktionshastigheden højest. Frem mod ph-optimum vil aktiviteten være stigende og efter phoptimum, vil den være aftagende. Figur 4 Reaktionshastighed som funktion af ph. Optimum er individuelt for hvert enzym Når et enzym har omsat en vis mængde substrat til produkt, vil der indstille sig en ligevægt mellem substratkoncentrationen og produktkoncentrationen, hvorved enzymaktiviteten vil falde 13. En øget produktkoncentration hæmmer enzymet. 11 Elektronparbindinger 12 Hydrolyse betyder spaltning vha. vand 13 Information fået af Mads A. T. Hansen ved foredrag Enzymer hvad rager det mig? 10

11 Stigende temperatur vil øge reaktionshastigheden. Når temperaturen stiger, bevæger molekylerne sig hurtigere og de vil støder oftere sammen. Muligheden for at enzym-substratkomplekset dannes, øges derfor. På et tidspunkt vil temperaturen dog blive for høj og enzymet vil denaturere 14, hvilket er en irreversibel 15 proces. Der tales derfor om en optimal-temperatur. Aktiviteten vil være stigende frem til optimaltemperaturen, hvor efter aktiviteten vil falde forholdsvis brat pga. denaturering. Den optimale temperatur individuel for hvert enzym. De enzymer, der benyttes til enzymatisk nedbrydning i forbindelse produktion af bioethanol, har en optimal hastighed ved en temperatur på C 16. Figur 5 Reaktionshastighed som funktion af tempreaturen. Grafen falder brat efter optimaltemperatur. Begrebet Q10 I forbindelse med enzymaktivitet og temperatur arbejdes der ofte med begrebet Q 10. Q 10 beskriver, hvor meget reaktionshastigheden stiger med for hver 10 graders temperatur øgning. Som tommelfingerregel er Q 10 = 2, dvs. at reaktionshastigheden fordobles for hver 10graders temperaturøgning. Dette gælder dog kun til et vist punkt, hvorefter enzymet begynder at denaturere. Til et vist punkt kan reaktionshastigheden som funktion af temperaturen udtrykkes som en eksponentielt stigende funktion, f (x) ba x, a 1. Kender man to punkter på grafen for en 1 eksponentielt stigende funktion, kan raten, a, beregnes ved a y x 2 y 2 x 2 1 x 2 x 1. Når man taler y 1 y 1 om eksponentielt stigende funktionen, tales også ofte om en fordoblingskonstant, som fortæller hvor mange skridt man skal tage hen ad x-aksen, for at fordoble y-værdien. Fordoblingskonstanten, T 2, kan beregnes ved T 2 x 2 x 1 log( 2) log( a). Ifølge Q 10 fordobles 14 Denaturere = ødelægges 15 Irreversibel = kan ikke gøre om igen 16 Mads A.T. Hansen, Enzymer hvad rager det mig? 11

12 reaktionshastigheden, når temperaturen øges med 10,. T 2 må derfor være lig 10. Jeg udleder en formel for Q 10 : Når x 10 og Q 10 2 : T 2 10 log(2) log(a) 10 log(a) log(2) log(a 10 ) a 10 2 y 2 y x 2 x 1 log(2) 2 10 y 2 x 2 x 1 2 Q 10 y 1 x-værdierne svarer til to temperaturer og y-værdierne svarer til reaktionshastighederne ved de to temperaturer. Q 10 kan derfor skrives som: 10 Q 10 R 2 R 1 T 2 T 1 Sakkarider Sakkarider kaldes i dagligtale kulhydrater. Alle kulhydrater indeholder carbon, hydrogen og ilt. De deles op i 3 grupper: monosakkarider, oligosakkarider og polysakkarider. Monosakkerider Monosakkerider er de simpleste kulhydrater. De består kun af én enhed og kan ikke spaltes til mindre molekyler. Bruttoformlen for monosakkerider er oftest (CH 2 O) n, hvor n er mellem 3 og 7. Der er 2 typer af funktionelle grupper i et monosakkarid: én carbonylgruppe 17 samt mindst 2 hydroxygrupper 18. De fleste monosakkarider vil pga. de polære hydroxygrupper være letopløselige i vand. 17 Enten en aldehyd eller keton 18 Primære og sekundære 12

13 Monosakkarider inddeles efter typen af carbonylgruppen og antallet af carbonatomer. Fx indeholder glukose seks carbonatomer og er en aldehyd. Derfor er glukose en aldohexose. Monosakkarider findes i kædeform 19 og ringform 20. Grundet asymmetriske carbonatomer 21 optræder monosakkarider i to stereoisomere, D- og L- Figur 6 Fra venstre: D-glukose og L- glukose form 22. Monosakkarider forekommer kun naturligt på D-formen. Ved dannelse af ringstruktur forekommer der ligeledes to stereoisomere, α- og β-form 23. Størstedelen af et monosakkarid 24 i naturen vil forekomme på ringform. Der vil dog stadig være en lille del på kædeform. Figur 7 D-glukose, der går på ringform Glukose er et af de vigtigste monosakkarider. Det er et af produkterne ved fotosyntese og er en vigtig energikilde til vores celler. Glukose har bruttoformlen C 6 H 12 O 6 og kan ved anaerobe forhold gæres til ethanol af gærceller. 19 Opstilles med Fischers projektionsfomel som lineære molekyler (kædeform) med carbonylgruppen øverst (næst øverst hvis det er en keton). Nummereringen af carbonatomerne sker oppe og ned. 20 Gælder kun for pentoser og hexoser. Bindingsvinklen mellem carbonatomerne bøjer kæden således at carbonylgruppen støder op til hydroxygruppen og danner en ringstruktur. 21 Et asymmetrisk carbonatom har bundet 4 forskellige radikaler, som enten er funktionelle grupper (fx OH), grundstoffer (fx -H) eller radikaler. 22 Afhænger af placeringen af hydroxygruppne på den nederste asymmetiske carbonatom i Fischers projektionsformel. D = Dexter = højre, L= Laevus = venstre 23 Carbonatomet fra carbonylgruppen er ved ringdannelse blevet et asymmetrisk carbonatom med en nydannet hydroxygruppen. Sidder -OH under for ringen, kaldes det for en α-form og sidder den over, kaldes det for en β-form 24 Indeholdende fem carbonatomer eller derover 13

14 Fruktose er et andet vigtigt monosakkarid. Det findes i søde frugter og kaldes derfor også frugtsukker. Fruktose er en ketohexose, hvilket betyder at den indeholder seks carbonatomer, og carbonylgruppen er en keton. Fruktose har derfor bruttoformlen C 6 H 12 O 6 ligesom glukose og er derfor en isomer til glukose. Fruktose danner ved ringdannelse en femkantet ring 25. Fruktose kan ligeledes gæres til ethanol. Figur 8 D-Fruktose og Alfa-D-Fruktose Oligosakkarider Oligosakkerider består af 2-10 monosakkarier bundet sammen ved fraspaltning af vand (en kondensation). I levende organismer er det altid hexoser, som er byggestene i oligosakkarider. De vigtigste oligosakkarider er disakkarider, som af navnet fortæller, at de består af netop to monosakkarider. Disakkarider har bruttoformlen C 12 H 22 O 11. Polysakkarider Ploysakkarider består af mange monosakkarider bundet sammen på samme måde som oligosakkariderne ved kondensation. Der kan være flere tusinde monosakkarid-enheder i et polysakkarid. Bruttoformlen for et polysakkarid er tilnærmelsesvist (C 6 H 10 O 5 ) n, hvor n er antallet af monosakkarider. Teoretisk set er polysakkarider opløseligt i vand, da de indeholder en masse polære hydroxygrupper, men da molekylerne er så store, er de meget tungt opløselige i vand. Biomasser I forsøgene benyttes 3 forskellige typer af sakkarider, som alle er kilde til glukose, der kan gæres til bioethanol. I sukkerroen udnyttes sukrose. Hvedekernerne, som fås i form af hvedemel, udnyttes stivelse, og i halmen bruges cellulosen. I dette afsnit vil jeg kort gennemgå sakkariderne samt valg af forbehandling og enzym for biomasserne. 25 Hydrogenatomet fra hydroxygruppen på carbon nr. 5 binder sig til oxygenatomet i ketonen på carbon nr. 2. Oxygenatomet fra hydroxygruppen på carbon nr. 5 binder sig til carbon nr. 2 og danner en femkantet ring. 14

15 Sukkeroer Sukkerroer består af disakkaridet, sukrose. Sukrose, også kaldes sakkarose, består af ét α-dglukose-molekyle og ét β-d-fruktose-molekyle. Bindingen mellem glukose-molekylet og fruktosemolekylet sker ved en kondensationsreaktion og kaldes for en α-1-glukosid-β-2-frukosidbinding 26. Sukrosen er meget let tilgængelig i sukkerroen og kræver derfor ikke nogen særlig forbehandling. Sukrose nedbrydes til glukose og fruktose af enzymet invertase. Gærceller kan danne ethanol ved gæring på både fruktose og glukose, derfor kan begge produkter ved enzymatisk nedbrydning af sukrose benyttes til gæring af ethanol. Figur 9 Dannelse af sukrose Ved behandling af sukkerroe ved høje temperaturer, så som 190 C, er der risiko for at sukrosen karamelliserer eller at glukose blive nedbrudt til giftstoffer, så som 5-hydroxymethylfurfural, som hæmmer gær. Hvedemel Hvedemel er fint malede hvedekerner, som består af stivelse. Stivelse er et polysakkarid, som er opbygget af glukose-molekyler. Stivelse består af to molekylestrukturer, amylose og amylopektin. Amylose er en uforgrenet kæde af α-d-glukose-molekyler, der danner en spiral. Glukosemolekylerne er bundet sammen ved en α-1,4-glukosidbinding 27. Der er mellem glukose-enheder i amylose 28. Amylopektin er ligesom amylose opbygget af glukosemolekyler bundet ved α-1,4- glukosidbindinger og har en grundstruktur som en spiral, men amylopektin har for ca. hver 20. glukose-enhed i spiralen en sidekæde, som er bundet ved α-1,6-glukosidbindinger. Disse bindinger 26 Bindingen sker mellem de to hydroxygrupper på henholdsvis carbon nr. 1 hos glukose og nr. 2. Hydroxygruppen på hos glukose er på α-form og hos fruktose er den på β-form. Her af navnet på bindingen. 27 Bindingen sidder mellem carbon nr. 1 på det ene molekyle og carbon nr. 4 på det andet 28 Biologiens ABc - Biokemi s

16 snor sig ikke i en spiral som α-1,4-glukosid og bryder derfor spiral-strukturen. Amylopektin består af op til glukose-enheder og er derfor et væsentlig større molekyle end amylose. Stivelse findes i mange planter, som en oplagring af glukose. Forholdet mellem Figur 10 Amylopektin amylose og amylopektin er forskelligt fra plante til plante. Stivelse nedbrydes af α-amylase, der tilfældigt spalter den lange kæde til mindre kæder, β- amylase, som spalter kæderne til disakkeridet maltose, og glucoamylase, som spalter maltose til glukose. β-amylase kan kun angribe stivelse fra enderne, derfor gør α-amylase flere ender tilgængeligt for β-amylase. Stivelse i vand ved C vil suge vandet og folde sig ud, så enzymerne får bedre afgang til stivelsen. Halm Halm indeholder polysakkaridet cellulose. Cellulose forekommer i plantecellernes cellevæg for at gøre denne stiv og modstandsdygtig, og er ikke opløseligt i vand. Cellulose består af β-dglukosemolekyler bundet sammen i β-1,4-glukosidbindinger i lange uforgrenede kæder. Disse bindinger gør cellulosemolekylet langt og trådformet. Den enzymatiske nedbrydning af cellulose sker vha. cellulaser, som er en blanding af cellobiohydrolaser, endoglukanaser og β-glukosidaser. Disse tre enzymer komplementerer hinanden. Cellobiohydrolase nedbryder cellulose til cellobiose, som er et disakkarid. Cellobiohydrolase kan kun angribe cellulose fra enderne. Endoglukanase spalter cellulose til kortere cellulosekæde. Dette sker tilfældigt på den lange cellulosekæde. På denne måde bliver der skabt flere ender på cellulosen, som cellobiohydrolase kan angribe. β-glukosidase nedbryder cellobiose til glukose. β-glukosidase nedbryder cellobiohydrolases produkt til glukose, som er det endelig produkt, der skal komme ud af en enzymatisk nedbrydning af cellulose. Cellulaserne, der arbejdes med i forsøgene, har et ph-optimum på omkring ph Forsøgsvejledning Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer 16

17 Figur 11 Cellulasernes nedbrydning af cellulose Cellulose i planter er bundet i et netværk af hemicellulose og lignin. Cellulose, hemicellulose og lignin kaldes tilsammen lignocellulose. Hemicellulose ligner cellulose, men er mere forgrenet og består ud over glukose også af andre monosakkarider bl.a. xylose og arabinose, som ikke umiddelbart kan gæres til ethanol. Lignin dannes ud fra aminosyren fenylalanin og er opbygget af en netværk af phenoler, dvs. aromatiske alkoholer. Phenylgrupperne, dvs. de aromatiske ringe, er hydrofobe. Fordelingen af de tre stoffer varierer efter hvilken plante, der arbejdes med. Halmstrå består af ca % cellulose, 20-30% hemicellulose og 20-25% lignin 30. Figur 12 Opbygning af lignocellulose Indholdet af lignocellulose nedsætter tilgængeligheden af cellulose for enzymer og derfor er en vigtig faktor at have med, når man vil udnytte cellulose fra planterester som biomasse til gæring af bioethanol. Ved fx opvarmning til C kan netværket af lignin delvisbrydes, så det bliver muligt at skille hemicellulose fra cellulose. Ligninen vil trods behandlingen forblive bundet til cellulose og gøre det svært for enzymerne at arbejde Lignocellulose, Biotech Akadameys hjemmeside 17

18 Mindste kvadraters metode Ved data fra et eksperiment eller resultater fra en undersøgelse, kan det være praktisk at beskrive sammenhængen og på denne måde lave en generalisering for resultaterne. Jeg vil beskrive teorien bag en lineær regression, f ( x) ax b, da jeg benytter netop denne type regression i forsøget Bestemmelse af glukoseindhold i hydrolyseprøver. For at få et overblik over data og den lineære regression, kan det være en god ide at tegne dataen ind som punkter i et koordinatsystem. Punkterne for sig selv kan beskrives ved den tilfældig model, som i princippet ikke beskriver sammenhængen, men kun de enkelte data. Den lineære regression beskriver en lineær sammenhæng for datapunkterne. Når man vil beskrive en række data ved hjælp af en lineær regression, skal regressionen helst falde så tæt på de data, man har med at gøre. Der findes derfor nogle tal, som fortæller hvor godt en regression beskrive den række data, der er tale om. Hvert datapunkt har en vis afvigelse, d n, fra regressionen. Denne afvigelse bestemmes ved afstanden fra punktet, (x n,y n ), til regressionen. Matematisk beregnes afvigelsen som differensen mellem datapunktets y-værdien og regressionens y-værdi ved sammen x-værdi: d n y n (a x n b) Kvadratsum-afvigelsen, R, er summen af den kvadrerede afvigelsen for hvert datapunkt: R (d 1 ) 2 (d 2 ) 2 (d 3 ) 2 (d 4 ) 2...(d n ) 2 Kvadratsumafvigelsen, R, kaldes også for den resterende variation, da denne beskriver variationen mellem den tilfældige model og den lineære model 32. Jo mindre R er, des bedre beskriver regressionen datapunkterne. Det gælder derfor om at finde en værdi for a og b i forskriften for regressionen, som giver den mindst mulige R-værdi. 31 Fra halm til alkohol s Tænk med en graf, s

19 Den totale variation, T, beskriver variationen i den tilfældige model. T beregnes ved summen af kvadraterne på forskellen mellem datapunkternes y-værdi og den gennemsnitlige y-værdi for datapunkterne 33 :T(y 1 y mi dde ) 2 (y l2 y mi dde ) 2 (y l3 y mi dde ) 2 (y l4 y mi dde ) 2...(y l n y mi dde ) 2 l Den gennemsnitlige y-værdi beregnes ganske enkelt ved summen af y-værdierne delt med antallet af y-værdier. Den totale variation, T, og den resterende variation, R, benyttes til at beregne forklaringsgraden, R 2, som fortæller hvor stor en del af datapunkterne, der bliver beskrevet ved regressionen: R 2 T R T Hvis den resterende variation, R, er lav, vil forklaringsgraden være tæt på 1. Er den resterende variation derimod tæt på at være lig T, vil forklaringsgraden være tæt på 0. Forklaringsgraden vil aldrig kunne blive et negativt tal, da både T og R er summen af kvadrater. R vil aldrig blive større end T, derfor vil forklaringsgraden altid ligge mellem 0 og 1. Jo tættere forklaringsgraden ligger på 1, des bedre passer den lineære regression. En lineær regression regnes for acceptabel med en forklaringsværdi på over 0.95 og glimrende hvis forklaringsværdien er over Benyttelse af de resterende variation og forklaringsgraden kaldes Mindste kvadraters metode, da man benytter sig af afgivelserne kvadreret og det gælder om at få den mindst mulige kvadratsum-afgivelse 34. Bestemmelse af standardkurve I forsøget Bestemmelse af glukose i hydrolyseprøver laves en standardkurve, som benyttes til bestemmelse af glukoseindhold i ukendte prøver. Jeg vil i dette afsnit forklare den matematiske teori bag standardkurven og vise benyttelsen af Mindste kvadraters metode 35. Målingerne af glukoseprøverne: 33 Tænk med en graf, s Tænk med en graf s Forklaring af forsøg samt benyttelse af standardkurven kommer i gennemgang af forsøget Enzymatisk hydrolyse samt bestemmelse af glukoseindhold i hydrolyseprøver 19

20 Gukose Konc. (g/l) Absorbans 0 0 0,005 0,029 0,01 0,054 0,05 0,248 0,1 0,493 0,2 1,009 For at få overblik over resultaterne, plottes de ind i et koordinatsystem. Det ses tydeligt i koordinatsystemet, at punkterne har en lineær sammenhæng. Jeg vil nu beregne den optimale a- og b-værdi for den lineære regression, som beskriver standardmålingerne bedst. Først beregner jeg hvert punkts afvigelse fra den lineære regression. Værdierne for a og b er stadig ukendte. 20

21 Med disse afvigelse kan jeg udtrykke den resterende variation R ved a og b: Hvis værdien for b fastholdes, kan R udtrykkes som et andengradspolynomium, R(a): Ligeledes kan R udtrykkes som andengradspolynomium, R(b), hvis a-værdien holdes fast: Et andengradspolynomium har den generelle formel: y(x) ax 2 bx c. I begge ovenstående polynomier er a-værdien positiv, hvilket betyder, at parablen for polynomierne vil have benene vendende opad. X-værdien i toppunktet på parablerne vil derfor være den x-værdi, som giver den mindst mulige y-værdi. Y-værdien svarer i begge polynomier til den resterende variation, R. For den bedste rette linje gælder det, at R-værdien er mindst mulig. Toppunkterne for de to polynomier skal derfor findes. Et andengradspolynomiums toppunkt har koordinaterne T Jeg definerer a-, b- og c-værdien for R(a): b 2a,b2 4ac 4a. 21

22 Jeg definerer a-, b- og c-værdierne for R(b): Toppunktets x-værdi for R(a), a t : Toppunktets x-værdi for R(b), b t : Når R-værdien er mindst mulig, så er a og b i den lineære regression lige a t og b t. Jeg benytter solve-funktionen: For at få den mindste resterende variation, skal den lineære regression have forskriften 22

23 Forklaringsgraden for denne regression 36 : Forklaringsværdien er tæt på 1, hvilket betyder at regressionen passer glimrende. Excel giver sammen regression, som jeg kom frem til ud fra mindste kvadraters metode. Forsøg udført på Det Biovidenskabelige Fakultet, KU Formålet med forsøgene var at illustrere biomassers forskellighed i forhold af enzymatisk nedbrydning og forbehandling. Optimaltemperaturen for cellulaser blev også testet samt forbehandlingens betydning for gæringen. I de næste afsnit vil jeg kort tilføje enkelte detaljer omkring teorien, som indtil nu ikke er gennemgået, en kort beskrivelse af fremgangsmetode, en behandling og fremstilling af data samt en kort kommentering på resultaterne, eventuelle fejlkilder og diskussion. En fælles opsummering og konklusion på resultaterne vil komme efter gennemgang af alle tre forsøg. 36 Glukose er en liste med glukoseindholdet, absorbans er en liste med tilsvarende absorbans og ymiddel er den gennemsnitlige y-værdi for målingerne, dvs. den gennemsnitlige absorbans. 23

24 Enzymatisk nedbrydning, samt bestemmelse af glukoseindhold i hydrolyseprøver Formålet med dette forsøg er at undersøge hvilken forbehandling og hvilket enzym, der for tre forskellige biomasser, giver det største udbytte af glukose. Jo større udbytte af glukose, jo større udbytte af ethanol, kan der opnås ved gæring. Nedbrydningen af biomassen til glukose er et essentielt skridt i produktion af bioethanol. Her skal man overveje, hvilke biomasse, der arbejdes med og hvilken type enzym samt forbehandling, der vil være fornuft at benytte. Det er derfor i dette skridt, omkostningerne kan variere alt efter hvilken løsning, man vælger. Teori Der anvendes tre biomasser, som alle findes i typisk dansk landbrug: hvedekerner (i form af hvedemel), sukkerroer og halm. Biomasserne testes uden forbehandling og efter kogning ved 100 C. Halm kogt under tryk ved 190 C bliver ligeledes testet. Der anvendes en stivelsesnedbrydende enzymblanding (amylaser) og en cellulosenedbrydende enzymblanding (cellulaser). Der fortages også prøver, hvor der intet enzym blev tilsat. I alt 21 kombination. Der laves duplikater af alle prøverne. Glukose-indholdet i prøverne bestemmes ved en to-trins enzymatisk metode, hvor Glukose Assay Reagens (GAR) tilsættes. GAR er tilsat enzymet invertase, så det bliver muligt at måle på glukosen fra sukrose i sukkerroen. Når GAR tilsættes, bliver glukose først til glukose-6-fosfat, som er en reaktion, der katalyseres af enzymet hexokinase og hjulpet af coenzymet ATP. Fosfat-gruppen fra ATP overføres til glukose, og ATP bliver til ADP. Dernæst bliver glukose-6-fosfat til 6-fosforglukonat, som katalyseres af glukose- 6-fosfat-dehydrogenase med coenzymet NAD. NAD optager et hydrogenatom fra glukose-6-fosfat og bliver til NADH. 1. C 6 H 12 O 6 ATP C 6 H 11 O 6 P ADP 2. C 6 H 11 O 6 P NAD C 6 H 10 O 6 P NADH Reduktionen af NAD til NADH giver en øget absorbans ved λ=340nm, som er proportional med glukoseindholdet i opløsningen. Der laves en standardkurve, hvor absorbansen måles på kendte 24

25 glukose-koncentrationen. Da absorbansen er proportional med glukose-indholdet, får standardkurven forskriften: A a [gl ukose ] b 37. Da glukoseindholdet i hydrolyseprøverne er ukendt, måles absorbansen for hver prøve ved tre fortyndinger, 25x, 100x og 500x. På denne måde sikres det, at en af målingerne vil falde inden for standardkurvens måleområde, hvilket vil gøre bestemmelsen af glukose-indholdet mest præcis. Ved denne måde at bestemme glukoseindholdet i prøverne bliver indholdet af fruktose i sukkerroeprøverne ikke målt. Ved gæring vil fruktose dog blive gæret til ethanol på samme måde som glukose. Ved sammenligning af glukoseindholdene fordobles derfor det målte glukoseindholdet i sukkerroeprøver. Fremgang De forskellige biomasser samt forbehandling fordeles mellem holdene, der hver laver 6 prøver. Vejlederne har udregnet en masse for hver biomasse, som svarer til 1.5 g ovntørt materiale. På denne måde sikres det at der er lige meget materiale ved hver prøve uanset hvilke type biomasse, der arbejdes med. Biomassen afvejes og tilsættes 20mL demineraliseret vand. Flaskerne rystes så alt materiale fugtes og kommer ned i opløsningen 38. De prøver, som skal forbehandles ved 100 C, koges i vandbad i 10min 39. Efter forbehandling og afkøling noteres evt. ændringer i udseende samt forskelle ved de forskellige prøve 40. Alle prøverne tilsættes 3mL 0,5 natriumcitratbuffer, som sikrer en fast ph på 4.8 og ens forhold i alle prøver. Volumen justeres til ca. 30 ml og der tilsættes 1 ml enzym 41. Låget skrues på hver flaske, og prøverne sættes i rysteinkubator ved 50 C 42 i et døgn. Efter 24 timer tages prøver ud af rysteinkubatoren. Forandringer ved prøverne noteres 43. Og forberedelsen af hydrolyseprøverne til bestemmelse af glukoseindhold kan begyndes. 37 ΔA betyder, at der for hver absorbans-måling bliver fratrukket en baggrunds-absorbans, som måles ved en prøve indeholdende GAR og 0 g/l glukose. 38 Det undgås så vidt muligt at noget af biomassen sidder på flaskernes sidde. 39 Lågene på flaskerne sættes ikke helt fast pga. tryk ved kogning 40 Opløseligheden af materialer samt forskelle af opløselig ved forbehandlet materiale 41 Amylase, cellulase eller vand 42 Temperatur-optimum for enzymerne, der arbejdes med 43 Farve og opløselighed ved brug af de forskellige enzymer 25

26 Prøver til standardkurve laves ud fra fortynding af en standardglukoseopløsning (0.5 g/l) 44. Hydrolyseprøverne laves i tre fortyndinger, 25x, 100x og 500x fortyndet ml af hver prøver overføres til en mikrotiterplade to gange, således at der i hver kolonne er to prøver af 25xfortynding, to prøver af 100x-fortynding og 2 prøver af 500x-fortynding. Alle standardprøverne samt halvdelen af hydrolyseprøverne tilsættes 0.20mL GAR. Resten af hydrolyseprøverne tilsættes 0.20mL vand 46. Pladen står i 15 min, hvor efter absorbansen kan måles på en mikrotiterpladelæser. Observationer Efter forbehandling er den generelle observation at sukkerroe og halm behandlet ved 100 C og 190 C virkede mere opløst i væsken end de uforbehandlede. Forbehandlet mel lå som en géléklump i bunden af flaksen. Efter 24 timers hydrolyse er næsten al halm forbehandlet ved 190 C og tilsat cellulase opløst. Prøverne for mel og sukkerroe tilsat cellulase havde alle fået en gullig farve. I melprøven med amylase havde opløst en smule af klumpen mens klumpen i melprøven med cellulase var i mindre stykker. Ved prøverne med sukkerroe var der ingen markant forskel mellem enzymtyperne. Resultater og beregninger 47 Ud fra hvert holds standardprøver laves en standardkurve 48 (lineær regression) med forskriften f (x) ax b. Absorbansen for prøverne med ukendt glukoseindhold bliver målt og er derfor en kendt værdi. Med a- og b-værdien for standardkurvens forskrift kan glukoseindholdet i prøverne beregnes ved: A a Glukose b A b Glukose a 44 Se skema for fortynding på bilag 9 45 Se skema for fortynding på bilag Se oversigt mikrotiterpladen på bilag Se resultaterne for hvert hold på bilag Dette er også gjort manuelt i afsnittet Mindste kvadraters metode 26

27 Enheden på glukoseindholdet er g/l. Da prøverne er fortyndede, beregnes glukoseindholdet i fortyndingen og ikke i selve prøven. For at finde glukoseindholdet i den oprindelige, ufortyndede prøve, skal der ganges med fortyndingsfaktoren: Glukose prøve A b a fortynding Hvis man beregner glukoseindholdet for en prøve, som er fortyndet 25gange, så er fortyndingsfaktoren 25. Ved hydrolyseprøverne fratrækkes, som ved standardkurven, også en baggrundsabsorbans. Dette er absorbansen for prøve tilsat vand i stedet for GAR. Et eksempel 49 : A(P12 5x) A(P12 5x (GA R) )A(P12 5x (v a n))0.1 d Glukoseindholdet beregnes for hver absorbansmåling, dvs. tre mulige glukoseindhold pr prøve. Det beregnede glukoseindhold varierer meget efter hvilke fortynding, der regnes på. Standardkurven er bedst omkring midten. Ligger en målingen længere ud af y-aksen end det sidste punkt på standardkurven, kan man ikke være sikker på, at standardkurve vil fortsætte lineært og derved regne med, at kurven passer til målingen. Ligger et punkt helt nede i begyndelsen af standardkurven, er det for små tal, der arbejdes med til, at det kan stoles på. Vejlederne 50 har vedtaget af standardkurven passer bedst fra en absorbans på over 0.2. Hvis absorbansen for 500x-fortyndingen er over 0.2, benyttes denne måling til beregning af glukoseindhold. Er den derimod under 0.2, mens fortyndingen 100x har en absorbans på over 0.2, benyttes denne måling i stedet. Er ingen af fortyndingernes absorbans på over 0.2, benyttes målingen for 25x, da denne i så fald vil være mindst fortyndet og derved passer bedst. I Excel er der benyttet en formel, således at denne sortering finder sted automatisk 51. Vejlederne udleverede nogle procenter for, hvor stort et teoretisk udbytte glukose, man kan få ud af de tre forskellige biomasser. Alle udvalgte glukoseindhold sammenlignes ved udregning af udbytteprocent af praktisk udbytte i forhold til teoretisk 52. Procenterne er baseret på vejledernes 49 Data benyttet er for prøven nr. 1 for halm, 100 C, ingen enzym 50 På Det Biovidenskablige Fakultet, KU 51 Billede af denne formel ses på bilag Se sammenlignede glukoseindhold på bilag 14 27

28 egen erfaring og er en kraftig generalisering. Det er derfor muligt at få over 100% praktisk udbytte i forhold til det teoretiske. Prøverne bestod af 1.5 g biomateriale i 30mL volumen. Hvis alt biomaterialet bliver omdannet til glukose, vil det svare til et glukoseindhold på 50 g/l. 1.5g L 50 g L Da der bliver tilføjet vand for at bryde bindingerne mellem glukoseenhederne, ganges der med en faktor på Det maximale udbytte af glukose er derfor 55.5 g/l. Da der ved hydrolyse af sukrose kun vil blive tilsæt et vandmolekyle for 2 glukosemolekyler 54, er faktoren for sukrose I cellulose er ca. 35% af glukosen tilgængelig. Det samme tal for stivelse er 80% og for sukrose 65%. Det teoretiske glukoseudbytte af cellulose er således 35% af 55.5 g/l. Udbytteprocenten for hver prøve beregnes ved Glukose prøve Glukose teori 100%. Det målte glukoseindhold for prøverne med sukkerroe fordobles, da fruktose kan gæres til ethanol på lige fod med glukose og derfor bør tælles med i udbyttet. Det er netop mængden af mulig bioethanol, der er interessant. Materiale Enzym Behandling Glukose, g/l Glukose+fruktose Udbytte% Halm cellulase , , ,12 Halm cellulase , , ,89 Mel amylase , , ,06 Mel amylase , , ,57 Mel cellulase , , ,16 Mel cellulase , , ,80 Sukkerroe cellulase , , ,65 Sukkerroe cellulase , , ,63 53 Udleveret af vejlederne 54 Et fruktose-molekyle og et glukose-molekyle, men da de har samme effekt i gæringen, ses og omtales fruktose i denne forbindelse som et glukose-molekyle. 28

29 Materiale Enzym Behandling Glukose, g/l Glukose+fruktose Udbytte% Sukkerroe ingen Ingen 2, , ,34 Sukkerroe ingen Ingen 7, , ,81 Mel ingen Ingen 1, , ,44 Mel ingen Ingen 1, , ,39 Halm Ingen Ingen 0, , ,77 Halm Ingen Ingen 0, , ,14 Ved udbytteberegningerne ses det, at halmprøverne gav største udbytte i kombination med cellulase og en forbehandling på 190 C. Melprøverne gav størst udbytte med tilsat cellulase og 100 C forbehandling. Melprøverne tilsat amylase har dog et stort udbytte, som ikke er meget lavere end udbyttet ved cellulaseprøverne. Sukkerroeprøverne giver meget stort udbytte med tilsat cellulase og 100 C forbehandling. Sammenlignes udbytteprocenterne for halm, mel og sukkerroe uden tilsætning af enzym og forbehandling, giver sukkerroe klart det største udbytte. Fejlkilder Udbytteprocenterne er udregnet for en kraftig generalisering, hvilket betyder at man ikke bør fokuserer for meget på selve tallene. Det giver dog et billede af prøvernes resultat i forhold til hinanden. Enzymer stammer fra enzymblandinger, som ikke er af den dyreste slags. Det er dyrt at oprense enzymer, hvilket kan betyde, at de mindre dyre enzymblandinger ikke er helt rene. Der kan være andre herlige enzymer i, som forsøget og teorien ikke tager højde for. Dette kan forklare den mystiske gullige farve, der opstod i cellulase-prøver, samt det store udbytte i alle cellulase-prøver uafhængigt af den benyttede biomasse. Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer Formål med denne øvelse er at bestemme reaktionshastigheden af cellulasers nedbrydning af glukose ved forskellige temperaturer. Reaktionshastigheden fortæller, hvor effektivt enzymerne arbejder. 29

30 Teori Filterpapir, der benyttes som substrat i forsøget, består af cellulose. Der benyttes derfor cellulaser i forsøget. Hastigheden bliver målt ved stuetemperatur, 32 C, 50 C og 80 C. Den enzymatiske nedbrydning vil blive fulgt løbende ved målinger efter 10, 20, 30, 45 og 60 min (efter tilsætning af enzym). Alle prøverne i forsøg tilsættes 0,5 M natriumcitrat-buffer, som giver en fast ph på 4.8. Dette gøres for at skabe et ens miljø for alle prøver samt en god ph-værdi for enzymerne. I forsøget benyttes DNS, som standser den enzymatiske nedbrydning af filterpapiret. På denne måde kan man, efter alle prøver er stoppet, måle mængde af dannet glukose løbende over en periode. Forsøget kører i en time. DNS er 3,5-dinitrosalisylsyre og har en ph på 11. En ph på 11 vil få cellulaserne til at ændre struktur og dermed virkeevne. Derfor vil den enzymatiske nedbrydelse stoppe. Samtidig vil DNS går i forbindelse med glukose og danne 3-amino-5-nitrosalisylsyre, som ved opvarmning til 100 C, vil blive orangerødt. Mængde af 3-amino-5-nitrosalisylsyre er ækvivalent med mængden af dannet glukose. Måling af absorbans i prøver vil derfor fortæller, hvor meget glukose, der er dannet i prøven. Absorbansen måles ved en bølgelængde på 540nm, som er en lysegrøn farve. Denne bølgelængde er valgt, da der måles på rødorange væske. Rød er komplementærfarve til grøn. Grønt lys vil derfor blive absorberet af en rød væske. Jo rødere væsken er, des mere af det grønne lys vil blive absorberet. Jo rødere væsken er, des mere 3-amino-5-nitrosalisylsyre findes i væsken. Der laves måling af baggrundsabsorbans, kaldet A blank. A blank bliver målt på en opløsning af buffer og DNS. Fremgang Hvert hold får tildelt en temperatur. Der skal udtages prøver ved 5 tidspunkter, og der laves duplikater, dvs. 10 prøver for hver gruppe. Prøverne mærkes, så det er tydeligt, hvilken temperatur de har stået ved samt hvor længe de har stået. De to prøver tilsættes 1,0 ml buffer og 0,5 ml enzymblanding (Cellulast). Prøverne sættes ved den ønskede temperatur i 2-3 min, således at enzymvæsken er på den ønskede temperatur ved forsøgets start. Substratet i form af filterpapir 30

31 foldet 3 gange kommes i prøverne og stopuret startes. Der sættes låg på prøverne. Efter henholdsvis 10, 20, 30, 45 og 60 min, udtages to af prøverne 55. De udtaget prøver tilsættes 3mL DNS. Når alle prøver er taget ud og tilsat DNS, koges de i 10 min 56. Alle prøver tilsættes 20 ml vand og vandes nogle gange for at prøverne bliver blandet. De står i 10mins tid så papiret kan bundfalde, inden 250 μl af hver prøve overføres til en mikrotiterplade. Absorbansen måles i en mikrotiterplade ved λ=540nm. Resultater og beregninger 57 Ved hver temperatur og tidspunkt beregnes en gennemsnitlig absorbans 58. Glukoseindholdet for hver gennemsnitlige absorbans beregnes vha. standardkurven 59. Figur 13 Taget fra bilag 15 Grafen viser, hvorledes glukoseindholdet i prøverne stiger over tid. Det ses tydeligt, at prøverne ved en temperatur på 50 C giver bedste udbytte. 80 C ligger lavest, hvilket betyder, at disse prøver gav mindst glukose. 55 Efter 10 min udtages de to prøver som er mærket 10min, så man til sidst ved præcis hvor længe hver prøve har fået lov til at reagere. 56 For at frembringe den røde farve i 3-amino-5-nitrosalisylsyre 57 Se bilag 15 for oversigt over målinger og beregnede data 58 Der er fire absorbansmålinger pr. tidspunkt og temperatur, undtagen for stuetemperatur, hvor kun en gruppe tog målinger, dvs. 2 målinger pr. tidspunkt. Absorbanserne fratrækkes A blank 59 Udleveret af vejlederne 31

32 Som det ses på grafen er dannelsen af glukose over en time tilnærmelsesvis en lineært funktion. Hældningen på grafen for en sådan lineær funktion har enheden mg glukose/min. Dette er et udtryk for hvor meget glukose der omsættes i minuttet, dvs. en hastighed. Hældning fortæller om enzymaktiviteten, dvs. reaktionshastigheden 60. I teoriafsnittet Enzymer redegjorde jeg for begrebet Q R 2 t 2 t 1 2 Q 10 R 1 R 1 og R 2 er reaktionshastigheder og t 1 og t 2 er tilhørende temperatur. Ved at lave en lineær regression for målingerne for hver temperatur, får jeg 4 hældninger, dvs. reaktionshastigheder. Temperatur Reaktionshastighed 25 0, , , , Reaktionshastigheden er stigende fra 25 C til 50 C, hvorefter den falder fra 50 C til 80 C. Dette tyder på at temperaturen har passeret enzymerne deres optimaltemperatur, og de ved 80 C er begyndt at denaturere, hvilket bekræfter teorien om optimaltemperatur. Jeg benytter reaktionshastigheder til at beregne Q 10 ud fra udledte formel: Temperaturer Q og 30 4, og 50 2, og 80 0, For hver 10grader temperaturstigning bliver Q 10 fordoblet. Måles der på to temperaturer med en forskel på mindre end 10, kan disse ikke give et korrekt billede af hvor meget 60 Volumen og mængde af enzym er den samme i hver prøve, derfor er enheden på hastigheden kun mg/min. 32

33 reaktionshastigheden er vokset efter 10graders stigning, hvilket er præcis hvad Q 10 fortæller. Når forskellen er større end 10grader, er det mere præcist at fortælle hvorledes reaktionshastigheden vokser for hver 10graders stigning. Derfor bliver Q 10 mellem 25 C og 30 C for stor, mens Q 10 mellem 25 C og 50 C bliver utrolig tæt på 2. Q 10 mellem 25 C og 80 C bliver meget lav, da enzymerne efter 50 C er begyndt at denaturere, og reaktionshastigheden fra 50 C til 80 C er faldet kraftigt. Efter 50 C vil Q 10 ikke længere gælde. Jeg laver en eksponentiel regression, f(x)=ba x, for reaktionshastighed som funktion af temperatur 61. Figur 14 Taget fra bilag 15 Som det ses på forklaringsværdien, R 2, passer regression ikke helt perfekt, men er dog acceptabel idet R 2 er lige over Dette skyldes formentlig, at der kun er tale om 3 punkter, som med det blotte øje ser ud til at have en lineær sammenhæng. En lineær sammenhæng er ikke interessant, da teorien siger, at reaktionshastigheden som funktion af temperaturen til en vis grad er en eksponentielt stigende graf. For en eksponentielt stigende funktion gælder følgende 63 : f (x) b a x b e k x k ln( a) a e k Regressionen har forskriften R(t) e x. Værdien for a er derfor: 61 Jeg fravælger 80 C, da denne temperatur ikke gælder i begrebet Q Uddybelse findes i afsnittet Mindste kvadraters metode 63 Matematisk Formelsamling stx A s

34 k a e Ved den matematiske udledning af Q 10 er et af trinene a Hvis den eksponentielle regression skal opfylde reglen om Q 10, så skal a 10 være lig 2. a Den eksponentielt stigende regression opfylder så godt som reglen om Q 10, hvilket betyder at hydrolysen af cellulose bekræfter tommelfingerreglen om stigning i reaktionshastighed for enzymkatalyserede reaktioner. Diskussion Forsøget foregår kun over en time. Det kan tænkes, at optimaltemperaturen er en anden, hvis forsøget kører over længere tid. Det kunne også være interessant at kigge på maksimal udbyttet ved de 4 temperaturer, for derefter at regne på det energimæssige udbytte i forhold til den energi der kræves ved hydrolyse på den givne temperatur. Dette vil kræve, at hydrolysen kører så længe, at al substratet er omdannet. Når enzymet har omsat al substrat, vil koncentrationen af glukose være det samme lige meget, hvor længe man lader hydrolysen køre og grafen vil derfor falde ud. Forskellen mellem temperaturerne vil ligge i tidspunktet, at grafen for glukose over tid flader ud. Jo længere tid hydrolysen ved en given temperatur skal køre, jo mere energi skal der benyttes. Gæring af hydrolysater Formålet med dette forsøg er at måle produktionen af ethanol i en gæring over et døgn. Det undersøges om forbehandlingen af biomassen har en betydning for gærens effektivitet, dvs. produktionen af ethanol. Teori Biomassen, der gæres på er sukkerroe. Der gæres på fire forskellige kombinationer. Forbehandling af sukkerroe Ingen Hydrolyse Uden enzym Med enzym 64 Hvis man tænker på det som en rentetilskrivning, så er a fremskrivningsfaktoren for hver rentetilskrivning og potensen er antallet af rentetilskrivning. Denne regnemåde tager højde for rentes rente. 34

35 120 C, 10 min Uden enzym Med enzym Den ønskede forbehandling af sukkerroe var oprindeligt 190 C i 10min, men grundet manglende ressourcer er forbehandlingen af sukkerroe kun mulig på 120 C. Sukkerroe består som nævnt tidligere af sukrose, som er et disakkarid af fruktose og glukose. Ganske almindeligt bagegær (Saccharomyces cerevisiae), som der benyttes i forsøget, kan under anaerobe forhold gære glukose og fruktose til ethanol. Når levende organismer skal have frigivet energi fra kulhydrat foregår det ved en stofnedbrydende proces dissimilation. Den stofnedbrydende proces begynder med glykolysen, hvor glukose omdannes til pyruvat, hvorefter det omdannes videre afhængig af hvilke forhold, der er tilstede (aerob eller anaerob). I en organisme som gær, omdannes pyruvat under anaerobe forhold først til ethanal og dernæst til ethanol. Glykolysen består af 10 reaktionstrin, som jeg ikke vil komme nærmere ind på. Glykolysen: C 6 H 12 O 6 2 ADP 2 P 2 NAD 2 CH 3 COCOO pyruvat 2 ATP 2 NADH 4 H ADP, P, NAD +, ATP og NADH 2 er alle coenzymer. NAD + overfører hydrogenatomer og ATP overfører fosfatgruppe og bliver til ADP og P. I glykolysen går fosfastgruppen dog den anden vej og optages af ADP, der bliver til ATP. Dernæst bliver pyruvat omdannet til ethanal vha. af enzymet puryvat-decarboxylase, som er en lyase. Lyaser kan fraspalte CO 2. CO 2. 2 CH 3 COCOO 2 H pyruvat decarboxylase 2 CH 3 CHO ethanal 2 CO 2 Der benyttes en dobbeltpil, da denne reaktion kan forløbe begge veje. Det er det samme enzym, som katalyserer reaktionen uanset retning. Ethanal er ustabilt og omdannes hurtigt videre til ethanol vha. enzymet ethanol-dehydrogenase, som er en oxido-reduktase. Ethanal reduceres til ethanol og NADH oxideres til NAD +. 2 CH 3 CHO 2 NADH 2 H ethanol dehydrogenase 2 CH 3 CH 2 OH ethanol 2 NAD 35

36 Bruttoligningen for dannelse af ethanol ved gæring bliver derfor C 6 H 12 O 6 2 ADP 2 P g æ ring 2 CH 3 CH 2 OH 2 CO 2 2 ATP Ud fra bruttoligningen ses det, at for hver glukose-molekyle (og fruktose) der bliver omdannet, bliver der produceret 2 ethanol-molekyler og 2 kuldioxidmolekyler. Forsøget er opstillet således, at kuldioxiden kan løbe ud af flasken, men ilt kan ikke komme ind. Dette er vigtigt, fordi gæringen kun kan finde sted under anaerobe forhold. Er der ilt tilstede, vil gæren i stedet for gæring, omsætte glukose til kuldioxid og vand, som ved ganske almindelig respiration. Da kuldioxiden forsvinder fra flasken, vil flasken falde i vægt efterhånden som, der bliver produceret ethanol. De molare masse for glukose, ethanol og kuldioxid: M(C 6 H 12 O 6 ) M C 6 M H 12 M O 6 12,011 g mol 6 1,0079 g mol 12 15,999 g mol 6 180,155 g mol M C 2 H 5 OH M C 2 M H 6 M O 12,011 g mol 2 1,0079 g mol 6 15,999 g mol M CO 2 M C M O 2 12,011 g mol 15,999 g mol 2 44,009 g mol Forholdet mellem glukose og produkterne, ethanol og kuldioxid: Forhold glukose og CO 2 M CO 2 M C 6 H 12 O 6 Forhold glukose ogethanol M CO 2 M C 2 H 5 OH 2 44,009 g mol 180,155 g mol 2 46,0684 g mol 180,155 g mol 0,489 0,511 46,0684 g mol Disse tal fortæller, at for hvert gram omdannet glukose, bliver der dannet 0,49 g kuldioxid og 0,51 g ethanol. Da vægttabet måler den dannede kuldioxid, er det interessant at finde forholdet mellem kuldioxid og ethanol, således at vægttabet kan omregnes til dannet ethanol: Forhold CO 2 og ethanol M C 2 H 5 OH M CO 2 46,0684 g mol 44,009 g mol 1,0468 For hvert gram dannet kuldioxid, dvs. tab i vægt, bliver der dannet g ethanol 65. Gæren er selv i stand til at hydrolysere sukrose til glukose og fruktose. Der bør derfor ikke være en markant forskel i glukoseproduktionen af ethanol ved tilsætning af enzym. 65 Vejlederne har benytte afrundet tal til beregning af denne faktor. Derfor benyttes faktoren 1.04 i databehandlingen 36

37 Fremgangsmetode Holdene deles i to, så den ene halvdel laver prøver for uforbehandlet sukkerroe og den anden laver prøver for forbehandlet sukkerroe. Der laves duplikater af alle prøver, dvs. hvert hold laver 4 prøver. Begge materialer er væske af ekstraheret sukkerroe, forbehandlet og uforbehandlet, som er blevet hydrolyseret ved rystebord i 50 C i 24 timer både med og uden tilsat enzym. 50 ml flakser tilsættes 25 ml sukkerroe-væske. Flaskerne tilsættes 2mL gæropløsning, som ligeledes var forbedret. Proppen med kanyle monteres og flaskerne vejes 66. Alle flaskerne sættes i rysteinkubator ved 32 C. Flaskerne vejes 4 gange i løbet et døgn og vægten noteres. Resultater og beregninger Ifølge målingerne har nogle af flaskerne i løbet af forsøget taget på i vægt, hvilket er umuligt og højst sandsynlig skyldes en fejl i vejningen. En vægtforøgelse vil give et negativt vægttab. Disse målinger bliver valgt fra, da de tydeligt er ukorrekte 67. Der beregnes et gennemsnitlig vægttab for alle prøverne af samme type, så der fås et gennemsnitlig vægttab over tid for hver kombination af enzym og forbehandling. I alt 4 sæt data 68. Ud fra vægttabet beregnes mængden af dannet ethanol over tid. Volumen af prøverne var på 27 ml. Enheden på mængde dannet ethanol laves til mg/ml. Udregningen for dannet ethanol ser således ud: Ethanol [Ethanol] v ægttab g 27mL mg ml Der benyttes det samme vægt for alle prøve og alle vejninger for at minimere fejlkilde ved vejning. 67 Disse målinger er markeret med gult i tabellen på bilag Se alle målinger og udregnede data på bilag 16 37

38 Figur 15 Taget fra bilag 16 Grafen viser produktion af ethanol over tid for de fire kombinationer af forbehandling og enzym. Kun kombinationen forbehandlet med enzym synes at falde uden for. De tre andre kombinationer ligger tæt og forholdsvis samlet. Det ser derfor ud til at betydningen af forbehandling ikke har gjort en markant forskel ved udbyttet af gæringen. Fejlkilder Hvis proppen ikke slutter tæt, eller der af en anden grund kommer ilt ned til gæren, vil gæren lave respiration i stedet for gæring. Ved respiration bliver glukose omsat til 6 kuldioxidmolekyler og 6 vand molekyler. Omdannelsen af et glukosemolekyle vil resulterer i et større vægttab. Noteres vægttabet som et resultat af gæring, vil udbyttet af ethanol være større end det i praksis er og målingerne vil være forkerte. Vægten er utrolig følsom, og der ligger derfor en vis usikkerhed i vejningen af prøver. Dette kommer også til udtryk i de målte data, hvor nogle af prøverne tager på i løbet af gæringen. Forbehandlingen på 120 C er ikke kraftig nok til at danne giftstoffer, som er den ønskede effekt. Dette ses i resultaterne, idet der ingen markant forskel er på gæringerne. Havde forbehandlingen haft sin effekt ville gæringen for disse prøver give et lavere glukoseindhold. 38

39 Opsummering og konklusion Forsøgene har illustreret forskelligheden i forbehandling afhængig af biomasse samt betydningen af temperaturen ved hydrolyse. Forsøget med gæring viste grundet den utilstrækkelige forbehandling ikke den store forskel i forbehandling af sukkerroer ved gæring, dog viste teorien bag dette forsøg, at der også findes forbehandling med negativ effekt. Efter teorien og forsøget med hydrolyse af biomasser, er det tydeligt at biomasser fra planterester, såsom halm, kræver en kraftigere forbehandling og en større blanding af enzymer end biomasser som sukkerroer og mel. En kraftig forbehandling og en stor mængde enzymer har store omkostninger. Vælges en billigere og mindre kraftig forbehandling eller en billigere og mindre broget enzymblanding, vil udbyttet af ethanol også blive mindre. Dette udgør et af de største problemer ved 2. generations bioethanol, da en produktion af bioethanol gerne skal kræve så lidt energi og ressourcer som muligt, samtidig med at give så stort et udbytte som muligt. Ser man desuden på den procentvise tilgængelighed af glukose, er den væsentlig lavere for cellulose end den er for sukrose og stivelse. Så selvom udnyttelsen af biomassen er bedst muligt, vil glukose udbyttet fra biomasser som halm giver en mindre udbytte i forhold til mængden af biomasse. Bioethanol gæret på sukkerroer eller hvedekerner vil kræve mindre forbehandling og enzym end fx halm og derved kræve mindre energi og penge at producere. Til gengæld har disse biomasser andre anvendelser, som vil øge efterspørgslen og derved også prisen på biomassen. Ved valg af enzym skal der også tænkes på de bedste forhold for enzymerne. Med en temperatur på 50 C vil enzymerne måske være mest effektive, men brugen af energi vil også være tilsvarende større. Vælges fx stuetemperatur, som ikke vil kræve meget energi at opretholde, vil enzymernes aktivitet falde og udbyttet af hydrolysen være derefter. Gær arbejder bedst ved 32 C. Det kunne derfor være en mulighed at slå hydrolysen og gæringen sammen til et trin. Ved en sådan løsning skal man tage stilling til, om temperaturen skal være til fordel for enzymerne, gæren eller om der findes en middelvej, hvor ingen af dem arbejder optimalt, men måske giver det bedste udbytte ved en sammenkobling af disse to trin. 39

40 For at gøre produktion af 2. generations bioethanol rentabel, skal der ske fremskridt inden for udviklingen og optimering af enzymer, optimering af gær samt forbehandling af planterester, som ikke kræver for meget energi og skaber restprodukter, der kan hæmme resten af produktionen af bioethanol. Der er derfor et stykke vej endnu før produktionen af 2. generations bioethanol bliver rentabel. 40

41 Litteraturliste Bøger Abildgaard, Kristen; Larsen, Vagn Juhl; Selchau Kirsten; Skadhede, Thomas Larsen: Biologiens Abc Biokemi ; kap. 1, 3 og 4 samt 5.2, 5.4 og Forlaget NICHE, 2007 Abildgaard, Kristen; Larsen, Vagn Juhl; Selchau Kirsten; Skadhede, Thomas Larsen: Biologiens Abc Økologi og økotoksikologi ; s. 35 Forlaget NICHE, 2007 Cederberg, Gunnar; Kristiansen, Kim Rongsted: Alkoholer kemi, teknologi, miljø L&R Uddannelse A/S, 2003 Cederberg, Gunnar; Kristiansen, Kim Rongsted: Aurum Kemi fir gymnasiet 1 ; kap. 9 Forlag Maling Beck, 2006 Christensen, Ditte Vesterager; Glejtrup, Eva; Larsen, Gy; Vedelsby, Jakob: Morgendagens Transportbrændstoffer danske perspektiver ; s Teknologirådet, 2006 Dejgaard, Jørgen; Schomacker, Gert: Matematisk formelsamling stx A ; s Matematiklærerforeningen, 2007 Felsager, Bjørn; Schomacker, Gert: Tænk med en graf matematik med grafregneren TI-83/82 ; s Munksgaards Forlag,

42 Mygind, Helge: Kemi 3, kap. 7.8, 7.9, 7.12 P. Haase & Søns Forlag, 1996 Nielsen, Oluf; Springborg, Anni: Biokemi ; s samt s udgave Nyt nordisk forlag Arnold Busck, 2002 Shou, Benthe: Kost og ernæring kemi ; s Kemiforlaget Torp, Kresten Cæsar: Biokemibogen liv, funktion, molekyle ; kap. 4 + s Nucleus Forlag ApS, 2007 Artikler Meyer, Anne; Rosgaars, Lisa: Fra halm til alkohol Aktuelt Naturvidenskab, nr. 3, 2005 Vedlagt, bilag 7 Devantier, Rasmus; Olsson, Lisbeth; Pedersen, Sven: Fremstilling af bioethanol nutidens teknologi og fremtidens udfordringer Procesteknik, nr. 2, 2005 Vedlagt, bilag 8 Felby, Claus; Jørgensen, Henning; Larsen, Jan;Thomsen, Anne Belinda; Thomsen, Mette Hedegaard; Fra halm og affald til morgendagens brændstof til biler 42

43 Procesteknik, nr. 2, 2006 Vedlagt bilag 18 Hjemmesider Inbicon A/S Biomass refinery og The ethanol solution Besøgt d Kristiansen, Luise C.; Biologiske katalysatorer forbedrer brødet ; Stivelse og amylaser Besøgt d Poulsen, Simon Guldberg: Fra Halm til bioethanol, en bioteknologisk udfordring Besøgt d Papirer Jakobsen, Kurt: Lineær regression + opgaver besvarelser (Udarbejdet af Signe Klinting) Udleveret til matematik undervisning, 2.g Vedlagt, bilag 17 Vejledere i forbindelse med forsøg på Det Biovidenskablige Fakultet på KU Bruun, Sander Lektor ved Institut for Jordbrug og Økologi/Plante- og Jordvidenskad Lindedam, Jane PhD studerende ved Institut for Jordbrug og Økologi/Plante- og Jordvidenskab 43

44 PowerPoint Potentiale for bioethanol i Danmark Vedlagt, bilag 6 Hansen, Mads A. T PhD studerende ved Skov & Landskab PowerPoint Enzymer Hvad rager det mig? Vedlagt, bilag 5 Nord-Larsen, Pia Post Doc ved Institut for Jordbrug og Økologi/Plante- og Jordvidenskab Skovgaard, Pernille Anastasia Forskerassistens på Skov & Landskab Figuroversigt Figur 1 Oversigt over trin i produktionen "Enzymer - Hvad rager det mig?" Figur 2 Grafen viser energiniveaut for en reaktion. Den lysegrønne graf er hvor reaktionen er enzymkatalyseret. Biokemibogen, s. 81 Figur 3 Enzyms virkning Aurum 2, s. 294 Figur 4 Reaktionshastighed som funktion af ph. Optimum er individuelt for hvert enzym Biokemibogen, s. 87 Figur 5 Reaktionshastighed som funktion af tempreaturen. Grafen falder brat efter optimaltemperatur. Biokemibogen, s. 86 Figur 6 Fra venstre: D-glukose og L-glukose Tegnet i Chemsketch Figur 7 D-glukose, der går på ringform "Enzymer - Hvad rager det mig?" 44

45 Figur 8 D-Fruktose og Alfa-D-Fruktose Biologiens ABC - biokemi, s. 13 Figur 9 Dannelse af sukrose Kost og Ernæring - kemi, s.20 Figur 10 Amylopektin Kost og Ernæring - kemi, s. 27 Figur 11 Cellulasernes nedbrydning af cellulose "Enzymer - Hvad rager det mig?" Figur 12 Opbygning af lignocellulose "Fra Halm til alkohol" Figur 13 Taget fra bilag 15 Figur 14 Taget fra bilag 15 Figur 15 Taget fra bilag 16 45

46 Bilag 1 Forsøgsvejledning Enzymatisk hydrolyse af forskellige biomasser 46

47 47

48 48

49 Bilag 2 Forsøgsvejledning Bestemmelse af glukose i hydrolyseprøver 49

50 50

51 51

52 52

53 Bilag 3 Forsøgsvejledning Reaktionshastighed af cellulaser ved forskellige temperaturer 53

54 54

55 55

56 56

57 Bilag 4 Forsøgsvejledning Gæring af hydrolysater 57

58 58

59 59

60 Bilag 5 PowerPoint Enzymer Hvad rager det mig? 60

61 61

62 62

63 63

64 64

65 65

66 66

67 67

68 Bilag 6 PowerPoint Potentiale for bioethanol I Danmark 68

69 69

70 70

71 71

72 Bilag 7 Artikel Fra Halm til alkolhol 72

73 73

74 74

75 75

76 Bilag 8 Artikel Fremstilling af bioethanol 76

77 77

78 78

79 79

80 Bilag 9 Skema for fortynding af standardprøver 80

81 Bilag 10 Skema for fortynding af hydrolyseprøver 81

82 Bilag 11 Oversigt iver mikrotiterplade for hydrolyse Prøve Halm, 100 C, Ingen enzym, nr. 1 Halm, 100 C, Ingen enzym, nr. 2 Halm, 100 C, amylase, nr. 1 Halm, 100 C, amylase, nr. 2 Halm, 100 C, cellulase, nr. 1 Halm, 100 C, cellulase, nr. 2 Forkortelse P1 P2 P3 P4 P5 P A S 0 P1-25x P2-25x P3-25x P4-25x P5-25x P6-25x (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) B S 0,005 P1-100x P2-100x P3-100x P4-100x P5-100x P6-100x (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) C S 0,01 P1-500x P2-500x P3-500x P4-500x P5-500x P6-500x (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) (GAR) D S 0,5 P1-25x P2-25x P3-25x P4-25x P5-25x P6-25x (GAR) (vand) (vand) (vand) (vand) (vand) (vand) E S 0,1 P1-100x P2-100x P3-100x P4-100x P5-100x P6-100x (GAR) (vand) (vand) (vand) (vand) (vand) (vand) F S 0,02 P1-500x P2-500x P3-500x P4-500x P5-500x P6-500x (GAR) (vand) (vand) (vand) (vand) (vand) (vand) Standardprøverne i kolonne 1, række A-F Prøver tilsæt GAR i kolonne 2-7, række A-C Prøver tilsat vand i kolonne 2-7, række D-F 82