Kvalitetssikring af trombocytpools mht. AB0-systemets kliniske betydning

Kvalitetssikring af trombocytpools mht. AB0-systemets kliniske betydning Professionsbachelorprojekt 2012 Bioanalytikeruddannelsen VIA university college Produceret af Nanna Haahr Vorsaa (99906) I perioden 8/10 19/12 2012 K-vejleder: Margrethe Emilie Nielsen I-vejleder: Karen Koed Antal tegn: 51.949

Indhold 1. Forord... 3 2. Resume... 4 3. Introduktion... 5 3.1. Baggrund og formål... 5 3.2. Problemformulering... 6 3.3. Målformulering... 7 4. Teori... 8 4.1. Trombocytter... 8 4.2. Fremstilling af trombocytpool og udlevering... 9 4.2.1. Aferese trombocytter... 10 4.3. Kvalitetssikring af trombocytter... 10 4.4. ABO-systemet... 10 4.5. Transfusionskomplikationer... 12 4.6. Børn og blodvolume... 13 4.7. Antistof titer og graduering... 13 4.8. Glas- og gelmetoden... 14 5. Materialer og metoder... 16 5.1. Apperatur/utensilier... 16 5.2. Reagenser... 16 5.3. Fremgangsmåde ved fremstilling af A 1 testerytrocytter 1 % og 5 %... 16 5.4. Fremgangsmåde ved 1:50 fortyndingen i gelkort... 17 5.5. Fremgangsmåde ved titreringsrækken i gelkort... 17 5.6. Fremgangsmåde ved titreringsrække i glas... 18 5.7. Data behandling... 18 6. Resultater... 19 Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 1 af 33

6.1. Rådata... 19 6.2. kontroller... 19 6.3. Fortyndingen 1:50... 19 6.4. Titreringsrækken ved gel og glas teknikken... 20 7. Diskussion... 22 7.1. Kvalitetssikring og overholdes af Europarådets vejledning... 22 7.2. Forskellen mellem de to teknikker og metoder... 25 7.2.1. Fordele og ulemper ved de 2 metoder... 27 7.3. Transfusionskomplikationer og børn... 27 7.4. Aferese trombocytter vs. TRPs... 29 7.5. Kontroller... 29 7.6. Fejlkilder... 30 8. Konklusion... 31 9. Perspektivering... 31 10. Reference... 32 Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 2 af 33

1. Forord Dette projekt er opstået efter interessen for titerværdierne for anti-a i trombocytpools og disses indflydelse på komplikationer ved transfusioner til børn under 6 år. Projektet er produceret på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitets hospital, Skejby. Personalet i fraktionering skal have en stor tak for at ville tage prøvemateriale fra til os i perioden og Mikkel S. Petersen skal have stor tak for at finde statistikken omkring transfusion af trombocytpools til børn under 6 år til os. Også en stor tak til vejlederne, de har været en rigtig stor hjælp under hele projektet og rapportskrivningen. Det har været en stor hjælp at kunne snakke med jer om tanker og ideer. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 3 af 33

2. Resume Ifølge Europarådets anbefalinger, må der maksimalt være en titer på 1:50 for anti-a og anti-b i plasma. Dette er også gældende for trombocytpools (TRP) da disse er plasmaholdigte produkter. På nuværende tidspunkt undersøges der ikke for anti-a eller anti-b i TRPs, på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby. Der udleveres 0-TRPs til både børn og voksne med blodtype A eller B, selvom hovedreglen for børn er, at der skal udleveres TRPs efter barnet blodtype, hvis dette er muligt. Ved undersøgelse af titerværdier på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, anvendes der på nuværende tidspunkt gelkort med coombs anti-igg, hvor der tidligere blev anvendt glasmetoden, både med og uden anti-igg. I dette forsøg analyseres der på 60 TRPs, disse analyseres ved fortyndingen 1:50 og opdeles i positive og negative. Der analyseres yderligere på de positive prøver ved, at fremstille en titreringsrække, så der kan bestemmes en endelig titerværdi. Denne titreringsrække analyseres med gelkort med indirekte agglutinationsteknik (IAT) og med glasmetoden med direkte agglutinationsteknik (DAT). Dette gøres for at bedømme om begge metoder er anvendelige og giver ens resultater. I første del af forsøget blev der fundet 53 positive og 7 negative ud af de 60 TRPs, hvilket svare til, at der er 88,33 positive prøver ved fortyndingen 1:50. Andet del af forsøget vidste at titerværdierne analyseret med DAT ved glasmetoden gav værdier mellem 1:4 og 1:64, og titerværdiente analyseret med IAT ved gelkort gav værdier mellem 1:32 og 1:2048. Der ses, at der er en meget signifikant forskel på værdierne fundet ved de to teknikker og metoder. Ved DAT (glas) er der 98,11 % der har en titerværdie under de 1:50 og ved IAT (gelkort) er der 11,32 % der har en titerværdi under de 1:50. Hvis der anvendes gelkort med coombs anti-igg, vil det ikke være muligt at overholde Europarådets anbefalinger med en max titerværdi på 1:50, dette vil kun være muligt, hvis der anvendes glasmetoden med DAT. Sensitiviteten tegner dog til at være bedre på gelkortene og disse vil derfor give de bedste resultater og de bedste kvalitets produkter til patienterne. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 4 af 33

3. Introduktion 3.1. Baggrund og formål Der findes flere forskellige blodtypesystemer, og AB0-systemet er et af de klinisk mest betydningsfulde i forbindelse med blodtransfusion. Indenfor AB0-blodtypesystemet findes fire forskellige blodtyper; A, B, 0 og AB. Blodtypen er bestemt ud fra A- og B-antigener repræsenteret på organismens celler. Hvis der kun findes A-antigener på erytrocytternes overflade er man blodtype A. Blodtypen nedarves fra ens forældre, hvor A- og B- egenskaberne nedarves kodominat. For at have blodtypen 0, skal man have arvet 0- genotypen fra begge forældre. Man har antistoffer rettet mod de antigener, man ikke selv har repræsenteret på overfladen af erytrocytterne. Antistofferne er naturligt forekommende (regulære) og derfor ikke dannet ved immunisering (1). Blodprodukter udleveres som hovedregel typespecifikt, men der kan opstå akutte situationer, hvor recipientens blodtype ikke er kendt, og man derfor skal udleverer universalprodukter. 0-Erytrocytter, 0-TRC og AB-plasma anses som universalprodukter, da de enten ikke har AB-antigener repræsenteret på celleoverfladen eller anti-a og anti-b i plasma (1). Trombocytpools (TRPs) fremstilles ud fra fire buffy-coats af samme AB0-type og 300 ml SSP+ (se bilag 1 for indhold). En buffy-coat indeholder leukocytterne, trombocytter (TRC) samt erytrocytter og plasma. Den færdige TRP er leukocytdepleteret, der er dog stadig op til 80 ml plasma (evt. indeholdende anti-a og anti-b afhængig af blodtype) i TRPen. På grund af det tilbageværende plasma, vil der i universal-trps altid forekomme anti-a og anti-b. Hvis en 0-TRP transfunderes til en recipient med blodtype A, vil anti-a kunne reagere med recipientens erytrocytter, hvorved disse destrueres vha. komplement-aktivering (1). Europarådet har opstillet en anbefaling vedrørende titerværdien for anti-a og anti-b i plasma/serum. Titerværdien angiver den højeste fortynding, hvor der stadig ses agglutination. Anbefalingen lyder, at titerværdien maksimalt må ligge på 1:50. Hvis titerværdien ligger over 1:50 anses type 0 plasma/serum at have høj risiko for at medfører akut hæmolytisk transfusionsreaktion (AHTR) ved recipienter med blodtypen A, B og AB (2). Titerværdien udtrykker ikke direkte styrken af et anti-a, så derfor kan der udregnes en score, hvor de enkelte gradueringer får tildelt en specifik værdi, der til sidst summeres til den endelige score. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 5 af 33

Grunden til at Europarådets anbefalinger har betydning for dette projekt skyldes som før nævnt, at der findes plasma i alle TRPs, og at der derfor altid findes anti-a og anti-b i 0- TRPs, der anses for at være universal-trps. Af anti-a og anti-b er det typisk anti-a, der forårsager AHTR (3). På nuværende tidspunkt undersøges der ikke for titerværdien i 0- TRPs på Klinisk Immunologisk Afdeling, Aarhus Universitetshospital, Skejby. På afdelingen udleveres TRP til børn under 6 år typespecifikt i henhold til de nuværende retningslinjer. Dog kan der opstå situationer, hvor typen ikke kan matches enten på grund af manglende lagerbeholdning eller manglende blodtypeinformationer. I disse tilfælde er retningslinjerne, at der transfunderes 0-TRPs (4). I 2010 rapporterede Josephson et al. (3) om et dødsfald på et 8 måneder gammel spædbarn, med blodtypen A, efter en transfusion med 0-TRP. Ydermere rapporteres der om en transfusionskomplikation ved et 3 måneder gammel spædbarn med blodtypen A, som har fået transfunderet 0-TRP med en titerværdi mindre end 1:20. Denne viden indikerer vigtigheden af en lavere titerværdi i 0-TRP til spædbørn med anden blodtype. Cooling et al. (5) har i 2008 udarbejdet et studie, der undersøger titerværdierne ud fra to forskellige analyseteknikker (direkte agglutinationsteknik i glas og i gelkort). Studiet viste, at gelmetoden var mere sensitiv og påviste højere titerværdier end glasmetoden. Formålet med projektet er at højne kvaliteten af proceduren for fremstilling og udlevering af TRPs til børn og på den måde højne kvaliteten af TRPen. Derudover finde ud af, om retningslinjerne for brug af 0-TRPs til børn med anden blodtype skal revideres. Endvidere forsøger projektet at belyse, om det er muligt at overholde Europarådets anbefalinger og finde ud af om anbefalingerne er for kritiske i forhold til de nuværende analysemetoder. 3.2. Problemformulering Hvordan overholdes Europarådets anbefalinger for udlevering af 0-trombocytpools til børn under 6 år og i forhold til den analytiske sensitivitet af laboratoriets to anvendte metoder; direkte agglutinations teknik i glas og indirekte agglutinations teknik udført i gelkort? Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 6 af 33

3.3. Målformulering - Indsamlingen af prøvematerialet (0-trombocytpools) sker løbende under fremstillingen i den daglige rutine på Klinisk Immunologisk Afdeling, Aarhus Universitetshospital, Skejby. - Vi vil undersøge, om titerværdien for anti-a er afhængig af, om der anvendes indirekte agglutinations teknik (IAT) i gelkort tilsat Coombs anti-igg eller direkte agglutinationsteknik (DAT) i glas uden hjælpeantistof. - Vi vil analysere ca. 60 0-trombocytpools ved at fremstille en 1:50 fortynding og undersøge om de er positive eller negative for anti-a vha. IAT i Coombs anti-igg gelkort - Vi vil videreanalysere på de positive prøver ved at fremstille en titreringsrække og foretage DAT og IAT for at bestemme titerværdien af anti-a i de enkelte trombocytpools. - Vi vil ud fra resultaterne beregne den procentvise andel af positive prøver ved fortyndingen 1:50 og derudfra vurdere, om Europarådets anbefaling bliver overholdt. - Vi vil sammenligne resultaterne for DAT og IAT og derved undersøge, om der er en signifikant forskel på de to teknikker i forhold til scoreværdierne. - For at få viden omkring hvor mange trombocytpools, der udleveres til børn under 6 år samt hvor mange 0-trombocytpools der udleveres til børn under 6 år med anden blodtype, vil vi forsøge, at få udtrukket statistik fra blodcenter midt i perioden 2011 og 2012. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 7 af 33

4. Teori 4.1. Trombocytter Trombocytter, også kaldet blodplader, er små kerneløse partikler. Trombocytter dannes i knoglemarven fra megakaryocytter, som afsnører små pakker af deres cytoplasma. En megakaryocyt kan danne ca. 6000 trombocytter. Trombocytternes overflademembran bugter sig mange gange ind i cytoplasmaet, så der dannes mange kanaler heri, ved beskadigelse af karvæggen, hvor trombocytterne binder sig til det beskadiget område, bruges disse kanaler til at transportere trombocytternes vesikler ud i omgivelserne. Vesiklerne indeholder et stort antal vigtige biologiske stoffer. Vesiklerne indeholde bla. Adenosindifoafat (ADP), dette påvirker trombocytternes overflade så denne bliver klæbrig og de nemmere klumper sammen og danner proppen der stoppe hullet i karvæggen og dermed blødningen. Figur 1: hul i karvæggen med dannelse af trombocytprop (1). Trombocytter har en levetid på ca. 10 dage, herefter destrueres de af makrofager, dette sker først og fremmest i milten og leveren. Leveren udsender en peptidhormon kaldet trombopoietin (TPO), dette hormon styre dannelsen af trombocytter, ved at accelerere dannelsen af megakarycytter fra stamcellerne(6). Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 8 af 33

Trombocytter er vigtige i forbindelse med hæmostasen. De er også aktive i bekæmpelse af infektioner. Behandlingen med trombocytter sker for at nedsætte risikoen for blødning eller at standse en igangværende blødning, begge tilfælde forsaget af trombocytmangel (6). Trombocytopeni er et sygdoms tilfælde hvor der ikke er nok trombocytter tilstede i patientens blod til at klare de små karskader der dagligt finder sted. Grunden til denne sygdomstilstand er ofte en nedsat produktion af trombocytter pga. behandling med cellegift eller leukæmi og andre knoglemarvsygdomme(6). 4.2. Fremstilling af trombocytpool og udlevering En portion blod opdeles i tre blodkomponenter. Erytrocytter, plasma og buffy-coats (koncentrat af leukocytter, plasma og trombocytter (1). Figur 2: opdeling af blodet i 3 poser (1). TRPs fremstilles af 4 buffy-coats. Disse har alle den samme blodtype inden for AB0- og rehsus-sytemet. De 4 buffy-coats samles ved hjælp af et suspensionsmedie SSP+ og centrifugeres herefter og leukocytdepleteres. Dette betyder at der fjernes ca. 99.9 % af alle leukocyt typer. Dette nedsætter risikoen for transfusionskomplikationer, grundet antigener på leukocytter. TRPs opbevares ved 20-24 o c. Alle TRPs tjekkes for bakterier og er derfor i karantæne i et døgn efter fremstillingen. TRPs er holdbare i op til 7 dage. Derfor produceres der kun TRPs af blodtypen A og 0 på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitets hospital, Skejby. Dette er fordi at der ville være et for stort spild af TRPs af blodtyperne B og AB, da der kun er 15 % af befolkningen der har denne blodtype. (7) Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 9 af 33

Udlevering af TRPs til børn sker som hovedregel efter deres egen blodtype. Ved tilfælde hvor dette ikke er muligt udleveres der i henhold til reglerne for normalt typeskift og her gives der som hovedregel TRP af blodtypen 0. Ved blodtypen AB, kan der dog også udleveres A eller B (4,8). 4.2.1. Aferese trombocytter Denne metode til høstning af trombocytter benyttes hyppigst når der ønskes trombocytter med en speciel vævstype eller trombocyt typer. Her bliver der udtrukket trombocytter, udelukkende fra en donor og man opnår et produkt der indeholder op til otte gange så mange trombocytter som i en TRP. Trombocytter tappet på ved denne metode opbevares i donors plasma. (1) 4.3. Kvalitetssikring af trombocytter Alle blodkomponenter på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, kvalitetssikres. TRPs vejes og skal ligge mellem 320-410 g, for at kunne være sikre på at der findes den ønskede mængde trombocytter til patienten. inden udleveringen bliver alle TRPs visuelt tjekket for følgende ting: Swirling, her skal den være positiv, aggregater, her skal den være negativ og farve, her må den ikke være rød. Bakteriekontrollen er også en del af kvalitetssikringen, her skal der være en negativ prøve før TRPen må udleveres(9) 4.4. ABO-systemet AB0-systemet er et af mange blodtype systemer, der findes 30 anerkendte systemer. Der findes derfor stor variation indenfor befolkningen i sammensætningen af blodtypeantigener på organismens celler. AB0-systemet er det mest betydningsfulde i forbindelse med blodtransfusioner. Kun i sjældne tilfælde kan man være tvunget til at hensyn til nogle af de andre systemer. AB0-systemet er antigener lokaliseret i glykoproteiner, som er fastgjort til proteiner i cellemembranden. Indenfor alle blodtyperne findes der glykoproteiner på trombocytoverfladen, men ved blodtypen A, sidder der et N-acetylgalaktosamin på glykoproteinet og ved blodtypen B, sidder der et D-galaktose på glykoproteinet. Ved blodtypen 0, findes der ikke noget ekstra kulhydrat på glykoproteinet. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 10 af 33

Figur 3: de forskellige antigener inden for AB0-Systemet (1). Blodtypen er arvelig, A- og B- fænotypen er kodominate og der findes derved 4 forskellige blodtyper i AB0-systemet(A, B, AB og 0). Indenfor AB0-systemet findes der som det eneste blodtype-system også A- og B- antistoffer, disse findes i plasmaet. Disse kaldes regulære antistoffer, fordi de fremkommer naturligt uden foregående immunisering. Anti-A og Anti-B, forekommer både som IgG og IgM antistoffer. Disse fremkommer ved 6 måneders alderen og individet har antistoffer rette med de antigener som individet ikke selv har. Det vil sige at er man blodtypen A, har man A-antigener og B-antistoffer (1). Figur 4: billede af de forskellige immunglobulin klasser (1) Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 11 af 33

4.5. Transfusionskomplikationer Hæmolytisk transfusionskomplikationer opstår typisk ved major-uforlig, men kan også opstå ved minor-uforlig, f.eks. ved transfusion med universaltrombocytter, med plasma indeholdende anti-a og anti-b. Ved transfusion med Trombocytter kan dette opstå ved, at man giver en patient med blodtypen A, trombocytter af blodtype 0 (universal trombocytter). Da der ikke findes antigener på 0 trombocytter, kan patientens antistoffer ikke bekæmpe de transfunderet trombocytter, så der opstår ikke major-uforlig, men plasmaet i TRPen indeholder anti-a som kan gå ind og bekæmpe patientens erytrocytter og dermed opstår der minor-uforlig. Dette sker heldigvis yderst sjældent, da TRPs er opbevaret i SSP+ og derfor kun indeholder minimale mængder af plasma, ca. 80 ml. Hæmolytisk transfusionskomplikationer kan forekomme på to forskellige måder. Intravaskulær eller ekstravaskulær. Intravaskulær hæmolytisk tranfusionskomplikationer betyder at erytrocytterne ødelægges i karbanen og erytrcytfragmenterne kan medfører livsfarlige nyreskader. I tilfælde med transfusion af TRPs findes der komplementbindende antistoffer rettet mod patientens erytrocytter. Komplementaktiveringen medfører en ødelæggelse at patientens erytrocytter. Patienter der rammes af intravaskulære hæmolytisk transfusionskomplikationer vil oftest opleve trykken for brystet, kulderystelser, feber, kvalme, hovedpine, rødme af huden, dyspnø, blodtryks fald og evt. hæmolytisk shock (1). Ekstravaskulær hæmolytisk transfusionskomplikationer skyldes de irregulære antistoffer fundet i plasmaet i TRP, rettede mod patientens erytrocytter. De fleste irregulære antistoffer er kun svagt eller ikke komplementaktiverende og derfor sker hæmolysen i makrofagsystemet ved fagrocytose. Derfor ses der ikke frit hæmoglobin i patientens plasma. symptomerne ved denne type af transfusionskomplikationer er kulderystelser, hæmoglobinfald, hæmoglobinuri og efterfølgende icterus (1). Transfusionsrelateret akut lungeskade (TRALS). Denne komplikation er forholdsvis hyppig og ses efter transfusioner af blodkomponenter der indeholder plasma. Denne tilstand er yderst alvorlig og kan have dødelig konsekvenser. Tilstanden skyldes ofte leukocytantistoffer (1). Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 12 af 33

4.6. Børn og blodvolume Børn har en højere procentvis blodvolume i forhold til deres vægt, i forhold til voksne. Nedstående tabel 1 viser hvordan blodvolume i ml/kg er faldende i hele barndommen og så ligger forholdsvis stabilt ved voksne. Der er dog en lille forskel mellem mænd og kvinder som ikke er vidst i skema da forskellen er på 1 ml/kg (10). Alder Blodvolume (ml/kg krops vægt) nyfødt 83,3 1 år 80 6 år 80 10 år 75 15 år 71 Voksen 70 Tabel 1: blodvolumen i ml/kg (10) Nedstående tabel 2 viser den gennemsnitlige vægt for drenge, drenge vejer i gennemsnittet lige lidt mere end piger. Alder Vægt i kg (gennemsnitlig) Nyfødt 3,5 1 år 11,8 2 år 13,3 3 år 15,4 4 år 17,3 5 år 19,0 Tabel 2: viser gennemsnitsvægten for drenge på 0-5 år (11) 4.7. Antistof titer og graduering Titeren er et udtryk for antistoffet styrke, denne findes ved at lave flere fortyndinger af plasma eller andet plasmaholdigt blodkomponent, dette kaldes en titrering. Oftest anvendes en almindelig tofolds fortynding, hvor fortyndingen hele tiden fordobles: 1:2, 1:4, 1:8 osv. Titeren angives herefter som den højeste fortynding hvor der anses en positiv reaktion. Titeren kan udbygges med en score værdi, hvor man alt efter gradueringen af den enkelte fortynding giver hver positiv fortynding en værdi. Dette kan f.eks. være at en fortynding vurderes til gradueringen 4, denne får så værdien 8 og til sidste kan man lægge værdierne sammen. Dette kan gøre da to prøver godt kan have samme titerværdi, men ikke være helt lige stærke, som så ses ved scoreværdien (1). Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 13 af 33

Graduering af antistofferne sker forskelligt afhængig af om der bruges gelkort metoden eller glasmetoden. Graduering er en bestemmelse af hvor kraftig den positive reaktion er. Graduering er en værdi fra 0-4, hvor 0 er negativ og 4 er den kraftigste reaktion. Figur 2: gradueringsprincippet for gelkort af BioRad Figur 3: gradueringsprincippet for gladmetoden 4.8. Glas- og gelmetoden Gelmetoden er den metode der bliver anvendt på kliniks immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby, til bestemmelse af antistoffer, blodtypebestemmelser og titerværdier. Dette gør den til et oplagt valg i forbindelse med bestemmelse af anti-a i TRPs. Til gelkortene kan der både bruges IAT eller DAT, men da de på afdelingen bruger IAT til bestemmelse af titerværdier, virker denne oplagt som undersøgelses teknik. Glas metoden er den metode der blev brugt inden gelmetoden blev indført. Til glasmetoden bruges der DAT teknik, dette skyldes sammen begrundelse som ved IAT, at det er denne som de har brugt i forbindelse med titreringer. Disse metoder bestå af en antistof/antigen binding. denne sker ved at der findes antistoffer i plasmaet i TRP og antigener på testerytrocytterne. Glasmetoden er en direkte agglutinations teknik (DAT). Dette betyder at der sker en direkte agglutination mellem antistoffet og antigenet, uden hjælp fra eventuelle hjælpemidler. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 14 af 33

Ved denne teknik detekteres antistoffer af klassen IgM bedst, da de er pentamer og har dermed 5 antistoffer bundet sammen som et, dermed er de store nok til at danne en bro imellem erytrocytterne og danne den ønskede agglutination. Disse antistoffer kaldes komplette antistoffer. IgG-antistoffer er derimod monomer og er for små til at danne bro mellem erytrocytterne og kan derfor ikke skabe en agglutination. Disse antistoffer kaldes inkomplette antistoffer. Gelmetoden er en indirekte agglutinations teknik (IAT). For at have en indirekte agglutination, skal man have et hjælpe middel, der kan binde til antistoffets konstante del. I dette tilfælde er det anti-igg der binder sig til IgG antistoffer og derved gør at der skabes en agglutination, ved at kunne binde flere sammen, så der dannes en bro mellem erytrocytterne (1). Figur 4: billeder viser en agglutination med i gel kort med Coombs reagens (12). Billedet viser en reaktion mellem erytrocytter med D-antigener og patient prøve med anti- D, hvor man kan se hvordan coombs reagenset går ind og hjælper til en agglutination. Det kunne også have været erytrocytter med A-antigener og en patientprøve med anti-a. Coombs reagenset består af Anti-IgG, som kan finde til antistoffer at typen IgG, de er her illustreret som gule og man ser her hvordan de kan hjælpe med at lave et netværk, så der opstår en synlig agglutination. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 15 af 33

5. Materialer og metoder Prøvematerialet er 0-trombocytpools, produceret på klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitets hospital, Skejby. 5.1. Apperatur/utensilier Pipetter inkl. Spidser Stativer Analyseglas Gelkortcentrifuge Inkubator Vaskeglas 5.2. Reagenser PBS 0-trombocytpools Cellstab (se bilag 2) Testerytrocytter A 1 1 % (suspenderet i cellstab) Testerytrocytter A 1 5 % (suspenderet i cellstab) Coombs anti-igg gelkort Titreringsstandard 5.3. Fremgangsmåde ved fremstilling af A 1 testerytrocytter 1 % og 5 % Pakning af erytrocytter. Der påfyldes PBS i flere vaskeglas. Derefter tilsættes der ca. 1 ml fyldblod til hvert vaskeglas og de centrifugeres herefter i 2 minutter ved 1500 RCF. Væsken suges herefter væk, så der kun er erytrocytter tilbage i glasset. Herefter tilsættes der igen PBS og centrifugeres og suges, dette gøres i alt tre gange. Alle erytrocytterne samles nu i et glas og centrifugeres en sidste gang og det overskydende væske suges væk. Nu suspenderes erytrocytterne i cellstab. Mængden at de cellstab og erytrocytter er afhængig af suspensionens koncentration. 1 % suspension: - 200 µl cellstab og 2µl pakkede erytrocytter Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 16 af 33

5 % suspension: - 200 µl cellstab og 10µl pakkede erytrocytter De færdige test erytrocytter, skal opbevares ved 2-6 o c og kan bruges i 4 uger efter fremstilling. 5.4. Fremgangsmåde ved 1:50 fortyndingen i gelkort Der udprintes 6 labels med batch nummeret for hver TRP, disse påføres prøveglasset, titreringsrækken, glasteknik rækken og de forskellige gelkort. Prøvematerialet overføres til et plastik glas. Derefter tilsættes der 196 µl cellstab til 10 glas som bruges til fortyndingen, der tilsættes så 4µl prøvemateriale til glassene og fortyndingerne blandes godt med en vortexmixer. Der fremstilles samtidig en positiv og negativ kontrol. Den positive kontrol er en 1:50 fortynding af titreringsstandarden og den negative kontrol er bare cellstab. Der skal bruges 1 brønd i gelkortet pr. prøve. Der tilsættes 50 µl A 1 1 % testerytrocytter til hver enkelt brønd i gelkortet. Herefter tilsættes der 25 µl prøvemateriale eller kontrol materiale til de enkeltbrønde i gelkortet som er mærket med prøvenummeret. Gelkortene centrifugeres herefter i 30 minuttet ved 37 o c og centrifugeres efterfølgende i 10 minutter ved 910 rpm (125 RCF). Til slut aflæses kortene for positiv eller negativ reaktion. Ved positivt resultat, laves der en titreringsrække på de gældende TRPs, ved brug af gelkort teknik og glasteknik. 5.5. Fremgangsmåde ved titreringsrækken i gelkort Der opstilles en titreringsrække med 10 glas (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512) første glas mærkes med TRPs batchnummer. 200 µl cellstab til sættes alle glas, på nær glas nr. 1 i alle titreringsrækker. Herefter tilsættes der 200 µl prøvemateriale i glas 2, som blandes ved hjælp af vortexmixeren. Der udtages derefter 200 µl fra glas 2, som tilsættes i glas 3, som så blandes med vortexmixeren. Sådan fortsættes til sidste glas i titreringsrækken. Der laves også en titreringsrække med titreringsstandarden. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 17 af 33

Der bruges her ca. 2 gelkort pr. prøve, som mærkes med TRPs batch nummer. Der tilsættes 50 µl A 1 1 % testerytrocytter til de enkelte brønde i gelkortet og derefter 25 µl fra titreringsrækken til hver enkelt brønd i gelkortet, som er mærket efter titreringsrækken. Gelkortene inkubere herefter ved 37 o c i 30 minutter og centrifugeres efterfølgende i 10 minutter ved 910 rpm (125 RCF). Kortene aflæses og der bestemmes den endelige titerværdi. 5.6. Fremgangsmåde ved titreringsrække i glas Der bruges titreringsrækken som er fremstilt ved gelkort teknikken. Der udtages 100 µl fra titreringsrækken til 10 nye glas som er mærket med batch nummeret fra TRP og den pågældende fortynding. Der tilsættes 50 µl cellstab til hvert glas og herefter 50 µl A 1 5 % testerytrocytter. Glassene oprystes og inkuberes ved 37 o c i 30 minutter. Prøverne aflæses og der findes den gældende titerværdi. 5.7. Data behandling Alt data behandling foregår i Excel. Der er en tabel for resultaterne ved fortyndingen 1:50 og lavet en procentvis udregn af positive og negative prøver. Der er fremstillet tabel til indsættelse gradueringerne og scoreværdierne, samt de endelige resultater for titerværdierne og samlet scoreværdi. Der er lavet et samlet søjlediagram over de endelig titerværdier for de 2 anvendte metoder, dette er gjort ved at anvende formlen Tæl.hvis i Excel som tæller antallet af en given værdi. Der er produceret tabeller til indsættelse af de daglige kontrol værdier. Der er yderligere fremstillet et differenceplot ved hjælp af Excels punkt diagram. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 18 af 33

6. Resultater 6.1. Rådata Bilag 3: fortyndingen 1:50 Bilag 4: titreringsrækken Bilag 5: kontroller Bilag 6: transfusions data af TRP 6.2. kontroller Der er dagligt analyseret på positive og negative kontroller i forbindelse med fortyndingen 1:50, dette for at sikre sig at metoden virker og resultaterne er brugbar. Den positive kontrol gav dagligt 3 og den negative kontrol blev altid negativ. Der er dagligt analyseret en kontrol titreringsrække for hver metode og denne har givet titerværdien 1:32 for glas teknikken og titerværdien 1:512 for gel teknikken. 6.3. Fortyndingen 1:50 antal positive 53 negative 7 samlet 60 Tabel 3: antal prøver analyseret ved fortyndingen 1:50 i Coombs anti-igg gelkort, fordelt i positive og negative. procent positive 88,33 procent negative 11,67 Tabel 4: procentvis fordeling af de positive og negative prøver ved fortyndingen 1:50 Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 19 af 33

Gelmetoden - glasmetoden hyppighed Nanna Haahr Vorsaa 19. December 2012 6.4. Titreringsrækken ved gel og glas teknikken 25 titerværdier med cut-off 20 15 10 5 0 gel teknik glas teknik titerværdi Figur 5: samlet graf over titreringsværdierne ved de 2 metoder. Den røde streg indikerer titerværdien 1:50. Gel teknikken procent over fortyndingen 1:50 88,68 procent under fortyndingen 1:50 11,32 Tabel 5: viser den procentvise fordelingen med titerværdierne over og under fortyndingen 1:50 Glas teknikken procent over fortyndingen 1:50 1,89 procent under fortyndingen 1:50 98,11 Tabel 6: viser den procentvise fordelingen med titerværdierne over og under fortyndingen 1:50 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Differensplot over scoreværdierne 15 20 25 30 35 40 45 Middelværdi Figur 6: differensplot, der viser forskellen mellem de opnået scoreværdien, ved de 2 metoder. Klinisk immunologisk afdeling, Aarhus universitetshospital, Skejby Side 20 af 33