Citat Det synes altid umuligt, indtil det er gjort. Professionsbachelorprojekt

Transkript

1 1

2 Citat Det synes altid umuligt, indtil det er gjort. NELSON MANDELA Professionsbachelorprojekt Titel : Gordon and Sweets overfor CD271 ved farvning af retikulære fibre Engelsk : Staining for reticular fibers with Gordon and Sweets or CD271 Billede forside Kilde: Taget på KPN af John Valentin (sølvsalt for retikulære fibre) Udarbejdet af John Valentin Projektperiode: til Tegn uden mellemrum: K-vejleder: Janne Marlene Jensen. PDF Klinisk underviser, Klinisk Editor Patologi Næstved I-vejleder: Adjunkt Merete Rasmussen. Underviser University Collage Sjælland. 2

3 Resume/Abstrakt I forbindelse med udredningen af Myeloid Fibrose udføres sølvsalt farvning for retikulære fibre. Metoden er svær reproducerbar. I 1993 blev der i tidsskriftet Blood præsenteret en teknik til påvisning af retikulære fibre i knoglemarven ved immunhistokemisk påvisning med CD271(1). Formål Hvis det er muligt at lave en dobbelt farvning med sølvsalt metoden og med antistoffet CD271, ville det være muligt at implementere CD271 i stedet for metoden med sølvsalt. Sølv udfælder langs med de retikulære fibre. Den immunhistokemiske metode med CD271 bruges med et detektionssystem fra DAKO, EnVision Flex, hvor antistoffet er konjugeret med HRP. Dette giver en brun farveudfældning, som er svær at skelne fra sølvet. Sølv udfældningen kan ikke ændres, men et antistof konjugeret med alkalisk phosphatase kan med Warp Red fremkaldes til et højrødt produkt(2,3). Materiale og Metode I tre cristabiopsier blev der lavet sølvfarvninger for retikulære fibre efter Gordon & Sweet sølvsaltmetode og Immunhistokemisk påvisning med CD271 og et AP visualiseringssystem. Det undersøges om der er trin i de to visualiserings metoder som giver problemer overfor hinanden. Resultater Når Gordon & Sweet blev lavet først, kunne antistoffet CD271 ikke reagere med vævet. Når den immunhistokemiske metode blev lavet først, blev produktet vasket væk i oxidationstrinnet. Konklusion Der blev ikke fundet en metode som gjorde det muligt at lave en dobbeltfarvning med Sølvsalt og CD271. Oxidationstrinnet antages at ændre proteinernes struktur i en sådan grad, at det antistof, som vi bruger i dag, ikke kan hæfte til epitoperne. 3

4 Forord Først en tak til mine medstuderende Line Hydén Hansen og Morten de Voss Nielsen, som jeg har udført dette projekt sammen med. Det har gennem hele projektet været en fornøjelse at arbejde sammen med de to. Line med en notat blok og pen parat så vi ikke glemte noget og Morten med sin skarpe evne til at se detaljen og et altid blomstrende sprog. Projektet er udført på Klinisk Patologi på Næstved Sygehus, region Sjælland, Sygehus Syd. Jeg vil derfor gerne takke hele afdelingen for al den kaffe, det har krævet at holde os kørende, der har altid været et smil på læben, selv om vi har optaget en del plads i laboratoriet. Det har også altid været muligt at få hjælp, hvis det har været nødvendig, og det har det. Derudover vil jeg specielt gerne takke histo-teamet og immun-teamet, uden hvis hjælp det ikke var blevet det samme projekt. En stor tak til vores K-vejleder Janne Marlene Jensen og I-vejleder: Merete Rasmusen, som begge i alt er gået udover, hvad der kan forventes af en god vejleder, både med deres tid og tålmodige guidning, hvorved de har hjulpet os frem til et resultat, vi kan være stolte af. 4

5 Indholdsfortegnelse Citat... 2 Resume/Abstrakt... 3 Formål... 3 Materiale og Metode... 3 Resultater... 3 Konklusion... 3 Forord... 4 Indholdsfortegnelse... 5 Introduktion... 8 Myelofibrose med G&S... 8 Retikulære fibre... 9 De tropocollagene fibre dannes flere steder To metoder til påvisning af retikulære fibre De to sølvionmetoder: Gomori og G&S Den immunhistokemiske metode To metoder til demaskering Blokering af endogen enzymaktivitet Det primære antistof CD Detektionssystemer: Fremkalder Afgrænsning Problembaggrund Problemformulering Metodiske overvejelser PDF Indledende forsøg... Editor 16 5

6 Efterfølgende forsøg Kontroller og neg-kontrol Materiale og Metode Materiale Indledende forsøg Gomori Gordon & Sweets: Immunhistokemi: Fortsættende forsøg: Gordon & Sweets Delforsøg A: G&S med efterfølgende demaskering Delforsøg B: Demaskering med efterfølgende G&S Immunhistokemi Delforsøg C: Hvilken demaskering for Hi-Def? Kombinationer Delforsøg D: Kombination af G&S og Hi-Def Delforsøg E: Identificering af fejlkilde Resultater Gordon & Sweets VS. Gomori Hi-Def VS Flex + Mouse Fortsættende forsøg Diskussion Har ændringerne i protokollerne noget at sige? Gomori og Gordon & Sweet Oxidationstrinnet PDF Antistoffet i dag og dengang Editor

7 Reagerer CD271 med retikulære fibre? TPK 300 nm lang og fibriller med en diameter på 30 nm Vævspræparation 1993 og i dag? NGFR er udtrykt mange steder Konklusion Perspektivering Et andet antistoffe Et elektronmikroskop Litteraturliste Bilag Bilag A. Litteraturliste inkl. evidensvurdering af litteratur Bilag B. Bekræftelse for udfærdigelsen af den skriftlige besvarelse

8 Introduktion I den anden måned efter undfangelsen begynder de første knogler at dannes, i den sidste halvdel af føtallivet er knoglemarven det vigtigste hæmopoietiske væv og det vil det være resten af livet. Når knoglemarven bliver syg bliver hele kroppen syg. Antallet af lidelser som har deres udspring i knoglemarvens myeloide væv er mange. Myelofibrose (MF), polycytæmia vera, kronisk myeloid leukæmi og essentiel trombocytose er alle såkaldt kronisk myeloproliferative sygdomme. Disse sygdomme er karakteriseret ved forøget dannelse (proliferation) af celler i knoglemarven. Ved myelofibrose, som er den mest sjældne af de nævnte sygdomme med ca. 50 tilfælde om året i DK, typisk hos voksne over 70 år, begynder knoglemarven at øge dannelsen af bindevæv(4,5,6). Patienten skal henvises til hæmatologisk udredning ved mistanke om kronisk myeloproliferativ sygdom af typen primær myelofibrose. Sundhedsstyrelsens pakkeforløb foreskriver at patienten er diagnostisk afklaret indenfor 10 hverdage(6,7). Myelofibrose med G&S Diagnosen Myelofibrose stilles blandt andet ved at undersøge knoglemarven for øget bindevævs dannelse, der laves en såkaldt cristabiopsi. I alle tilfælde med MF kan den øgede bindevævsdannelse påvises med en sølvsaltmetode som Gomori eller Gordon & Sweets. Der er dog det problem med denne metode, at den er svær reproducerbar. Derfor er man altid nysgerrig, når der viser sig en mulighed for at påvise disse bindevævs fibre med en anden metode(5). I 1993 blev der i en artikel publiceret i Blood udgivet af the American Society of Hematology under overskriften Bone marrow stroma in humans: anti-nerve growth factor receptor antibodies selectively stain reticular celles in vivo and in vitro. Denne artikel mente, at det var muligt at påvise retikulære fibre med CD271(NGFR). I artiklen beskrev man en metode, hvor man farvede retikulære fibre i knoglemarven ved at lave en Immunhistokemisk farvning med CD271, i kombination med en Gomori sølvsaltmetode(1) 8

9 Retikulære fibre Når man undersøger for MF er det de retikulære fibre i knoglemarven, der kikkes på. Malignitetsgraden afgøres ud fra mængde af retikulære fibre i forhold til en normal tilstand, der er mf1, mf2 og mf3 som beskrives ud fra en sølvfarvning af de retikulære fibre. De retikulære fibre adskiller sig væsentlig fra andre bindevævs fibre i deres opbygning. Som navnet siger, er der tale om spinkle fibre, som danner et fint net (latinsk: reticulum, små net). De retikulære fibre er hovedsagligt opbygget af Tropokollagen type III (TPK-III) men der er også tropokollagen type-i tilstede i det retikulære væv. Tropokollagen type I, type II og type III udgør 80 til 90 % af alt kollagen i legemet og kaldes derfor også de klassiske fibrildannende kollagener. De retikulære fibre ser ud til at være sammensat af nogle få mikrofibriller, som har samme sammensætning, som man ser i de kollagene fibre. Grundstrukturen i alle Tropokollagen fibre er en triplehelix, som dannes ved tre α-kollagenkæder binder til hinanden(4,8,9) PDF Figur 1 I cellen syntetiseres prokollagen kæden Editor som danner en tripel-helix. Extracellulæret fraspaltes endepeptiderne og tropokollagen danner tværbindinger(polymerisering) og der dannes kollagenfibriller(10) 9

10 Disse α-kollagenkæder er lange proteinkæder, hvor hver tredje aminosyre i hver α- kæde er glycin. Glycin kommer til at danne centrum i den triplehelixstruktur, som ses i fibrillær kollagen, da det er det mindste protein i kæden. Prolin er ikke lige så hyppigt forekommende i tropokollagen som glycin (23%),men ses ofte i sekvenser med Gly- Pro-X, hvor X er en tilfældig aminosyre. Prolin optræder også som hydroxyprolin, da de i det Endoplasmatisk Retikulum (ER) gennemgår en hydroxylering, hvorved antallet af hydrogenbindinger i mellem de tre α-kæder forøges, hvilket er med til at stabilisere den yderligere. Det er i ER at selve pro-kollagenet dannes. De tre α-kæder bindes sammen, så de får lighed med et reb. I hver ende af α-kæderne sidder der en peptidkæde, som hindrer at de mange pro-kollagener, som er på vej ud af cellen, begynder at binde sig sammen på vejen ud af cellen. Når pro-kollagenet er ude af cellen, i det extracellulære rum, fraspaltes disse peptider ved hjælp af enzymet prokollagen-peptidase.(4,8,9,11,12) Tropokollagen molekylerne polymeriserer til fibriller ved tværbinding til andre tropokollagener ved hydrogenbindinger og kovalente bindinger, baseret på oxidering af lysinsidekæder. OH grupper er vigtige i forbindelse med påvisningen af retikulære fibre ved sølvsaltmetoder som Gomori eller Gordon and Sweets. PAS farvningen bruger også disse OH grupper. Normalt beskrives sølvsaltmetoden i forbindelse med de argyrofile fibre. Tropokollagen type III, som farves med sølvsaltmetoden, har en matrix omkring fibrene, som har et stort indhold af proteoglykaner, hvor indholdet af hydroxy grupper kan oxideres. Figur 2. de tropokollagen fibre er omgivet af en matrix af proteoglykaner 10

11 De tropocollagene fibre dannes flere steder Når man ser på Tropocollagene fibre er det naturligt at spørge, hvor dannes disse fibre henne? Og spørgsmålet er godt, for der er flere celler involveret og så alligevel ikke. Helt tilbage ved undfangelsen begynder denne proces af væv. Ca. 16 dage efter undfangelsen findes der i mesodermen relativt udifferentierede celler, som betegnes mesenchymale celler. Det er de celler, som syntetiserer den ekstracellulær matrix til at begynde med, senere differentierer de til fibroblaster, som så overtager produktionen af f.eks. tropokollagen samt mange andre, af de proteiner, der findes i den ekstracellulære matrix. En anden celle, som minder om fibroblaster, er reticulumceller, som det antages er en anden form af den samme celle. De findes i det lymfoide væv og organer, hvor disse stjerneformede celler er en central del af det net, som de retikulære fibre danner. De står for dannelsen af de tropokolagener, som i det ekstracelulære rum danner disse retikulære fibre. Der menes at være en pulje af de mesenchymale celler også efter fødslen, de er mindre end fibroblasterne, men ligner dem meget, og de kan være svære at skelne fra hinanden(4,8,9,11,12). To metoder til påvisning af retikulære fibre Til påvisning af retikulære fibre i udredningen af MF er det Gordon & Sweet sølvsaltmetoder, der bruges på KPN i dag. I artiklen fra 1993 præsenteres der to metoder til påvisning af retikulære fibre, en histokemisk, Gomori som også er en sølvsaltmetode og en immunhistokemisk metode, hvor der bruges et antistof rettet mod CD271 (NGFR)(1,2,13,14). De to sølvionmetoder: Gomori og G&S I udredningen af MF udtager man en knoglemarvsprøve, som man fikserer i NBF, hvorefter den fremføres til paraffin. Vævet skæres på en slædemikrotom i snit af 1-3 μm. Vævet rehydreres, så det er muligt at lave farvningen. Det første trin i Sølvfarvningen er at oxidere de nabostillede OH-grupper i glycoproteinernes hexoser til aldehyder. I G&S og Gomori bruger man Kaliumpermangant (KMnO 4 ) som oxidationsmiddel (to forskellige koncentrationer). Ved reaktionen reduceres permanganat til mangandio- xid/brunsten(mno 2 ). Vævssnittet bliver brunligt. Derefter skal brunstenudfældningerne fjernes. Dette gøres ved reduktion med oxalsyre (HOOC-COOH) i G&S og med kaliummetabisulfit i Gomori. Så skal der ske en sensibilisering af vævet, så det er mere 11

12 modtageligt for sølv. Dette gøres med Jernalun. Her bruges der også to forskellige koncentrationer ved G&S og Gomori. Herefter kommer vævet ned i sølvbadet. Reaktionerne skal ske i en basisk opløsning. Så det er vigtigt at sølvionerne er kompleksbundet, for ikke at sølvet udfælder som Ag 2 O. Dette sikres ved at sølv-opløsningen tilsættes ammoniakvand og en stærk base natriumhydroxid (NaOH). Der laves en titrering for G&S og en dobbelt titrering i Gomori. I den basiske opløsning reducerer aldehydgruppen Sølvdiamin-ionen Ag(NH 3 ) + 2 til metallisk sølv, og aldehyd oxideres samtidigt til carboxylsyre. Mængden af frit sølv, som lejrer sig langs fibrene, er ikke synlige i et lysmikroskop, da mængden ikke er stor nok. Heldigvis sker der en binding af Ag(NH 3 ) + 2 der har en høj affinitet over for det frie sølv og negativt ladede vævskomponenter med høj ph (ca. ph 10). Disse Sølvdiaminioner fremkaldes i en formaldehyd-opløsning. Formaldehyden reducerer sølvdiaminionerne til frit sølv, som lejrer sig på fibrene i forbindelse med det sølv, som allerede er udfældet. Mængden af frit sølv gør, at det nu kan ses i et lysmikroskop. For at hindre baggrundsfarvning afsluttes der med en Natriumthiosulfatopløsning, som fjerner overskuddet af ionbundet sølv og sølvkomplekser. I Gomori og G&S anbefales det at der laves en toning med guldchlorid. Især dobbelt titreringen giver en stor mængde udfældet sølv. Toning med guldchlorid gør komplexet mindre, der udskiftes 3 Ag atomer ud med 1 Au atom. Dette trin kan udelades som det gøres på KPN (1,2,13,14,15). Den immunhistokemiske metode Immunhistokemiske analyser er en helt anden metode, som tager udgangspunkt i de antigener, som findes på overfladen af celler og væv. Ved hjælp af antistoffer, som er rettet mod de enkelte antigener, kan deres tilstedeværelse påvises i vævet. Epitoperne, som antigenet er rettet mod, er protein strukturer, som er karakteristisk for de enkelte celler eller vævs komponenter. Dette gør det mugligt at fastslå, om en celle eller vævskomponent er tilstede et bestemt sted, hvis antistoffet hæfter sig fast på prøvematerialet. Det er det samme væv, der bruges ved den histokemiske analyse, som bruges ved immunhistokemiske analyse, det vil sige, at vævet er fikseret i NBF og indstøbt i paraffin, så der skal ske en afparaffinering og hydrering sted, inden farvningen kan PDF påbegyndes. Da vævet er fiksret Editor med NBF er der også et stort antal formalinbindinger, som skal fjernes inden det er muligt at få antistoffet til at reagere med epitoperne i 12

13 vævet. Formalin bindingerne spærrer så at sige epitoperne inde. Der skal finde en demaskering af epitoperne sted. Vævet skal gøres mere permeable(2,3,) To metoder til demaskering Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) er en varme baseret demaskering af epitoper. Selv om mekanismen bag teknikken ikke fuldt ud kendes, menes det, at man kan fjerne nogle af de formaldehydinducerede tværbindinger (methenbroer), som dannes ved fiksering i NBF. Derved gøres de immunaktive igen. Brugen af proteolytiske enzymer til at åbne vævet op, bygger på det faktum, at enzymerne klipper huller eller fordøjer dele af proteinkæderne i vævet. For proteolyse med enzymer som Proteinase K er det fremherskende spaltningssted peptidbindinger, som støder op til carboxylgrupper. Der er dog det problem, at inkubationstiden er stærkt afhængig af fikseringstiden i NBF. Disse er forholdsvise proportionale med hinanden. Hvis der sker en enzym påvirkning af vævet for længe, kan det gå ud over morfologien(2,3) Blokering af endogen enzymaktivitet Det kan til tider være nødvendigt, at blokere for, at antistofkomplekset reagerer med vævs proteiner andre steder end der, hvor epitoperne, som antistoffet er rettet mod sidder. Det kan ske ved svage uspecifikke bindinger. Hvis der i detektions systemet som f.eks. i Envision FLEX, som bruges på KPN, er et antistof konjugeret med HRP, som visualiseres med DAB, skal der blokeres for endogen peroxidaseaktivitet. Peroxidase er naturligt forekommende i granulocytter, monocytter og makrofager og erythrocytter har en indogen aktivitet, der minder om peroxidase, pseudo-peoxidase aktivitet. Blokeringen sker ved at udsætte vævet for brintperoxid og derved forbruge peroxidasen. Hvis der bruges alkalisk phosphatase, er det ikke lige så stort et problem, da der ikke er lige så mange pseudo-phophataser i vævet. Samtidig har det vist sig, at væv som er fikseret i NBF blokerer for den endogene alkaliske phosphatase(2,3) Det primære antistof CD 271 I artiklen fra Blood er det spændende, at det trækkes frem, at det med CD271 (NGFR) er muligt at påvise retikulære fibre. Normalt bruges den, som det også fremgår af navnet Nerve Growth Factor Receptor (NGFR) til påvisning af nerveceller, astrocytter og schwannske celler, som alle er en del af nervesystemet(1,3,16,17) 13

14 Detektionssystemer: Det er ikke muligt, at se antistoffet, når det reagerer med antigenet, så det er nødvendigt med et detektionssystem. Der findes flere typer af detektionssystemer. Den letteste og mest enkle måde er at bruge et antistof, som er direkte konjugeret med et enzym eller et fluorokrom. Men dette er ikke særligt sensitivt. Denne metode omtales som en direkte teknik. Der findes også indirekte teknikker både 2 og 3 lags teknikker. Disse teknikker har et eller to trin, som skal være med til at gøre farvekomplekset større for hver enkelt epitop. Der hæftes et nyt antistof, som er rettet mod det primære antistofs epitoper, på det primære antistof. På den måde amplificeres komplekset. Der kan også bruges et tredje antistof. Fælles for alle metoderne er, at der bruges et antistof som er konjugeret med enten et fluorokrom eller et enzym (eks. EnVision Flex eller Hi Def). Det er ofte det sidste antistof, der er konjugeret med et enzym som f.eks. Horse Radish Peroxidase (HRP) eller Alkalisk Phosphatase (AP). Det er dog stadig ikke muligt, at se komplekserne. Der skal finde en fremkaldelse af enzymerne sted(1,3). Fremkalder Figur 3 A. APAAP-teknik og B. PAP-teknik. De enzymer som er hæftet til antistoffet det være sig både i den direkte og indirekte metode, er i sig selv usynlige, men kan synliggøres ved forskellige histokemiske metoder. Inden for immunhistokemien er horse radish peroxidase (HRP) den fortrukne enzymlabel. Den kan fremkaldes ved brug af brintperoxid som substrat, og så skal der bruges et kromogen, et af de foretrukkende er 3,3 -Diaminobenzidin (DAB). Med et antistof konjugeret med AP kan der bruges en fremkaller som Warp Red som bygger på Alkalisk Phosphatase Anti Alkalisk Phosphatase (APAAP)(1,3,18). 14

15 Afgrænsning I dag er Gordon & Sweet en golden standard for farvningen af retikulære fibre. Når man i artiklen fra Blood vælger at bruge Gomori, er det to teknikker, der ligger tæt op af hinanden. I artiklen fra 1993 laves der en farvning med Gomori og efterfølgende en immunhistokemisk farvning med APAAP(1). I dag på KPN udføres der immunhistokemisk farvning hvor der bruges både HRP og AP, f.eks. når der skal lave dobbelt bestemmelse med to antistoffer. Der forlægger validerede forskrifter for begge metoder på KPN(19). I artiklen i Blood blev der brugt et antistof CD271. Dette findes på afdelingen under navner NGFR og kan bruges både med HRP og AP. I 1993 fandt man, at der var sammenfald i påvisningen af retikulære fibre med CD271 og Gomori på det samme væv(1). Problembaggrund I udredninger af Myeloid Fibrose bruges der i dag på KPN en retikulinfarvning, som er en modificeret Gordon and Sweets(G&S) sølvsaltmetode. Denne metode er svær reproducerbar og kan variere meget fra den ene bioanalytiker til den anden, selv om man bruger den samme protokol. Hvis det er muligt at påvise de samme fibre, som man kan med G&S, ved brug af den immunhistokemiske metode med CD271. Metoden ville kunne implementeres, så den kunne køres automatisk på de maskiner, der er på afdelingen. Automatisering medfører ens udførelse hver gang. Det ville ud fra et patientmæssigt synspunkt give en mere præcis diagnose. Det vil betyde færre analyser, som skal laves om. De retikulære fibre er ca nm og et snit med mikrotomen er ca. 3-5 μm, så der kan ligge ca. 100 fibre oven på hinanden. Af den grund vil det ikke være muligt at lave to snit, som viser det samme retikulære netværk. I artiklen fra Blood blev der anvendt en metode, hvor en sølvsaltmetode viste sammen fald med det produkt som fremkom ved den IHC metode, hvor man brugte antistoffet CD271 og et detekterings system, som byggede på en AP. Det er dog ikke muligt at verificere dette, hvis det ikke er muligt at påvise begge reaktioner på samme snit. 15

16 Problemformulering For mesenchymale celler i knoglemarv med tilstanden myelofibrose: I hvilken grad er der sammenfald mellem reaktionen for retikulære fibre med hhv. sølvsaltmetoderne (Gordon and Sweets og/eller Gomori) og immunhistokemisk farvning for CD271. Vil den immunhistokemiske farvning kunne erstatte og/eller supplere sølvsaltreaktionerne? Metodiske overvejelser I artiklen i Blood fremhæves det at det er muligt at få sammenfald mellem sølvsaltmetoden og påvisning af retikulære fibre ved AP med CD271. I artiklen bruges der Gomori s sølvsaltmetode, på KPN bruges der i dag Gordon & Sweets. Metoden er en golden standard og kan derfor danne grundlag for implementeringen af en anden metode til påvisning af retikulære fibre. Indledende forsøg For at kunne vurdere Gordon og Sweets over for Gomori, er det nødvendigt at afprøve de to metoder over for hinanden. Det behøver ikke at være knoglemarv som bruges. Tonsil og Lever indeholder retikulære fibre, som der næsten dagligt laves sølvfarvning for på afdelingen. Kriterierne for egnethed skal vurderes ud fra den diagnostiske egnethed og ud fra hvilke metoder, der er en del af den daglige rutine, da det gerne skulle være muligt at implementere de fundne resultater. Efterfølgende forsøg De efterfølgende forsøg vil blive udført på cristabiopsier. For at kunne sammenligne sølvfarvningen med den Immunhistokemiske metode vil det vær nødvendigt at finde et visualiserings system som ikke kan forveksles med den sort-brune farve i sølvfarvningen. Warp Red til IHC blev valgt. Den er allerede valideret og en del af den daglige rutine. Christabiopsierne vil blive udvalgt fra en elektronisk journal. Vævet fra cristabiopsierne skal udvælges efter malignitets graderne MF1, MF2 og MF3 fra patienter som er færdig udredt og der skal udtaget ca. 1/3 så der stadig ville være væv til yderlig udredning hvis det skule være nødvendig. Hvert af de udskårede vævsstykker blev beskrevet efter malignitets graden, yderligere patient henfør bare data blev ikke medtaget. 16

17 En række delforsøg vil blive lavet for at teste hvorvidt sølvsaltmetoden kan kombineres med demaskering enden med enzym eller HIER som er nødvendig, forud for IHC, efter som der bruges formalin fikseret væv. Til vurdering af farvningen af snittene vil et scorings system blive lavet. Kontroller og neg-kontrol For at sikker kvalitet af de forsøg der bliver lavet, laves der kontrol at reaktionen. Til alle glas hvor der blev lavet G&S blev der lavet positive kontroller, indeholdende retikulære fibre, for at sikre at reaktionen med de retikulære fibre var tilfredsstillende. Med IHC laves der både negative og positive kontroller. De negative kontroller, hvor man f.eks. udelader det primære antistof, sikrer at der ikke sker uspecifik binding. Den positive kontrol er kendt væv hvor en reaktion må forventes for antistoffet. 17

18 Materiale og Metode Materiale Alt benyttet væv var fikseret i neutral phosphatbufferet formaldehyd (NBF) og fremført i KPN Vakuum Infiltrator Processor fra Sakura. Vævsnittene blev skåret på mikrotom, med en snittykkelse på ca. 2-3 µm. Efterfølgende blev snittene afparaffineret i henhold til afdelingens rutine. De indledende forsøg med sammenligning af sølvsaltsmetoderne og IHC foregik på forbehandlet mikroskopiglas, Dako flex IHC microscope slides (k8020) med snit fra multiblok indeholdende væv fra tarm, lever, nyre og tonsil. Vævet var af ældre dato, med en ukendt fikseringstid og ikke længere tilknyttet patienter eller afdelingens system. Efter metodesammenligningerne blev de mest hensigtsmæssige metoder udvalgt til det videre arbejde med de fortsættende forsøg. Der blev benyttet forbehandlet mikroskopi glas med væv fra multiblok med tre forskellige cristabiopsier henholdsvis fra MF stadie 1, 2 og 3. Endvidere var glasset påført otte andre vævstyper; Hjerne, spytkirtel, pancreas, nyre, binyre, tonsil, appendix og lever, i et kontrolsnit navngivet QCB1, valideret til IHC på KPN. Biopsierne var fra 2012 og blev udvalgt gennem elektroniske journaler på baggrund af de tre stadier af MF. Indledende forsøg Gomori Ved Gomori blev alle reagenser fremstillet fra bunden i henhold til forsøgsvejledningen i Theory and Practice of Histological Techniques (kilde: (Bancroft J.D., Stevens A. Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, Fourth edition, 1996, kapitel 7. Det drejede sig om 1 % kaliumpermanganat, 2 % kaliumdisulfit, 2 % jernalun, dobbelt titreret sølvopløsning, 4 % formalin og 0,2 % guldklorid. Vejledningen blev også brugt som protokol på nær kontrastfarvning, hvor kernechtrot fra G&S blev brugt. To glas #A #B blev lavet nøjagtigt efter vejledningen. Yderligere tre glas blev farvet med modifikationerne: Et #C blev behandlet med dobbelt tid i reduktionsmidlet ka- 18

19 liumdisulfit. Et #D glas hvor første reduktionstrin med kaliumdisulfit blev erstattet med oxalsyre og et #E glas, hvor begge trin med kaliumdisulfit blev erstattet med oxalsyre.. Indledende forsøg med Gomori Behandling/glas #A #B #C #D #E Kaliumpermanganat 2 min 2 min 2 min 2 min 2 min Kaliumdisulfit 1 min 1 min 2 min - - Oxalsyre min 1 min Jernalun 2 min 2 min 2 min 2 min 2 min Sølvopløsning 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Formalin 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min Guldklorid 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min Kaliummetabisulfit 1 min 1 min 1 min 1 min - Oxalsyre min Natriumthiosulfat 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Kernechtrot 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Tabel 1; Indledende forsøg med Gomori, udført på multiblok indeholdende lever, tarm, nyre og tonsil. Modifikationer er skrevet med sort, det som er fælles er med gråt og kontroller er markeret med rødt Gordon & Sweets: Ved G&S farvninger blev der taget udgangspunkt i KPN modificerede udgave. (Kilde( De fremstillede reagenser var 0,5 % kaliumpermanganat, 1 % oxalsyre, 2,5 % jernalun, enkelt titreret sølvopløsning, 10 % formalin, 2,5 % natriumthiosulfat og kernechtrot. Der blev lavet fem snit til sammenligning med Gomori. To kontroller #F og #G nøjagtig efter forsøgsvejledningen. To glas #H #I med sølvopløsningen fra Gomori forsøgsrækken og 1 glas #J med guldtoning fra samme. 19

20 Indledende forsøg med G&S Behandling/glas #F #G #H #I #J Kaliumpermanganat 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min Oxalsyre 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Jernalun 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min Sølvopløsning G&S 30 sek 30 sek sek Sølvopløsning Gomori sek 30 sek - Formalin 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Gulklorid min Natriumthiosulfat 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min Kernechtrot 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Tabel 2; Indledende forsøg med G&S, udført på multiblok indeholdende lever, tarm, nyre og tonsil. Modifikationer er skrevet med sort, det som er fælles er med gråt og kontroller er markeret med rødt. Immunhistokemi: Med henblik på at finde den mest egnede kombinationsmulighed til sølvsaltsmetoderne, blev de to detektionssystemer Flex-Mouse og Hi-Def sammenstillet mikroskopisk. Ved de indledende immunhistokemiske farvninger foregik demaskering på Dako PT- Link, ved programmet Low ( i buffer TRS LOW ph fra Dako (Lot: 89536). Protokollen, Næstved Flex + mouse HRP ( var i forvejen valideret for CD271 på laboratoriets maskine, Dako Autostainer Link 48, og blev således benyttet til det første præparat. De reagenser, der blev fremstillet til maskinen, alle fra Dako, til Flex + Mouse; Endogen blokering(ev Flex Peroxidase-blocking, Lot: 82633), primært antistof CD271 (klon MRQ21, Lot: B, fra Cell Marque)(17), sekundært antistof (FLEX + Mouse Linker, Lot: ), konjugeret antistof (Envision FLEX/HRP, Lot: 81921), fremkalder (FLEX DAB, Lot: og kontrastfarvning (Envision FLEX Hæmatoxylin). Til Hi-def(KILDE) blev fremstillet følgende reagenser fra Dako; 20

21 Primært antistof CD 271 (klon MRQ21, Lot: B), sekundært antistof (HiDef Amplifier, Lot: P), konjugeret antistof (HiDef Alk Phos Polymer Detector, Lot: B), fremkalder (Warp Red Chromogen, Lot: ) Indledende forsøg med IHC Behandling/glas Flex Mouse Hi-Def HIER 20 min - Proteolyse - 4 min Primært antistof 30 min 30 min Sekundært antistof 20 min 10 min Alkalisk fosfatase - 10 min Peroxidase 30 min - Fremkalder 10 min 20 min Kontrast 1 min 1 min Tabel 3; Oversigt over indledende forsøg med sammenligning af to immunhistokemiske protokoller (Flex Mouse og Hi-Def) til visualisering af retikulære fibre. Testet på multiblok indeholdende væv fra tarm, lever, nyre og tonsil. De vævssnit der er medtaget, blev farvet med de fire metoder Gomori, G&S, Flex+Mouse og Hi-Def hvorefter de blev sammenlignet mikroskopisk. Opløsningerne på mikroskopet var henholdsvis 10X10 og 40X10. primært 40X10 for at kunne vurdere cellemorfologi detaljeret. Fortsættende forsøg: En række delforsøg blev efterfølgende udført. Der blev foretaget justeringer efter parametrenes ønskede kriterier, før de fortsættende forsøg med cristabiopsier skulle udføres: Til G&S blev der fremstillet nye reagenser fra bunden. Ved IHC blev visualiseringssystemet ændret fra Flex-Mouse til Hi-Def(Kilde: D4 protokol) Demaskeringen blev ændret fra HIER til proteolytisk med enzymet prote- 21

22 inase K fra Dako i henhold til protokollen på KPN (Kilde: D4 protokol), bortset fra enkelte præparater, #4, #13, #6 og #14, hvor HIER blev genovervejet. Gordon & Sweets Delforsøg A: G&S med efterfølgende demaskering Med henblik på at undersøge hvorvidt demaskering efter en G&S vil påvirke visualiseringen af retikulære fibre, blev fem glas først farvet G&S efter forskriften på KPN. Derefter blev der lavet demaskeringsforsøg, hvor glas #1, #2 og #3 fik proteolytisk demaskering i henholdsvis to, fire og seks minutter. Glas #4 og #6 fik HIER ved lav ph mens glas #5 ingen demaskering fik. Tabel 4; Oversigt over kombinationsforsøg med G & S med efterfølgende demaskeringsbehandlinger til visualisering af retikulære fibre, testet på multiblok indeholdende cristabiopsier samt kontrolvæv. Parametre, som ikke varierer, er skrevet med gråt og kontrol er markeret med rødt. Delforsøg A Behandling/glas #1 #2 #3 #4 #5 #6 Kaliumpermanganat 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min Oxalsyre 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Jernalun 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min Sølvopløsning 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Formalin 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Natriumthiosulfat 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min Kernechtrot 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min HIER LOW - LOW Proteolyse 2 min 4 min 6 min

23 Delforsøg B: Demaskering med efterfølgende G&S For at teste, hvordan et indledende demaskeringstrin påvirker en efterfølgende G & S farvning blev følgende forsøg udført: #10, #11 og #12 fik først proteolyse i to, fire og seks minutter og derefter G&S rutine. #7, #8 og #9 blev udført som kontroller, hvor #7 fik en normal kontrastfarvning med kernechtrot, #8 fik Mayer som kontrastfarvning, og #9 fik ingen kontrastfarvning. Delforsøg B Behandling/glas #7 #8 #9 #10 #11 #12 Proteolyse min 4 min 6 min Kaliumpermanganat 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min Oxalsyre 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Jernalun 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min Sølvopløsning 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Formalin 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Natriumthiosulfat 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min Kernechtrot 1 min min 1 min 1 min Mayer - 1 min Tabel 5; Oversigt over forsøg til test af forskellige proteolysemetoder påvirker en efterfølgende G & S farvning af retikulære fibre, testet på cristabiopsier og kontrolvæv, Parametre, som ikke varierer, er skrevet med gråt og kontrollerne er markeret med rødt. 23

24 Immunhistokemi Delforsøg C: Hvilken demaskering for Hi-Def? For at kunne afgøre, hvilken demaskeringstype og -tid, der er mest velegnet ved en efterfølgende IHC farvning på Hi-Def, blev følgende test udført: Der blev først udført en positiv kontrol for Hi-Def #14 med tilhørende negativ kontrol #13. Der blev på tre glas #15, #17 og #19, med tilhørende negative kontroller #16, #18 og #20, udført proteolytisk demaskering, i henholdsvis to, fire og seks minutter, samt farvet med Hi-Def. To glas #21 og #22 fik ingen demaskering men kun Hi-Def, #21 var en negativ kontrol. Delforsøg C Behandling/glas #13 #14 #15 #16 #17 #18 #19 #20 #21 #22 HIER LOW LOW Proteolyse min 2 min 4 min 4 min 6 min 6 min - - Primært antistof - 30 min 30 min - 30 min - 30 min min Sekundært antistof 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min Alkalisk fosfatase 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min Fremkalder 20 min 20 min 20 min 20 min 20 min 20 min 20 min 20 min 20 min 20 min Mayer 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Tabel 6; Oversigt over forsøg til test af optimal demaskeringsmetoder- og tid til efterfølgende Hi-Def-visualisering af retikulære fibre, testet på cristabiopsier og kontrolvæv. Parametre, som ikke varierer, er skrevet med gråt og kontrollerne er markeret med rødt. 24

25 Kombinationer Delforsøg D: Kombination af G&S og Hi-Def Metoderne blev nu forsøgt inkorporeret på fælles præparater. I de forskellige kombinationer blev der ikke udført kontrastfarvninger, bortset fra glas #25. Proteolytisk demaskering blev ved hvert præparat fire minutter. #23 og #24 fik først demaskering, så Hi-Def med en efterfølgende G&S. #24 som negativ Hi-Def kontrol. #25, #26 og #27 blev farvet med G&S. #27 forblev positiv kontrol af G&S, hvor #25 og #26 blev behandlet med proteolyse og farvet med Hi-Def. #26 som negativ Hi-Def kontrol. Delforsøg D Behandling/glas #23 #24 #25 #26 #27 Proteolyse 4 min 4 min 4 min 4 min X Kaliumpermanganat 3 min 3 min 3 min 3 min 3 min Oxalsyre 1 min 1 min 1 min 1 min 1 min Jernalun 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min Sølvopløsning 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Formalin 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Natriumthiosulfat 5 min 5 min 5 min 5 min 5 min Primært antistof 30 min X 30 min X X Sekundært antistof 10 min 10 min 10 min 10 min X Alkalisk fosfatase 10 min 10 min 10 min 10 min X Fremkalder 20 min 20 min 20 min 20 min X Mayer X 1 min X 1 min X Tabel 7; oversigt over forsøg til kombination af Hi-Def og G&S med proteolytisk forbehandling. Testet på multiblok med cristabiopsier og kontrolmateriale. Parametre, som ikke varierer, er skrevet med gråt og kontrollerne er markeret med rødt. Delforsøg E: Identificering af fejlkilde Endelig blev der udført forsøg for at finde årsagen til den mislykkede kombination af metoderne Hi-Def og G&S. 25

26 #32 blev udført som endelig positiv kontrol af G&S før de sidste fire kombinationsglas; #28, #29, #30 og #31. #28 blev først behandlet med et minut i oxalsyre, og efterfølgende demaskeret og farvet med Hi-Def. #29 fik de to første trin af G&S, kaliumpermanganat og oxalsyre. Derefter demaskering og Hi-def. Til sidst blev glasset behandlet med de resterende trin i G&S. #30 fik først G&S uden oxalsyre og derefter demaskering og Hi-Def. Ved #31 blev oxalsyre erstattet af kaliumdisulfit fra Gomori, men eller rutine G&S, med efterfølgende demaskering og Hi-Def. Delforsøg E Behandling/glas #28 #29 #30 #31 #32 Proteolyse 4 min 4 min 4 min 4 min X Kaliumpermangant X 3 min 3 min X 3 min Kaliumdisulfit X X X 1 min X Oxalsyre 1 min 1 min X X 1 min Jernalun X 15 min 15 min 15 min 15 min Sølvopløsning X 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Formalin X 30 sek 30 sek 30 sek 30 sek Natriumthiosulfat X 5 min 5 min 5 min 5 min Primært antistof 30 min 30 min 30 min 30 min X Sekundært antistof 10 min 10 min 10 min 10 min X Alkalisk fosfatase 10 min 10 min 10 min 10 min X Fremkalder 20 min 20 min 20 min 20 min X Mayer X X X X X Tabel 8; Oversigt over afsluttende forsøg, med formål at finde metode delen der umuliggør kombinationen. Testet på multiblok med cristabiopsier og kontrolmateriale. Parametre, som ikke varierer, er skrevet med gråt og kontrollerne er markeret med rødt. 26

27 Resultater Gordon & Sweets VS. Gomori De første indledende forsøg illustrerede forskellen på Gomori og G&S. Ved gomori ses uspecifik baggrundsfarvning. Begge metoder har farvet retikulære fibre. Figur 4; Glas #A. Gomori. Lever 40X10 Figur 5; Glas #F. G&S. Lever 40X10 27

28 Hi-Def VS Flex + Mouse Det konkluderes at CD271 ikke er positiv for alle retikulære fibre, dog for tonsil. Hi-Def bliver rød, og Flex + Mouse bliver brun. Figur 3; Glas Hi-Def. Tonsil 40X10 Figur 4; Glas Flex + Mouse. Tonsil 40X10 28

29 Fortsættende forsøg Præparaterne vil blive vurderet i et gradueringssystem, bestående af karakterne 0, + og ++. O er defineret som decideret negativ reaktion, eller fuldstændigt utilstrækkeligt billede mikroskopisk, med udfældning, korn og/eller uspecifik farvning. + er udtryk for en ufuldstændig reaktion, som ikke er tilfredsstillende til diagnostisk brug. ++ gives til præparater, der er tilsvarende G&S' golden standard eller som minimum diagnostisk egnet. Bemærk at negativ kontroller bør få 0 som graduering. Figur 6; Eksempler på henholdsvis graduering 0, + og ++. G&S udført på cristabiopsi. Fra venstre ses #4, #23 og #32. Delforsøg A: G&S med efterfølgende demaskering Glas nummer Modifikation Graduering #1 G&S med efterfølgende proteolyse i 2 min. ++ #2 G&S med efterfølgende proteolyse i 4 min. ++ #3 G&S med efterfølgende proteolyse i 6 min. ++ #4 G&S med efterfølgende HIER low ph + #5 G&S kontrol ++ #6 G&S med efterfølgende HIER low ph + Tabel 9; Resultat for delforsøg A med gradueringer. Kontrol er markeret med rød. 29

30 Delforsøg B: Demaskering med efterfølgende G&S Glas nummer Modifikation Graduering #7 G&S kontrol ++ #8 G&S kontrol + Mayer + #9 G&S kontrol kontrast ++ #10 Proteolyse i 2 min med efterfølgende G&S ++ #11 Proteolyse i 4 min med efterfølgende G&S ++ #12 Proteolyse i 6 min med efterfølgende G&S ++ Tabel 10; Resultat for delforsøg B med gradueringer. Kontroller er markeret med rød. Delforsøg C: Hvilken demaskering for Hi-Def Graduering Glas nummer Modifikation IHC MF #13 Negativ kontrol Hi-Def 0 0 #14 Positiv kontrol Hi-Def ++ + #15 Proteolyse 2 min efterfølgende Hi-Def ++ + #16 Negativ kontrol Proteolyse 2 min efterfølgende Hi-Def 0 0 #17 Proteolyse 4 min efterfølgende Hi-Def ++ + #18 Negativ kontrol Proteolyse 4 min efterfølgende Hi-Def 0 0 #19 Proteolyse 6 min efterfølgende Hi-Def ++ + #20 Negativ kontrol Proteolyse 6 min efterfølgende Hi-Def 0 0 #21 Negativ kontrol ingen demaskering + Hi-Def 0 0 #22 Ingen demaskering + Hi-Def + + Tabel 11; Resultat for delforsøg C med gradueringer af den IHC reaktion og MF udtryk. Kontroller er markeret med rød. 30

31 Delforsøg D: Kombination af G&S og Hi-Def Graduering Glas nummer Modifikation G&S IHC #23 Proteolyse 4 min + Hi-Def + G&S + 0 #24 Proteolyse 4 min + Hi-Def negativ kontrol + G&S ++ 0 #25 G&S + proteolyse 4 min + Hi-Def ++ 0 #26 G&S +proteolyse 4 min + Hi.def negativ kontrol ++ 0 #27 G&S kontrol ++ 0 Tabel 12; Resultat for delforsøg D med gradueringer. Kontroller er markeret med rød. Delforsøg E: Identificering af fejl kilde Graduering Glas nummer Modificering G&S IHC #28 Oxalsyre + proteolyse 4 min + Hi-Def 0 + #29 KPM + oxalsyre + 4 min proteolyse + Hi-Def + rest G&S + 0 #30 G&S oxalsyre + proteolyse 4 min+ Hi-Def + 0 #31 KPM + kaliumdisulfit + G&S + proteolyse 4 min + Hi-Def ++ 0 #32 G&S kontrol ++ 0 Tabel 13; Resultat for delforsøg E med gradueringer. Kontrol er markeret med rød. 31

32 Diskussion Eftersom disse resultater ikke viser sammenfald mellem sølvfarvningen og den immunhistokemiske farvning med CD271, rejser der sig nogle spørgsmål. Det var ikke muligt at eftergøre det, som var beskrevet i artiklen, som blev publiceret i Blood i Har ændringerne i protokollerne noget at sige? Gomori og Gordon & Sweet Det blev forsøgt at tilpasse forsøget til de rutiner, som man bruger til daglig på KPN. Deraf kom beslutningen om at bruge Gordon & Sweet i stedet for at bruge Gomori. Selve resultatet af de to sølvfarvninger viste en kraftig overfarvning ved brugen af Gomori. Dette kan selvfølgelig skyldes flere faktorer, men især sølvfarvningens svære reproducerbarhed kan være en af årsagerne til at Gomori blev så kraftig. Toningen med guld i Gomori vidner om, at det må forventes, at der vil være en overfarvning. Måske ville yderligere toning kunne afhjælpe denne overfarvning. Der er dog intet, der taler for, at der skulle komme et andet resultat af den IHC farvning med Gomori, da teknikken er den samme som G&S. For sikre at reduktions midlet, som der bruges i Gomori ikke ville give et andet udtryk blev der lavet en analyse af dette. Ved at udskifte kaliumpermanganat med kaliumdisulfit. Om Titrering eller dobbelt titrering er at fortrække, er det svært at bedømme, men dette kunne også være en årsag til det kraftige udtryk i Gomori, da der bliver en væsentlig større mængde Sølvdiamin-ioner (Ag(NH 3 ) + 2 tilstede, og derfor er det også nødvendigt med denne toning med guldchlorid(1). Oxidationstrinnet I delforsøg E blev oxidationstrinnet på #28 ikke udført. Dette gav en positiv reaktion for HiDef alkalisk phosphatase, hvilket vi ikke har set i nogle af de andre delforsøg, hvor oxidation med enten Kaliumpermangant eller Kaliumdisulfit er blevet udført. Derudfra blev det konkluderet, at det var oxidationstrinnet i G&S, som var årsagen, til at det ikke ville lykkedes at påvise de retikulære fibre i vævet med CD271. Dette oxidationstrin foretages også i Gomori med Kaliumdisulfit. Oxidation af snittet kan, som det ses i delforsøg E #28, ikke udelades, da udfældningen af sølv ikke ses. 32

33 Der kan være flere grunde til at oxidationstrinnet medfører et manglende udtryk i de IHC resultater. Når man oxiderer vævet, er det alle OH grupper, der oxideres, hvis det er muligt at få oxidationmidlet ind og reagere. Dette gælder også de OH grupper, som findes i proteinerne, det vil sige både i epitoperne, i antistofferne, i detektionssystemerne og kromogenerne. Som følge heraf kan der være mange grunde til at oxidationen gør det svært for antistoffet at reagere med vævet eller fjerner det fra de steder, det har reageret. Antistoffet i dag og dengang De antistoffer som de gjorde brug af (Me20.4, Me8211) var fra to kloner, som ikke var til rådighed på KPN, hvor der i dag bruges et antistof fra en klon MRQ21. NGFR har været et kendt antistof i mange år. Klon Me20.4, som stadig er på markedet i dag kan, som det var tilfældet med mange af de tidligere antistoffer, tænkes ikke at være så specifik, som de antistoffer, der findes på markedet i dag. Dette giver en mulighed for, at antistoffet måske stadig kan reagere med epitoperne, selv om der er sket en mindre forandring i konstellationen af proteinet. Det antistof, som vi har til rådighed i dag, er lavet på en klon (MRQ21), der er forskellig fra dem, der var til rådighed i 1993 og retter sig sandsynligvis mod epitoper, der har en anden proteinstruktur, som måske på samme måde kan være mere følsomme over for oxidation, og heraf kan det tænkes, at antistoffer og epitoperne mister evnen til at danne et immunhistokemisk komplex. Både MRQ21, som blev brugt her, og Me20.4 og Me8211 er alle antistoffer med en lav affinitet over for NGFR. Det kunne måske tænkes, at et antistof med høj affinitet ville bevare bindingen, og det derved ville være muligt at opbygge et kompleks, som kunne afprøves sammen med en sølvfarvning(25,33). En anden epitop, som ikke er så følsom overfor oxidation, kunne også afprøves. Der blev prøvet med oxidation både før og efter den IHC behandling. Selv om vi fik en reaktion med CD271, blev produktet fjernet når det blev udsat for oxidationstrinnet. Så måske har oxidationstrinnet også en påvirkning på selve detektionssystemet. Reagerer CD271 med retikulære fibre? Det er tydeligt at se på #15 at der med den immunhistokemiske metode med CD271 kommer en reaktion. Det ser ud til at produktet lejrer sig så det absolut godt kunne PDF være retikulære fibre. Editor 33

34 Men da vi ikke kan få en immunhistokemisk reaktion og en sølvfarvning til at reagere på samme vævssnit, kan vi ikke se om der er sammenfald. Det ser dog ud til at der sker en reaktion i matriksen omkring cellerne. Reaktion skulle være tydelig i området omkring fibroblasterne, da det ofte er i Figur 7 #15 Crista MF3 CD271 med AP 410 celle membranen at man ser den immunhistokemiske reaktion. I den immunhistokemiske protokol, som der er brugt her, indgår der et primært antistof, en linker og et konjugeret antistof. Da det er et forholdsvist stort komplex, som ikke er så specifikt i sit udtryk med hensyn til, hvor antistoffet reagerer. TPK 300 nm lang og fibriller med en diameter på 30 nm I nogle tilfælde hvor det ikke er muligt at lave en dobbelt farvning på et vævssnit, kan man lave to snit, som er fortløbende og derved få udtrykt den samme celle på to glas. Kunne man bruge den samme metode i denne undersøgelse? Hvis man gjorde det ville man se den samme morfologi i snittet. Men kan det bruges? Når man laver et vævssnit på ca 3-5 μm gennem en celle på ca. 15 μm kan den samme celle godt fanges i to på hinanden følgende vævssnit. Når der i den extracellulære matriks syntisseres retikulære fibre, er det til forskel fra de kollagene fibre og de elastiske fibre kun meget få eller nogen gange kun enkelte mikrofibriller, med en diameter på ca. 30 nm, som danner dette net, som de retikulære fibre består af. Dette betyder, at der i et vævssnit skåret på en mikrotom på ca. 3 μm, vil det i næste snit være et PDF Figur 8 antigenpåvisning af collagen type I og III helt andet billede man ser, og de Editor 34

35 snit vil ikke kunne sammenlignes. På den anden side, hvis det var muligt at bruge et elektronmikroskop, der kan forstørre op til gange, ville det være muligt at se de steder, som antistoffet reagerer med(20). Vævspræparation 1993 og i dag? I artiklen fra 1993 har man brugt to typer af snit, der blev brugt frysesnit og formalinfikseret snit. Det er i dag meget sjældent, at man gør brug at frysesnit, da morfologien ikke er god, der opstår mange artefakter, som kan vanskeliggøre diagnosticeringen. Men det kunne have været interessant at lave frysesnit, da det ikke ville være nødvendigt at lave forbehandling af vævet for at fjerne de formalinbindinger, som der er i det væv, som er fikseret med NBF. Men oxidationstrinnet ville stadig være der. Derfor opstår den næste tanke. NGFR er udtrykt mange steder NGFR kan, blandt andet sammen med CD34, bruges til at påvise Mesenchymale stamceller i knoglemarven. Det er interessant, da disse celler er med i dannelsen af retikulære fibre i tiden umiddelbart efter undfangelsen. Dertil kommer også det interessante aspekt, at man er inde på, at netop disse celler, som befinder sig i en hvilende tilstand, måske i forbindelse med MF bliver aktive igen og begynder at producere retikulære fibre. Hvis mesenchymale stamceller udtrykker NGFR, er der en stor sandsynlighed for at fibroblaster som mesenchymale celler differentierer til, også udtrykker det samme antigen. Det samme gør sig gældende for mange af de celler, der findes i knoglemarven. Så kan vi spørge, om det er cellerne, der udtrykker NGFR eller om det er matrixen omkring de retikulære fibre, eller om det er de retikulære celler selv(22,23,26). Vi kan ikke uden at se et sammenfald mellem Sølvfarvningen og den immunhistokemiske farvning bruge resultatet fra den immunhistokemiske farvning, som et udtryk for de retikulære fibre. Det er ikke fuldt ud defineret, hvorfor vi får en reaktion i tilknytning til de retikulære fibre, når vi laver en sølvfarvning, men noget tyder på at det er indholdet af OH grupper i hydroxyprolinerne, som er med til at øge sølvets affinitet over for den matrix, som omgiver de retikulære fibre. 35

36 Konklusion Det blev meget tidligt i forløbet tydeligt, at der var dele af de to metoder, som ikke var forenelige. Udfordringen var at lokalisere disse parametre og måske finde et alternativ, som kunne muliggøre en dobbelt farvning. Det viste sig, at det var oxidationstrinnet i sølvsaltmetoden, der var årsag til at de to metoder ikke var forenelige, og selv om der blev anvendt oxidationsmidler af en anden karakter, var det ikke muligt at forene de to metoder. Det lader til at oxidationstrinnet deformerer epitoperne, som CD271 er rettet imod i en sådan grad, at det ikke er muligt for antistoffet at fæstne sig, og det ser også ud til at vedhæftningen ikke er så stærk, at den kan tåle en efterfølgende oxidation. Perspektivering Et andet antistoffe På antibodies-online.com kan der købes et Monoclonal antistof (MC3-HA) som er rettet mod Collagen Type III, hvor epitoperne sidder på alpha 1 kæden. Det fremgår dog, af databladet, at det ikke er velegnet på formalinfikseret væv. Der er dog andre antistoffer, som kan bruges til at påvise TPcollagen type III, men disse er rettet mod de to peptidkæder, som fraspaltes inden de collagenefibre kan kædes sammen, så disse antistoffer er mere rettet mod de celler som danner retikulære fibre og det TPcollagen, som befinder sig i cellernes ER og golgi. På findes der også antistoffer rettet mod TPkollagen type III, som ikke er så følsom over for formalinfikseret væv. Der er åbnet op for, at det måske ville være muligt at finde et andet antistof, som ikke var så påvirket af oxidationstrinnet, eller som havde så stærke bindinger til de epitoper, det bandt til, at det ikke ville være muligt at løsne dem fra fibrene ved oxidation(27,28,29,30,31,). En af de parameter, som i særliggrad adskiller sig fra det der blev gjort i 1993 og i dag er, at der blev brugt et antistof CD271 fra forskellige kloner. Det der blev brugt i 1993 var sikkert ikke så sensitivt, som det vi bruger i dag. Antistoffernes sensitivitet er en af de ting der, i de seneste år, er blevet udviklet på for at undgå at skulle bruge serum i den immunhistokemiske metode. 36

37 Et elektronmikroskop Hvis man havde et elektronmikroskop til rådighed og man derved kunne se de retikulære fibre og man samtidig udvalgte et antistof som reagerer med de retikulære fibre. Samtidig skulle et detektionssystem, som det var muligt at se i et elektronmikroskop bruges. Der skulle bruges et detektionssystem, hvor farvning ikke lavede et komplex som lå langt fra epitoperne. Med dette ville det være muligt at påvise de antistoffer som reagerer med de retikulære fibre. Derved ville man være ude over problematikken med at skulle have sammenfald med en sølvfarvning(33). Et elektronmikroskop er en anselig investering på omkring ½ til 1 milion kr., men det ville ikke være nødvendig at gøre brug af i den daglige rutine, hvis vi kunne sikre at reaktionsproduktet var specifikt for kollagen I og III eller for de retikulære fibre. En påvisning med et antigen ville give en reproducerbar påvisning af de retikulære fibre og måske en mulighed for at fastslå, hvorfra de retikulære fibre stammer fra. Dette ville hjælpe lægerne i forbindelse med at stille diagnosen, da det ville give en ide om malignitetsgraden, hvis man vidste, om det var reticulumceller eller mesenchymale stamceller, som var årsagen til produktionen af retikulære fibre, ville det være muligt at afgøre om der var tale om en begyndende Myeloid Fibrose. Hvis det kunne påvises, at det var de mesenchymale stamceller, der var årsagen til myeloid fibrose, ville det måske være muligt at stille diagnosen på et tidligere tidspunkt. Og det fører os frem til det vigtigste: nemlig af det ville komme patienten til gavn at blive udredt på et tidligere tidspunkt i sit sygdomsforløb. 37

38 Litteraturliste 1. Giorgio Cattoretti, Raffaella Schiró, et al. Bone Marrow Stroma in Humans: Anti-Nerve Growth Factor Receptor Antibodies Selectively Stain Reticular Cells In Vivo and In Vitro, Blood Vol 81, No 7 (April), American Society of Hematology. 2. Hallager K., Jelsbak V., Meyer T, Farvning af celler og væv. Noter.Juni 2010/3. udgave. VIA University College Bioanalytikeruddannelsen. Århus N 3. Mogens Vyberg. Anvendt Immunhistokemi, Academic books, Bioanalytikeruddannelsen og Odontologisk Boghandel, København Histologi på molekylærbiologisk grundlag. Finn Geneser, 1. udgave, 9 oplag 2010 Munksgaard Danmark 5. Den 13. december ling/myelofibrose.htm 6. Den 13. december. 7. Den 13. december 2013http:// 8. Poul Vagn Jensen, Poul Prentø. Cellebiologi-cellens organisation og livsprocesser, 2.reviderede udgave, Gads Forlag Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, The Cell-A Mulecular Approach,Fifth Edition, 2009, The American Society for Microbiology. 10. Den 30. december 2013http:// 11. Vibeke Diness Borup, Biokemi,2010 FADL s Forlag København. 12. K.Gelse,E.Pöschl,T.Aigner, Collagens-structure,function and biosynthesis, 2003 Advanced Drug Delivery Reviewa 55 s Hans Lyon, Poul Prentø, Kompendium I Kemiske og Biokemiske Analyseprincipper, 2008 Odontologisk Boghandel København. 14. John D. Bancroft, Alan Stevens, Theory and Practice of Histological techniques", 1996 Churchill Livingstone. 15. J.K. Kiernan, Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice 4 th Edition, Scion Publishing Ltd. 2008,. Department of anatomy and Cell Biology, The University of Western Ontario. 16. M-L. Rogerds,A. Beare, H. Zola, R.A.Rush, CD271 (P75 Neurotrophin Receptor), 2008 Journal of Biological & Homeostatic agents, vol 22 no.1,1-6(2008) 17. Pular Garun Chesa, et al. Immunohistochemica l Analysis of Nerve Growth Factor Receptor Expression in Normaland Malignant Human Tissues, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 1988 Vol.36.No.4.pp Den 30. december 2013http://biocare.net/wp-content/uploads/WR806.pdf 19. Den 13 december 2013http://d4.regsj.intern/d4doc/formularer/formshow.asp?FormID= Raul Fleischmajer, et al. Dermal Collagen Fibrils Are Hubrids of Type I and Type III Collagen Molecules, Journal of Structural Biology Luigi Aloe,MariaLuisa Rocco,Patrizia Bianchi and LuigiManni, Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use. Journal of Translational Medicine 2012,10:239, Muzlifah A. Haniffa, et al. Mesenchymal stem cells: The fibroblasts new clothes?, Haematologica Marie-Caroline Le Bousse-Kerdiles, Primary myelofibrosis and the bad seeds in bad soil concept Fibrogensis & Tissue Rapair 24. Bruce A. Ponder and Maureen M. Wilkinson, Inhibition of Endogenous Tissue Alkaline Phosphatase with the Use of Alkaline Phosphatase Conjugates in Immunohistochemistry, institute ofcancer Research. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Inc.Vol. 29, No. 8, pp , 1981 Received for publication October 30, 1980 and in revised form February 27, 1981; accepted February 28, 1981 (TN ) 25. PhD Keith M. Meek, et al. Immunolocalization of Elastin, Collagen Type I and Type III, Fibronectin, and Vitronectin in Extracellular Matrix Components of Normal and Myxomatous Mitral Heart Valve Chordae Tendineae Saeed Akhtar, Cardiovascular Pathology Volume 8, Issue 4, July August 1999, Pages Nadia Quirici, Cinzia Scavullo, Laura de Girolamo, Silvia Lopa, Elena Arrigoni, Giorgio Lambertenghi Deliliers, and Anna T. Brini. Anti-L-NGFR and -CD34 Monoclonal Antibodies Identify Multipotent Mesenchymal Stem Cells in Human Adipose Tissue; Stem Cells and Development. June Den 26. december 2013http:// den

39 28. Nerve Growth Factor Receptor (NGFR) (MRQ-21) - CMC , Cell Mark data blad. 29. Den 30.december 2013http:// 30. Den 13. december 2013http:// Collagen+Type+III+COL3+Chain+alpha+1/ 31. Den 26. december 2013http:// 32. Den http:// 33. Raul Fleischmajer, E. Douglas MacDonald Jerome S. Perlish, Robert E. Burgeson, Larry W. Fisher, Dermal collagen fibrils are hybrids of type I and type III collagen molecules, Journal of Structural Biology Volume 105, Issues 1 3, October December 1990, Pages

40 Litteraturliste - Analyseskema til oversigt over brugen af referencer/ressourcer i et læringsforløb med et skriftligt produkt. Navn: John Valentin Studienummer: Bn10s011@ucsj.dk Modul: Modul 14 Produktionsår: 2014 Titel: Gordon and Sweets overfor CD271 ved farvning af retikulære fibre Problemformulering: For mesenchymale celler i knoglemarv med tilstanden myelofibrose: I hvilken grad er der sammenfald mellem reaktionen for retikulære fibre med hhv. sølvsaltmetoderne (Gordon and Sweets og/eller Gomori) og immunhistokemisk farvning for CD271. Vil den immunhistokemiske farvning kunne erstatte og/eller supplere sølvsalt-reaktionerne? Reference Bemærkninger Videnskab og forskning, på dansk, peer-reviewed Videnskab og forskning, ikke-dansk, peer-reviewed Lærebog Faglig artikel, ikke peerreviewed Debat- og populærartikel Andet (skriv hvad) Giorgio Cattoretti, Raffaella Schiró, et al. Bone Marrow Stroma in Humans: Anti-Nerve Growth Factor Receptor Antibodies Selectively Stain Reticular Cells In Vivo and In Vitro, Blood Vol 81, No 7 (April), American Society of Hematology. x Hallager K., Jelsbak V., Meyer T, Farvning af celler og væv. Noter.Juni 2010/3. udgave. VIA University College Bioanalytikeruddannelsen. Århus N x Mogens Vyberg. Anvendt Immunhistokemi, Academic books, Bioanalytikeruddannelsen og Odontologisk Boghandel, København 2008 x Histologi på molekylærbiologisk grundlag. Finn Geneser, 1. udgave, 9 oplag 2010 Munksgaard Danmark Den 13. december Reference-kategorier: Kategori 1: Videnskab og forskning (peer-reviewed), på dansk; Kategori 2: Videnskab og forskning (peer-reviewed), andre sprog end dansk; Kategori 3: Lærebog; Kategori 4: Faglig artikel (ikke peer-reviewed artikler fx fra fagblade); Kategori 5: Debat- og populærartikel (holdningsprægede artikler (uden referencer), indlæg, avisartikler, radio- og tv-interviews, samtaler mv.) Kategori 6: Andet (under andet skrives, hvad dette er, eksempelvis film fra YouTube (faglig, debat el. lign. angives), analysevejledning, datasheet osv.) 40 x x

41 Reference Bemærkninger Den 13. december. X Den 13. december 2013http:// X Poul Vagn Jensen, Poul Prentø. Cellebiologi-cellens organisation og livsprocesser, 2.reviderede udgave, Gads Forlag 2003 Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, The Cell-A Mulecular Approach,Fifth Edition, 2009, The American Society for Microbiology. X X Den 30. december 2013http:// X Vibeke Diness Borup, Biokemi,2010 FADL s Forlag København. X K.Gelse,E.Pöschl,T.Aigner, Collagens-structure,function and biosynthesis, 2003 Advanced Drug Delivery Reviewa 55 s X Hans Lyon, Poul Prentø, Kompendium I Kemiske og Biokemiske Analyseprincipper, 2008 Odontologisk Boghandel København. John D. Bancroft, Alan Stevens, Theory and Practice of Histological techniques", 1996 Churchill Livingstone. J.K. Kiernan, Histological and Histochemical Methods, Theory and Practice 4 th Edition, Scion Publishing Ltd. 2008,. Department of anatomy and Cell Biology, The University of Western Ontario. X X X M-L. Rogerds,A. Beare, H. Zola, R.A.Rush, CD271 (P75 Neurotrophin Receptor), 2008 Journal of Biological & Homeostatic agents, vol 22 no.1,1-6(2008) Pular Garun Chesa, et al. Immunohistochemica l Analysis of Nerve Growth Factor Receptor Expression in Normaland Malignant Human Tissues, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 1988 Vol.36.No.4.pp X X X Data blad Den 30. december 2013http://biocare.net/wp-content/uploads/WR806.pdf X Data blad PDF Den 13 december 2013http://d4.regsj.intern/d4doc/formularer/formshow.asp?FormID= Editor X Raul Fleischmajer, et al. Dermal Collagen Fibrils Are Hubrids of Type I and Type III Collagen Molecules, Journal of Structural Biology 1990 X Luigi Aloe,MariaLuisa Rocco,Patrizia Bianchi and LuigiManni, Nerve growth factor: from the early discoveries the potential clinical use. Journal of Translational Medicine 2012,10:239, X Muzlifah A. Haniffa, et al. Mesenchymal stem cells: The fibroblasts new clothes?, Haematologica

42 Reference Bemærkninger Marie-Caroline Le Bousse-Kerdiles, Primary myelofibrosis and the bad seeds in bad soil concept Fibrogensis & Tissue Rapair X Bruce A. Ponder and Maureen M. Wilkinson, Inhibition of Endogenous Tissue Alkaline Phosphatase with the Use of Alkaline Phosphatase Conjugates in Immunohistochemistry, institute ofcancer Research. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Inc.Vol. 29, No. 8, pp , 1981 Received for publication October 30, 1980 and in revised form February 27, 1981; accepted February 28, 1981 (TN ) PhD Keith M. Meek, et al. Immunolocalization of Elastin, Collagen Type I and Type III, Fibronectin, and Vitronectin in Extracellular Matrix Components of Normal and Myxomatous Mitral Heart Valve Chordae Tendineae Saeed Akhtar, Cardiovascular Pathology Volume 8, Issue 4, July August 1999, Pages Nadia Quirici, Cinzia Scavullo, Laura de Girolamo, Silvia Lopa, Elena Arrigoni, Giorgio Lambertenghi Deliliers, and Anna T. Brini. Anti-L-NGFR and -CD34 Monoclonal Antibodies Identify Multipotent Mesenchymal Stem Cells in Human Adipose Tissue; Stem Cells and Development. June X X X Den 26. december 2013http:// den X Data blad Nerve Growth Factor Receptor (NGFR) (MRQ-21) - CMC , Cell Mark data blad. X Data blad Den 30.december 2013http:// X Data blad Den 13. december 2013http:// X Data blad Den 26. december 2013http:// X Data blad Den http:// X Data blad Raul Fleischmajer, E. Douglas MacDonald Jerome S. Perlish, Robert E. Burgeson, Larry W. Fisher, Dermal collagen fibrils are hybrids of type I and type III collagen molecules, Journal of Structural Biology Volume 105, Issues 1 3, October December 1990, Pages X 42

43 Bioanalytikeruddannelsen Næstved Bekræftelse for udfærdigelsen af den skriftlige besvarelse Eksaminandens navn: John Valentin Modulets nummer: Modul 14 Professionsbachelorprojekt Professionsbachelorprojektets titel (dansk): Gordon and Sweets overfor CD271 ved farvning af retikulære fibre Professionsbachelorprojektets titel (engelsk): Staining for reticular fibers with Gordon and Sweets or CD271 I henhold til Bekendtgørelse om prøver og eksamen i erhvervsrettede uddannelser BEK nr. 714 af 27. juli 2012, 18 stk. 6 skal eksaminanden ved aflevering af en skriftlig besvarelse med sin underskrift bekræfte, at besvarelsen er udfærdiget uden uretmæssig hjælp. Det underskrevne dokument afleveres sammen med den skriftlige besvarelse. Undertegnede bekræfter hermed, at ovennævnte besvarelse er udfærdiget uden uretmæssig hjælp Eksaminandens navn: Dato: Underskrift: 43

44 1