Holdbarhed på Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) på Cobas 8000

Holdbarhed på Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) på Cobas 8000 Forfatter:, 09-12-89, studienr.: 60080393 Bioanalytikeruddannelsen, PH Metropol, modul 14, 7. oktober 2013 2. januar 2014 Vejledere: Kathrine Overgaard Foss Jensen (bioanalytikerunderviser på KB3011) Conni Jølving (bioanalytikerunderviser på PH Metropol) Antal sider, inkl. bilag: 68 Antal anslag, ekskl. mellemrum: 33.719 Billede: http://www.cobas.com/home/products_services/cobas_8000_modular_analyzer_series.html Denne opgave er udarbejdet af studerende ved PH Metropol. Den foreligger ukommenteret fra uddannelsens side og er således et udtryk for de studerendes egne synspunkter Opgaven må gerne anvendes internt i uddannelsen

2/68

Forord Projektet er udført på klinisk biokemisk afdeling på Rigshospitalet (KB3011) og har i sidste ende til formål at konkludere, om KB3011 fortsat kan benytte Li-Heparin-glas til analysering af parathyreoideahormon (PTH). Jeg,, vil på gruppens vegne takke vores vejledere, Kathrine Overgaard Foss Jensen og Connie Jølving, samt ansatte på KB3011 for deres hjælp og støtte til vores projekt. I dette bachelorprojekt benyttes Vancouver til angivelse af referencer (1) og der benyttes skemaer, figurer og tabeller i opgaven, der forekommer i kronologisk rækkefølge. Resumé Indledning: Under implementering af Cobas 8000 kan det muligvis hænde, at en veneblodprøve henstår i 4 timer inden centrifugering. Det undersøges, om der er nogen forskel af klinisk betydning ved måling af PTH i hhv. Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod ved tiden 0 og ved 4 timer ved både henståen som plasma og fuldblod. Projektet har til formål at finde ud af, om der kan benyttes Li-Hep-veneblod i stedet for K3EDTA-veneblod til måling af PTH samt at konkludere, om en veneblodprøve til måling af PTH kan henstå i 4 timer som hhv. plasma eller fuldblod. Metoder: Der indsamles veneblod fra 30 forskellige patienter fra ambulatoriet og hospitalets sengeafdelinger. Veneblodet opbevares ved 20-25 C og analyseres til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som plasma eller fuldblod ved brug af Cobas 8000 og analyseprincippet ECLIA. Resultater: Analyseresultaterne præsenteres i 7 xy-plots som lineære regressioner, der alle er understøttet af Bland-Altman-plots. Til hver lineær regression ses en regressionsligning samt en korrelationskoefficient. Konklusion: Der ses ingen forskel af klinisk betydning, hvad enten der benyttes Li-Hepveneblod eller K3EDTA-veneblod, samt om veneblodet analyseres ved tiden 0 eller efter henståen i 4 timer som plasma eller fuldblod. Der kan dermed fortsat benyttes Li-Hepveneblod i stedet for K3EDTA-veneblod på KB3011. Dette er med det forbehold, at der kun er medtaget én patient med en høj PTH-koncentration på ca. 32 pmol/l. 3/68

Indhold 1. Indledning... 6 1.1. Problembaggrund... 6 1.2. Problemformulering... 8 1.2.1. Begrebsdefinitioner... 8 1.3. Teori... 8 1.3.1. PTH... 8 1.3.2. Li-Hep og K 3EDTA...10 1.4. Metodevalg/afgrænsning...10 1.4.1. Valg af antal patienter/prøvemateriale...10 1.4.2. Metodeopsætning i praksis...12 1.4.3. Databehandling og statistik...15 2. Materialer, apparaturer og metoder...16 2.1. Materialer og apparaturer...16 2.2. Metoder...17 3. Resultater...18 3.1. Sammenligning mellem P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i Li-Hep-glas og K 3EDTA-glas...20 3.2. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K 3EDTA-veneblod...23 3.3. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K 3EDTA-veneblod...25 4. Diskussion...27 4.1. Sammenligning mellem P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i Li-Hep-glas og K 3EDTA-glas...27 4.2. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K 3EDTA-veneblod...28 4.3. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K 3EDTA-veneblod...29 4.4. Samlet diskussion...30 5. Konklusion...33 6. Perspektivering...33 7. Litteraturliste...34 8. Bilag...35 8.1. Bilag 1...36 4/68

8.2. Bilag 2...37 8.3. Bilag 3...38 8.4. Bilag 4...39 8.5. Bilag 5...40 8.6. Bilag 6...41 8.7. Bilag 7...42 8.8. Bilag 8...43 8.9. Bilag 9...44 5/68

1. Indledning Dette kapitel inkluderer problembaggrund, problemformulering, teorien bag P- Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) (PTH) og antikoagulanserne Lithium-Heparin (Li- Hep) og K3EDTA, samt metodevalg/afgrænsning med overvejelser omkring den praktiske udførelse af undersøgelsen. 1.1. Problembaggrund Klinisk biokemisk afdeling på Rigshospitalet (KB3011) er i 2013 ved at implementere Cobas 8000 fra Roche A/S (Cobas 8000), som i fremtiden skal benyttes til diverse biokemiske analyser i stedet for analyseudstyret, Hitachi Modular fra Roche A/S (Modular). Cobas 8000 er bygget til at blive et fuldautomatiseret analyseapparat og næsten hele processen fra modtagelse til analysering foregår i et lukket system. Veneblodprøver modtages via rørpost, som sættes i funktion som det sidste led i implementeringen af Cobas 8000. Veneblodprøverne bliver derefter sendt til centrifugering og efter centrifugering sendes veneblodprøverne automatisk til analysering. Rørpost og det præanalytiske modul er ikke sat op under dette projekt og derfor foregår modtagelse af veneblodprøver og centrifugering af disse manuelt. Når Cobas 8000 er sat op fuldstændig, skelner apparatet ikke mellem analyser, der har en kort holdbarhed i forhold til de analyser, der har en længere holdbarhed. Derfor kan nogle veneblodprøver henstå uhensigtsmæssigt i længere tid både inden og efter centrifugering. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) kan muligvis være forskellig, hvis denne henstår i længere tid som henholdsvis fuldblod og plasma, end anbefalet, grundet en kort halveringstid for PTH (2, s. 4). Se skema på næste side, hvor forskellige holdbarheder for P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) er nævnt. Kilderne er nævnt i parentes og er at finde i litteraturlisten. 6/68

Fuldblod Centrifugeret (plasma) Opbevaret ved rumtemp. Opbevaret ved rumtemp. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) Li-Hep 4 timer (2, s. 9) - K 3EDTA 3 døgn (3) 2 døgn (2, s. 4) (EDTA-plasma) Skema 1: Viser holdbarheden for P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i hhv. fuldblod og plasma, samt hvor meget holdbarheden af fuldblod og plasma muligvis kan forlænges, i henhold til PTH, ved at benytte K3EDTA i stedet for Li-Hep. Holdbarhederne er angivet ifølge forskellige kilder. Den anbefalede holdbarhed af fuldblod på 4 timer ifølge metodelisten (2, s. 9) ønskes undersøgt, da denne holdbarhed muligvis ikke altid vil blive overholdt, selvom det tilstræbes under implementeringen af Cobas 8000. Ved måling af P- Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) benytter KB3011 veneblod fra Li-Hep-glas (2, s. 9) og ønsker fortsat at benytte dette, da Li-Hep-glas i forvejen benyttes til at analysere andre parametre på Cobas 8000. Producenten, Roche Diagnostics A/S, anbefaler dog at benytte veneblod fra K3-EDTA-glas til måling af PTH, da dette prøveglas er testet og fundet acceptabelt (2, s. 4), se evt. skema ovenfor. Da der ønskes korrekte analyseresultater for korrekt behandling af patienterne, mens Cobas 8000 implementeres og efterfølgende, ønskes der derfor fra KB3011, at der udføres et bachelorprojekt af 3 bioanalytikerstuderende, der omhandler følgende: En undersøgelse af, om der er forskel på P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l), hvis veneblodprøver, der skal analyseres for denne parameter, udtages i henholdsvis Li-Hep-glas eller i K3-EDTA-glas. Derudover ønskes der, i samme projekt, også en undersøgelse af, om der er forskel på holdbarheden af fuldblod og plasma i forhold til måling af PTH, hvis veneblodprøven henstår i længere tid som henholdsvis plasma og fuldblod end, som tidligere nævnt, anbefalet. 7/68

1.2. Problemformulering Er der forskel af klinisk betydning på analyseresultaterne for P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l), taget fra venepunktur, når: der anvendes Li-Hep-glas eller K3EDTA-glas? der analyseres ved tiden 0 og efter 4 timer? fuldblod henstår i 4 timer inden centrifugering og analysering i forhold til tiden 0? 1.2.1. Begrebsdefinitioner Tiden 0 defineres som udgangspunkt som analysering efter analyseforskriften, men da der kan gå op til 4 timer ifølge analysevejledningen ift. centrifugering af veneblodprøven (2, s. 9), aftales det, at tiden 0 i dette projekt defineres som centrifugering og analysering efter maksimalt 1½ time efter første blodprøvetagning grundet den tid, det tager at gå en morgenrunde eller at indsamle veneblodprøver på ambulatoriet. 1.3. Teori I dette afsnit gennemgås teorien og analyseprincippet bag PTH, samt hvilke begrænsninger (interferenser) analysen har. Teorien bag antikoagulanserne Li-Hep og K3EDTA er også beskrevet. 1.3.1. PTH PTH er en forkortelse for parathyreoideahormon, som består af en polypeptidkæde, der indeholder 84 aminosyrer og har en molekylvægt på omkring 9500 daltons. Hormonet dannes i parathyreoidea og udskilles via blodbanen. I PTH findes en biologisk aktiv N- terminal, som har en halveringstid på kun få minutter. Forstyrrelser i parathyreoidea kan bl.a. medføre hypo-/hypercalcæmi samt hypo-/hyperparathyreoidisme og måling af PTH benyttes ofte i forbindelse med sidstnævnte. Analyseprincippet er et immunkemisk sandwichprincip (ECLIA), hvor et monoklonalt antistof, mærket med biotin, binder sig til N-fragmentet, og et monoklonalt antistof, mærket med et rutheniumkompleks, binder sig til C-fragmentet. Analysen er ikke sensitiv over for interferenser fra icterus, lipæmi og hæmolyse, med mindre disse er synlige. Hvis der, under implementeringen af Cobas 8000, ses synlig icterus, lipæmi eller hæmolyse, kan Cobas 8000 sættes til at lave et plasmaindeks, der viser, om interferensen er for stor 8/68

til at afgive et validt svar på P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) (2, s. 4). Når Cobas 8000 er fuldstændig sat op, måler den alle tre plasmaindekse automatisk. Referenceintervallet ligger mellem 1,6-6,9 pmol/l, samt måleområdet for analysepparatet ligger mellem 0,127-530 pmol/l (2, s. 5). Nedenfor ses figur 1, der viser analyseprincippet bag P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l). Figur 1: Analyseprincip for P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) (ECLIA). 9/68

1.3.2. Li-Hep og K3EDTA Li-Hep er en forkortelse for Lithium-Heparin. Heparin forekommer naturligt som antikoagulans og produceres af mastceller og de basofile celler. Heparin fungerer som antikoagulans ved at binde sig til antithrombin III, som er en proteaseinhibitor. Ved hjælp af bindingen mellem antithrombin III og heparin forekommer et aktivt site i antithrombin III og det inaktiverer thrombin og andre proteaser, der findes i koagulationsprocessen. Antikoagulanset er coated på indersiden af prøverør med grøn prop og anvendes til analyser, som udføres på bl.a. Modular og Cobas 8000 (4, s. 47). K3EDTA er en forkortelse for Kalium(III)-EDTA. EDTA binder Ca 2+ i blodet og hæmmer dermed koagulationen. Dette er en vigtig faktor, da Ca 2+ er nødvendigt for en række enzymer, der fremmer koagulationsprocessen. Antikoagulanset er coated på indersiden af prøverør med lilla prop og anvendes hovedsageligt til hæmatologiske analyser på bl.a. Sysmex (4, s. 48). 1.4. Metodevalg/afgrænsning I dette afsnit gennemgås alle overvejelser i forbindelse med den praktiske udførelse af projektet. Det inkluderer bl.a. valg af patienter/prøvemateriale, metodeopsætningen i praksis samt databehandling og statistik. 1.4.1. Valg af antal patienter/prøvemateriale Når der vælges patienter, lægges der fokus på, at hele måleområdet for analysen dækkes så vidt muligt (7, s. 6) og at undersøgelsen afspejler hverdagens indkomne veneblodprøver. Det kan dog blive problematisk at dække hele måleområdet, da Cobas 8000 har et måleområde for P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) på op til 530 pmol/l (2, s. 5). Det tilstræbes derfor, at der udtages veneblod på patienter fra både ambulatoriet og sengeafdelinger, når det er muligt, da undersøgelsen på denne måde kommer til at inkludere forskellige typer patientgrupper, så der forhåbentlig måles PTHkoncentrationer der ligger under/over og inden for referenceintervallet som minimum. Patienternes PTH-koncentrationer kendes ikke på forhånd, da patienterne udvælges tilfældigt og deltager frivilligt. Det er derfor, som udgangspunkt, ikke sikkert, at måleområdet eller referenceområdet både over/under bliver dækket pga. den tid, der er afsat til projektet. Af planlægningsmæssige årsager ønskes det, at projektet udføres 10/68

tirsdag og onsdag i uge 43 2013, da Cobas 8000 er ledig i dette tidsrum. På denne måde har vi, som studerende, apparatet for os selv, og der vil dermed ikke være oplæring af personale på apparatet i disse to dage. Den første dag udtages veneblod på patienter fra ambulatoriet og den efterfølgende dag på både hospitalsafdelinger og fra ambulatoriet. Ifølge Vejledning til validering af analysemetoder (5, s. 6) ønskes der ca. 60 forskellige patienter for at opnå et statistisk grundlag, når databehandling påbegyndes, men pga. økonomiske årsager og at selve PTH-analysen allerede er valideret, kræves kun ca. 25-30 patienter. Det er fordi, at dette projekt ikke omhandler en egentlig validering, men derimod en sammenligning mellem analyseresultater, der er fremkommet i to forskellige typer prøveglas og efter forskellige tider ved henståen som plasma eller fuldblod. Det kan ske undervejs, at visse veneblodprøver må ekskluderes grundet synlig hæmolyse, lipæmi eller icterus. Hvis dette ikke umiddelbart er synligt, analyseres veneblodprøven, og ekskluderes dermed ikke, da PTH-analysen, som nævnt i teoriafsnittet, ikke er sensitiv over for de omtalte interferenser, hvis de ikke er synlige apparatet er heller ikke sat til at lave plasmaindeks i dette projekt, da vi i projektet ser på veneblodprøverne, inden de analyseres, for at konstatere om der forefindes en eller flere interferenser. Når Cobas 8000 er sat op fuldstændig, vil det automatisk kunne finde frem til, om der er for meget af én eller flere af interferenserne til at kunne analysere veneblodprøven. Hvis nogle af veneblodprøverne ekskluderes, udtages nye veneblodprøver fra andre patienter, så det ønskede antal på ca. 25-30 veneblodprøver opnås som et minimum. Prøvematerialet, der anvendes, er, som tidligere nævnt, veneblod udtaget i 4 ml Li-Hep-glas og 2 ml K3EDTAglas. Det er vigtigt, at prøveglasset indeholder de nævnte voluminer, da der analyseres på primære glas, dvs. de prøveglas som veneblodet som udgangspunkt er udtaget i. Da der udtages veneblod i 4 glas pr. patient, overvejes det, om der vil være større sandsynlighed for, at patienterne vil takke nej til at deltage i projektet, da de muligvis synes, at det er mange glas. De to nævnte prøvetagningsglas vælges, da KB3011 allerede benytter Li-Hepglas og som det også nævnes i problembaggrunden, anbefaler producenten, Roche Diagnostics A/S, at benytte K3EDTA-glas (2, s. 4). Som kvalitetssikring af projektet benyttes kalibratorer fra Roche til udarbejdelse af kalibreringskurver og kontroller tilhørende Biorad. Det giver en større validitet af analyseresultaterne, at kontrollerne er fra Biorad 11/68

frem for producenten selv. Det er vigtigt, at alle kalibratorer har det samme LOTnr. og det samme gælder for kontrollerne, så analyseresultaterne, der fremkommer ved de valgte tider, er valide og dermed sammenlignelige. På denne måde ekskluderes evt. fejlkilder, som skyldes forskellige LOTnr. på f.eks. kalibratorerne, da målet er at evt. analyseforskelle kun skyldes enten brugen af Li-Hep eller K3EDTA ved de valgte tider (5, s. 5). 1.4.2. Metodeopsætning i praksis Som nævnt i punkt 1.4.1. tilstræbes det at udtage veneblod på patienter fra både ambulatoriet og fra sengeafdeling. I forbindelse med blodprøvetagningen gøres hver enkel patient opmærksom på, at veneblodprøven bruges til kvalitetssikring samt til et bachelorprojekt for at imødekomme kravene inden for de etiske rammer. Der indhentes skriftligt samtykke, ved at patienten får vist en formular (bilag 1), som underskrives, hvis han/hun ønsker at give blod til projektet. Patienten har ret til at få en kopi af formularen (6). Den første dag udtages veneblodprøver på patienter fra ambulatoriet, da det denne dag ikke er muligt at komme på morgenrunde grundet opstart af Cobas 8000, kalibrering og analysering af kontroller om morgenen (se evt. bilag 2-6). For begge prøvetagningsglas (Li-Hep og K3EDTA) gælder det, at veneblodet centrifugeres, så plasma adskilles fra de øvrige blodkomponenter, og dette er essentielt, idét der ønskes at måle koncentrationen af PTH i plasma. Som det fremgår af problemformuleringen, vælges det at opbevare fuldblod og plasma ved rumtemperatur (ca. 20-25 C) frem for ved nedfrysning eller køl. Dette skyldes, at fuldblod og plasma normalt henstår ved rumtemperatur i det fuldautomatiserede apparat, Cobas 8000, indtil henholdsvis centrifugering og analysering finder sted. Projektet vil på denne måde give en realistisk begrundelse for, hvorvidt det kan lade sig gøre at fuldblod og plasma henstår i længere tid i apparatet end anbefalet for PTH og om det kan være en bedre løsning at anvende K3EDTA-glas frem for Li-Hep-glas. Derudover er køl eller nedfrysning kun essentielt, hvis det viser sig, at veneblodprøver, med henblik på PTH, skal analyseres inden for en tid, som ikke overholdes ved at veneblodprøverne henstår i apparatet (2, s. 4). Som det fremgår af problemformuleringen, vælges specifikke tider; analysering ved tiden 0 og ved 4 timer for både plasma og fuldblod. 12/68

Nedenfor ses et skema, der viser, hvilke tider, der vælges til dette projekt, samt hvilke holdbarheder, der angives ifølge forskellige kilder. Kilderne er nævnt i parentes og er at finde i litteraturlisten. P- Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) Valgte tider Fuldblod opbevaret ved rumtemp. Ved 4 timer Valgte tider Plasma opbevaret ved rumtemp. 1½ time (tiden 0) Ved 4 timer Holdbarhed ifølge kilder Fuldblod opbevaret ved rumtemp. 4 timer (2) 6 timer (7) 24 timer (EDTA) (7) 3 døgn (3) Skema 2: Viser de valgte tider ved både fuldblod og plasma for analysering af PTH, samt de givne holdbarheder af fuldblod og plasma ifølge forskellige kilder. Den valgte tid, tiden 0 (1½ time), vælges, da en veneblodprøve, med henblik på P- Holdbarhed ifølge kilder Plasma opbevaret ved rumtemp- 2 døgn (EDTA) (2) Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l), ifølge metodelisten, skal centrifugeres inden 4 timer (se evt. afsnit 1.2.1., s. 8). Analysering inden for dette tidsinterval er derfor projektets referencemåling. Tiden, ved 4 timer, vælges, da det er relevant at finde ud af, om en ucentrifugeret/centrifugeret veneblodprøve kan tåle at henstå i 4 timer, som tidligere beskrevet er anbefalingen. Derudover er det tilmed muligt, med disse tider, at undersøge, om der skal benyttes K3EDTA-glas frem for Li-Hep-glas, hvis nogle veneblodprøver henstår i 4 timer, eller om KB3011 fortsat kan benytte Li-Hep-glas. 13/68

Nedenfor ses et flowdiagram, der i kort form viser, hvordan projektet udføres i praksis. Se evt. også bilag 7 for metodeopsætning i praksis. Figur 2: Flowdiagram over metoden i praksis Opstart af Cobas 8000 Fremstilling af kalibratorer samt kalibrering. Kontroller analyseres (kvalitetssikring) Indsamling af skriftlig og mundtligt samtykke Der udtages 4 veneblodprøver på én patient (2 x Li-Hep-glas og 2 x K 3EDTA-glas) 1 x Li-Hep og 1 x K 3EDTA veneblodprøve centrifugeres og analyseres ved tiden 0 1 x Li-Hep og 1 x K 3EDTA veneblodprøve henstilles som fuldblod i 4 timer De analyserede veneblodprøver henstilles i 4 timer som plasma og analyseres derefter Fuldblod centrifugeres og analyseres Veneblodprøverne destrueres ved afslutning af den praktiske del af projektet 14/68

1.4.3. Databehandling og statistik Til databehandling opsamles alle analyseresultater i en tabel i resultatafsnittet. Til sammenligning af metoderne benyttes lineær regression samt Bland-Altman plot vha. Excel (5, s. 6). Ved lineær regression betragtes analysering ved tiden 0, hvor fuldblod er centrifugeret og analyseret inden for maksimalt 1½ time, som den sande værdi, da denne metode netop allerede benyttes på KB3011, og denne metode holdes derfor ud ad x-aksen. Den anden metode (centrifugering og analysering ved 4 timer) holdes op ad y- aksen. Når der sammenlignes to forskellige glastyper, holdes Li-Hep-glas ud ad x-aksen, da denne også betragtes som den sande værdi, da det er denne type glas, KB3011 allerede benytter. Der udføres lineær regression for hver enkel tid sammenlignet med den sande værdi. Til understøttelse af lineær regression udføres Bland-Altman plot (5, s. 6), der viser, hvor meget det enkelte analyseresultat fra de enkelte metoder, afviger fra x af den sande værdi og den anden metode (8). 15/68

2. Materialer, apparaturer og metoder I dette kapitel gennemgås etik, hvilke materialer og apparaturer, der benyttes, samt hvilke metoder, der anvendes til udførelsen af projektet. Patienterne gøres opmærksom på, at glassene indeholder hhv. 2 ml og 4 ml. Som tidligere beskrevet, indhentes skriftligt informeret samtykke fra hver enkel patient. For at anonymisere patienterne, mærkes veneblodprøveglassene med mærkater, der ikke associeres med de oprindelige mærkater, der er tilknyttet den enkelte patient. Herudover forbliver alle veneblodprøver i Danmark og de destrueres alle ved projektets afslutning (6). 2.1. Materialer og apparaturer Veneblod fra 30 forskellige patienter 60 x Vacuette 4 ml Li-Heparin-glas med gel fra producenten greiner bio-one, LOT.nr.: A12110VH, udløbsdato: 2014-05 60 x Vacuette 2 ml K3EDTA-glas, LOT.nr.: A130500M, udløbsdato: 2014-11 Lav kontrol: Liquichek Specially Immunoassay fra Biorad, LOT.nr.: 41691, udløbsdato: 2015-02-28 Høj kontrol: Liquichek Specially Immunoassay fra Biorad, LOT.nr.: 411693, udløbsdato: 2015-02-28 Kalibratorer: Cal1 og Cal2 fra Roche, LOT.nr.: 17290901, udløbsdato: 2014-08 Roche Cobas 8000, modul e 602 (beta) Universal 320 R Hettich Zentrifugen indstillet til 2200 g i 10 min., nr. 223277, kalibreret: 07-01-13 Finn-pipetter til afpipettering af kalibratorer: automatisk pipette Rh. 223572, 50-1000µL, kalibreret: 09.07.2013 og manuel pipette, 1A-13, 200-1000µL, kalibreret: 18.05.2010 16/68

2.2. Metoder I dette afsnit gennemgås fremgangsmåden i praksis trin for trin med uddybende forklaringer. Fremgangsmåde: 1. Der printes 120 etiketter 4 nye etiketter til hver patient. F.eks. patient 1 får tildelt følgende numre: 1,1lilla, 1,2lilla, 1,3grøn og 1,4grøn. Patient 2 får: 2,1lilla, 2,2lilla, 2,3grøn og 2,4grøn. Etiketterne sættes på veneblodprøveglassene. 2. Der udføres opstart af Cobas 8000, hvor kalibrering foretages efterfulgt af analysering af kontroller. Acceptintervallet for kontrollerne er på 10% grundet implementeringen af Cobas 8000. Derudover tjekkes udløbsdato og om kontrollerne har det samme LOTnr. Det samme gælder for kalibratorer og reagenser. 3. Herefter indsamles veneblodprøver fra hospitalsafdelinger og ambulatoriet. Veneblodprøverne fragtes manuelt til KB3011 inden for 1½ time. 4. Et Li-Hep-glas og K3EDTA-glas fra hver patient centrifugeres og analyseres med det samme. Resultaterne udskrives. Efterfølgende henstilles disse som plasma i 4 timer ved rumtemperatur (ca. 20-25 C). 5. De to andre (Li-Hep-glas og K3EDTA-glas) henstilles som fuldblod i 4 timer ved rumtemperatur (ca. 20-25 C). 6. Fuldblod fra punkt 5 centrifugeres efterfulgt af analysering og resultaterne udskrives. Plasma, fra punkt 4, som har henstået i 4 timer, analyseres anden gang og resultaterne udskrives. 7. Når alle veneblodprøverne er analyseret, forbliver de på KB3011 og destrueres ved slutningen af den praktiske del af projektet. 8. Databehandling. 17/68

3. Resultater I dette kapitel gennemgås alle resultater, der er præsenteret i 7 xy-plots som lineære regressioner, der hver især er understøttet af Bland-Altman plots. Herudover gennemgås kort kalibrering, analysering af kontroller og evt. fejlkilder. Undersøgelsesdesignet forløb uden problemer, dog med det forbehold at veneblodprøverne samt analysering fandt sted i et rum, der umiddelbart er indstillet til rumtemperaur (20-25 C), men denne blev ikke noteret. Kalibrering blev udført den første dag om morgenen som LOT-kalibrering uden komplikationer (bilag 2), og det samme gjaldt for analysering af kontroller både inden og efter analysering af veneblodprøverne begge dage (bilag 3-6). Veneblodprøverne blev udtaget fra hhv. 12 mænd og 18 kvinder i aldersgruppen 23-91 år (bilag 8). På næste side ses en tabel indeholdende samtlige analyseresultater af veneblodprøverne i undersøgelsen. Rådata ses i bilag 9. 18/68

Patient nr. Li-Hepveneblod analyseret til tiden 0 K3EDTAveneblod analyseret til tiden 0 Li-Hepveneblod (henstået som plasma) genanalyseret efter 4 timer K3EDTAveneblod (henstået som plasma) genanalyseret efter 4 timer Li-Hepveneblod (henstået som fuldblod) analyseret efter 4 timer K3EDTAveneblod (henstået som fuldblod) analyseret efter 4 timer [pmol/l] [pmol/l] [pmol/l] [pmol/l] [pmol/l] [pmol/l] 1 2,93 2,74 3,04 2,92 2,96 2,89 2 6,61 6,02 6,84 6,44 6,66 6,43 3 6,59 6,16 7,02 6,48 6,95 6,47 4 4,21 4,02 4,39 4,23 4,31 4,25 5 7,94 7,58 8,40 7,87 8,27 7,99 6 6,64 6,19 7,12 6,62 7,10 6,64 7 2,97 2,75 3,05 2,90 3,05 2,85 8 2,94 2,82 2,96 2,96 2,84 2,93 9 2,28 2,27 2,42 2,36 2,25 2,38 10 5,87 5,54 6,07 5,74 5,80 5,74 11 4,23 4,01 4,33 4,23 4,29 4,24 12 2,34 2,23 2,37 2,33 2,45 2,32 13 3,70 3,42 3,85 3,56 3,77 3,57 14 31,79 30,35 32,05 30,89 31,40 30,75 15 4,79 4,53 4,90 4,58 4,76 4,44 16 4,39 4,19 4,46 4,20 4,37 4,17 17 1,45 1,40 1,44 1,39 1,40 1,35 18 5,23 4,92 5,22 5,01 5,28 4,99 19 3,04 2,82 3,07 2,84 2,92 2,82 20 6,00 5,35 5,91 5,50 5,71 5,30 21 13,50 12,55 13,47 12,75 13,19 12,45 22 8,46 7,86 8,41 7,98 8,36 7,90 23 5,86 5,50 5,76 5,59 5,57 5,55 24 6,12 5,90 6,14 6,02 5,95 5,93 25 7,06 6,51 7,08 6,54 6,87 6,28 26 3,85 3,55 3,79 3,66 3,61 3,54 27 4,39 4,15 4,49 4,22 4,32 4,16 28 4,13 3,92 4,01 3,94 4,01 3,83 29 11,58 10,97 11,51 10,93 11,36 10,96 30 5,16 4,93 5,18 4,86 5,11 4,88 Tabel 1: Viser samtlige analyseresultater for hver enkel patient til hver enkel tid for både Li-Hep-glas og K3EDTA-glas. De farvede markeringer, pile og prikker benyttes i diskussionen. 19/68

3.1. Sammenligning mellem P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i Li-Hep-glas og K3EDTA-glas Figur 3a + b [PTH] i K 3 EDTAveneblod til tiden 0, [pmol/l] Sammenligning af [PTH] mellem K 3 EDTA-veneblod og Li-Hepveneblod til tiden 0 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0, [pmol/l] y = 0,9517x - 0,0641 R² = 0,9995 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 3a: Lineær regression viser sammenligning mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod og Li-Hep-veneblod, hvor begge er centrifugeret og analyseret til tiden 0, [pmol/l]. Differens mellem [PTH] i K 3 EDTA-veneblod til tiden 0 ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hep-veneblod og K 3 EDTA-veneblod til tiden 0 1,5 Differens mellem [PTH] i K 3 EDTAveneblod til tiden 0 ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hepveneblod og K 3 EDTA-veneblod til tiden 0, [pmol/l] 1 0,5 0-0,5-1 0 10 20 30 40 Serie1-1,5 Middelværdi af [PTH] i K 3 EDTA-veneblod og Li-Hep-veneblod til tiden 0, [pmol/l] Figur 3b: Bland-Altman viser differensen mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod og Li-Hep-veneblod til tiden 0 ift. middelværdien af [PTH] i K3EDTA og Li-Hep til tiden 0, [pmol/l]. 20/68

Figur 4a + b [PTH] i K 3 EDTAveneblod efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] Sammenligning af [PTH] i Li-Hep-veneblod og K 3 EDTA-veneblod, der begge har henstået i 4 timer som plasma 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 y = 0,9602x - 0,0565 R² = 0,9995 Serie1 Lineær (Serie1) [PTH] i Li-Hep-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer [pmol/l] Figur 4a: Lineær regression viser sammenligning mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod, hvor begge har henstået som plasma i 4 timer, [pmol/l]. Differens mellem [PTH] i K 3 EDTA-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hep-veneblod og K 3 EDTA-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer Differens mellem [PTH] i K 3 EDTAveneblod efter henståen som plasma i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hepveneblod og K 3 EDTA-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] 1,5 1 0,5 0-0,5-1 -1,5 0 10 20 30 40 Serie1 Middelværdi af [PTH] i K 3 EDTA-veneblod og Li-Hep-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] Figur 4b: Bland-Altman viser differensen mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod ift. middelværdien af [PTH] i K3EDTA-veneblod og Li-Hep-veneblod, hvor begge har henstået som plasma i 4 timer, [pmol/l]. 21/68

Figur 5a + b [PTH] i K 3 EDTAveneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] Sammenligning af [PTH] i Li-Hep-veneblod og K 3 EDTA-veneblod, der begge har henstået i 4 timer som fuldblod 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 y = 0,9737x - 0,0674 R² = 0,9991 Serie1 Lineær (Serie1) [PTH] i Li-Hep-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] Figur 5a: Lineær regression viser sammenligning mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod, hvor begge har henstået som fuldblod i 4 timer, [pmol/l]. Differens mellem [PTH] i K 3 EDTA-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hep-veneblod og K 3 EDTA-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer Differens mellem [PTH] i K 3 EDTAveneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hepveneblod og K 3 EDTA-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] 1,5 1 0,5 0-0,5-1 -1,5 0 10 20 30 40 Serie1 Middelværdi af [PTH] i K 3 EDTA-veneblod og Li-Hep-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] Figur 5b: Bland-Altman viser differensen mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod ift. middelværdien af [PTH] i K3EDTA-veneblod og Li-Hep-veneblod, hvor begge har henstået som fuldblod i 4 timer, [pmol/l]. 22/68

3.2. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod Figur 6a+b: Sammenligning af [PTH] mellem Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som plasma [PTH] i Li-Hepveneblod efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0, [pmol/l] y = 1,0055x + 0,056 R² = 0,9992 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 6a: Lineær regression viser sammenligning mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som plasma, [pmol/l]. Differens mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer Differens mellem [PTH] i Li-Hepveneblod til tiden 0 ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hepveneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] 1,5 1 0,5 0-0,5-1 -1,5 0 10 20 30 40 Serie1 Middelværdi af [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] Figur 6b: Bland-Altman viser differensen mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer. 23/68

Figur 7a + b Sammenligning af [PTH] mellem K 3 EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som plasma [PTH] i K 3 EDTAveneblod efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 [PTH] i K 3 EDTA-veneblod til tiden 0, [pmol/l] y = 1,0145x + 0,0614 R² = 0,9995 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 7a: Lineær regression viser sammenligning mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som plasma, [pmol/l]. Differens mellem [PTH] i K 3 EDTA-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i K 3 EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer Differens mellem [PTH] i K 3 EDTAveneblod til tiden 0 ift. middelværdien af [PTH] i K 3 EDTAveneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] 1,5 1 0,5 0-0,5-1 0 10 20 30 40 Serie1-1,5 Middelværdi af [PTH] i K 3 EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l] Figur 7b: Bland-Altman viser differensen mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod efter henståen som plasma i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i K3EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer, [pmol/l]. 24/68

3.3. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod Figur 8a + b [PTH] i Li-Hepveneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] Sammenligning af [PTH] mellem Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som fuldblod 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0, [pmol/l] y = 0,9864x + 0,0454 R² = 0,9989 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 8a: Lineær regression viser sammenligning mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som fuldblod, [pmol/l]. Differens mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer Differens mellem [PTH] i Li-Hepveneblod til tiden 0 ift. middelværdien af 1,5 1 0,5 0 [PTH] i Li-Hepveneblod til tiden -0,5 0 10 20 30 40 Serie1 0 og efter -1 henståen som fuldblod i 4 timer, -1,5 [pmol/l] Middelværdi af [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] Figur 8b: Bland-Altman viser differensen mellem [PTH] i Li-Hep-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i Li-Hep-veneblod til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l]. 25/68

Figur 9a + b [PTH] i K 3 EDTAveneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] Sammenligning af [PTH] mellem K 3 EDTA-veneblod til tiden 0 og K 3 EDTA-veneblod, der har henstået i 4 timer som fuldblod 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 [PTH] i K 3 EDTA-veneblod til tiden 0, [pmol/l] y = 1,0095x + 0,0397 R² = 0,999 Serie1 Lineær (Serie1) Figur 9a: Lineær regression viser sammenligning mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som fuldblod, [pmol/l]. Differens mellem [PTH] i K 3 EDTA-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i K 3 EDTA -veneblod til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer Differens mellem [PTH] i K 3 EDTAveneblod til tiden 0 ift. middelværdien af [PTH] i K 3 EDTAveneblod til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] 1,5 1 0,5 0-0,5-1 0 10 20 30 40 Serie1-1,5 Middelværdi af [PTH] i K 3 EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l] Figur 9b: Bland-Altman viser differensen mellem [PTH] i K3EDTA-veneblod efter henståen som fuldblod i 4 timer ift. middelværdien af [PTH] i K3EDTA-veneblod til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer, [pmol/l]. 26/68

4. Diskussion I dette kapitel diskuteres analyseresultaterne, som præsenteres i de lineære regressioner (figur 3-9a), der er understøttet af Bland-Altman-plots (figur 3-9b) i samme rækkefølge som i kapitel 3, der omhandler resultaterne. Til sidst diskuteres alle resultaterne samlet og her inddrages to originalartikler: Stability study of 81 analytes in human whole blood, in serum and in plasma (9) og Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones (10) samt andre kilder, som er nævnt i skema 1+2. 4.1. Sammenligning mellem P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i Li-Hep-glas og K3EDTA-glas Figur 3a, 4a og 5a viser lineære regressioner for sammenligningen mellem analyseresultater, målt i hhv. Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod til både tiden 0 og hvor veneblodet har henstået som både plasma og fuldblod i 4 timer. Alle lineære regressioner har tilhørende regressionsligninger med skæringer i hhv. (0;-0,0641), (0;- 0,0565) og (0;-0,0674). Dvs. de alle sammen har skæringer i tilnærmelsesvis (0,0), som kun er en af forudsætningerne for, at der er 100% sammenlignelighed mellem P- Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i hhv. Li-Hep-glas og K3EDTA-glas. Denne oplysning kan ikke stå alene og dermed kigges også på bl.a. hældningen i hver regressionsligning, disse ligger på 0,9517x, 0,9602x og 0,9737x, hvilket viser, at de ligger på tilnærmelsesvis 1, som også er en forudsætning for, at der er 100% sammenlignelighed mellem de to metoder. Til regressionsligningerne ses en R 2 -værdi, som ligger på 0,9995, 0,9995 og 0,9991, hvilket ligger mellem 0,96-1. Dette er acceptabelt, da PTH-analysen allerede er valideret. Jo tættere på 1, jo tættere ligger punkterne (hver enkel måling) på selve regressionslinjen. Visuelt ses det også på regressionslinjerne, at punkterne ligger tilnærmelsesvis på selve linjen. Som tidligere nævnt understøttes de lineære regressioner af Bland-Altman-plots, som viser evt. tendenser, der ikke kan ses på de lineære regressioner. På figur 3b, 4b og 5b ses det, at der er en tendens til, at P- Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) måles lidt lavere i K3EDTA ift. x af målingerne i de to glastyper, når veneblodet analyseres til tiden 0 eller henstår som plasma eller fuldblod i 4 timer dette ses også i tabel 1 i f.eks. de to første kolonner med analyseresultater til tiden 0 for både Li-Hep og K3EDTA (tabel 1, rød markering). Når veneblodet henstår som 27/68

fuldblod i 4 timer, ligger der et par enkelte punkter på den positive side af y-aksen (tabel 1, lysegrøn markering), når P-Parathyreoideahormon; stofk (pmol/l) ikke er så høj, dvs. inden for referenceintervallet, og jo højere koncentrationen bliver i den enkelte patientprøve, dvs. over referenceintervallet, jo lavere koncentration måles i K3EDTA ift. Li- Hep. Dette er dog ikke noget, der umiddelbart har nogen klinisk betydning ifølge de lineære regressioner, og det gør derfor, i dette tilfælde, ikke umiddelbart nogen forskel, om K3EDTA-veneblod giver lidt lavere koncentrationer end Li-Hep-veneblod. Det skal dog nævnes, at der i projektet, som vist i resultatafsnittet i tabel 1, ikke indgår flere høje koncentrationer end ca. 32 pmol/l (tabel 1, gul markering). Da denne høje koncentration måles umiddelbart noget lavere end de andre ift. x af koncentrationerne i de to glastyper, så vides det ikke, om en/nogle andre høje koncentration(er) i samme område ville give en helt anden R 2 -værdi og dermed også en anden skæring og hældning i regressionsligningerne. Hvis denne/disse høje koncentration(er) ville ligge endnu lavere i K3EDTA-veneblod ift. x af koncentrationerne i de to glastyper, så kan dette sandsynligvis ændre ved regressionsligningen. Ved sammenligningen mellem de to glastyper, er det umiddelbart uden klinisk betydning, om der benyttes Li-Hep-veneblod eller K3EDTAveneblod til måling af parathyreoideahormon, hos de patienter, der er medtaget i dette projekt, når veneblodprøverne analyseres til tiden 0 ift. når veneblodprøverne henstår som plasma eller fuldblod i 4 timer for hhv. Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod. 4.2. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som plasma i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod Figur 6a og 7a viser lineære regressioner for sammenligningen mellem analyseresultater til tiden 0 ift. de analyseresultater, der fremkommer, når hhv. Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod henstår som plasma i 4 timer. De har begge skæringer på hhv. (0;0,056) for Li-Hep og (0;0,0614) for K3EDTA, hvilket er tæt på (0,0). Derudover har de begge hældninger på hhv. 1,0055x for Li-Hep og 1,0145x for K3EDTA, som er tæt på 1. Korrelationskoefficienterne ligger på hhv. 0,9992 for Li-Hep og på 0,9995 for K3EDTA, som ligger mellem 0,96-1, som er dét, der ønskes, og som tidligere beskrevet er der tættere på 100% sammenlignelighed mellem de to metoder (til tiden 0 ift. efter henståen som plasma i 4 timer), når korrelationskoefficienten nærmer sig 1. På de lineære regressioner 28/68

ser det også visuelt ud som om, at punkterne ligger tilnærmelsesvis på selve regressionslinjen, ligesom i de tre første figurer (figur 3a, 4a og 5a). På figur 6b og 7b ses det, at både Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod, når de har henstået som plasma i 4 timer, umiddelbart begge giver lidt højere analyseresultater (tabel 1, blå og orange pile) ift. x af analyseresultaterne fra de to typer glas, men der ligger dog punkter på begge sider af x, og selvom det måske visuelt ser ud som om, at de begge måler højere, så kan dette skyldes tilfældigheder. Når der ses på de lineære regressioner sammen med Bland- Altman-plots for hver af disse, er det umiddelbart uden klinisk betydning, om der benyttes Li-Hep-veneblod eller K3EDTA-veneblod, hvis det hænder, at veneblodprøver, med henblik på P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l), henstår i 4 timer som plasma. 4.3. P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod Figur 8a og 9a viser lineære regressioner for sammenligningen mellem analyseresultater til tiden 0 og efter henståen som fuldblod i 4 timer for både Li-Hep-veneblod og K3EDTAveneblod. Begge regressionslinjer har skæringer på hhv. (0;0,0454) for Li-Hep-veneblod og (0;0,0397) for K3EDTA-veneblod, hvilket er tæt på 0, samt de har begge hældninger på hhv. 0,9864x for Li-Hep-veneblod og 1,0095x for K3EDTA-veneblod, som er tæt på 1. Korrelationskoefficienten er på 0,9989 for Li-Hep-veneblod og på 0,999 for K3EDTAveneblod, som tidligere nævnt også ligger mellem 0,96-1. Der er altså meget stor sammenlignelighed mellem de to metoder, hvad enten Li-Hep-veneblod eller K3EDTAveneblod analyseres til tiden 0 eller om veneblodet henstår i 4 timer som fuldblod. Bland- Altman-plots for både Li-Hep-veneblod og K3EDTA-veneblod (figur 8b og 9b) viser, at punkterne/analyseresultaterne ligger jævnt fordelt på begge sider af x af analyseresultaterne til tiden 0 og efter henståen i 4 timer som fuldblod (tabel 1, lilla og lyserøde pile). Ved den højeste koncentration, som indgår i projektet på ca. 32 pmol/l (se tabel 1) fremkommer der et lavere analyseresultat i Li-Hep-veneblod ift. K3EDTA-veneblod (tabel 1, grå og mørkegrønne prikker), når de hver især har henstået som fuldblod i 4 timer de ligger altså på hver deres side af x, men der er kun tale om en afvigelse på ca. +/-0,5 pmol/l ift. x, hvilket ikke er meget, da der statistisk set vil være 5% af alle mennesker, der ligger uden for referenceintervallet, uden at de nødvendigvis er syge. Alle 29/68

andre punkter i begge Bland-Altman-plots ligger som tidligere beskrevet jævnt fordelt på begge sider af x. Ud fra en vurdering af de lineære regressioner (figur 8a og 9a) og de to Bland-Altman-plots (figur 8b og 9b) ses der ingen forskel af klinisk betydning, om der benyttes Li-Hep-glas eller K3EDTA-glas, hvis veneblodet kommer til at henstå i 4 timer inden centrifugering og analysering. 4.4. Samlet diskussion Som beskrevet i afsnit 4.1. ses der ingen forskel, som har klinisk betydning, hvad enten der analyseres i Li-Hep-glas eller K3EDTA-glas, og det samme viser projektets andre to delundersøgelser (se evt. afsnit 4.2. og 4.3.) også dvs. det er umiddelbart uden betydning, om veneblodet henstår som plasma eller fuldblod i 4 timer i hhv. Li-Hep-glas eller K3EDTA-glas. Artiklen, skrevet af Oddoze C. et al (9), omhandler en undersøgelse med 81 forskellige analytter, hvor det undersøges, om der er forskel på analyseresultaterne, hvad enten veneblodet analyseres umiddelbart med det samme, eller om veneblodet henstår i 6, 24, 48 eller 72 timer ved både 4 C og 25 C inden centrifugering og analysering. Én af parametrene er PTH, men denne parameter analyseres kun i K3EDTA, umiddelbart fordi dette prøveglas er anbefalingen til måling af PTH (2, s. 4). Der er altså ingen sammenligning mellem P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i hhv. Li-Hep og K3EDTA, men de kommer frem til, at K3EDTA sagtens kan benyttes til måling af PTH, da der først ses en forskel af klinisk betydning på analyseresultaterne efter 72 timer i serum eller plasma, hvilket er den samme holdbarhed, et uddrag fra Sundhedsfagligt råd for klinisk biokemi (3) anbefaler bare for fuldblod i K3EDTA. Brugen af K3EDTA til måling af PTH kommer selvfølgelig an på, om veneblodprøven skal transporteres fra et sted til et andet sted, og der kan muligvis godt gå op til eller mere end 72 timer. Dette er dog ikke af så stor betydning, da det umiddelbart ikke er sandsynligt, at en veneblodprøve kommer til at henstå i mere end 4 timer, da veneblodprøven udtages fra patienten på Rigshospitalet på enten en sengeafdeling eller på ambulatoriet. Det understreges, at det er på Rigshospitalet, at det ikke umiddelbart er sandsynligt, at en veneblodprøve med henblik på måling af PTH ikke henstår i mere end 4 timer og der kan være andre retningslinjer på andre hospitaler. Derudover kan det muligvis hænde, at en veneblodprøve er 72 timer (3 døgn) eller længere tid om at blive centrifugeret/analyseret fra det tidspunkt, veneblodet er udtaget 30/68

fra patienten, hvis veneblodet skal fragtes fra en adresse til en anden adresse. Artiklen, skrevet af Evans, M. J. et al (10), beskriver netop, at der er sket en stigning i antallet af prøver, som fragtes fra prøvetagningsstedet til det laboratorium, hvor analysering finder sted. Undersøgelsen foregår i New Zealand og deres undersøgelsesdesign er helt anderledes fra det, der benyttes i vores bachelorprojekt, både hvad der inkluderer typer af patientgrupper, antikoagulans (de undersøger med EDTA), tidsintervaller, analyseapparatur og analyseprincip. De kommer dog alligevel frem til, at PTH i EDTA har en holdbarhed på mere end 120 timer ved 4 C og 36 timer ved 30 C. Svagheden ved dette undersøgelsesdesign ift. bachelorprojektets undersøgelsesdesign er, at sammenligneligheden ikke er så stor. Det tyder dog alligevel på, at EDTA, selvom de ikke beskriver præcis, hvilken slags EDTA, der benyttes (K2EDTA eller K3EDTA), er det bedste antikoagulans at benytte med henblik på måling af PTH ved forskellige tider og temperaturer. Vi har i dette bachelorprojekt undersøgt, om der er forskel på analyseresultaterne ift. PTH i hhv. Li-Hep og K3EDTA, og da der sandsynligvis ikke er andre, der har undersøgt dette, gør det dette projekt endnu mere interessant, da der kun er fordele ved at benytte Li-Hep frem for K3EDTA der spares et K3EDTA-glas og der er større sandsynlighed for, at patienten får hurtigere svar på sine blodprøver, da PTHanalysen foregår på samme apparat som mange af de andre parametre, som ofte er rutinebaserede analyser hos forskellige typer patientgrupper. Der tages forbehold for, at Oddoze C. et al ikke umiddelbart har taget flere patientgrupper med end 10 umiddelbart sunde og raske donorer pr. analyt (9), hvilket kan betyde, at der muligvis kun er donorer, der ligger inden for referenceintervallet ift. måling af PTH. I dette bachelorprojekt er der sat fokus på at indsamle veneblodprøver fra forskellige typer patientgrupper så vidt muligt for at dække måleområdet og som minimum referenceområdet, både over/under, samt at have et antal på 25-30 patienter. Dette giver en valid undersøgelse af, om projektets resultater viser en tendens til lavere eller højere måling, jo højere/lavere P- Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) er, om det er Li-Hep-veneblod eller K3EDTAveneblod, der analyseres til tiden 0 eller centrifugering og analysering efter 4 timer ved henståen som fuldblod eller plasma. En anden vigtig sammenhæng mellem dette bachelorprojekts metode og metoden, der er beskrevet i artiklen, skrevet af Oddoze C. et al (9), er benyttelsen af samme analyseprincip på hhv. Cobas 8000 i dette projekt og på 31/68

Cobas 6000 i undersøgelsen i artiklen. Dette giver endnu en validitet af bachelorprojektets analyseresultater, da begge undersøgelser ingen forskel viser på analyseresultaterne i K3EDTA-veneblod, hvad enten der analyseres med det samme eller efter henståen som fuldblod eller plasma ved forskellige tider. Da der umiddelbart ingen analyseforskelle af klinisk betydning forefindes i K3EDTA-veneblod, og der i dette bachelorprojekt er undersøgt for evt. forskelle i P-Parathyreoideahormon; stofk. (pmol/l) i Li-Hep-veneblod ift. K3EDTA-veneblod, må dette betyde, at der umiddelbart kan benyttes Li-Hep i stedet for K3EDTA ift. de tider, der er benyttet i projektet. Hvis det bliver interessant at vide, om der også kan benyttes Li-Hep-veneblod ved længere henståen end 4 timer, kræves der yderligere undersøgelser. Ved evt. yderligere undersøgelser, beskriver Guder, W. G. (7), at holdbarheden på PTH i plasma eller serum er 6 timer, men det beskrives ikke, om det er i K3EDTA-plasma eller i Li-Hep-plasma og her er det interessant, om der her også kan benyttes Li-Hep-veneblod i stedet for K3EDTA-veneblod. 32/68

5. Konklusion Ud fra en vurdering af de statistiske data i form af lineære regressioner, understøttet af Bland-Altman-plots, er der umiddelbart ingen forskel af klinisk betydning, når der benyttes Li-Hep-veneblod eller K3EDTA-veneblod. Derudover er der heller ingen forskel af klinisk betydning, hvis veneblodet henstår i 4 timer som hhv. plasma eller fuldblod ift. tiden 0 dog med det forbehold, at der ikke er inkluderet mere end én patient med en relativ høj PTH-koncentration på ca. 32 pmol/l i undersøgelsen. 6. Perspektivering Som optimering af dette projekt kan det være oplagt at udføre samme projekt, dog med den ændring, at der medtages patienter, hvor det på forhånd vides, at de har høje PTHkoncentrationer. Grunden til dette er, at der i dette projekt kun er én patient med en PTH-koncentration på ca. 32 pmol/l. Her ses det netop, at der umiddelbart er en tendens til, at denne koncentration i K3EDTA ligger lavere ved henståen som plasma og højere ved henståen som fuldblod på Bland-Altman-plottet ift. middelværdien af de to glastyper eller tider, der sammenlignes. Det er derfor interessant at finde ud af, om det er tilfældigt, at denne koncentration, der ligger over referenceintervallet ligger højere eller lavere, eller om der er en tendens til det ved at medtage flere høje PTH-koncentrationer. En anden ændring er at medtage længere tider, da det kan være brugbar viden, om der kan benyttes Li-Hep-glas, hvis en veneblodprøve skal fragtes fra f.eks. en af RHEL s 8 filialer til hovedfilialen, RHEL (Region Hovedstadens Elektive Laboratorium) i Pilestræde i København, hvor analysering af veneblodprøverne finder sted (11). 33/68