DNA s fotofysik. Steen Brøndsted Nielsen. Institut for Fysik og Astronomi Aarhus Universitet

Transkript

1 DNA s fotofysik Steen Brøndsted Nielsen Institut for Fysik og Astronomi Aarhus Universitet

2 Schrödinger skrev i 1944 bogen: What is life? En diskussion af et komplekst molekyle med den genetiske kode for levende organismer. Vigtig inspirationskilde til DNA strukturundersøgelser.

3 DNA s struktur blev fundet vha. eksperimenter (Røntgendiffraktion) og modelbygning Vi skal tilbage til Tre konkurrerende steder: King s College, London Cambridge California Institute of Technology

4 Franklin Wilkins, 1954 King s College, London

5 Watson og Crick, 1953 Cambridge

6 Pauling, 1987 Caltech

7 Strukturbestemmelse vha. Røntgendiffraktion Atomer spreder lys elastisk:

8 Bragg s diffraktionslov Konstruktiv interferens Destruktiv interferens 2 d sinθ = n λ (n heltal) Diffraktionsmønstret giver elektrontæthed fra hvilken atomstruktur kan udledes.

9 Et diffraktionseksperiment kræver en periodisk struktur som fx en krystal. DNA: fibre

10 Fotografi 51 Franklin, 1952

11

12

13 DNA dobbeltstreng Sukker-phosphat-rygrad Nukleobaser 3.4 Å 20 Å Sukkermolekyle Phosphatgruppe Hydrogenbindinger

14 Watson-Crick basepar H H 3 C O H N N Thymin (T) N N O H N N N Adenin (A) H N H O N Cytosin (C) N N O H H N N H N N Guanin (G)

15 Hydrogenbindinger

16 DNA kopiering (Replikation)

17 Molekylærbiologiens centrale dogme

18 Hot emne: Vekselvirkningen mellem DNA og UV lys Fotofysik: Hvilke tilstande populeres og hvordan omsættes og spredes energien? Fotokemi: Hvilke strukturelle ændringer sker?

19 Nukleotiders fotofysik Absorption λ max = 260 nm Adenosin 5 -monophosphat (AMP) - O O P -O O N O NH N 2 N N HO OH Wavelength Bølgelængde [nm] Phosphat Sukker Nukleobase Absorptionen skyldes en elektronisk overgang i nukleobasen (ππ*)

20 S 0 S 1 T 1 S: singlet-tilstand (total spin = 0) T: triplet-tilstand (total spin = 1)

21 Tilstandsdiagram og elektroniske overgange S 1 T 1 Anslåede tilstande Spintilladt overgang Spinforbudt overgang S 0 Grundtilstand Hunds regel: T 1 er lavere i energi end S 1

22 Nukleobasers fotofysik S 1 Spinflip T 1 UV-lys Fluorescens (absorption) Phosphorescens S 0 Fluorescenskvanteudbytte < 10-4 Negligibelt tripletkvanteudbytte Strålingsløs overgang til grundtilstanden Hvad er den anslåede tilstands levetid?

23 Tilstandsdynamik: transient absorption S 1 -tilstandens levetid: elektronisk energi omdannes til varme 290 fs 720 fs S N Probe: 570 nm S 1 Pumpe: 263 nm 460 fs 540 fs S 0 S: singlettilstand J.-M. L. Pecourt, J. Peon, and B. Kohler, J. Am. Chem. Soc. 123, (2001).

24 Levetider på få hundrede femtosekunder. Elektronisk anslåede molekyler er meget reaktive. En kort levetid giver beskyttelse mod kemiske reaktioner.

25 Nukleobaserne virker som effektive solskærme!

26 Den stærkeste overlever på molekylært niveau!

27 DIREKTE LYSABSORPTION I NUKLEOBASEN Hvad sker med den oprindelige elektroniske energi? Elektronisk energi? Bindingsbrud 0.3 ps?? Varme (vibrationsenergi) i nukleobasen ps Fordeling af varmen over hele molekylet (1000 K) Intramolekylære processer molekyle omgivelser ps Energiafgivelse til vand-varmebadet

28 Problem: Vi skal have nukleotider på gasform uden at de går i stykker! Problemet blev løst i 1980 erne af John Fenn (Yale University). Electrospray ionisering

29 Electrospray ionisering droplets nøgne ioner

30

31 ELectrostatic Ion Storage ring in Aarhus (ELISA)

32 ELectrostatic Ion Storage Ring Aarhus (ELISA) S.P. Møller, NIM A 394, 281 (1997). J.U. Andersen, J.S. Forster, P. Hvelplund, T.J.D. Jørgensen, S.P Møller, S. Brøndsted Nielsen, U.V. Pedersen, S. Tomita, H. Wahlgreen, Rev. Sci. Instrum. 73, 1284 (2002).

33 ELectrostatic Ion Storage Ring Aarhus (ELISA) Laser power meter Ionpakke Laserpuls (266 nm) Magnet Laser Injektion Micro-channel plate detektor Accelerator med electrospray ionkilde Forsinket spaltning måles i dette område

34 Enkeltladede ioner: kinetisk energi på 22 kev. Omløbstider på 100 μs, masseafhængigt. Levetid bestemt af trykket i ringen, mbar. Typisk af størrelsesordenen sekunder. Forsinket spaltning: dødtid på et halvt omløb ( 50 μs). Nylig opgradering af ELISA giver information om reaktionskanalerne!

35 Bestråling af AMP med fotoner (λ = 266 nm) 10 5 O O P O OH O N N NH 2 N N Laserpuls 10 4 OH OH Tællinger Kollisionsinduceret spaltning Tid [ms]

36 Levetid mht. spaltning efter fotonabsorption 10 6 Tællinger μs AMP anion Tid efter fotoabsorption [μs] Phys. Rev. Lett. 91, (2003)

37 Levetiden for statistisk spaltning er adskillige mikrosekunder, hvilket er en del mere end tiden for afkøling i vandig opløsning (picosekunder). I væskefase kan statistisk spaltning ikke konkurrere med vibrationel køling af AMP-nukleotidet hν AMP (aq) hν 0.3 ps AMP (S o ) AMP* (S 1 ) AMP* (S o ) AMP (S o ) 16 μs Fotofragmenter Dannes kun i gasfase Nedkøling i vand (0.3-2 ps)

38 ELISA som datterionmassespektrometer Ionpakke Ringelementspændinger 10 o afbøjer MCP detektor V xv 0 Moderionlagring Fotoexcitation Datterionlagring Hurtig ændring af alle ringspændinger (μs) t 1 t 2 Dump af datterioner på MCP 10 o afbøjer Tid Rev. Sci. Instrum. 79, (2008)

39 Fotodissociation af enkeltstreng bestående af tre adeninbaser Tællinger [da 3 +H] + A m/z

40 DNA beskyttelsesmekanismer 1) Hurtig strålingsløs overgang til den elektroniske grundtilstand (enkelte baser) 2) Delokalisering af excitationsenergien over adskillige baser? Kommunikation mellem to strenge (baseparring) 3.4 Å Kommunikation i samme streng (basestakning)

41 Det diskuteres indædt hvorledes basestakning og parring påvirker den elektroniske deexcitation Antal baser der kobler og hvilke? Basestakning vs. baseparring Hvorledes ser den elektronisk exciterede tilstand ud? Excitontilstand vs. charge transfer tilstand

42 Monomer hν Kun een exciteret tilstand A A*

43 Dimer hν eller A A A* A A A* To mulige exciterede tilstande (exciton) eller A + A A A + Charge-transfer tilstande (excimer)

44 C.E. Crespo-Hernandez, B. Cohen, B. Kohler, Nature 436, (2005)

45 Enkeltstreng af stakkede adeninbaser da n : levetid af anslået tilstand er 126 ± 8 ps Dobbeltstreng af stakkede adeninebaser og stakkede thyminbaser da n :dt n : levetid af anslået tilstand er 150 ± 30 ps Elektronisk kommunikation er begrænset til en streng Men tidsopløste eksperimenter prober ikke nødvendigvis den oprindelige tilstand efter excitationen.

46 Det vi adresserer: Hvor mange nukleobaser taler sammen i den oprindeligt anslåede tilstand?

47 DNA s fotofysik i vandig opløsning Absorption og circulær dichroisme ved ASTRID synchrotronstrålefaciliteten

48 Synchrotronstråling Lineært polariseret lys ved højere fotonflux end konventionelle kilder, specielt ved korte bølgelængder. Experimenter med bølgelængder under 200 nm er mulige!

49 Circulær dichroisme (CD) Forskel i absorption af venstre- og højredrejet cirkulært polariseret lys af et asymmetrisk eller kiralt molekyle.

50 Nukleosider er kirale pga. sukkergruppen OH HO * * O * * OH N N N N NH 2 OH HO * * O * N N N N NH = 16 forskellige sukkerkonfigurationer 2 3 = 8 forskellige sukkerkonfigurationer

51 ε (10 4 mol -1 cm -1 ) damp da 2 DNA enkeltstrenge af adenine Absorption: damp vs. da 2 F λ (mdeg nmol -1 cm -2 ) F λ (10 2 mdeg nmol -1 cm -2 ) da 4 2 x 3 da 16 3 da 6 da 20 2 da 10 da da 12 da Wavelength (nm) damp da 2 Circulær dichroisme: damp vs. da 2 Tre exciton bånd Circulær dichroisme: da n : n = 2 30 Phys. Rev. E 77, (2008).

52 CD signal ved 190 nm (10 2 mdeg nmol -1 cm -2 ) da n : CD signal ved 190 nm Experimentelle data Lineært fit til høj-n data Modelfit, a i = a 1 exp( βi) max Hældning = i= Mindst otte nukleobaser kobler elektronisk n i 1 a i

53 Model for CD signal af da n A A A A A A A A A a 1 a 1 a 1 a 1 a 1 a 1 a 2 a 2 a 1, a 2, a 3, er koblingsled CD signal (n) = n i= 1 ( n i) a i a 3 a 2 Antag a i = 0 for i > i max max CD signal (n) = d CD signal dn i i i= 1 max = i= 1 a i ( n i) a i

54 da n : CD signal ved 218 nm CD signal ved 218 nm (10 2 mdeg nmol -1 cm -2 ) Experimentelle data Fit til ret linie a n Hældning = a 1 Kun to adeninnukleobaser kobler elektronisk

55 Konklusion Elektronisk kobling imellem adeninbaser i den exciterede tilstand afhænger stærkt af excitationsenergien: Ved 190-nm excitation kobler mindst otte adenin elektronisk. Ved 218-nm og 250-nm excitation kobler to adenin elektronisk. Kun nærmeste nabovekselvirkninger betyder noget.

56 Vores næste projekt: DNA dobbeltstrenge med samme antal A-T basepar (18) men forskellig antal adenin i stakke (thymin slukker for koblingen imellem adeninbaser): Streng 1 Streng 2 A A A A A A A A A T TTTTTTTT TTTTTTTTTA A A A A A A A A 2 9 A A A T TTA A A TTT A A A TTT TTTA A A TTTA A A T TTA A A 6 3 A T A T A T A T A T A T A T A T A T T A T A T A T A T A T A T A T A T A

57 Elektrontransport langs en DNA-streng - A A A A A A A A A A A A A A A A - A A A A A A A A A A A A A A A A - A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A - DNA er en nanoledning (molekylær elektronik)

58 CURRENT GROUP MEMBERS Principal investigators: Preben Hvelplund Jens Ulrik Andersen Steen Brøndsted Nielsen Post docs: Henning Zettergren Jean A. Wyer Kristian Støchkel Students: Anne I.S. Holm Maj-Britt S. Kirketerp Camilla S. Jensen Jakob B. Overgaard Lisbeth M. Nielsen Rune S. Thing ISA Søren Vrønning Hoffmann FNU Lundbeckfonden Carlsbergfondet Villum Kann Rasmussen

59 VÆRKTØJSSÆT ELECTROSPRAY IONISERING MASSESPEKTROMETRI: ACCELERATORINSTRUMENT LAGERRINGEN ELISA LASERE COMPUTERE TIL MOLEKYLMODELERING