DJF Juni 2001 rapport Nr. 27 Husdyrbrug Betina S. Knudsen, John E. Hermansen, Søren K. Jensen, Troels Kristensen & Mette Olaf Nielsen Evitamin til malkekøer forekomst og funktion samt vitaminstatus og sammenhæng til hyppigste produktionssygdomme i økologiske besætninger
Evitamin til malkekøer forekomst og funktion samt vitaminstatus og sammenhæng til hyppigste produktionssygdomme i økologiske besætninger Betina S. Knudsen, John E. Hermansen & Troels Kristensen Afdeling for Jordbrugssystemer Postboks 50 DK8830 Tjele Søren K. Jensen Afdeling for Husdyrernæring og Fysiologi Postboks 50 DK8830 Tjele Mette Olaf Nielsen Institut for Anatomi og Fysiologi Den Kgl. Veterinær og Landbohøjskole Grønnegårdsvej 7 DK1870 Frederiksberg C. DJF rapport Husdyrbrug nr. 27 juni 2001 Udgivelse: Danmarks JordbrugsForskning Tlf. 89 99 19 00 Forskningscenter Foulum Fax 89 99 19 19 Postboks 50 8830 Tjele Løssalg: t.o.m. 50 sider 50, kr. (incl. moms) t.o.m. 100 sider 75, kr. over 100 sider 100, kr. Abonnement: Afhænger af antallet af tilsendte rapporter, men svarer til 75% af løssalgsprisen.
FORORD Forskergruppen Bedriftsudvikling og Produktion ved Afd. for Jordbrugssystemer har i en årrække gennemført undersøgelser vedrørende økologisk mælkeproduktion. Undersøgelserne har primært været bygget op omkring projektet Demonstration og udvikling af økologiske landbrugssystemer, hvor der deltager 21 private økologiske bedrifter, og projektet Økologiske mælkeprodukter. Begge projekter er støttet af Direktoratet for FødevareErhverv. De detaljerede registreringer af produktionens gennemførelse, som foretaget i disse projekter har dannet grundlag for nærværende arbejde, der er gennemført som led i hovedforfatternes masterafhandling ved Institut for Anatomi og Fysiologi, Den Kgl. Veterinær og Landbohøjskole og Afd. for Jordbrugssystemer, Danmarks Jordbrugs Forskning. Alle forsøgsværter takkes for et godt samarbejde omkring projektets udførelse. Endvidere rettes tak til forsøgsteknikerne Henning Bjerre, Gunnar Grønning, Helge Yde, Niels H. Thomsen, Orla Nielsen, Michael Hansen samt til edbmedarbejder Jytte Christensen og overassistent Lene Kirkegaard for medvirken ved databehandling og udarbejdelse af rapporten. Forskningscenter Foulum Maj 2001 Harald E. Mikkelsen Forskningschef 2
INDHOLDSFORTEGNELSE Side 1 Baggrund og mål 6 2 Evitamin s funktion og indhold i blod og mælk samt betydning for mælkens 7 kvalitet og forekomst af sygdomme. 2.1 Struktur og biologisk aktivitet 7 2.2 Fordøjelse og absorption 8 2.3 Funktion 9 2.4 Indholdet af Evitamin i blodplasma og mælk 13 2.5 Betydning for mælkens kvalitet 18 2.6 Betydning for forekomst af sygdomme 21 2.7 Metoder til vurdering af malkekøers Evitamin status 28 2.8 Konklusion 29 3 Fodermidlernes indhold af Evitamin 30 3.1 Grovfoder 30 3.2 Kraftfoder og tilskudspræparater 33 3.3 Typetal for Evitamin indholdet i danske fodermidler 35 4 Materialer og metoder ved undersøgelser i besætninger 36 4.1 Nøgletal for økologiske malkekvægsbesætninger 36 4.2 Dataindsamling 36 4.3 Statistiske metoder 40 5 Evitamin tildeling, vitaminstatus og sygdomsfrekvens i økologiske malkekvægsbesætninger 43 5.1 Evitamin tildeling 43 5.2 Indholdet af Evitamin i tankmælken 45 5.3 Evitamin status 47 5.4 Sygdomsfrekvens 49 5.5 Anbefaling 55 6 Konklusion 57 7 Litteraturliste 59 8 Appendiks 75 3
SAMMENDRAG I økologiske malkekvægsbesætninger gives ikke konsekvent direkte vitamintilskud, dels af principielle grunde og dels som følge af begrænsninger i de præparater, der kan tilbydes. Herved beror malkekøernes Evitamin forsyning i høj grad på fodermidlernes naturlige indhold heraf. På baggrund af den foreliggende litteratur er Evitamin s funktion, indhold i blod og mælk samt betydningen for mælkens kvalitet og forekomsten af sygdomme beskrevet. Naturligt forekommende Evitamin har en højere biologisk aktivitet (virkning) end syntetisk Evitamin, der bruges i tilskudspræparater. Malkekøernes Evitamin status ser ud til at kunne vurderes ud fra såvel indholdet i mælkefedtet som indholdet i blodplasma. Generelt kan det vurderes, at et indhold på mindst 20 µg/g mælkefedt eller 3 µg/ml blodplasma kan tolkes som en god vitamin status i forhold til såvel risiko for oxidation som en optimal immunfunktion. I den sidste del af goldperioden og lige efter kælvning ses et fald i blodets indhold af Evitamin. Herved fås ofte en lavere Evitamin koncentration end det niveau, der anses for nødvendigt for at opnå en optimal immunfunktion. Tilskud af Evitamin i denne periode kan til en vis grad udligne dette. Der er i flere undersøgelser med normale foderrationer fundet, at tilskud af Evitamin i goldperiode og i den tidlige laktation medførte en reduceret forekomst af mastitis. Der er ligeledes i nogle undersøgelser fundet en reduceret forekomst af tilbageholdt efterbyrd ved tilskud af E vitamin, men fælles for sidstnævnte undersøgelser har været at den generelle forsyning med Evitamin var lav. Mælkens indhold af Evitamin følger i vid udstrækning indholdet i blodet, som er en funktion af tildelingen ved normale niveauer. For lavt Evitamin indhold i mælken øger risikoen for oxidation og harsk smag. Fodermidlernes indhold af Evitamin er beskrevet sammen med de vigtigste forhold, der påvirker indholdet. På grundlag af registreringer hos 12 økologiske forsøgsværter over en periode på to år, hvoraf fem værter anvendte tilskud af Evitamin i vinterperioden, er malkekøernes forsyning med Evitamin beregnet på grundlag af typetal for fodermidlernes indhold. Vitaminindholdet i mælken er målt, og besætningernes Evitamin status er vurderet ved Evitamin indholdet i mælkefedt. Frekvensen af dyrlæge behandlede sygdomme er sat i relation til vitamin tildelingen og den vurderede status. Den gennemsnitlige tildeling i sommerperioden var ca. 1.350 mg Evitamin pr. ko daglig. I vinterperioden tildeltes ca. 750 mg i besætninger, hvor der ikke blev givet tilskud, og ca. 1.100 mg i besætninger, der gav tilskud. Mælkens indhold af Evitamin udviste en klar sæsonvariation fra i gennemsnit 1,1 µg/ml i sommerperioden til 0,9 µg/ml i vinterperioden. Der blev fundet en negativ sammenhæng mellem besætningernes Evitamin tildeling og frekvensen af alle sygdomme og yverlidelser. 4
Derimod var der ikke nogen sammenhæng mellem besætningernes Evitamin tildeling og frekvensen af reproduktionslidelser. Det konkluderes, at de nuværende danske normer for Evitamin næppe er tilstrækkelige til at sikre en optimal Evitamin status, og der gives forslag til hvorledes en besætnings Evitamin status kan vurderes ved mælkeprøver. 5
1 BAGGRUND OG MÅL I de økologiske malkekvægsbesætninger udgør den produktionsbetingede sygdom mastitis det væsentligste sundhedsproblem (Vaarst & Enevoldsen, 1995). En effektiv forebyggelse af tabsgivende faktorer, såsom de produktionsbetingede sygdomme, er af stor betydning for produktionen af kvalitetsvarer samt for dyrenes velfærd, idet forudsætningen herfor er sunde dyr. Endvidere har forekomsten af sygdomme betydning for den enkelte besætnings rentabilitet, idet tilbageholdelsestiden af mælken er tre gange så lang efter antibiotikabehandling i økologiske besætninger end i konventionelle. Der er mange resultater, der tyder på, at køernes Evitamin tildeling har betydning for deres sundhed og herunder specielt yversundheden. Der er endvidere rejst spørgsmålstegn ved, om de danske normer for Evitamin i alle tilfælde er høje nok. For den økologiske mælkeproduktion har dette en særlig interesse, idet der ikke automatisk foregår tildeling af betydelige tilskud af Evitamin. Problemstillingen er yderligere aktualiseret af den seneste revision af tilladte tilskudsfodermidler i den økologiske mælkeproduktion, der i princippet udelukker anvendelse af syntetiske E vitamin præparater. Dette medfører, at køernes forsyning med Evitamin i høj grad bliver afhængig af fodermidlernes naturlige indhold heraf. På denne baggrund er det målet med nærværende arbejde, der er udført som et led i hovedforfatterens masterafhandling at give en litteraturoversigt over Evitamin s funktion og indhold i blod og mælk at give en litteraturoversigt over betydningen af køernes Evitamin forsyning for mælkens kvalitet og forekomst af sygdomme at opdatere den foreliggende viden om fodermidlernes naturlige indhold og E vitamin og variationsårsager hertil og på grundlag af ovennævnte at undersøge den forventede forsyning med Evitamin i eksisterende økologiske malkekvægsbesætninger, herunder såvel besætninger hvori der gives tilskud som besætninger, hvori der ikke gives tilskud at undersøge, om der var sammenhæng med besætningernes Evitamin forsyning og henholdsvis Evitamin status udtrykt ved mælkens indhold af E vitamin og sygdomsfrekvensen. 6
2 EVITAMIN s FUNKTION, INDHOLD I BLODPLASMA OG MÆLK SAMT BETYDNING FOR MÆLKENS KVALITET OG FOREKOMST AF SYGDOMME Evitamin blev opdaget i 1922, som et essentielt fedtopløseligt stof for normal reproduktion hos rotter (Evans & Bishop, 1922). Evitamin er et essentielt næringsstof, idet tocopherol ikke kan dannes af pattedyr (Janiszowska & Pennock, 1976; Bauernfeind, 1980; Putnam & Comben, 1987). Der foregår således ingen syntese, hvorfor dyrene er afhængige af Evitamin tilførsel via fodret og/eller via tilskudspræparater. Interessen for Evitamin er øget i takt med den stigende forståelse af vitaminets fysiologiske funktioner. 2.1 STRUKTUR OG BIOLOGISK AKTIVITET Evitamin er fællesbetegnelsen for en gruppe fedtopløselige forbindelser. Der eksisterer otte naturligt forekommende former af Evitamin, som kan opdeles i to grupper á fire i henhold til om molekylets sidekæde er mættet (tocopheroler) eller umættet (tocotrienoler) (e.g. Parrish, 1980; Elsas & McCormick, 1986; Putnam & Comben, 1987; Treuthardt, 1992; Pryor, 1996). I tabel 2.1 er den kemiske struktur af de fire naturligt forekomne tocopheroler illustreret. Tabel 2.1. Nomenklatur og kemisk struktur af naturligt forekommende tocopheroler (mod.e. Roels, 1967; Hjarde, et al., 1973; Kasparek, 1980; Parrish, 1980; Bieri, 1984; Wills, 1985; Treuthardt, 1992). R 2 R 3 O Me Me Me Me HO R 1 Forbindelse Stereokemisk struktur R1 R2 R3 αtocophorol βtocopherol γtocopherol δtocopherol 5,7,8Trimethyltocol 5,8Dimethyltocol 7,8Dimethyltocol 8Monomethyltocol Me Me H H Me H Me H Me Me Me Me R 1, R 2 og R 3 henviser til figuren, Me: Methylgruppe (CH 3), OH: Hydroxylgruppe, H: Hydrogen, α: alfa, β: beta, γ: gamma, δ: delta. Evitamin kan desuden findes på to former, d og lform, efter den rummelige struktur. De naturlige former af Evitamin har alle dform, og benævnes f.eks. som dαtocopherol (Hjarde et al., 1973; Leth & Søndergaard, 1977; Bieri & McKenna, 1981). Isomere med dform er mere aktive end isomere med lform (e.g. Scott & Desai, 1964; Bieri, 1984; Pond et al., 1995). Det er kun tocopherolerne, der spiller en vigtig fysiologisk rolle (Weber et al., 1964; Bondi, 1987), hvorfor det kun er disse, der vil blive behandlet i det efterfølgende. Som følge af dette vil Evitamin og tocopherol, blive betragtet som synonymer, hvilket ligeledes ofte praktiseres i litteraturen (e.g. Walker, 1979, Pryor, 1996). 7
Stabiliteten af naturligt forekommende tocopheroler er relativ lav. Da esterifikation forbedrer stabiliteten af tocopherol, findes det kommercielle Evitamin almindeligvis som dlαtocopheryl acetat. Tidligere blev Evitamin oftest udtrykt i Internationale Enheder (IU), men i dag benyttes primært mg Evitamin pr. kg ts. En IU af Evitamin er defineret som 1 mg af syntetisk dlαtocopheryl acetat (e.g. Young et al., 1975; Bieri, 1984; Putnam & Comben, 1987; McDonald et al., 1988; Pond et al., 1995). Syntetisk dlαtocopheryl acetat har en betydelig lavere biologisk aktivitet end den naturlige form, hvilket er illustreret i tabel 2.2. Tabel 2.2 Biologisk aktivitet af syntetisk Evitamin i forhold til naturligt E vitamin. Reference dαtocopherol (naturligt) dlαtocopheryl acetat (syntetisk) Webster (1979) 100% 73% Pryor (1996) 100% 67% Man skal således være opmærksom på, at det Evitamin (dlαtocopheryl acetat), som gives via tilskud har en lavere biologisk aktivitet end det Evitamin (dαtocopherol), som forefindes naturligt i fodermidler. 2.2 FORDØJELSE OG ABSORPTION Foderets indhold af lipider består primært af triglycerider (hovedsagligt fra kraftfoder og korn) samt af galaktolipider og phospholipider (primært fra grønfoder), men tillige af de fedtopløselige vitaminer (A, D, E og K), m.m. (Hindhede, 1983; Mainz, 1988; Pond et al., 1995). De fedtopløselige vitaminer følger fodermidlernes fedtfase og absorberes sammen med lipiderne fra foderet (e.g. GalloTorres, 1980; Christensen, 1983; Van Soest, 1994). Det er således nødvendigt med en normal sekretion af bugspytsekret og galdesalte for at danne miceller (emulsion), hvori de fedtopløselige vitaminer inkorporeres sammen med hydrolyserede lipider før absorption i tarmepithelet (Elsas & McCormick, 1986; Herdt & Stowe, 1991). Evitamin absorberes i tyndtarmen primært fra jejenum (Hidiroglou & Jenkins, 1974; Pryor, 1996), hvor det passerer tarmvæggen til det systemiske kredsløb via det lymfatiske system (Johnson & Pover, 1962; Bieri & Farrell, 1976; Elsas & McCormick, 1986). I lymfen cirkulerer Evitamin bundet til nonspecifikke lipidproteiner (e.g. GalloTorres et al., 1971; Behrens et al., 1982; Traber & Kayden, 1984). Supplering med Evitamin forekommer oftest i form af dlαtocopheryl acetat, som før absorption skal hydrolyseres til frit tocopherol i tarmlumen. Hydrolysen foregår fortrinsvis med den galdesalt stimulerede esterase, carboxyl ester hydrolase, som udskilles fra bugspytkirtlen. 8
Absorptionen af Evitamin fra foderet er relativ lav, og er fundet at ligge i intervallet 1045% af den mængde, der er indtaget med foderet (e.g. Johnson & Pover, 1962; Bondi, 1987; Pond et al., 1995). Weber et al. (1962), Akerib & Sterner (1971) og Gallo Torres et al. (1971) fandt, at der er en interaktion mellem Evitamin og andelen af polyumættede fedtsyrer, specielt linolensyre, i foderet. Undersøgelserne viste, at polyumættede fedtsyrer nedsætter den tilsyneladende absorption, sandsynligvis gennem inaktivering i vommen eller øget oxidation af Evitamin i tarmen. Alderson et al. (1971) fandt, at der var et væsentligt tab af Evitamin i de præintestinale regioner ved en forøgelse af kraftfoderandelen. Ved fodring med 4060% kraftfoder forsvandt således 2225% af det optagne Evitamin i vommen, medens der forsvandt omkring 42% ved fodring med 80% kraftfoder. Hidiroglou & Jenkins (1974) fandt hos får et højere indhold af Evitamin i blod og væv, når vitamintilskuddet blev tildelt i duodenum sammenlignet med tildeling i vommen og løben. Disse resultater verificerer således, at Evitamin forbruges under de tilstande, som eksisterer i vommen. 2.3 FUNKTION Evitamin er en meget vigtig komponent i alle cellemembraner, idet vitaminet forebygger peroxidering af bl.a. membranlipiderne og beskytter derved celler og omkringliggende væv mod ødelæggelser. Dette har betydning for bl.a. dyrets immunforsvar og for mælkens kvalitet og holdbarhed. Antioxidant Evitamin er den primære fedtopløselige antioxidant in vivo, og findes indlejret i alle cellemembraners lipidfase. Evitamin er den væsentligste celluære beskytter mod oxidative ødelæggelser (Glavind, 1973; McCay & King, 1980). Mikromineralet selen er ikke i sig selv nogen antioxidant, men mineralet inkorporeres i enzymet glutathion perioxidase (GSHPx), som primært fungerer som intracelluær (i cytoplasmaet og i mitochondrier) antioxidant (Hansen, 1983; Hogan et al., 1993). Når først enzymet er mættet med selen, vil yderligere tilsætning af mineralet til systemet ikke øge dets antioxidative evne (Bendich, 1990). GSHPx findes især i de røde og hvide blodlegemer. Antioxidanter beskytter cellernes ydre og indre mod oxideringsskader, der kan opstå i forbindelse med det normale cellestofskifte, idet Evitamin og GSHPx kan neutralisere de dannede frie radikaler (R : hydrogenperoxid, H2O2; hydroxyl, OH ) (Hoekstra, 1975; Babior, 1984; Putnam & Comben, 1987). Alle umættede fedtsyrer, og specielt dem der indeholder mere end to dobbeltbindinger, er meget modtagelige overfor angreb af de frie radikaler, hvorved der dannes peroxider. Da alle cellemembraner indholder polyumættede fedtsyrer (PUFA), såsom phospholipider, er de potentielle angrebssteder for frie radikaler (Coniglio, 1984; Wills, 1985). Specielt under en betændelsestilstand kan dannelsen af frie radikaler stige kraftigt i de fagocyterende celler (neutrophiler, m.fl.). Dannelsen af de frie radikaler er et vigtig led i bekæmpelsen af en infektion, idet de virker bakteriedræbende. Men bliver 9
overskydende oxygenmetabolitter ikke neutraliseret vil de virke toksiske for de fagocyterende celler selv (Bendich, 1996). Evitamin medfører forbedret evne af blodneutrofiler til at lokalisere og bekæmpe patogene bakterier (Weiss, 1998). Antioxidanterne (herunder Evitamin) er derfor af stor betydning for et velfungerende immunsystem foruden tillige at beskytte det omkringliggende væv mod ødelæggelse (oxidering). Immunrespons Koens primære beskyttelse mod mikroorganismer er huden og slimhinderne, men undertiden invaderer mikroberne organismen, sædvanligvis gennem revner og sår f.eks. på patterne (Nickerson, 1985; Agger et al., 1995; Waller, 1998). Når mikroberne er trængt ind i organismen træder dyrets immunsystem i kraft. Immunforsvaret kan inddeles i nonspecifikke og specifikke immunsystem (Agger et al., 1995; Sordillo et al., 1997). Det nonspecifikke immunrespons varetages af makrofager og neutrophile granulocytter, som fagocyterer og dræber det infektiøse agens. Processen støttes endvidere af komplementproteiner, der har betydning for aktivering af fagocytose, lysering, kemotaksi, m.m. (Agger et al., 1995; Waller, 1998). Det første trin i et immunrespons er bevægelsen af fagocytter til infektionsstedet. Det næste trin i processen er fagocytose, der involverer fagocytternes optagelse samt fordøjelse af bakterier (mikrobicid mekanisme). I forbindelse med fordøjelsen af bakterier sker der en markant stigning i den oxidative metabolisme, det såkaldte "respiratoriske burst". Formålet med det "respiratoriske burst" er, at danne forskellige oxiderende agens, såsom hydrogenperoxid, der virker bakteriedræbende (Targowski, 1983; Babior, 1984; Hogan et al., 1993). De fagocytdannede oxygenmetabolitter er nødvendige i den mikrobicide mekanisme, men de producerede frie radikaler kan tillige ødelægge fagocytterne selv samt det omliggende væv (Weiss & LoBuglio, 1982). Evitamin beskytter, som antioxidant, fagocytterne mod den cytotoksiske effekt af oxygenmetabolitterne, hvorved immunforsvaret forbedres (e.g. Philpot & Nickerson, 1991; Hogan et al., 1992; Gyang et al., 1984). En styrkelse af immunresponset i form af en forbedring af fagocytternes funktion ved tilskud af Evitamin er efterhånden generelt accepteret i litteraturen. Ifølge Finch & Turner (1996) kan mangel på Evitamin have en negativ effekt på fagocytternes evne til at migrere til infektionsstedet. TianQuan et al. (1994) fandt eksempelvis en stigning i neutrophilernes migration med 38% om sommeren i forhold til i vinterperioden, hvilket blev forklaret ved, at køerne generelt har en højere Evitamin status i sommerperioden, hvor udbuddet af grønfoder er størst. Effektiviteten af neutrophilernes bevægelse til infektionsstedet afhænger af produktionen af kemotaksiske stoffer samt neutrophilernes evne til at respondere på de kemotaksiske stoffer. Kemotaksisk respons af neutrophiler er oftest nedsat omkring kælvning (Tengerdy, 1980). Politis et al. (1996) fandt en signifikant forøgelse på 30 10
83% af det kemotaksiske respons af neutrophilerne i blodet ved supplement af E vitamin (3.000 mg/ko/dag plus injektion af 5.000 mg 1 u.f.k.) i perioden omkring kælvning. EicherPruitt et al. (1992) fandt tilsvarende forbedringer af neutrophilernes kemotaksi hos Evitamin supplerede (57 mg/kg mælkeerstatning) tyrekalve. Politis et al. (1995) fandt endvidere, at supplement med Evitamin i den tidlige laktation var til gavn for blodets makrofager, idet bl.a. produktionen af interleukiner steg, hvilket ligeledes er fundet af Bendich (1993). Leukiner medfører bl.a. tiltrækning af neutrophiler til det inflammatoriske sted (Willis, 1984; Lands, 1991; Ganong, 1993; Smith et al., 1997). Hogan et al. (1990) fandt ved tilskud af Evitamin (700 mg/ko/dag) en signifikant stigning i neutrophilers intracelluære drab af Staphylococcus aureus og Escherichia coli på henholdsvis 15 og 30%. Hogan et al. (1992) fandt ligeledes en stigning i det intracelluære drab af bakterier på 12% hos Evitamin supplerede køer. En signifikant forbedring af det intracelluære drab af S. aureus ved tilskud af Evitamin (1.000 mg/ko/dag) er tillige fundet af Gyang et al. (1984). Den positive effekt af Evitamin tilskrives ifølge førnævnte forfatterne, at Evitamin hæmmer autooxidation af polyumættede fedtsyrer i neutrophilernes membraner og derved forbedrer neutrophilernes funktion. Sammenhængen mellem Evitamin og neutrophilers intracelluære drab af bakterier er illustreret i figur 2.1 og 2.2. 90 Neutrophil drab (%) 85 80 75 70 65 60 0 7 14 28 Dage efter kæ lvning Figur 2.1 Intracelluære drab (%) af bakterier af neutrophiler hos kontrolkøer, der fik injekteret placebo 10 og 5 d.f.k. ( ) og hos køer injekteret med 3.000 mg dlαtocopheryl acetat 10 og 5 d.f.k. ( ) (mod.e. Hogan et al., 1992). 11
Neutrophil drab (%) 100 75 50 25 0 1 2 3 4 5 6 α tocopherol (µ g/ml) Figur 2.2 Sammenhængen mellem intracelluære drab af bakterier af neutrophiler (%) og plasmakoncentrationer af αtocopherol (µg/ml) ved kælvning (mod.e. Hogan et al., 1993). Det ses ud fra figur 2.2, at der er en positiv sammenhæng mellem plasmakoncentrationen af Evitamin og neutrophilernes intracelluære drab af bakterier. Således ses en stigning i neutrophilernes drab på 25% ved, at øge plasmakoncentrationen fra 1 til 3 µg αtocopherol/ml. Resultaterne tyder således på, at der må tilstræbes en plasmakoncentration på mindst 3 µg/ml for at have optimal immunfunktion. Det specifikke immunsystem består grundlæggende af antistoffer og lymfocytter. Der er to typer af lymfocytter; Blymfocytter, som kan udvikles til antistofproducerende celler og Tlymfocytter, der bl.a. regulerer Blymfocytternes syntese af antistoffer, m.m. (Kaufmann & Bergenholz, 1992; Agger et al., 1995). Evitamin beskytter, lymfocytternes cellemembran mod oxidering. Tab af cellemembranens integritet er direkte relateret til nedsat evne af lymfocytterne til at reagerer mod indtrængende patogener (Bendich, 1993), hvilket således vil resultere i et nedsat immunrespons. Evitamin tilskud kan ifølge Tengerdy (1980) og Hidiroglou et al. (1992) øge effektiviteten af antistofproduktionen, såfremt dyrets immunsystem fungerer normalt. Effektiviteten vil være størst i mangelsituationer (Tengerdy, 1980; Philpot & Nickerson, 1991). EicherPruitt et al. (1992) fandt således en øget celledeling af lymfocytterne hos kalve suppleret med Evitamin, hvilket tillige er fundet af Bendich (1993). Tengerly et al. (1980) dokumenterede, at Evitamin tilskud stimulerer antistofsyntesen, i kraft af en øget proliferation af de antistofproducerende celler, specielt IgGantistoffer, hvilket også er fundet af Swecker et al. (1989) hos tyrekalve. Reddy et al. (1987) fandt en stigning i immunresponset hos kviekalve, der ugentlig blev suppleret med E vitamin. St. Laurent et al. (1990) samt Garber et al. (1996) fandt tilsvarende et højere immunrespons (øget celledeling af lymfocytter) hos køer, der fik tilskud af E vitamin. Herudover er Evitamin fundet at spille en regulerende rolle i biosyntesten af forskellige inflammatoriske mediatorer, og antages at have en immunforbedrende effekt i kraft af en ændret arakidonsyreomsætning (e.g. Willis, 1984, Vander et al., 1990, Sandholm, 1995). 12
Den forebyggende effekt af Evitamin på sundhedstilstanden kan ifølge Morill & Reddy (1988) og McDowell et al. (1996) tilskrives en reduktion af glucocorticoiderne (herunder cortisol), der er immunsuppressive stoffer. Reddy et al. (1987) fandt således en signifikant nedsat cortisolkoncentration hos kviekalve, der fik tilskud af E vitamin (125500 mg/kvie/dag). Lee et al. (1985) observerede forbedrede produktionsresultater (bl.a. øget tilvækst) hos Evitamin supplerede (450 mg/stud/dag) stude, på trods af at de blev stressede ved langdistance flytning. Den forbedrede tilvækst kan ifølge Lee et al. (1985) tilskrives en sænkning af cirkulerende cortisolkoncentrationer som følge af Evitamin tilskud. 2.4 INDHOLDET AF EVITAMIN I BLODPLASMA OG MÆLK Indholdet af Evitamin i plasma og mælk varierer betydeligt afhængig af Evitamin tildelingen, laktationsstadium, m.m. Denne variation vil blive beskrevet i det følgende med det formål at vurdere hvilke muligheder, der er for at reducere disse fluktationer specielt i den kritiske periode omkring kælvning. Indholdet af Evitamin i blodplasma Koncentrationen af Evitamin i plasma varierer betydeligt afhængig af tidspunktet i laktationen. Således observerede Goff & Stabel (1990), Batra et al. (1992b), Weiss et al. (1990a), Weiss et al. (1994a), Miller et al. (1995), Politis et al. (1996) og Smith et al. (1997), at plasmakoncentrationen af αtocopherol begynder at falde i tiden før kælvning, og når det laveste niveau omkring en uge efter kælvning, hvorefter niveauet stiger igen. Dette er illustreret i figur 2.3. Ved kælvning var indholdet af Evitamin faldet med omkring 50% til ca. 2 µg/ml. I undersøgelsen af Weiss et al. (1990a) reduceredes koncentrationen fra ca. 2 µg/ml i goldperioden til ca. 1,2 µg/ml ved kælvning En mulig forklaring på faldet af Evitamin koncentration i plasma i tiden omkring kælvning kan være, at koncentrationen af plasmalipider ligeledes er lav i denne periode. Goldkøer har pga. fodringen generelt lavere koncentrationer af cirkulerende plasmalipider end lakterende køer (Herdt & Stowe, 1991; Weiss et al., 1994a). Denne lave koncentration af plasmalipider kan medføre en reduktion i absorptionen af E vitamin i tarmen. Endvidere kan det lave niveau af Evitamin i plasma til dels skyldes, at goldkøer i nogle tilfælde får foder af ringere kvalitet (krybbeaffald, m.m.), der generelt har et lavere indhold af Evitamin samt at foderoptagelsen og tildelingen er nedsat. Stress (kælvning, foderskift, m.m.) og koens almene sundhedstilstand kan tillige påvirke E vitamin koncentrationen i plasma gennem øget forbrug. Umiddelbart efter kælvning er foderoptagelsen stadig lav, hvilket sammen med en høj Evitamin udskillelse til colostrum, der har et meget højt indhold af Evitamin, kan være årsag til, at E vitamin niveauet først stiger omkring en uge efter kælvning. 13
Selv om der gives tilskud af Evitamin ses samme forløb af Evitamin i plasma omkring kælvning, men på et højere niveau (figur 2.3). Vit. E (µg/ml) 10 8 6 4 2 0 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M åneder i laktationen Figur 2.3 Plasmakoncentrationen af Evitamin (µg αtocopherol/ml) hos kontrolkøer ( ) og køer suppleret med henholdsvis 1.000 mg/dag i goldperioden og 500 mg/dag i laktationen ( ). Basalration indeholdt: 300 mg (goldkøer) og 1.000 mg Evitamin/dag (øvrige) (mod.e. Batra et al., 1992b). Sammenfattende observeres der ved usupplerende fodringer en væsentlig lavere E vitamin koncentration i plasma omkring kælvning end niveauet på 3 ug/ml, der må anses for nødvendig for at opnå optimal immunfunktion (jf. afsnit 2.3). Ved tilskud af betydelige mængder Evitamin i tiden omkring kælvning er det muligt at øge plasmaindholdet af Evitamin, og til en vis grad at udligne reduktionen af Evitamin i plasma omkring kælvning. Koncentrationen af Evitamin i plasma afhænger således i høj grad af størrelsen af E vitamin tildelingen. Således fandt Weiss et al. (1990a) en korrelation på henholdsvis 0,75 og 0,67 mellem Evitamin tildelingen og plasmakoncentrationen af Evitamin hos henholdsvis goldkøer og køer i den tidlige laktation. Tabel 2.3 viser den forventede koncentration af Evitamin i plasma ved forskellig tildeling. Tabel 2.3 Koncentrationen af Evitamin i plasma (µg/ml) hos goldkøer og køer i den tidlige laktation afhængig af den daglige tildeling af Evitamin (mg/ko/dag) (mod.e. Weiss et al., 1990a). Daglig Evitamin tildeling (mg/ko/dag) 200 400 600 800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 Goldkøer 1,6 2,4 3,1 3,9 4,7 5,4 6,2 6,9 7,7 8,5 Lakterende køer 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 Tallene i tabellen er fremkommet på baggrund af følgende ligninger (Weiss et al., 1990a): Goldkøer: [Plasma] Evitamin = 0,85 + 0,0038 x Foder Evitamin Lakterende køer: [Plasma] Evitamin = 1,19 + 0,0010 x Foder Evitamin 14
De danske normer for Evitamin tildeling angives til 400800 mg/dag (Strudsholm et al., 1999), hvor den højeste tildeling gælder, hvis der anvendes meget polyumættet fedt, udelukkende konserveret foder, eller der er lav selen status. Tabel 2.4 viser, at goldkøer skal tildeles i alt mindst 600 mg/dag og lakterende køer i alt 1.6001.800 mg/dag, hvis der skal opnås en plasmakoncentration af Evitamin på ca. 3 µg/ml. Mælkens indhold af Evitamin Mælkekirtlen kan ikke syntetisere Evitamin, og som følge heraf relaterer mælkens indhold sig til blodplamaets indhold (Hogan et al., 1996). Mængden af Evitamin udskilt i mælken når dog et plateau. StLaurent et al. (1990) observerede således ingen stigning i mælkens indhold af Evitamin på trods af, at plasmakoncentrationen af E vitamin steg, hvilket er i overensstemmelse med resultater fundet af Jensen et al. (1999). Ifølge Jensen et al. (1999) kan denne udskillelse i mælken beskrives ved hjælp af en mætningskurve. Denne kurve er endvidere uafhængig af mælkeydelsen og er kun afhængig af koens Evitamin status og dens genetiske baggrund. Den gennemsnitlige maksimale daglige udskillelse for de 38 køer der indgik i forsøget blev beregnet til 32 mg αtocopherol med signifikant forskel mellem de tre kofamilier (samme far), der indgik i forsøget. Jensen & Nielsen (1996) fandt hos køer med samme Evitamin status før forsøgets begyndelse, at størrelsen af Evitamin tildelingen samt indholdet af Evitamin i plasma bliver reflekteret i mælken, hvilket er illustreret i figur 2.4. 12 60 Vit. E (µg/ml plasma) 10 8 6 4 2 50 40 30 20 10 Vit. E (µg/g fedt) K_Plasma S_Plasma K_Mælk S_Mælk 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Dage 0 Figur 2.4 Koncentrationer af αtocopherol i plasma (µg/ml) og i mælkefedt (µg/g fedt) hos kontrolkøer (K) og supplerede køer (S), der blev injekteret med 10.000 mg dlαtocopheryl acetat ved dag 0. Basalration indeholdt omkring 500 mg E vitamin /ko/dag. Køerne i forsøget havde kælvet fire uger før forsøgets start (mod.e. Jensen & Nielsen, 1996). Det ses endvidere at indholdet af Evitamin i plasma hos supplerede køer nåede maksimum ved dag 2, hvilket ligeledes var tilfældet for Evitamin indholdet i mælken. 15
En øget tildeling af Evitamin til malkekvæg har vist, at kunne medføre en stigning på mellem 2080% i mælkens tocopherol indhold, hvilket er illustreret i nedenstående tabel 2.4. Tabel 2.4 Effekten af tocopherol tilskud tilsat foderrationen eller injekteret på mælkens indhold af tocopherol udtrykt som henholdsvis µg/ml mælk og µg/g mælkefedt. Indhold af tocopherol (mg/ko/dag) Tocopherol i mælk i foderrationen µg/ml mælk µg/g fedt Reference 500 mg 0,7 13,7 Dunkley et al. (1960) 1.000 mg 1,6 32,0 440 mg 1,0 27,9 Dunkley et al. (1966) 440 mg + 500 mg tilsat 2,1 56,5 475 mg 0,7 21,0 Dunkley et al. (1967) 475 mg + 400 mg tilsat 0,9 23,4 200 mg 0,5 13,1 St.Laurent et al. (1990) 200 mg + 3.000 mg tilsat 0,8 22,3 Lucerne, helsædsensilage og 0,3 6 Hidiroglou (1989) kraftfoder som + 5.000 mg inj. 4 u.e.k. 1,6 34 250 mg (lucernens.) 200 mg (helsædens.) 250 mg + 7.000 mg tilsat 200 mg + 7.000 mg tilsat 1,0 0,9 1,8 1,6 28 (2433) 24 (2325) 47 (3553) 41 (2251) Nicholson & St.Laurent (1991) 500 mg 500 mg + 10.000 mg inj. 1.000 mg 1.000 + 10.000 mg inj. 1.000 mg tilsat 9.000 mg tilsat Helsæd, hø og kraftfoder hele året Helsæd, hø og kraftfoder (vinter) + afgræsning (sommer) 0,6 1,9 1,1 2,7 0,30,6 1,62,1 0,8 1,8 16 50 30 72 7,714,4 4054 21,8 (524) 29,7 (1552) Jensen & Nielsen (1996) Atwall et al. (1990) Shingoethe et al. (1978) De angivne mængder er foderrationens indhold af naturligt forekomne tocopheroler, hvis andet ikke er nævnt. Det tilsatte tocopherol er af typen: dlαtocopheryl acetat. Uger før og efter kælvning angives hhv. som u.f.k. og u.e.k. Tilsatte tocopherol er af typen: dαtocopheryl acetat. Tallene i parentes angiver minimum og maksimumsværdier for mælkefedtes indhold af tocopherol, hvor disse er angivet. Det fremgår af tabel 2.4, at der forekommer relativt store variationer i mælkens indhold af tocopheroler, afhængig af tilskuddets størrelse, men tillige som følge af hvilke kilder af Evitamin der anvendes. Det fremgår således, at den største stigning i mælkens tocopherol indhold forekom med den naturlige form af tocopherol i form af forårsgræs (Schingoethe et al., 1978), hvorimod den laveste stigning var ved fodertilskud med dlαtocopheryl acetat (Dunkley et al., 1967). 16
Endvidere vil køernes Evitamin status før forsøgenes start have betydning for andelen af Evitamin i mælken, idet køer med en optimal Evitamin status udskiller mere Evitamin i mælken end køer med lav Evitamin status (Jensen & Nielsen, 1996). Forskellene imellem de enkelte forsøg kan ligeledes skyldes forskelle i prøveudtagningstidspunkt. Således fandt Jensen & Nielsen (1996), at Evitamin indholdet i mælken allerede nåede maksimum (en stigning på 6570%) to dage efter injektion med 10.000 mg dlαtocopheryl acetat. En uge efter injektionen var mælkens indhold af Evitamin næsten halveret (4045%), hvilket understreger, at tidspunktet for prøveudtagning har stor betydning for de resultater som fremkommer. Langtidseffekter af koens vitaminforsyning er undersøgt af Schingoethe et al. (1978), der i en forsøgsperiode på 4 år udelukkende fodrede et hold køer med opbevaret foder, medens et andet hold kom på græs om sommeren. I hvert hold indgik 20 Holstein Friesian køer. Det opbevarede foder bestod af helsædsensilage, lucernehø samt kraftfoder efter mælkeydelse. Det friske græs bestod primært af lucerne og hejregræs. Mælkeprøver blev taget dagligt i det 2. og 3. forsøgsår, og hver måned i det 4. forsøgsår. Resultaterne af det omtalte forsøg er illustreret i figur 2.5. Evitamin (µg/g fedt) 60 50 40 30 20 10 0 jan. feb. marts april maj juni juli aug. sept. okt. nov. dec. Figur 2.5 Månedlige variationer i mælkefedtets indhold af Evitamin (µg/g fedt) hos køer fodret med opbevaret foder hele året (150400 mg/ko/dag) ( ) og hos køer fodret med frisk græs om sommeren (8002.400 mg/ko/dag) (medium majseptember) og opbevaret foder i vinterperioden (150400 mg/ko/dag) ( ) (mod.e. Schingoethe et al., 1978). Det ses, at Evitamin indholdet i mælken hos køer på græs ( ) forblev høj i denne periode med et gennemsnit på knap 50 µg Evitamin/g mælkefedt. Derefter ses et fald i vinterperioden, hvor køerne ikke havde adgang til frisk foder, til under 30 µg Evitamin/g fedt. Hos køerne, der udelukkende blev fodret med opbevaret foder ( ), forblev koncentrationen af Evitamin derimod under 25 µg Evitamin/g fedt, dog med undtagelse af oktober og november måned, hvilket kan skyldes, at der blev påbegyndt fodring med nyt ensilage og hø. Nicholson & St. Laurent (1991) fandt, at ved Evitamin tilskud i vinterperioden (7.000 mg Evitamin/dag) var det muligt at opnå tilsvarende høje indhold af Evitamin (gns. 45 µg/g fedt) som hos det hold køer, der fik frisk græs i forsøget illustreret i fi 17
gur 2.9 ( ). Foruden sæsonforskelle fandt Nicholson & St. Laurent (1991), at køer fodret med lucerneensilage havde en signifikant højere plasmakoncentration af E vitamin end køer fodret med helsædsensilage. Der var dog ikke signifikante forskelle i mælkens Evitamin indhold eller mælkens resistens mod oxideret smag afhængig af grovfodertype. Tilsvarende resultater er fundet af Atwall et al. (1991). I et dansk forsøg med 40 SDMkøer er lignende resultater fundet af Jensen & Nielsen (1995), hvilket er illustreret i figur 2.6. E_Fedt (µg/g mælkefedt) 40 30 20 10 Kons. Foder Afgræsning 0 0 5 10 15 20 25* 30 35 40 45 50 Uger i laktationen Figur 2.6 Indholdet af Evitamin i mælkefedtet (µg/g mælkefedt) hos køer fodret med en Evitamin fattig ration (byghalm og kraftfoder) i goldperioden. Fra kælvning og indtil 25 uger efter kælvning (*) blev køerne fodret med græs og helsædsensilage samt kraftfoder, hvorefter køerne blev inddelt i to hold, hvor det ene fortsatte på førnævnte ration ( ), medens det andet hold kom på græs i fem uger ( ) (mod.e. Jensen & Nielsen, 1995). Det fremgår af figur 2.6, at indholdet af Evitamin i mælkefedtet hos køer fodret med konserveret foder var lavest i den tidlige laktation (<20 µg/g mælkefedt i den tidlige laktation) for derefter at stige hen i gennem laktationen. Det ses endvidere, at indholdet af Evitamin i mælkefedtet steg betydeligt hos køer, der kom på græs i fem uger samt at niveauet hos disse køer forblev højere i den resterende laktationsperiode. Ved optagelse af frisk græs, ensilage af god kvalitet og/eller ved tilskud af Evitamin er det således muligt at øge mælkens indhold af Evitamin, hvilket har betydning for mælkens kvalitet og holdbarhed. 2.5 BETYDNING FOR MÆLKENS KVALITET Fedtdråber i mælk er beskyttet og adskilt fra hinanden af en tynd dobbeltlaget membran, der benævnes MFGM (Milk Fat Globule Membrane). Denne membran består af protein, phosholipider, triglycerider, enzymer og mikronæringsstoffer herunder E vitamin (Jensen et al., 1991; Hogan et al., 1996; Jensen & Nielsen, 1996). Oxidation af mælkefedt menes at begynde på overfladen af MFGM, hvorfor dennes indhold og sammensætning af antioxidanter er af stor betydning. Den oxiderede smag skyldes dannelse af flygtige carbonylforbindelser fra oxidation af umættede fedtsyrer fra fedtdråbernes membran (Nicholson & St.Laurent, 1991). Mængden af αtocopherol associeret med MFGM betragtes som værende af stor betydning for mælkens resistens mod oxidering. 18
I et forsøg af Jensen & Nielsen (1996) var αtocopherol det eneste fedtopløselige vitamin, som blev fundet i MFGM, mens der i den øvrige del af mælkefedtet foruden αtocoopherol fandtes retinol og βcaroten. Dette understreger yderligere Evitamin s betydning for mælkens beskyttelse mod oxidation. Mængden af αtocopherol i MFGM afhænger af det totale indhold af tocopherol i mælkefedtet, dog således at indholdet i MFGM mættes ved et indhold på 5060 µg/g mælkefedt (Jensen & Nielsen, 1995). Mælkefedt indeholder ifølge Jensen & Nielsen (1996) mellem 1575 µg tocopherol/g fedtsyrer med et gennemsnit på 2535 µg tocopherol/g fedtsyrer. Lignende resultater er fundet af Hermansen (1995), Miller et al. (1995) og Jensen et al. (1999), som fandt et gennemsnitligt indhold af Evitamin på henholdsvis 2032, 2337 og 1242 µg/g mælkefedt. I tabel 2.5 er effekten af forskellige tilskudsniveauer af Evitamin på mælkefedtets indhold af tocopheroler belyst samt på mælkens kvalitet og holdbarhed udtrykt som den oxidative smag. 19