Overvågning af tilsætningsstoffer

Transkript

1 Overvågning af tilsætningsstoffer - Indkøring af HPLC metode til bestemmelse af Neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer Udført på Fødevareregion København af Udo Jensen. PROJEKTLEDELSE: Ib Krog Larsen Fødevareregion København og Nordøstsjælland LABORATORIEARBEJDE: Marian Weber Udo Jensen Projektnr ( )

2 Overvågning af tilsætningsstoffer - Indkøring af HPLC metode til bestemmelse af Neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer FødevareRapport 2006:13 1. udgave, 1. oplag juli 2006 Copyright: Fødevarestyrelsen Id-nummer Denne publikation findes kun elektronisk Rapporten findes i elektronisk form på adressen: Fødevarestyrelsen Mørkhøj Bygade 19, DK-2860 Søborg Tlf , fax Fødevarestyrelsen er en del af Ministeriet for Familie- og Forbrugeranliggender. Styrelsen står for administration og kontrol på veterinær- og fødevareområdet. Kontrollen med fødevarer og tilsyn med veterinære forhold varetages af 3 fødevareregioner fordelt over hele landet, mens regeldannelse og koordination af kontrollen foregår i Mørkhøj ved København. Fødevarestyrelsen har ca årsværk i regionerne og ca. 300 årsværk i Mørkhøj.

3 Indhold Sammendrag INDLEDNING PRØVEMATERIALE OG UNDERSØGTE STOFFER ANALYSEMETODE Indledning Krav til analysemetoden Analyseoptimering Kolonnevalg og eluentprogrammering Bølgelængder til detektion Homogenisering Baggrund Eluentens bufferkapacitet Tyggegummi Analysevalidering Standardkurve Kvantitativ detektionsgrænse Spredning og dobbeltbestemmelser Genfindinger Præstationsprøvninger KONKLUSION ANALYSEKVALITETSSIKRING REFERENCER...12 Bilag Chromatogram af standard K Bilag Chromatogrammer af forskellige prøvetyper Bilag Standardkurve Bilag Validering af analyse TS-NEO Neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer ved HPLC Bilag Metode TS-NEO Neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer ved HPLC

4

5 Sammendrag Med henblik på fremtidig kontrol og overvågning af indholdet for sødestoffet neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer var det nødvendigt at indkøre og validere en HPLC metode. Til det formål skulle en foreløbig metode, som blev startet op af IFEE (ref. 1), tilpasses og indkøres. Metoden blev ændret og optimeret på flere punkter og herefter indkørt og valideret ved hjælp af et udvalg på 9 repræsentative prøvetyper. 1 INDLEDNING Fødevareregion København har i foråret/sommer 2004 indkørt en metode til analyse af sødestoffet neohesperidin dihydrochalcon for 9 repræsentative fødevaretyper. Grundlaget herfor var en HPLC metode, indkørt af IFEE. Metoden blev ændret og optimeret på flere punkter og herefter indkørt og valideret ved hjælp af et udvalg på 9 repræsentative prøve-typer. 2 PRØVEMATERIALE OG UNDERSØGTE STOFFER Prøverne er blevet indkøbt af laboratoriet i detailleddet foråret Ud fra en gennemgang af Positivlisten (ref. 2) blev repræsentative prøvetyper indenfor væsentlige grupper udvalgt. Tabel 2.1 viser en oversigt over de anvendte produkter. Tabel 2.1 Prøveoversigt Positivliste nr. Varetype Eksempler 1 Mælkeprodukter Yoghurt 3 Konsumis Vanille flødeis, 4 Frugter og grøntsager Hindbærmarmelade og chilisauce 5 Konfektureprodukter Mælkechokolade og lakridspastiller 7 Bagværk Vanillekranse 9 Fisk og fiskerivarer Marineret sild 14 Drikkevarer Sødet frugtsaft I alt 9 forskellige prøvetyper 5

6 3 ANALYSEMETODE 3.1 Indledning Metoden fra IFEE er blevet ændret og optimeret af følgende årsager: --- Metoden var kun blevet undersøgt på et meget begrænset udvalg af prøvetyper som yoghurt og marmelade, --- Dårlige genfindinger på prøvetyperne kunne indikere problemer med ekstraktionen, --- metodens analysetid formentlig p.g.a anvendelse af en kolonne med en lille diameter var uhensigtsmæssigt lang, hvilket medførte meget brede toppe, --- bølgelængdeangivelserne til en optimal analyse af Neohesperidin dihydrochalcon skulle justeres, --- der manglede en undersøgelse af de i den angivne bølgelængde typisk forekommende interfererende stoffer som sorbin- og benzoesyre samt parabenerne, de andre intense sødestoffer, coffein, theobromin og vanillin og deres placering i chromatogrammet, --- undersøgelsen af prøvetypernes baggrundsinterferenser var ikke tilstrækkelig belyst. 3.2 Krav til analysemetoden Der er 4 krav, som metoden som udgangspunkt bør kunne opfylde for, at blive en god rutinemetode: --- Neohesperidin dihydrochalcontoppen og de mulige interferenser som sorbin- og benzoesyre, methyl-, ethyl- og propylparaben, coffein, vanillin, theobromin samt de andre intense sødestoffer aspartam, acesulfam-k og saccharin samt nedbrydningsproduktet DKP (diketopiperazin fra aspartam) skal være adskilt tilfredsstillende og gerne således, at basislinien nås mellem hver top i den rene standardblanding. Interferenserne er retentionstidsmæssigt adskilt, der mangler dog en samlet chromato-grafering af alle stoffer, for at se hvor god adskillelsen er. --- Metoden bør i standardproceduren kunne dække hele koncentrationsniveauet, som man kan komme ud for, når positivlisten følges. En gennemgang af positivlisten viser, at maksimalgrænserne svinger fra 5 mg/kg som smagsforstærker i fedtemulsioner med mindre end 60 % fedt, positivlistenr til 400 mg/kg i kosttilskud, positivlistenr Metoden kan medtage koncentrationer på op til 960 mg/l(kg), så dette krav er også overholdt. Typisk ligger de fleste grænseværdier på mg(kg(l). --- Detektionsgrænsen bør som minimum være mindst 1/10 del af den grænseværdi, som skal kontrolleres. Ved udrystning med 60ºC varmt vand er detektionsgrænsen beregnet 6

7 til 0,5 mg/kg(l) og ved udrystning med 30 % acetonitril i vand opløsning er den beregnede detektionsgrænsen 2 mg/kg(l). For langt de fleste prøvetyper er dette krav også overholdt. --- Genfindingerne bør være høj, gerne over 85 %. Ved udrystning med begge ekstraktionsmidler svinger genfindingsprocenterne fra %, afhængig af den anvendte prøvetype. Det samme gælder den interfererende baggrund, som kan svinge fra 0 60 mg/kg, målt som Neohesperidin dihydrochalcon. Vælges udrystingmediet for de enkelte prøvetyper ud fra en lav interferensbaggrund i kombination med en høj genfindingsprocent, så ligger genfindingerne generelt over 75 % med baggrunds-interferens under 2 mg/kg(l), målt som Neohesperidin dihydrochalcon, hvilket er tilfredsstillende. Derudover skal metoden naturligvis overholde de krav, man almindeligvis stiller til akkrediterede metoder. 3.3 Analyseoptimering Kolonnevalg og eluentprogrammering Kolonnen fra IFEE s foreløbige metode (test 4) blev på grund af for brede toppe og lang analysetid i samråd med Waters erstattet med X Terra XP18, 3.5 µm, 4,6 x 100 mm. Anvendelse af eluentsammensætningen fra test 4, som angivet af Mørkhøj, giver en utilstrækkelig adskillelse af toppe. Neohesperidin dihydrochalcon og Vanillin som bliver tilsat til fødevarer coeluerer, 3-hydroxybenzoesyremethylester (som vi vil anvende som intern standard) og methylparaben coeluerer. Efter en forsøgsrække har følgende betingelser vist sig, at være de mest optimale: Opdeling af eluenten i 2 eluenter A: 0,5 % eddikesyre og B: 100 % acetonitril. Elueringen foretages isokratisk med 73 % A og 27 % B. Alle stoffer er på tilfredsstillende måde adskilt fra hinanden i en standardblanding, idet basislinien nås efter hver top. 3- hydroxybenzoesyremethylester coeluerer dog stadig med methylparaben. De få gange hvor der vil forekomme methylparabener i fødevaren kan kvantificeringen dog foretages med 3 hydroxybenzoesyre, som tilsættes til hver prøve eller ved ekstren standard beregning Bølgelængder til detektion IFEE s valg af bølgelængderne 200 nm til alitam og 240 nm til neohesperidin dihydrochalcon - til detektionen er ændret til andre bølgelængder. Alitamsignalet overdøves af støj fra eluenten ved 200 nm og neohesperidin dihydrochalcon har det absolut laveste respons ved 240 nm. Alitam kan om end med et meget lavt respons detekteres ved 220 nm og neohesperidin dihydrochalcon har 2 maksima ved 225 og 282 nm. 282 nm giver her det bedste resultat i forhold til støjniveauet og blev valgt. Vi vælger i denne indkøring ikke at gå videre med analyse for alitam, idet stoffet ikke kan detekteres på tilfredsstillende måde, ikke er anført i positivlisten og dermed ikke er genstand for analyse i det kommende projekt omfattende Neohesperidin dihydrochalcon og andre sødestoffer i fødevarer. 7

8 3.3.3 Homogenisering Som prøvehomogenisering og ekstraktion blev samme ekstraktionsprocedure som ved TM- 3091, kunstige sødestoffer m.m. i fødevarer valgt (homogenisering med 60 ºC varmt vand på ultra thurax). Ved indledende forsøg blev konstateret, at neohesperidin dihydrochalcon ikke blev nedbrudt ved ovennævnte procedure. Senere i indkøringsforløbet blev der på grund af lave genfindingsprocenter også undersøgt en alternativ ekstraktion med en 30 % acetonitril i vand opløsning ved stuetemperatur Baggrund Baggrundsinterferenser blev undersøgt for alle relevante prøvetyper for begge ekstraktionsmåder. Ved 60 ºC varmt vand ekstraktionen viser carrezfældningen med kaliumhexacyanoferrat(ii) opløsning efterfulgt af zinksulfatopløsning ingen effekt på chromatograferingsbaggrunden men formindsker ydermere neohesperidin dihydrochalconindholdet i standardprøver med 40 %, hvorfor denne oprensningsprocedure ikke kan anbefales. Interferende baggrundsstøj er med undtagelse af vanillekranse og hindbærmarmelade ikke eksisternede ved 60 ºC varmt vand ekstraktionen. Ved 30 % acetonitril ekstraktionen er baggrundsstøjen tilstede for næsten alle prøvetyper, fra 2 26 mg/kg(l), målt som neohesperi-din dihydrochalcon. Baggrundschromatogrammer kan ses i bilag Eluentens bufferkapacitet På grund af eluentsammensætningens lave bufferkapacitet blev det undersøgt om prøveekstrakternes ph værdi har nogen indflydelse på toparealerne for neohesperidin dihydrochalcon og den interne standard. Ved ph værdier over 7 blev kun arealet for neohesperidin dihydrochalcon formindsket med op til 9 %. Forsøg viser, at ph værdien på ekstrakterne fra de anvendte prøvetyper ligger på mellem 2,5 og 6 og det anses ikke sandsynligt, at fødevarer generelt opnår en ph over 7. Retentionstiderne på neohesperidin dihydrochalcon og den interne standard 3-hydroxybenzoesyremetylester varierer op til +/ %, hvilket formodes at kunne tilskrives eluentens lave bufferkapacitet. Variationen er dog acceptabel, set i lyset af, at der benyttes en intern standard Tyggegummi Undersøgelse af tyggegummiprøver blev ikke foretaget. 3.4 Analysevalidering Standardkurve Standardkurven er lineær i måleområdet fra 0,2 48 mg/l, svarende til mg/kg(l) i fødevaren med en korrelationskvotient på 0,9997 samt at kurven går gennem Kvantitativ detektionsgrænse Den kvantitative detektionsgrænse er beregnet efter en af de retningslinier, som er beskrevet i instruksen AIK-KS Validering af analysemetoder (ref. 3). De kvantitative detektions- 8

9 grænse med begge ekstraktionsprocedurer blev undersøgt i spikede yoghurt prøver og beregnet ud fra spredningen: DL = t 0,995 (f) s resultat, hvilket svarer til 4,3 s resultat. Detektionsgrænsen kunne beregnes til 0,5 mg/kg(l) for den varme vandige ekstraktion og 2 mg/kg(l) for 30 % acetonitril i vand ekstraktionen Spredning og dobbeltbestemmelser Variationer foretaget på standarderne 0,19, 1,9 og 47,5 mg/l samt dobbeltbestemmelser på 10 genfindingsforsøg med 60 ºC varmt vand ekstraktionen på niveauet 110 mg/kg ligger mellem 0,4 og 4,6 %, hvilket giver en acceptabel repetérbarhed Genfindinger Genfindinger blev lavet på alle prøvetyper, som blev undersøgt m.h.t. baggrundsinterferensen. Der blev foretaget 2 genfindingsforsøg for hver prøvetype for hver ekstraktionsmetode i et niveau på ca 100 mg/kg(l) i fødevaren. Ved 60 ºC varmt vand ekstraktionen svinger genfindingerne mellem %, i over halvdelen af prøverne er den under 85 %. Ved 30 % acetonitrilekstraktionen er genfindingerne generelt gode, fra %, i over halvdelen af prøverne over 95 %. Men her er interferensbaggrunden på niveau fra 2 26 mg/kg(l) beregnet som Neohesperidin dihydrochalcon generelt højere end ved 60 ºC varmt vand ekstraktionen. Tabel 3 viser en oversigt over genfindingsprocenter og baggrundsinterferenser for de 2 ektraktionsmetoder. På alle prøvetyper er foretaget 2 genfindingsforsøg; resultatgennemsnittet er angivet i tabellen. 9

10 Tabel 3 Genfindinger i % og baggrund for alle prøvetyper ved 2 ekstraktionsmetoder. Prøve nr. Prøvetype 60 ºC varmt vand Baggrund C mg/kg(l) 30 % acetonitril Baggrund C mg/kg(l) Maks. gr.værdi 9213 Blandet saft 104 % 0 95 % 1, Marineret sild 47 % 0 99 % Yoghurt m pære/ban 79 % 0 93 % Flødeis 80 % % 5, Vanillekranse 76 % % 2, Hindbærmarmelade 63 % A % 1, Chilisovs 90 % % 3, Ren lakrids pastiller 67 % B 0 84 % Chokolade, mørk % 6,6 0 Gns. alle prøvetyper 76 % 98 % A 69 og 46 % B 45 og 93 % C Beregnet som Neohesperidin dihydrochalcon Ud fra Tabel 3 kan kombinationen for højest genfinding og lavest baggrundsinterferens findes for de enkelte prøvetyper: Prøvetype 60 ºC varmt vand 30 % acetonitril Blandet saft X Marineret sild X Yoghurt m pære/ban X Flødeis X Vanillekranse X Hindbærmarmelade X Chilisovs X Ren lakrids pastiller X Chokolade, mørk X 1 1 Foreløbig er 30 % acetonitril i vand ekstraktionen at foretrække. Fremtidige genfindingsforsøg med 60 ºC varmt vand ekstraktionen bør dog foretages Præstationsprøvninger Der er endnu ikke set foretaget nogen præstationsprøvninger for Neohesperidin dihydrochalcon fra såvel FAPAS og CHECK 10

11 4 KONKLUSION Den fra IFEE modtagne metodeindkøring danner grundlag for denne metodeindkøring, optimering og validering. Enkelte punkter som interferenser fra såvel prøvetypebaggrund fra andre tilsætningstoffer og genfindingsproblematikkerne skulle undersøges nærmere, idet de ikke var belyst tilstrækkeligt i IFEE metoden. Den nuværende metode er egnet til analyse af neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer. Med hensyn til valget af ekstraktionsmetode, så afhænger denne af prøvetypen. Nedenstående tabel viser hvilke ektraktionsmidler der for de nævnte typiske prøvetyper giver både en acceptabel genfinding - over 80 % - samt en lav baggrundsstøj - under 2 mg/kg(l): Prøvetype 60 ºC vand (2.2.1) Prøvetype 30% acetonitril (2.2.2) Læskedrikke X Fiskeprodukter X Mælkeprodukter X Småkager X Flødeis X marmelade m.m. X Saucer m.m. X Chokolade X Lakrids X Der er en betydeligt retentionstidsvariation på alle stoffer omkring +/ %. Årsagen til det formodes at være eluentens manglende bufferkapacitet. Der kan med fordel fremover foretages yderligere metodeudvikling på følgende punkter: --- En bedre ekstraktion. --- En anden eluentsammensætning med høj bufferværdi. --- Afprøvning af metoden på tyggegummiprøver. 2 ekstraktionsmetoder anvendes i metoden: 60ºC varmt vand ekstraktion og ekstraktion med 30 % acetonitril i vand. Valget af ekstraktionsmetode afhænger af den prøvetype, som skal undersøges. 5 ANALYSEKVALITETSSIKRING Analysen gennemgår de samme kvalitetssikringskrav m.h.t. kontrolkort for genfindinger og dobbeltbestemmelser som gælder for akkrediterede analyser. 11

12 6 REFERENCER 1. Rapport fra Fødevaredirektoratet, december 2002, institut for fødevareundersøgelser og ernæring, afdelingen for ernæring: Udvikling og validering af HPLC metode til bestemmelse af sødestofferne neohesperidin dihydrochalcon og alitam i fødevarer, udført af Niels Fabricius i samarbejde med Jytte Børup. 2. Fortegnelse over tilsætningsstoffer til fødevarer, Positivlisten. Veterinær- og Fødevaredirektoratet; august AIK-KS Validering af analysemtoder. 12

13 Chromatogram af standard K-1 Bilag 1 13

14 Chromatogrammer af forskellige prøvetyper Bilag 2 Marineret sild: 14

15 Yoghurt med pære/banan: Vanillekranse: 15

16 Lakrids pastiller: 16

17 Standardkurve Bilag 3 17

18 Bilag 4 Validering af analyse TS-NEO Neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer ved HPLC. 18

19 19

20 20

21 Metode TS-NEO Neohesperidin dihydrochalcon i fødevarer ved HPLC. Bilag 5 21

22 22

23 23

24 24

25 25

26 26

27 27

28 28

29 29

30 30

31 31

32 32