Modul 8, fagpakke 1 Kromosomabnormaliteter, FISH og CGH Stud. udgave (minus billeder) 1

Transkript

1 Modul 8, fagpakke 1 Kromosomabnormaliteter, FISH og CGH Stud. udgave (minus billeder) kako@viauc.dk 1

2 Karyotypering Foruden mutationer kan genetiske sygdomme skyldes kromosomabnormalite ter. Typisk fejl i meiosen ca. 1 ud af 150 levende fødte. Cancer kan ligeledes skyldes kromosomabnormalite ter Her er det så en fejl i mitosen Forudsætningen for at vi kan studere kromosomabnormaliteter (cytogenetik) er, at vi kan se kromosomer f.eks. ved at fremstille en karyotype. kako@viauc.dk 2

3 Kromosomfarvning På denne skematiske tegning (figur 6.3 s. 109 i Medical Genetics af Jorde m.fl., 3. udgave, udgivet i 2006 af forlaget Mosby),er der kun et eksemplar af de autosomale kromosomer Kromosomundersøgelse: 1. Celler skal være i delingsfasen/mitose (dyrkes) 2. Gifte mod tentrådsapp. fastholder celle i prometafasen/metafasen (kromosomer synlige) 3. Hypotonisk opløsning (lav salt) osmotisk chok kernesprængning 4. Kromosombåndfarvning typisk med Kinakrin/Giemsa og Reverse 5. Udklippes fra fotografi og ordnes efter længde, centromer position og de farvede bånds placering Q-QUINACRINE G-GIEMSA R-REVERSE kako@viauc.dk 3

4 Karyotype fra normal kvinde 46,XX Figur 6.1 fra Medical Genetics Husk at hvert kromosom består af 2 kromatider Den ordnede, i forhold til længde af kromosomerne, fremvisning af kromosomer kaldes karyotype fremstilles ved at udklippe metafasekromosomerne fra et mikrofoto efter farvning. kako@viauc.dk 4

5 Karyotype fra normal mand 46,XY Fig i Histologi af Finn Geneser kako@viauc.dk 5

6 Kromosomabnormalitet - non-disjunction Non-disjunction: kromosomerne adskilles ikke normalt under meiosen - den mest alm. grund til aneuploidy Figur 6.6 fra Medical Genetics Kan ske under både Meiosis I (adskillelse af homologe kromosomer) eller Meiosis II (adskillelse af søsterkromatider) kako@viauc.dk 6

7 Eksempel på non-disjunktion (trisomi 21) Downs syndrom Figur 6.7 fra Medical Genetics Autosomal anueploidy: Kroppen kan nemmere klare for meget genetisk materiale, end den kan klare for lidt genetisk materiale. Dvs trisomi bedre end monosomi! Den mest kendte autosomale trisomi er trisomi 21 Downs syndrom (i gamle dage mongolisme). Ca. 1 : levende fødte Ca. 95 % skyldes non-disjunction (resten skyldes translokation). Som regel er non-disjunktion sket i meiosen hos moderen! (typisk i 1. meiotiske deling). Risiko for non-disjunktion hos moderen stiger med alderen. Der kendes også til trisomi 18 (Edwards syndrom, ca. 1 : 6000 levende fødte) og trisomi 13 (Patau syndrom, ca. 1 : ), men kun ca. 5 % overlever 1. leveår. KARYOTYPE: 47,XY,+21 kako@viauc.dk 7

8 Kønskromosome aneuploidy TURNER: 45,X KLINEFELTER: 47, XXY TRISOMY X: 47,XXX 47,XYY SYNDROME Turner og Klinefelter syndrom er de mest alvorlige. Turner forekommer i 1-2 % af graviditeter men ses kun i 1 : levende fødte (45,X = 1 : 5000, flere skyldes rearrangements) Klinefelter i 1 : Trisomy X og 47,XYY findes begge i ca. 1 : 1000 kako@viauc.dk 8

9 Abnormaliteter i kromosomstruktur Translokationer (mellem ikke homologe kromosomer) Deletioner Duplikationer Inversioner Ring kromosomer Sker generelt i hotspots Translokationer kan være balanceret (reciprokke, ikke tabt eller vundet materiale, generelt ikke alvorligt) eller ubalanceret Deletioner: kromosomstykke knækket af og tabt eller barn af reciprok translokationsbærer Duplikation (som regel ikke så alvorligt som deletion): kan opstå som følge af uens overkryds eller barn af reciprok translokationsbærer Inversion: opstår tit som følge af 2 kromosomknæk vendt forkert i reparationen tit ikke så slemt Ring kromosomer: fusion af teleomer ender ofte p.gr.a. deletioner i enderne (klistrede sticky ends) kako@viauc.dk 9

10 Kromosom abnormaliteter forbundet med genetiske sygdomme Se f.eks. S i meneskets genetik kako@viauc.dk 10

11 Cytogeneticists can now go "FISH-ing" for chromosomal abnormalities, which are deletions and duplications that can cause disease. (citat fra Clare O Connor (2008) Nature Education) Eller: Hvordan man finder en nål i en høstak kako@viauc.dk 11

12 Anvendelse af FISH Cytogenetik: Kromosom anormaliteter forbundet med genetiske sygdomme (f.eks. Downs syndrom) Kromosom anormaliteter forbundet med somatiske sygdomme (f.eks. cancer) Genekspression: mrna tilstedeværelse (kvalitativ og semikvantitativ) Mikrobiologi: Direkte identifikation af patogen i vævsprøve kako@viauc.dk 12

13 Fluorescens in situ hybridisering (FISH): Cytogenetik: Specifik farvning af hele kromosomer eller kromosomområder med en enkelt eller flere farver herved kan deletioner, trisomier og translokationer detekteres Cellerne fixeres på slide (cellerne dyrkes først og kernen sprænges ved metafase FISH) DNA-strengene gøres enkeltstrenget (ved f.eks. opvarmning til 94 o C). Derefter tilsættes der et overskud af (fluorescens) mærket DNA/RNA-probe (komplementære baseparring ved hybridiseringstemperaturen). Overskydende probemateriale vaskes væk. Undersøges ved fluorescens mikroskopi Kako, kako@viauc.dk

14 FISH Figure 1 : Principles of fluorescence in situ hybridization (FISH). (a) The basic elements of FISH are a DNA probe and a target sequence. (b) Before hybridization, the DNA probe is labeled by various means, such as nick translation, random primed labeling, and PCR. Two labeling strategies are commonly used: indirect labeling (left panel) and direct labeling (right panel). For indirect labeling, probes are labeled with modified nucleotides that contain a hapten, whereas direct labeling uses nucleotides that have been directly modified to contain a fluorophore. (c) The labeled probe and the target DNA are denatured. (d) Combining the denatured probe and target allows the annealing of complementary DNA sequences. (e) If the probe has been labeled indirectly, an extra step is required for visualization of the nonfluorescent hapten that uses an enzymatic or immunological detection system. Whereas FISH is faster with directly labeled probes, indirect labeling offers the advantage of signal amplification by using several layers of antibodies, and it might therefore produce a signal that is brighter compared with background levels kako@viauc.dk 14

15 FISH Kan gøres på metafase eller interfase kromosomer (afhænger af hvad man vil undersøge, og om celler kan dyrkes) Prober er typisk fra 60 kb 1,5 Mb lange og oftest mærket med et fluoriserende stof (hvis flere prober bruges, er de ofte mærket med hver sin fluorofor) Område specifikke prober (hvis flere taler man om dual-fusion eller beak-apart prober), centromer, teleomer prober bruges i forskellige kombinationer Kako, kako@viauc.dk

16 FISH eksempler på brug af område specifikke prober Figur 8.15 fra MD Figur 8.16 fra MD Fusion Dual Fusion Figur 8.17 fra MD Break-apart Tricolor probe er kombination af enten 2 farvede (dual color) break-apart eller fusions prober med kromosom specifik probe (oftest centromer (teleomer) specifik) kako@viauc.dk 16

17 Almindelige autosomale mikrodeletioner i forbindelse med genetiske sygdomme Tabel 12.1 Fra Molecular Diagnostics edited af Patrinos og Ansorge. Elsevier 2005 kako@viauc.dk 17

18 FISH DiGeorges Syndrom Kromosom 22 - normal Metafase FISH med teleomer probe specifik for kromosom 22 (grøn) og en probe specifik for en region på 22q11.2 (rød) Fig i Histologi af Finn Geneser Kromosom 22q11.2 deletion DiGeorges Syndrom Kako, kako@viauc.dk

19 Spektral karyotype Spektral karyotype: forskellige FISH prober kombineret med specielle kameraer og computerbillede behandlingsprogrammer Delvis kromosom 3 trisomi metafase Fig i Histologi af Finn Geneser Kako, kako@viauc.dk

20 Spektral karyotype Color plate 6 fra Medical Genetics Eksempel: Balanceret reciprok translokation mellem kromosom 2 og 22 Kako, kako@viauc.dk

21 Kromosom abnormaliteter forbundet med somatiske sygdomme ifish af 9 og 22 translokation (billede hugget fra Eigil Kjeldsens foredrag) Interfase FISH med en probe specifik for et område på kromosom 9 (f.eks den grønne) og en probe specifik for et område på kromosom 22. Ved translokation mellem 9 og 22 bringes de to prober sammen (fusion) (philadelfia kromosom, et kendetegn for CML, fører til aktivering af et oncogen). Problem: kan også skyldes at de to kromosomer tilfældigvis ligger tæt på hinanden inden fixeringen, derfor skal der undersøges flere celler + at nogle af de undersøgte celler ikke behøver at være cancerceller. CML Normal Chr 9 Chr 22 Der 22 Der 9 kako@viauc.dk 21

22 CLL Figur fra Döhner et al. N. Engl. J Med. 343: kako@viauc.dk 22

23 CGH (comparative genome hybridization) se side i MD Det DNA, der skal testes, isoleres og mærkes med en fluorescerende farve og kløves i passende stykker (DNase). Reference DNA (normalt) mærkes med en anden fluorescerende farve og kløves i passende stykker (DNase). Lige mængder tilsættes til normale metafase kromosomer. Denaturer og hybridiser. Hybridiseres samme mængde af de to farvestoffer? Kako, kako@viauc.dk

24 CGH Deletion i cancer celle Amplifikation i cancer celle Figur 8-22 fra MD Kako, kako@viauc.dk