Professionsbachelorprojekt, modul 14 University College Lillebælt. Udarbejdet af Reem Kazem Studienummer:

Transkript

1 Sammenligning af E-test og vancomycin antibiotikatabletten fra Rosco med en valgt opsætning af Real time PCR, som golden standard, ved detektion af vancomycin-resistente Enterococcus med vana, vanb og vanc. Comparison of E-test and vancomycin antibiotic tablet from Rosco with a selected setup of Real time PCR, as golden standard, for the detection of vancomycin-resistant Enterococcus with vana, vanb and vanc. Professionsbachelorprojekt, modul 14 University College Lillebælt Udarbejdet af Reem Kazem Studienummer: Vejledere: Sanne Malig, bioanalytikerunderviser Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Odense Universitetshospital Charlotte Birk Olsen, bioanalytikerunderviser University College Lillebælt Projekt udført i samarbejde med: Sara Ismail Dallal og Asmaa Ismail Dallal Projektperiode: 6.oktober december 2014 Antal anslag:

2 Resumé Introduktion Enterococcus har udvist en stigende resistens overfor vancomycin. Vancomycin reserveres som sidste behandlingsmulighed, når der ses resistens for andre antibiotika f.eks. ampicillin. Der er blevet identificeret flere vancomycin resistensmekanismer hos Enterococcus, herunder vana, vanb og vanc. De mest klinisk relevante af disse genotyper er vana og vanb. Mindst hæmmende koncentration (MIC) for vanb sensitive-enterococcus er fastsat til 4µg/ml, og derfor vil nogle vanb stammer med MIC-værdi på 4 være vanskelige at identificere. I sådanne tilfælde vil det være oplagt at anvende metoder med høj sensitivitet og specificitet til korrekt detektion af vanb stammer; derfor vil anvendelse af en genotypisk metode, f.eks. Real time Polymerase Chain Reaction (PCR) være oplagt. Formål Et tidligere studie, har vist uoverensstemmelse mellem de fænotypiske metoder, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, derfor ønskes der i nærværende projekt en sammenligning af disse fænotypiske metoder med en valgt opsætning af Real time PCR der følgende anvendes som projektets golden standard. Materialer og metoder Til opsætning af Real time PCR blev 7 velkarakteriserede VRE stammer afprøvet på forskellige assays. Efterfølgende blev 64 Enterococcus stammer isoleret fra blod undersøgt vha. Real time PCR som golden standard. Resultater Ved sammenligning af E-test og ulden/ikke ulden fænomenet med Real time som golden standard, er der opnået sensitiviteter på 100 % og specificiteter på hhv.100 % og 80 %. Konklusion Ifølge det nærværende projekt kan rutinediagnostikken af VRE bedst udføres vha. diskdiffusionsmetoden ved anvendelse af tabletter fra Rosco og efterfølgende med E-test. Ved påvisning af VRE udføres Real time PCR. Side 1 af 45

3 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet på modul 14 af bioanalytikeruddannelsen, i perioden 6.oktober december Det nærværende projektets praktiske del er udført på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling (KMA), Odense Universitetshospital. Projektet henvender sig til studerende, undervisere, bioanalytikere, KMA samt andre interesserede. I forbindelse med dette projekt vil jeg rette en speciel tak til mine medstuderende Asmaa Ismail Dallal, Sara Ismail Dallal, for et fantastisk godt teamarbejde igennem hele projektet. Endvidere vil jeg takke min kliniske vejleder, Sanne Malig, bioanalytikerunderviser på KMA, OUH, samt min teoretiske vejleder, Charlotte Birk Olsen, bioanalytikerunderviser på University College Lillebælt, Odense, for en stor indsat og vejledning under hele projektperioden. Desuden vil jeg takke Louise Hjelmsted Pedersen, bioanalytikerunderviser på KMA, OUH, Elisa Knudsen samt molekylær biolog Silje Vermedal Høgh for hjælp og råd under projektets praktiske del. Til slut vil jeg takke min mor, Fatima Enad, samt min mand, Yosuf Mansour for deres støtte og praktiske hjælp, specielt under projektets forløb og generelt under hele uddannelsesforløbet. Reem Kazem 2014 Side 2 af 45

4 Indhold Resumé... 1 Forord... 2 Introduktion... 5 Enterococcus... 6 Resistensmekanismer... 7 Vancomycin... 8 Vancomycin resistensgener... 8 Problemformulering Real time PCR Agardiffusionsmetoder Resistensbestemmelse med vancomycin-tabletten fra Rosco Resistensbestemmelse for vancomycin med E-test Metodiske overvejelser Materialer og metoder Materialer Prøvematerialer Apparatur Utensilier Reagenser Metode Del 1: Klargøring af stammer Del 2: Klargøring af DNA Del 3: Real time PCR Litteratursøgning Resultater Diskussion Opsætning af Real time PCR Sammenligning af E-test med Real time PCR Sammenligning af ulden/ikke ulden fænomenet med Real time PCR Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag Side 3 af 45

5 Bilag 1: svar opnået vha. en elektronisk spørgeundersøgelse Bilag 2: liste over 65 Enterococcus stammer Bilag 3: Eksempel på PCR-pladelayout over 11 prøver Bilag 4: tabeller over ct-værdier og middelværdier opnået ved anvendelse af forskellige assays Bilag 5: rådata Bilag 6: udregninger af sensitiviteter og specificiteter Side 4 af 45

6 Introduktion Antimikrobielle midler har i årevis været anvendt til behandling af bakterieinfektioner. Der har været observeret en sammenhæng mellem introduktionen af nye antibiotika og resistensudvikling hos bakterierne. Resistensudvikling mod disse midler udgør et stigende og grænseoverskridende globalt problem. Udfordringen ligger i udviklingen af nye antibiotika til behandling, da bakteriens resistensudvikling begrænser behandlingsmulighederne betydeligt. Af den grund bliver antibiotikaresistensen set som en alvorlig trussel for menneskernes sundhed [1,2]. Vancomycin er et antibiotikum som Enterococcus har udvist en stigende resistens overfor, siden detektionen af dem i 1980 erne [3, 4,5]. Vancomycin er et glykopeptid, der reserveres som sidste behandlingsmulighed, når der ses resistens for andre antibiotika f.eks. ampicillin [3,4,5,6,7]. Vancomycin resistente Enterococcus (VRE) er et udbredt problem i den vestlige verden, men særligt stigende i USA [3,4,8], hvor VRE ses som hyppigste årsag til nosokomielle infektioner, og udgør mere end 28 % af alle Enterococcus infektioner [8]. De første udbrud af VRE blev observeret i slutningen af 1980 erne på engelske og franske sygehuse og senere i andre lande [5]. VRE er et mindre udbredt problem i Europa men problemet varierer markant fra land til land. I Grækenland og Irland blev der i 2007 set >30 % VRE i nosokomielle Enterococcus infektioner, hvor der kun ses ca. 1 % i Skandinavien. Dog har en alarmerende rapport fra Sverige understreget at der er sket en firedoblet stigning i infektioner forårsaget af VRE i perioden mellem sammenlignet med perioden [4]. I Danmark blev der i perioden rapporteret færre end 30 VRE tilfælde pr. år, hvor tallet er steget til 54 tilfælde i Endvidere blev der i 2013 detekteret største antal VRE hidtil: 248 stammer fra infektioner og 168 stammer fra fæces screeninger hos patienter uden klinisk symptomer [9]. Denne stigning er primært registeret fra hospitaler i Region Hovedstanden, Region Sjælland og Region Midtjylland [9]. Det relativt lave vancomycin forbrug i Europa samt stigning i forekomsten af VRE har givet anledning til mistanke om, at den forhøjede brug af glykopeptidet, avoparcin i landbruget, var skyld i denne udvikling. Avoparcin er af samme familie som vancomycin og blev tidligere anvendt som vækstfremmer for dyr i landbruget [2,3,4]. I 1995 blev anvendelsen af avoparcin forbudt i Danmark samt i en række andre lande [2,4]. Da bakteriernes resistensudvikling accelerer med produktionen af nye antibiotika kan det betyde at der vil forekomme infektioner, hvor der ingen behandling findes. En af de bidragende faktorer til denne resistensudvikling, er netop det øgede forbrug af antibiotika i sundhedsvæsnet og i Side 5 af 45

7 landbruget, hvorfor det er vigtigt at overvåge antibiotikaforbruget. I Danmark overvåges antibiotika forbruget af Danish Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Program (DANMAP) siden 1995, netop for at holde antibiotikaforbruget på et minimum. DANMAP beskriver det årlige forbrug af antibiotika samt forekomsten af antibiotikaresistens hos dyr og mennesker [9]. DANMAP har desuden overvåget og anvendt Enterococcus faecalis og Enterococcus faecium som indikatorer til monitorering af resistensudvikling hos grampositive bakterier siden Dette skyldes at disse bakterier findes hos såvel mennesker som dyr og kan tilpasse deres resistensmekanismer til antibiotikaforbruget [9]. Enterococcus Enterococcus er grampositive fakultative anerobe kokker som lejres i par eller i kæder af forskellige længder [10,11,12]. Kolonierne er katalase negative og har en diameter på 1-2 mm målt fra vækst på blodagarplade efter 24 timers inkubation [10]. Enterococcus er karakteriseret ved at være meget robuste, der bl.a. indebærer deres særlig hårdfør overlevelsesevne i organismer og andre miljøer, herunder ekstreme forhold såsom høje temperaturer, - salte koncentrationer og - ph-værdier. De kan vokse ved et temperaturområde fra o C, men har en temperaturoptimum ved o C [4,10,12, 13]. Enterococcus er en del af menneskets normalflora i tarm og vagina, men er opportunistiske bakterier. Enterococcus forårsager bl.a. urinvejsinfektioner, sepsis, endocarditis samt sårinfektioner [3,8,13,14,15]. Infektioner grundet Enterococcus skyldes oftest E. faecium og E. faecalis [3,8,13,14]. E. faecalis og E. faecium ses hyppigere som årsag til nosokomielle infektioner [4,9,10,12], dog er E. faecium mere resistent over for vancomycin og ampicillin sammenlignet med E. faecalis [4]. Denne resistensudvikling skyldes den stigende forbrug af antibiotika, herunder er vancomycin værd at nævne [4]. Eksempelvis steg procentdelen af E. faecium-stammer som var resistent over for vancomycin i USA fra 0 % i 1980 erne til ca. 80 % i 2007, hvorimod der kun var ca.5 % E. faecalis der var vancomycin resistent i samme periode [4]. En hver ændring eller udvikling i de pågældende bakterierens resistens har en afgørende klinisk betydning, f.eks. er infektioner med E. faecium betydelig sværere at behandle end infektioner med E. faecalis [4,9]. Ifølge DANMAP blev der i 2013 detekteret vancomycin resistens i hhv. 3,4 % og 0,2 % af fundne E. faecium og E. faecalis i blodstammer fra mennesker. Lang det fleste af VRE stammer detekteret i perioden har været vana E. faecium [9]. Side 6 af 45

8 Resistensmekanismer Resistens mod antibiotika kan enten være medfødt eller erhvervet. Medfødt resistens indebærer at bakterien ikke påvirkes af de anvendte antibiotika da den mangler strukturer eller metaboliske processer som midlerne virker imod. Enterococcus overlevelsesevne skyldes deres medfødte og erhvervede resistens overfor mange almen anvendte antibiotika. Erhvervet resistens hos Enterococcus skyldes bl.a. deres evne til at udvikle nye resistensmønstre ved at undergå genetiske forandringer og dermed udvikling af ny resistens. Disse forandringer sker via sporadiske mutationer eller erhvervelse af fremmed genetisk materiale gennem plasmid overførsel [12,14]. Enterococcus har medfødt resistens over for lave koncentrationer af β-lactamer (pencillin, ampicillin og cefalosporiner) og aminoglykosider (gentamycin) [4,9,15]. Dog har Enterococcus med tiden erhvervet mere resistens overfor højere koncentrationer af β-lactamer og aminoglykosider. Enterococcus cellevæg indeholder pencillin-bindende-protein (PBP) og β- lactamers virkningsmekanismer fungerer ved at angribe bakteriens cellevæg, ved at binde sig kovalent til PBP. Denne binding påvirker syntesen i cellemembranen, hvilket resulterer i en svag cellevæg medførerende bakteriens død [4,12,13]. Resistensen overfor β-lactamer hos Enterococcus skyldes udskiftning af en specifik aminosyre i PBP eller en øget produktion af alternativ PBP (PBP5). Dette resulterer i lav affinitet for pencillin [4,12,13]. Det menes at denne resistensmekanisme er overført fra Staphylococcus aureus, hvilket bekræfter at Enterococcus har evnen til at modtage resistensmekanismer fra andre grampositive bakterier [13]. Aminoglykosiderne er derimod ikke cellevægsaktive midler og virker ved at trænge ind i bakteriens cellevæg, og inhibere syntesen af de ribosomale proteiner. Ved resistens over for aminoglykosider, kan stoffet ikke trænge igennem cellevæggen og derved sker der ingen optagelse af det [12]. For at opnå en stærk baktericid effekt mod svær infektioner forårsaget af Enterococcus anvendes oftest en kombination af et cellevægsaktivt middel f.eks. penicillin eller ampicillin, og et aminoglykosid f.eks. gentamycin som medfører en synergistisk effekt. Synergi mellem penicillin og gentamycin udøves ved at penicillin ødelægger cellevæggen, hvorved gentamycin optagelsen i bakterien forstærkes [15,16]. På baggrund af ovennævnte resistens mod penicilliner og aminoglykosider blev behandling af infektioner forårsaget af Enterococcus vanskeligt. Vancomycin har været et klinisk essentielt Side 7 af 45

9 alternativ for disse antibiotika indtil opdagelsen af VRE forekomst i 1980 erne [5], da Enterococcus har erhvervet resistens mod visse glykopeptider såsom vancomycin og teicoplanin [4,7,12,14]. Vancomycin Medfødt og erhvervet resistens hos E. faecalis og E. faecium over for pencillin (ampicillin) og aminoglykosid (gentamicin) udgør en stor behandlingsudfordring da disse cellevægsaktive antibiotika ofte anvendes til behandling af infektioner forårsaget af disse bakterier. Vancomycin anvendes til behandling i tilfælde hvor β-lactamer ikke virker baktericide på bakterien [4,6,9]. På baggrund af ovenstående resistensmekanismer hos Enterococcus er vancomycin forbruget til behandling af alvorlige grampositive infektioner steget markant. Vancomycin er et glykopeptid, og anvendes som en af de sidste behandlingsmuligheder for alvorlige infektioner med gram positive bakterier [4,7,13,14]. Vancomycin anvendes primært som et alternativ for ampicillin ved infektioner forårsaget af ampicillinresistente Enterococcus eller som en alternativ behandling for patienter som er allergiske over for β-lactamer [4]. Vancomycin er et cellevægsaktivt stof som udøver sin effekt ved at hæmme syntesen i bakteriens cellevægge resulterende i celledød. Dens virkningsmekanismer virker ved at danne komplekser med aminogruppen i peptidoglykan, peptidyl- D-alanyl-D-alanine(D-Ala-D-Ala), som er sidekæder af peptidoglykanforstadierne på celleoverfladen og som har en høj affinitet for vancomycin. Enterococcus resistens over for vancomycin skyldes en enzymatisk ændring i aminogruppen i peptidoglykan. Herved bliver D- alanyl-d-alanine(d-ala-d-ala), ændret til D-alanyl-D-lactate(D-Ala-D-lac). Det nydannede kompleks, D-Ala-D-lac, har en lavere affinitet for vancomycin [4,7,13]. Dvs. ved vancomycinresistens er vancomycin-bindingsaffiniteten til bakteriens overflade betydelig lavere ligesom ved resistens over for β-lactamer [3,4,5,14,17]. Vancomycin resistensgener Vancomycinresistens i Enterococcus kommer til udtryk i forskellig grad, afhængig af hvilken genotype der er tale om. Der er blevet identificeret flere vancomycin resistensmekanismer hos Enterococcus, herunder vana, vanb og vanc. De mest klinisk relevante af disse genotyper er vana og vanb [3,14]. Derudover inddeles vanb i 3 undertyper; vanb1, vanb2 og vanb3 [17,18]. Endvidere inddeles vanc i vanc1 og vanc2/3 [5]. Genotyperne kendetegnes bl.a. ved at have forskellige resistensmønstre over for vancomycin. VanA og vanb gentyper er lokaliseret på transposoner og kan derfor overføres til en anden bakterie, hvorimod vanc er kromosomalt kodet og ikke er transportabel til andre bakterier. Side 8 af 45

10 VanC forekommer generisk i Enterococcus species og betragtes af den grund som mindre problematisk i forhold til overførsel af resistens end vana og vanb. VanC-bærende species er E. gallinarum (vanc1) og E.casseliflavus (vanc2), hvor det primært er E. faecalis og E. faecium der er vana og vanb [3,13]. VanA- og vanb stammer adskiller sig fænotypisk ved at have forskellige mindst hæmmende koncentrationer (MIC) [14,17]. MIC-værdien for vana er µg/ml og for vanb er 4-64 µg/ml. Pga. denne forskel i niveauet for resistensudtryk bliver vana stammer kaldet for high-level resistente og vanb for low-level resistente. Derudover adskiller vana og vanb VRE sig fra hinanden ved at vana ud over vancomycin viser resistens over for glykopeptidet teicoplanin, hvilket vanb ikke gør [17]. MIC-værdien for vanb sensitive-enterococcus er fastsat til 4µg/ml [19], derfor kan vanb stammer med en MIC-værdi på 4 µg/ml blive fejlagtigt diagnosticeret som værende sensitive i stedet for resistente. Dette kan have fatale konsekvenser for patienten. I sådanne tilfælde vil det være oplagt at anvende metoder med høj sensitivitet og specificitet til detektion af vanb stammer. På nuværende tidspunkt på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling (KMA), Odense Universitetshospital (OUH), identificeres Enterococcus med Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight (MALDI-TOF). Efterfølgende resistensbestemmes bakteriestammer med fænotypisk agardiffusionsmetoden ved anvendelse af antibiotikatabletter fra Rosco efter Euproean Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) retningslinjer. Vancomycin tabletten tages ikke med i resistensbestemmelsen. Ved påvisning af ampicillin-resistens laves der E-test (Biomerieux) for vancomycin, ligeledes efter EUCAST retningslinjer. Ved påvisning af VRE sendes VRE-isolatet til Statens Serum Institut(SSI) med henblik på overvågning [19,20]. Når de fænotypiske tests anvendes til resistensbestemmelse, fås kun viden om vancomycinresistens samt tilnærmelsesvis hvilke fænotyper der er tale om ud fra MIC-værdierne, derfor er det nødvendigt at sammenholde og bekræfte resultater opnået ved disse tests med en yderligere metode, der specifikt påviser genotype ved VRE såsom Real time Polymerase Chain Reaction (PCR). Dette er nødvendigt i forbindelse med vanb stammer, der ligger i gråzonen og som kan fortolkes fejlagtigt. Resistensbestemmelse for vancomycin med E-test omtales som E-test i nærværende projekt. Desuden omtales fremadrettet resistensbestemmelse for vancomycin med antibiotikatabeletter fra Rosco, hvor vancomycinresistens bl.a. vurderes ud fra vancomycin-tablettens kant, for ulden/ikke ulden fænomenet. Side 9 af 45

11 I et tidligere studie, som blev udarbejdet på KMA, OUH, [21] med det formål at sammenligne forskellige fænotypiske metoder til påvisning af VRE hos Enterococcus stammer isoleret fra bloddyrkning, sås uoverensstemmelse mellem E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. Med udgangspunkt heri er det interessant at sammenligne de fænotypiske metoder med en valgt opsætning af Real time PCR der efterfølgende anvendes som projektets golden standard. Problemformulering Hvordan kan Real time PCR, efter opsætning heraf, indgå i rutinediagnostikken af vancomycinresistente Enterococcus med vana, vanb og vanc, og hvordan er sensitiviteten og specificiteten for E-test og ulden/ikke ulden fænomenet ved detektion af vancomycin-resistente Enterococcus overfor Real time PCR som golden standard? Real time PCR Igennem de senere år er der blevet udviklet en række molekylærbiologiske metoder til genotypisk karakterisering af mikroorganismer. Metoderne er baseret på påvisning af en gensekvens og har muliggjort isolering og påvisning af deoxyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA) hos f.eks. bakterier [22,23]. Inden Real time PCR kan foretages, skal prøvematerialet, som ønskes undersøgt oprenses, da udgangsmaterialet for analysen er genomisk ekstraheret DNA eller RNA [22,23]. Real time PCR er en molekylær biologisk analyse og anvendes rutinemæssigt på KMA. Analysen bygger på de samme principper som ved standard PCR, hvor analysen består af en cyklus, der bliver gentaget ca. 37 gange. Hver cyklus består af 3 temperaturafhængige trin hhv. denaturering, hybridisering (annealing) og elongering (ekstention) [22,23]. Under det første trin foregår adskillelsen af DNA strengen ved 95 C resulterende i to enkelte strenge DNA. Den høje temperatur medvirker til at hydrogenbindingerne mellem baserne brydes dvs. basernes bindingspotentiale påvirkes, hvilket udnyttes i det efterfølende trin. I det næste trin bindes to korte syntetisk fremstillede DNA stykker, kaldet revers og forward primere, til hver deres enkeltstrengede DNA, hvorved der genskabes områder med dobbeltstrenget DNA. Primer sekvensen skal fremstilles således at den binder specifikt til den gensekvens som ønskes påvist. Revers primer er komplementær til 3 enden af DNA template hvor forward primer er identisk med 5 enden af DNA template [22,23,24]. Derudover bindes i dette trin en kort oligonukleotid, kaldet TaqMan probe, til det enkeltstrengede DNA. TaqMan proben består af nukleotider som er Side 10 af 45

12 komplementær til target DNA og er mærket med to fluorescerende farvestoffer hhv. reporter og quencheren. Så længe proben er intakt neutraliserer farvestofferne hinanden. I dette trin er det nødvendigt at sænke temperaturen til 54 C som er annealingstemperatur [22,23,24]. Sidst trin forløber ved 72 C, hvor DNA syntesen foregår under elongeringfasen vha. en varmestabil DNA polymerase som er et enzym der katalyserer påsætning af frie nukleotider(dntp) på den komplementære streng. Under DNA syntesen vil polymerasen klippe proben i stykker da proben forhindrer syntesen. Når proben klippes i stykker vil der kunne detekteres et fluorescerende signal fra reporteren. Signalets styrke er afhængig af target DNA, dvs. jo mere DNA der replikeres, jo mere probe der klippes i stykker, desto kraftigere er signalet. Dvs. at der er tale om en ligefrem proportionalitet mellem det fluorescerende signal og PCR-produktet [22,23]. Signalet der detekteres bliver registreret på en amplifikationskurve, som viser resultaterne opnået ved Real Time PCR. På x-aksen ses et antal af cykler som funktion af DNA mængden på y-aksen. Derudover ses på amplifikationskurven en tærskelværdi(treshold), der fastsættes og som er det punkt hvor fluorescenssignalet overstiger baggrundssignalet. Det cyklusnummer, hvor Treshold nås, betegnes Cycle treshold(ct) og beregnes for hver prøve. På amplifikationskurven ses desuden de 3 faser, som en Real time PCR-analyse indeholder, nemlig den eksponentielle fase, den lineære fase og den stationære fase. Ved realtime PCR foretages måling under dannelsen af PCR-produktet under eksponentielle fase [22,23]. Real time PCR analysen kan i praksis forløbe som et FAST PCR program, hvilket indebærer, at annealings- og elongeringstrinnet kan kombineres hvis temperaturerne i disse trin er tætte på hinanden [14,23]. Agardiffusionsmetoder Resistensbestemmelse af bakterier sker bl.a. ved bestemmelse af MIC-værdien eller ved bestemmelse af hæmningszonen vha. diskdifussionsmetoden, hvor antibiotika diffunderer ud i den inokulumtilsået agarplade. Antibiotika kan være i form af plastik strip (E-test) eller disktabletter (Rosco) [25]. Resistensbestemmelse med vancomycin-tabletten fra Rosco Resistensbestemmelse med Rosco-tabletter udføres ved at lægge antibiotika tabletter på en inokulumtilsået agarplade, som inkuberes i 24 timer ved 35 grader. Antibiotika vil under inkubationen diffundere ud i mediet, hvor der dannes en hæmningszone hvis bakterien er sensitiv for det pågældende antibiotikum [25]. Zonestørrelsen måles ved at måle zonediameteren til kanten af den komplette hæmning rundt om tabletten [26]. De aflæste zonestørrelser konverteres derefter til Side 11 af 45

13 SIR-værdier/breakpoints fra EUCAST, hvor S står for sensitiv, I for intermediær og R for resistent [27,25]. Vancomycin er ifølge EUCAST sensitiv ved 12 mm og resistent ved < 12 mm [19]. Desuden skal vurdering af vancomycinresistens ifølge EUCAST ikke kun baseres på måling af zonestørrelsen ved anvendelse af vancomycin-tabletten, men også på baggrund af hæmningszonens udseende, hvor fænomenet hedder ulden/ikke ulden [27]. Ved resistens overfor vancomycin vil kanten på hæmningszonen være uskarpt ulden, og der ses bakteriekolonier ind i hæmningszonen. Derimod indikerer en ikke ulden kant dvs. en skarp kant, at bakterien er sensitiv for vancomycin [27]. Resistensbestemmelse for vancomycin med E-test E-test er en metode der anvendes til resistensbestemmelse og som bygger på gradientdiffusion [25]. E-test er en plastik strip på ca. 50 mm og anvendes med henblik på at bestemme MIC-værdien af et givet antibiotikum overfor en bestemt bakterie [28,29]. E-test er en kvantitativ metode som kombinerer agardiffusionsmetoden med fortyndingsmetoden [24]. På oversiden af E-testen ses en antibiotikakoncentrationsgradient med 15 forskellige MIC-værdier, angivet i µg/ml, i dobbeltfortyndinger for det antibiotikum som ønskes undersøgt. Desuden ses på oversiden maksimumsværdien i toppen af strimlen og minimumsværdien i bunden. Undersiden af strippen består af foruddefineret antibiotikagradient. Ved resistensbestemmelse placeret E-test strippen på overfladen af en inokulumtilsået agarplade, hvor antibiotika vil begynde at diffundere. Efter inkubationen ved 35 o C i 24 timer, vil der dannes en ellipseformet hæmningszone omkring strippen hvis bakterien er sensitiv. MIC-værdien for det pågældende antibiotikum kan direkte aflæses ved hæmningszonens skæring med strippen [28,29,30,31]. De aflæste MIC-værdier fortolkes ligeledes med SIR-værdier/breakpoints. MIC-værdien for E-test vurderes ifølge EUCAST på baggrund af ovenstående breakpoints, hvor vancomycin er sensitiv ved 4µg/ml og resistent ved > 4 µg/ml [27]. Metodiske overvejelser Dette projekt er en retrospektiv kvantitativ undersøgelse som baserer sig på 64 Enterococcus stammer isoleret fra blod, samt 4 kendte VRE-stammer som kontroller. Formålet med det nærværende projekt er, at detektere tilstedeværelse af vancomycin-gener, vana, vanb og vanc, i en kollektion af 64 Enterococcus stammer isoleret fra blod, samt 4 VRE kontrolstammer for de pågældende gener vha. en opsat Real time PCR med henblik på at Side 12 af 45

14 sammenligne med de fænotypiske metoder, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet, som i det tidligere studie [21] er udført på samme 64 Enterococcus stammer. Nærværende projekt blev baseret på opsætning af Real time PCR, hvorved de mest specifikke primere-/probe assay og den bedste positive kontrolstamme for hhv. vana, vanb og vanc gener samt den bedste interne kontrol blev valgt. I denne forbindelse blev der bestilt to assays, som begge indeholder en forward primer, en reverse primer og en probe, for hhv. vana, vanb, vanc (vanc1 og vanc2/3) samt et assay for hhv. 23s og 16s som er interne kontroller. 23s er et Enterococcus specifikt assay hvor 16s ikke er species-specifikt assay, da det indeholder ribosomale RNA (rrna) gener, som findes i ethvert bakteriegenom [32]. Både 23s og 16s kontrollerer at eluatet indeholder DNA, der kan opformeres, samt at der ikke er for mange hæmmende stoffer tilstede i prøven. Den ene assay for vana og vanb, begge vanc assays samt 16s assay blev designet på KMA, OUH vha. et elektronisk blastings program (NCBI primer-blast program). Sidst nævnt assays omtales i nærværende projekt som in-house 1 assays. De andre assays for vana og van B blev valgt på baggrund af Fang H. et al. studie [33], hvor 23s blev valgt på baggrund i et studie af Ryu Hodon et al. [32]. Sidstnævnte assays omtales som in-house 2 i projektet. De ovennævnte forskellige assays blev afprøvet på 7 velkarakteriserede VRE stammer. Ud fra de opnåede ct-værdier på baggrund af de målte fluorescerende signaler ved Real time PCR, blev de bedste assays for vana og vanb samt den interne kontrol valgt. Begge vanc assays blev også valgt. Derudover blev 4 af de 7 medtagene kendte VRE stammer valgt som positive kontroller. I betragtning af at projektet tager udgangspunkt i kendte gener, er real time PCR en ideel påvisningsmetode. Real time PCR metoden benyttes i nærværende projekt som golden standard. Dette skyldes at det er blevet påvist at Real time PCR kan erstatte de fænotypiske metoder til detektionen af VRE, da metoden er mere sensitiv. Desuden er den mindre tidskrævende [14,34]. Endvidere er Real time PCR en ideel påvisningsmetode, da den i forhold til andre PCR metoder er mere reproducerbar, mere simpel, mindre tidskrævende og har mindre risiko for kontaminering [14,34]. Disse fordele ligger til grund for valg af real time PCR. For at sammenligne tidligere resultater opnået ved hhv. E-test og ulden/ikke ulden metoderne med resultater fremkommet ved Real time PCR, anvendes deskriptiv statistik i form af specificitet og sensitivitet. Sensitivitet og specificitet anvendes til at vurdere metodens evne til at give en korrekt og præcis diagnose. Sensitivitet indebærer metodens evne til at give en korrekt diagnose af Side 13 af 45

15 vancomycin resistente bakterier(positive), hvorimod specificiteten er metodens evne til at give korrekt diagnose på vancomycin sensitive bakterier (negative). Ud fra den beregnede sensitivitet og specificitet kan der konkluderes på forsøgsresultaterne. Sensitivitet og specificitet beregnes på følgende måde [35]: Til beregning af sensitivt og specificitet er følgende defineret; Sandt positiv (SP) angiver, at der ved hhv. E-test eller ulden/ikke ulden er enighed om resistens med Real time PCR. Falsk positiv (FP) angiver, at stammen er sensitiv ved Real time PCR men resistent ved hhv. E-test og ulden/ikke ulden. Sandt negativ (SN) angiver, at der ved E-test og ulden/ikke ulden er enighed om sensitivitet med Real time PCR. Falsk negativ (FN) angiver, at stammen er resistent ved Real time PCR men sensitiv ved hhv. E- test og ulden/ikke ulden. På baggrund af resultater opnået ved sammenligning af de fænotypiske metoder blev der i nærværende projekt foretaget en mindre elektronisk spørgeundersøgelse, for at danne overblik over hvilke detektionsmetoder, der på nuværende tidspunkt anvendes af de forskellige Kliniske Mikrobiologiske Afdelinger i Danmark til detektion af VRE (bilag 1). Materialer og metoder Materialer Prøvematerialer Til opsætning af Real time PCR blev følgende 7 kendte VRE stammer og assays anvendt; De kendte stammer er fra KMA (Skejby) og SSI, og besår af: E. faecium vana (1) (A ATCCA ), E. faecium vana (2)(B ), E.faecium vanb (N-AST 4), E. faecalis vanb1 (N-AST 9), E. faecium vanb2 (N-AST 5), E. gallinarum vanc1 (G ATCC ) og E. casseliflavus vanc2 (H ATCC ). Side 14 af 45

16 Følgende in-house 1 assays; vana-svh forward (CAGGAAGTCGAGCCGGAAA), vana-svh reverse (GGTCTGCGGGAACGGTTAT) og vana-svh probe (FAM- AGGCTCTGAAAACGCAGT-MBG), vanb-svf forward (GGTAACGAGGATGATTTGAG), vanb-svh reverse (CGTGGCTCATCCGGATT) og vanb-svh prober (VIC- CGGCGAAGTGGATC-MGB), vanc1-forward (GAAATTGGCTGCGGCATCT), vanc1-reverse (TCGCATCACAAGCACCAATC) og vanc1-probe (FAM-AGGAAATGAGCAATTGA-GMB), vanc2/3-forwad (GATCGGTTGCGGTATTTTGG), vanc2/3-forward (TGAAATGGCGTCACAAGCA), vanc2/3-reverse (TGAAATGGCGTCACAAGCA) og vanc2/3-probe (VIC-CAACGACTCTTTGACTGTC-MGB), 16S- forward (CCAGAAAGCCACGGCTAACT), 16S- reverse (CGCTTGCCACCTACGTATTA) og 16S-probe (FAM-CGTGCCAGCAGCC-MGB). Følgende in-house 2 assays; vana-forward (AGTCAATACTATGCCCGGTTTC), van-reverse (GCAGCGGCCATCATACG) og vana-probe (FAM-CGTCATACAGTCGTTATC-MGB), vanbforward (TCCGGTCGAGGAACGAAA), vanb-reverse (GCCCTCTGCACCAAGCA) og vanbprobe (VIC-ACGGCAAAGAAAGTATATC-MGB), 23S-forward (AGAAATTCCAAACGAACTTG), 23S-reverse (CAGTGCTCTACCTCCATCATT) og 23Sprobe (FAM-TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTAGGGCTA-BHQ1). Opsætning af Real time PCR blev anvendt til undersøgelse af følgende 64 Enterococcus stammer; med henblik på sammenligner med de fænotypiske tests; 19 E. faecium, 9 E. faealis, 5 E. casseliflavus, 5 E. galllinarum, 4 E. casseliflavus/gallinarum, 5 E. avium, 6 E. durans, 3 E. raffinosus, 2 E. avium/raffinosus, 1 E. dispar, 1 E. gilvus/maldoratus, 1 E. mundtii, 1 E. psuedoavium, 2 E. hirae/durans/faecium og 1 E. avium/raffinosus (bilag 2). Kontrolstammerne var 4 velkarakteriserede VRE stammer fra hhv. KMA (Skejby) og Statens Serum Institut (SSI), ved navn E. faecium vana 2, E. faecalis vanb1, E. gallinarum vanc1 og E. casseliflavus vanc2/3. Apparatur Til projektet blev 7500 FAST Real time PCR system anvendt til analyse af prøvematerialet. 35 C termostat blev anvendt til inkubation af renkulturerne. Mikrocentrifuge blev anvendt til centrifugering af prøverne. Eppendorf Termostat Plus blev anvendt til kogning af bakterier. Køleskab blev anvendt til opbevaring af tubes med bakterieafkog. Side 15 af 45

17 Utensilier Derudover blev følgende utensilier anvendt; PCR-plade, automatpipetter, tubes med sterilt vand, filterpipettespidser, 1½ ml mikrocentrifugerør, køleblokke, 5 % agarplade (SSI) og 1μL øjepodenål. Reagenser Følgende reagenser for Real time PCR analysen blev anvendt; mastermix (no AmpErase UNG (Applied Biosystems ) som indeholdt PCR buffer, dntp, TagMan-polymerase, forward primer for vana, vanb og vanc samt reverse primer for vana, vanb og van C (DNA Technology), sterilt H 2 O, Tag-Man probe (MGB-prober fra Applied Biosystems og Prober med quencheren BHQ1 fra DNA Technology). Metode Det eksperimentelle arbejde i dette projekt blev udført efter nedstående fremgangsmåde for såvel de 7 kontrolstammer som de 64 Enterococcus stammer. Del 1: Klargøring af stammer Enterococcus-stammer fra frysestik samt kontrol-stammer blev udsået på 5 % blodagarplade. Alle plader blev inkuberet ved 35 C i termostat i et døgn. Dagen efter blev der udsået renkulturer af alle stammer på 5 % blodagarplade og inkuberet ved 35 C i termostat. Del 2: Klargøring af DNA 1-2 enkelt liggende kolonier fra renkulturerne blev opslemmet i en tube tilsat 250 µl sterilt vand til opløsningen blev uklar. Eppendorf Termostat Plus, som er klar til anvendelse når temperaturen er oppe på 99 C blev anvendt til indsætning af blokken med de klargjorte tubes. Efter 10 minutters kogning blev tubes taget ud af apparatet og afkølet. Dernæst centrifugeredes alle tubes ved rpm i 1 minut. Tubes med oprenset bakterie-dna opbevaredes på køl. Del 3: Real time PCR 7500 FAST Real time PCR apparatet blev tændt og fik lov til at stabilisere sig i 15 minutter. Efterfølgende blev et PCR-pladelayout for resistensgenerne vana, vanb og vanc udfyldt. PCRpladelayoutet viste fordelingen af prøverne i PCR apparatet (bilag 3). Data indtastedes i 7500 FAST Real time PCR apparatet. Inden PCR-kørslen, skulle de bestilte primere og prober for hhv. vana, vanb og vanc opløses med 100 μl nuclease-frit vand. Efterfølgende skulle PP-mix for hhv. vana, vanb og vanc Side 16 af 45

18 resistensgenerne fremstilles separat i et 1½ ml mikrocentrifugerør. PP-mixet blev fremstillet ved at blande 25 µl af den opløste forward primer, 25 µl af den opløste reverse primer, 5 µl probe og 195 µl nuclease-frit vand, således at der blev et samlet volumen på 250 µl. Derefter blev rørene centrifugeret kort vha. mikrocentrifugen. Dernæst blev et PCR-mastermixet pr. reaktion fremstilet ved at tilsætte 12,5 µl Taqman FAST mastermix 2x der bl.a. indeholder dntp, PCR-buffer samt Tag-polymerase i mikrocentrifugerør. Derudover tilsættes 2,5 µl af det fremstillede PP-mix samt 5,0 µl nuclease-frit vand. Mastermixet havde et samlet volumen på 20 µl. Efterfølende centrifugeredes kort vha. mikrocentrifugen, således at reagenserne samledes i bunden af røret. En PCR-plade blev lagt i en køleblok. Der blev tilsat 20 µl PCR- mastermix i bunden af hver brønd i PCR-pladen samt 5 µl bakterieafkog til hver brønd i PCR-pladen på nær den negative kontrol hvor der blev tilsat 5 µl nuclease-frit vand. PCR-pladen blev tildækket med stanniol og indsat i 7500 FAST Real-Time PCR apparatet. PCR apparatet blev indstillet til at forløbe efter følgende FAST PCR-program: initial denaturering ved 95 C i 20 sekunder, 45 cykler ved denaturering ved 95 C i 3 sekunder efterfulgt af annealingstrinnet kombineret med elongeringstrinnet ved 60 C i 30 sekunder. Efter endt analyse blev resultaterne vha. USB-stik overført til en computer hvor de blev behandlet og analyseret. I denne proces blev treshold fastsat og derved fremkom CT-værdierne som udtryk for DNA-mængden. Litteratursøgning I forbindelse med udarbejdelse af dette projekt, blev de anvendte artikler søgt via PubMed på Til søgning af artiklerne, blev der anvendt søgeord, som vancomycin, Entercococcus, vana, Real time PCR, detection of VRE, resistance og vancomycin resistance. Desuden blev der valgt flere filtre for at få indkredset søgningen, såsom; Abstract, Engelsk, Full free PDF og Humans. Ved søgning af relevant litteratur blev opstillet visse kriterier: litteratur af nyere dato, skrevet af fagligt kompetente forfattere og publiceret af troværdige kilder. Artiklerne blev i første omgang vurderet på baggrund af titel og abstract, hvorefter de blev gennemlæst og endelig vurderet. Derudover blev KMA s Dokument og kvalitetsssystem, Qualiware, anvendt i forbindelse med beskrivelse af de nuværende identifikationsmetoder af Enterococcus. Side 17 af 45

19 Resultater I nærværende projekt blev Real time PCR opsat på baggrund af in-house1 og in-house 2 assays, hvor der indgik 7 kendte VRE kontrolstammer. Resultater opnået herved præsenteres i nedenstående tabeller. In-house 1 In-house 2 Assays Kontrol-stamme vana vanb vanc1 vanc2/3 vana vanb Middelværdi Middelværdi E. faecium vana(1) 16, ,6 - E. faecium vana(2) 15, ,1 - E. faecium vanb 37,8 22,1 20, ,5 20,4 21,4 20,9 E. faecalis vanb1-19,4 19, ,7 18,1 19,3 18,9 E. faecium vanb2-25,4 25, ,8 24,5 25,4 25,2 E. gallinarum vanc , E. casseliflavus vanc ,3 - - Negativ kontrol (Rnase frit vand) Tabel 1: viser oversigt over beregnede middelværdier af ct-værdier i dobbeltbestemmelser opnåede ved positive reaktioner mellem 7 VRE kontrol-stammer og hhv. in-house 1 assays, vana, vanb, vanc1 og vanc2/3, og in-house 2 assays, vana og vanb (bilag 4). Ved vanb assayene angiver de markerede felter ctværdier. Ved stammerne angiver - i tabellen, at stamme mangler van-genet som ønskes undersøgt med det pågældende assay. - ved de negative kontroller angiver fravær af van-gen til opformering. Af tabel 1 ses at der ved anvendelse af in-house1 vana assay opnås en middelværdi på 16,4, 15,4 og 37,8 for hhv. E. faecium vana(1), E. faecium vana(2) og E. faecium vanb. For in-house 2 vana assay er middelværdierne for hhv. E. faecium vana(1), E. faecium vana(2) på 18,6 og 17,1. For in-house 1 vanb assay opnås middelværdier på 21,4, 19,3 og 25,4 på hhv. E. faecium vanb, E. faecalis vanb1 og E. faecium vanb2, og middelværdier på 20,9, 18,9 og 25,2 for samme stammer ved anvendelse af in-house 2 vanb assay. Tabel 1 viser også at der ved anvendelse af in-house 1 vanc1 assay opnås en middelværdi på 21,3 for E. gallinarum vanc1 isolat og en middelværdi på 21,3 for E. casseliflavus ved anvendelse af inhouse 1 vanc2/3 assay. Side 18 af 45

20 ct-værdier for interne kontroller Kontrol-stamme In-house 1 16S In-house 2 23S E. faecium vana(1) 15,5 15,5 17,0 17,0 E. faecium vana(2) 13,8 13,9 15,4 15,5 Negativ kontrol 31,4 31,9-38,6 (Rnase frit vand) E. faecium vanb 16,1 17,5 E. faecalis vanb1 14,7 16,0 E. faecium vanb2 20,7 22,2 E. gallinarum vanc1 14,5 15,7 E. casseliflavus vanc2 15,2 16,3 Negativ kontrol (Rnase frit vand) 32,5 - Tabel 2: viser ct-værdier opnået ved reaktioner mellem 7 VRE kontrolstammer og assays for de interne kontroller 16s og 23s. VanA kontrol-stammer er kørt i dobbeltbestemmelser mens vanb- og vanc-kontrolstammer er kørt i enkeltbestemmelser. - i tabellen angiver en negativ reaktion som indikerer manglende opformering. Ved tabel 2 ses at der ved anvendelse af in-house 1 16s intern kontrol, opnås ct-værdier for alle de anvendte stammer. Den negative kontrol for E. faecium vana(1) og E. faecium vana(2) er på hhv. 31,4 og 31,9. Den negative kontrol for vanb- og vanc -stammer er på 32,5. Ligeledes opnås ctværdier for alle de 7 stammer ved anvendelse af 23s. Derudover er der fremkommet en ct-værdi på 38,6 i dobbeltbestemmelsen ved den negative kontrol for E. faecium vana(1) og E. faecium vana(2). På baggrund af ovenstående middelværdier på de opnåede ct-værdier blev in-house 2 vana assay, in-house 1 vanb assay, in-house 1 vanc1- og vanc2/3- assays samt 23s som interne kontrol valgt. E. faecium vana(2)-stamme, E. faecalis vanb1-stamme samt E. gallinarum vanc1-stamme og E. casseliflavus vanc2-stamme blev også valgt som positiv kontroller. Alle valg blev foretaget med henblik på undersøgelse af de 64 Enterococcus stammer. Efter opsætning af Real time PCR blev de fænotypiske metoder, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet sammenlignet med Real time PCR golden standard. Beregningerne af sensitiviteter og Side 19 af 45

21 specificiteter for både E-test og ulden/ikke ulden baseret på samme 64 Enterococcus stammer (bilag 5,6) indgår i nedstående tabel: Sensitivitet Specificitet E-test 41 % 100 % 100 % 100 % Ulden/ikke ulden 24 % 100 % 80 % 80 % Tabel 3: viser beregnede sensitiviteter og specificiteter for hhv. E-test og ulden/ikke metoderne. + angiver E. casseliflavus og E. gallinarum hvor - angiver at disse stammer er undladt i beregningerne. Af tabel 3 ses at den beregnede sensitivitet for E-test og ulden/ikke ulden er på hhv. 41 % og 24 % hvor E. casseliflavus og E. gallinarum er medtaget og på 100 % for begge test hvor casseliflavus og E. gallinarum er undladt. Det ses også i tabellen at specificiteten for E-test er uændret på 100 % med og uden casseliflavus og E. gallinarum, på lignende måde er specificiteten af ulden/ikke ulden uændret på 80 %. Diskussion Opsætning af Real time PCR Da Real time PCR i nærværende projekt anvendes til undersøgelse af 64 Enterococcus stammer vil en opsætning heraf være nødvendig. På baggrund af de afprøvede assays til denne opsætning blev de mest specifikke assays valgt på baggrund af deres specifikke reaktioner med de kendte VRE stammer. Assays blev anvendt til det formål, at påvise van-gener, vana, vanb og vanc i Enterococcus stammerne. Ud fra de afprøvede vana assays til påvisning af vana genet blev in-house 2 vana assay valgt. Af tabel 1 ses, at In-house 1 vana assay gav lavere middelværdier på de opnåede ct-værdier i dobbeltbestemmelserne som er på hhv. 16,4 og 15,4 for E. faecium vana1 og E. faecium vana(2) sammenlignet med in-house 2 vana assay hvor middelværdierne på samme stammer lå på 18,6 og 17,1. På baggrund af de opnåede lave middelværdier for in-house 1 vana assay, indikerer disse værdier at dette vana assay umiddelbart vil være hurtigere til at detektere vana genet. Dette betyder at der skal færre cyklusser til for at opformering af genet sker, derved opnås tærskelværdien hurtigere resulterende i lavere ct-værdier. Dog blev in-house 1 vana assay trods det fravalgt til detektion af vana genet i nærværende projekt. Dette skyldes at in-house 1 vana assay reagerede uspecifikt med en vanb-stamme, E. faecium vanb jf. tabel 1 med en middelværdi på 37,8. Ulempen ved anvendelse af netop in-house 1 vana assay vil være forbundet med en risiko for falske positive Side 20 af 45

22 resultater, og at evt. positive reaktioner ikke vil være pålidelige. Med udgangspunkt i den valgte inhouse 2 vana assay, blev E. faecium vana(2)-stamme endvidere valgt som positiv kontrol til undersøgelse af projektets Enterococcus stammer, da stammen gav en lavere middelværdi på 17,1 sammenlignet med E. faecium vana1 som havde en middelværdi på 18,6 jf. tabel 1. Til detektionen af vanb genet blev in-house 1 vanb assay valgt. Sammenligning af in-house 1 vanb assay med in-house 2 vanb assay blev ikke baseret på middelværdierne på de opnåede ct-værdier ligesom ved vana assays. Sammenligningen blev baseret på differencerne mellem de præsenterede ct-værdier i dobbeltbestemmelser jf. tabel 1. Dette skyldes at middelværdierne for både in-house 1/2 vanb assays lå meget tæt på hinanden, hvilket indikerer at begge assays er lige anvendelige til detektion af vanb typer. Da der skulle vælges en opsætning til detektionen af vanb genet, blev valget af de afprøvede vanb assays baseret på differencen mellem ct-værdierne i hver enkel dobbeltbestemmelse. Ved in-house 1 vanb assay var differenserne, i test med to vanb-stammer, E. faecalis vanb1-stamme med ct-værdier på 19,4 og 19,1 og E. faecium vanb2-stamme, med ctværdier på 25,4 og 25,3, i disse dobbeltbestemmelser mindre i forhold til differenserne på in-house 2 vanb assay for E. faecalis vanb1-stamme med ct-værdier på 19,7 og 18,1 og E. faecium vanb2- stamme med ct-værdier på 25,8 og 24,5. Da differencen mellem ct-værdierne ved in-house 1 vanb assay er mindre end ved in-house 2 vanb assay betyder det, at der ved anvendelse af in-house 1 vanb assay, skal færre cyklusser til for at opformering af vanb-genet sker. Dvs. at tærskelværdi(treshold) nås hurtigere og dermed registreres på kurven som lavere ct-værdier. Dette betyder at in-house 1 vanb umiddelbart vil være hurtigere til at detektere vanb genet. Derfor blev in-house 1 vanb assay valgt til påvisning af vanb typer i de anvendte 64 Enterococcus stammer i nærværende projekt. Endvidere blev E. faecalis vanb1 valgt som positiv kontrol for vanb genet i de undersøgte Enterococcus stammer, da stammen havde lavere Ct-værdier end de andre vanb-stammer. Til detektion af vanc1 samt vanc2/3 blev begge in-house 1 vanc assays valgt. Ud fra tabel 1 ses at både vanc1 og vanc2/3 assays var specifikke for hver deres stamme, dvs. begge assays reagerede korrekt, hvilket er observeret ved at vanc1 assay kun reagerede med vanc1-stammen som er E. gallinarum. Det samme gælder for vanc2/3, der specifikt reagerede med vanc2/3-stammen som er E. casseliflavus. E. gallinarum vanc1 samt E. casseliflavus vanc2 stammer blev derfor valgt som kontroller til undersøgelse for projektets Enterococcus stammer for hhv. vanc1- og vanc2/3- gener. Side 21 af 45

23 Under opsætning af Real time PCR blev interne kontroller, in-house 2 23s assay, som er et Enterococcus species-specifikt assay, og in-house 1 16s assay, der i modsætning hertil er et speciesuspecifikt assay [32], undersøgt. I betragtning af at de interne kontrollere skal kontrollere at prøvematerialet indeholder DNA, som kan opformeres, er kontrollen umiddelbart ikke interessant til opsætning af Real time PCR; da opsætningen tager udgangspunkt i kendte VRE stammer og dermed forventes at blive opformeret. Dog indgik 23s som intern kontrol under opsætning da kontrollen skal efterfølgende anvendes til undersøgelse af de 64 Enterococcus stammer i nærværende projekt. Tabel 2 viser at ved den negative kontrol for vana-stammer ses en positiv reaktion med ct-værdier i dobbeltbestemmelsen på 31,4 og 31,9 ved anvendelse af 16s in-house 1 assay. Ligeledes ses en ctværdi i den negative kontrol for vanb- og vanc- stammer på 32,5. De overraskende positive reaktioner i de nævnte negative kontroller hænger måske sammen med en kontaminering, da ctværdierne ved disse er langt højere end ct-værdierne opnået for VRE kontrol-stammerne. Kontaminering kan være fra producentens side eller kan skyldes en kontaminering med PCRprodukter fra en tidligere PCR kørsel. Valget af 16s assay som intern kontrol til undersøgelse for projektets Enterococcus stammer ville være forbundet med upålidelige positive resultater ved en evt. positive reaktion og derfor blev dette assay ikke valgt. 16s skal afprøves på flere kendte VRE stammer for endeligt at kunne vurdere på dens anvendelighed i klinikken som intern kontrol. Tabel 2 viser at den interne kontrol in-house 2 assay, 23s, har en positiv reaktion ved den negativ kontrol for vana-stammer i en dobbeltbestemmelse med en ct-værdi på 38,6. 23s har dog som forventet givet en negativ reaktion i den negative kontrol for både vanb- og vanc-stammer samt i dobbeltbestemmelsens anden måling ved den negative kontrol for vana-stammer. Den overraskende positive reaktion kan evt. skyldes en kontaminering som tidligere nævnt. Ud fra de opnåede ct-værdier for 23s og 16s assays, blev 23s assay valgt til at indgå som intern kontrol i undersøgelsen af projektets Enterococcus stammer på trods af den ene positive reaktion, der efterfølgende kan give anledning til falske positive resultater. Ifølge studiet af Ryu Hodon et al.[32] er 23s et Enterococcus specifikt assay. I dette studie af Ryu Hodon et al.[32] blev 153 Enterococcus stammer undersøgt for at evaluere 23s som værende et Enterococcus species-specifikt assay. 23s assay har ifølge studiet reageret specifikt med alle de undersøgte Enterococcus stammer. Side 22 af 45

24 På baggrund af den valgte opsætning af Real time PCR blev 64 Enterococcus stammer undersøgt, med henblik på sammenligning med tidligere opnåede resultater på samme stammer med fænotypisk test, E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. Til sammenligning af sidstnævnte tests anvendes Real time PCR som golden standard i nærværende projekt. Under opsætning af Real time PCR blev 7 kendte Enterococcus kontrol stammer inkluderet. For at kunne anvende PCR som golden standard til sammenligning med de fænotypiske test, vil en opsætning baseret på 7 VRE kontrolstammer ikke være tilstrækkelig i forhold til at beregne sensitiviteter og specificitet for disse metoder. I et studie af Tripathi A, Shukla SK et al.[14] blev 80 VRE samt 65 vancomycin-resistente Enterococcus (VSE) inkluderet til undersøgelse af Real time PCR s kliniske anvendelse i forbindelse med detektion af VRE sammenlignet med andre VRE detektionsmetoder som f.eks. E- test og andre molekylær biologiske metoder bl.a. standard PCR. Et andet studie af Taek Soo Kim, Hye Lin Kwon et.al [34] viser en anvendelse af 100 VRE samt VSE stammer til undersøgelse af Real time PCR s kliniske anvendelse til detektion af VRE, hvor studiet efterfølgende anvender resultatet for disse stammer, opnået ved Real time PCR, til vurdering af forskellige fænotypiske metoder. Da den anvendte VRE population i nærværende projekt er begrænset sammenlignet med ovennævnte studier, vil det være oplagt at anvende flere VRE stammer til selve opsætningen af Real time PCR som golden standard til sammenligning af de fænotypiske metoder. Dvs. at populationen skal være væsentlig større, da sandsynligheden for at opdage en evt. uspecifik reaktion ved de valgte assays vil være større [35]. På trods af projektets begrænsede datasæt til opsætning af Real time PCR, et sæt der bestod af kun 7 VRE stammer, blev metoden valgt til videre undersøgelse for projektets 64 Enterococcus stammer. Denne opsætning blev valgt ud fra de meste specifikke vana, vanb og vanc assays som forventedes at binde specifikt ved efterfølgende anvendelse af dem. Med udgangspunkt i de valgte assays, har det været muligt, at anvende disse til identifikation af de 64 Enterococcus stammer, hvor resultaterne efterfølgende blev anvendt til sammenligning med resultater opnået tidligere fra de fænotypiske metoder hhv. E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. Sammenligning af E-test med Real time PCR Til beregning af sensitiviteter og specificiteter for E-test og ulden/ikke ulden vha. Real time PCR blev der i jf. tabel 3 opnået en sensitivitet på 41 % for E-test og en sensitivitet på 24 % for Side 23 af 45

25 ulden/ikke ulden hvor E. gallinarum (vanc1) og E. casseliflavus (vanc2) stammer er inddraget i beregningerne. Sensitiviteten er dog betydelig forhøjet når disse to stammer ikke tages i betragtning i beregningerne, hvilket ses ved at der opnås en sensitivitet på 100 % for de omtalte metoder dvs. sensitiviteten øges med hhv. 59 % og 76 %. En sensitivitet på 100 % angiver metodens evne til at give en korrekt diagnose af vancomycinresistente bakterier. Endvidere kan der ud fra tabel 3 ses, at specificiteten er uændret på 100 % for E-test og på 80 % for ulden/ikke ulden hvilket understreger metodernes evne til at give en korrekt diagnose på vancomycin sensitive bakterier. E. gallinarum og E. casseliflavus stammer har medfødt resistens for vancomycin grundet deres vanc resistensmekanisme. Ifølge EUCAST [27] kan MIC-bestemmelsen samt diskdiffusionsmetoden ikke anvendes til identifikation af vanc-stammer. Derfor kan artsbestemmelsen anbefales udført bl.a. med MALDI-TOF og menes at være tilstrækkeligt til efterfølgende valg af behandling. Ud fra resultaterne opnået ved sammenligning af de fænotypiske test med Real time PCR jf. tabel 3 og som diskuteret i ovenstående, ses at de beregnede sensitiviteter påvirkes betydeligt når E. casseliflavus og E. gallinarum medtages. For at opnå en højere sensitivitet for de fænotypiske metoder skal disse to vanc-stammer udtages og identificeret vha. eksempelvis MALDI-TOF som tidligere nævnt at være anbefalet af EUCAST. Dette bekræftes ved de 100 % opnåede sensitiviteter for begge metoder hvor E. casseliflavus og E. gallinarum ikke blev taget i betragtning i beregningen. Et studie af Griffin PM et. Al [6] viser at MALDI-TOF egner sig til artsidentifikation af Enterococcus, hvor der konkluderes på at metoden har en sensitivitet på 96,7 % og en specificitet på 98,1 %, hvilket stemmer overens med EUCAST anbefalingen. Så ud fra ovenstående hvor der understreges at MALDI-TOF kan anvendes til artidentifikation af E. casseliflavus og E. gallinarum, kan det betyde at patienten kan komme hurtigere i behandling med f.eks. teicoplanin da vanc stammer er sensitive overfor teicoplanin [36]. Dog vil en fænotypisk resistensbestemmelse i form af E-test efterfølgende kunne tænkes at være nødvendigt, idet E. casseliflavus og E. gallinarum måske kan erhverve eksempelvis et vana-gen [27], hvilket igen kan betyde at patienten alligevel ikke vil have gavn af anvendelsen af teicoplanin som behandlingsmulighed, idet vana er resistent overfor vancomycin og teicoplanin, i modsætning til vanb og vanc [17]. Side 24 af 45

26 På baggrund af ovennævnte problemstilling ved medtagelse af vanc- stammer i sensitivitet beregningen, vil den videre diskussion af de fænotypiske metoder tage udgangspunkt i de beregnede sensitiviteter hvor E. casseliflavus og E. gallinarum ikke er medtaget. I nærværende projekt ses som tidligere nævnt at der ved sammenligning af E-test opnås en sensitivitet på 100 % når metoden holdes op imod Real time PCR som golden standard. De opnåede resultater på de 64 Enterococcus stammer, stemmer fuldstændig overens med resultaterne opnået ved Real time PCR. Dvs. at E-test i dette projekt peger på at metoden kan anvendes til detektion af VRE. Detektionen af et specifikt van-gen hos Enterococcus kan ved anvendelse af E-test i forbindelse med rutinearbejde i nogle tilfælde være problematisk. Da for eksempel MIC-værdien for vanb sensitive-enterococcus er fastsat til 4µg/ml [19], og dermed ligger i gråzonen, kan det betyde at nogle vanb stammer ved en MIC-værdi på 4 µg/ml fejlagtigt bliver diagnosticeret som værende sensitive i stedet for resistente. Dette kan have fatale konsekvenser for patienten. Et studie af Schulz JE, Sahm et. al, [30] der bl.a. undersøger for E-testens evne til at detektere high-level and low-level resistens for vancomycin ved anvendelse af blot 14 VRE fordelt på følgende stammer; E. faecium, E. faecalis, E. gallinarum og E. casseliflavus konkluderer at fortolkning af E-test må udføres med forsigtighed da især detektionen af low-level vancomycin resistens i denne forbindelse er problematisk. Endvidere kan detektionen af Enterococcus ved anvendelse af E-test ligeledes være problematisk ved vanb-stammer, med høje MIC-værdier. Der kan opstå et overlap mellem vana, med en MICværdi på µg/ml, og vanb med en MIC-værdi på 4-64 µg/ml. Overlappet vil kunne forekomme ved en MIC-værdi på µg/ml, hvilket kan vanskeliggøre identifikationen af highlevel vanb. Eftersom der i nærværende projekt kun anvendes 2 vanb stammer kan der ikke siges noget om hvor god E-test endelig er til at detektere det eksakte gen som ligger i gråzonen, trods dens 100 % opnåede sensitivitet da sensitiviteten i denne forbindelse kun siger noget om hvor god E-test er til at detektere resistens for vancomycin hos de undersøgte Enterococcus stammer. Med afsæt i ovenstående diskussion vil det være oplagt at anvende en detektionsmetode som den anvendte Real time PCR i nærværende projekt, da analysen er i stand til at detektere det eksakte Side 25 af 45

27 van-gen og dermed vil problematikken ved vanb stammer i gråzonen undgås når vancomycinresistens skal detekteres. Dette er relevant når behandling for patienten skal vælges. Eksempelvis kan vanb resistens behandles med teicoplanin hvilket ikke er tilfældet for vana resistens, da dette som tidligere nævnt, adskiller sig fra vanb ved at vana ud over vancomycin viser resistens over for teicoplanin. I flere studier [14,34] er der enighed om at den omtalte PCR analyse er en oplagt metode til detektionen af van-gener hos Enterococcus. Ifølge det tidligere nævnte studie af Tripathi A et. Al [14] blev de anvendte VRE stammer analyseret specifikt for van-gener vha. Real time PCR hvor stammer blev bekræftet værende vana typer. Real time PCR har opnået en sensitivitet og en specificitet på 100 %. Endvidere bekræfter studiet at Real time PCR analysen er en hurtig metode til detektionen af van-gener hos Enterococcus, når MIC-værdien på forhånd er bestemt ved f.eks. E- test. Desuden vil denne kombination af metoder vil være til gavn når behandling af infektioner forårsaget af VRE skal vælges [14]. Desuden nævner studiet, at der ved anvendelse af Real time PCR som en kvantitativ analyse, blev set en direkte sammenhæng mellem vana kopiantal dvs. niveauet af glykopeptid-resistens, og MIC-værdien. Studiet konkluderer bl.a. at Real time PCR er en mere præcis og hurtig metode til detektion af VRE sammenlignet med fænotypiske metoder. I et andet tidligere nævnt studie skrevet af Taek Soo Kim et. al [34], hvor formålet var at undersøge den kliniske anvendelse af Real time PCR til detektionen af vana gen overfor de fænotypiske detektionsmetoder såsom E-test og diskdiffusion, kom studiet også frem til at Real time PCR var bedre til detektion af VRE og at metoden kan erstatte de fænotypiske metoder. Når ovenstående studier holdes op imod hinanden ses at der er uenighed om hvordan Real time PCR klinisk kan anvendes. I studiet Tripathi A et. al [14] understreges at Real time PCR s anvendelighed i klinisk sammenhæng må være optimalt når den udføres efter en fænotypiske metode, f.eks. E-test. Derimod mener studiet af Taek Soo Kim et. al [34] at Real time PCR kan benyttes som alternativ for de fænotypiske metoder. På baggrund af ovenstående, hvor Real time PCR direkte anvendes til detektionen af VRE, vurderes det at være økonomisk dyrt at anvende Real time PCR rutinemæssigt uden en forudgående resistensbestemmelse vha. diskdiffusionsmetoden og E-test, da flere vancomycinsensitive Side 26 af 45

28 Enterococcus stammer i så fald ville blive analyseret med Real time PCR, hvilket ofte kunne have været undgået ved anvendelse af de fænotypiske metoder. Sammenligning af ulden/ikke ulden fænomenet med Real time PCR I nærværende projekt sammenlignes ulden/ikke ulden metoden med Real time PCR som golden standard på samme 64 Enterococcus stammer. Af tabel 3 ses at, ulden/ikke ulden metoden ligesom E-test opnår en sensitivitet på 100 %, hvilket antyder at metoden er god til at detektere VRE. Metodens specificitet er på 80 %, trods projektets begrænsede population, hvilket vil sige at 20 % af de undersøgte Enterococcus stammer vil blive opfattet som værende resistente hvor de reelt er sensitive. Dette kunne antyde at ydereligere undersøgelser af disse 20 % ville være opportunt. Metodens 80 % specificitet vil derfor være forbundet med falsk positive resultater der kan føre til fejlbehandling af patienten, hvorved patienten kan udsættes for unødvendige bivirkninger ved behandling med f.eks. linezolid eller daptomycin. Disse antibiotika anvendes ifølge DANMAP i dag til behandling af VRE [9]. På den anden side kan den lave specificitet i forbindelse denne metode forklares ud fra den risiko der er forbundet ved fejlvurdering af zonekanten. Vurdering af zonekanten blev udført af bioanalytikerstuderende i forbindelse med et tidligere studie på KMA [21], og derfor vil evt. manglende erfaring inden for aflæsning kunne medføre en fejlvurdering af zonekanten og dermed fejlvurdering af resistensbestemmelsen i form af vancomycin sensitiv eller vancomycin resistente Enterococcus. I sådanne tilfælde vil specificiteten være påvirket. Ifølge EUCAST [27] skal identifikationen af VRE ikke kun baseres på vurdering ulden/ikke ulden fænomenet, men også ud fra MIC bestemmelse, fx i form af E-test, da stammerne kan være sensitive på trods af, at de har en ulden zonekant, som indikerer at der er tale om resistens. Med udgangspunkt i de opnåede resultater i nærværende projekt for E-test og ulden/ikke ulden metoderne overfor Real time PCR jf. tabel 3, kan der siges at E-test vil være den bedste fænotypiske metode til detektion af VRE. Som tidligere nævnt anvender KMA, OUH, ved resistensbestemmelse af Enterococcus antibiotikatabletter fra Rosco, hvorved zonestørrelsen aflæses. Vancomycin tabletten tages ikke med i resistensbestemmelsen og dermed bliver vancomycinresistens ikke vurderet ud fra zonekanten. Ved påvisning af ampicillin-resistens, laves der E-test for vancomycin. Efterfølgende sendes VRE-isolatet til ISS til overvågning. Ved at sammenholde nærværende projektets resultater, hvor der er opnået en specificitet på 80 % for ulden/ikke ulden fænomenet, med EUCAST s anbefalinger, der peger på, at identifikationen Side 27 af 45

29 af VRE ikke kun må baseres på vurdering af zonekanten, tyder det på, at KMA s, OUH, metodevalg til detektionen af et evt. VRE er fint overensstemmende. Dette skyldes at afdeling ikke medtager vancomycin-tabletten under resistensbestemmelsen, og derfor bliver der ikke taget højde for ulden/ikke ulden fænomenet. Ved sammenligning af svarene indsamlet via mails vedrørende de forskellige afdelingsmetoder til detektionen af VRE, stemte svaret fra Mikrobiologisk Afdeling, Midt-Vest Regionshospital Viborg ikke overens med projektets opnåede resultater samt KMA s rutinediagnostik af VRE. Afdelingen anvender diskdiffusionen med vancomycin tabletten til resistensbestemmelse, hvor vancomycinresistens vurderes ud fra zonekanten. I tilfælde af en ulden kant vil bakterien fortolkes som værende resistent uanset zonestørrelsen og isolatet sendes efterfølgende til SSI. Endvidere understreger afdelingen, at der ikke bliver udført en konfirmatorisk MIC-bestemmelse, da metoden er mindre sensitiv end tolkning af zonekanten. Ud fra de 100 % opnåede sensitivitet for både E-test og ulden/ikke ulden i nærværende projekt, kan afdelingens fravalg af MIC-bestemmelsen grundet en lav sensitivitet modsiges. Endvidere stemmer afdelingens detektionsmetode ikke overens med EUCAST retningslinjer da ulden/ikke ulden fænomenet ifølge EUCAST ikke kan stå alene, når vancomycin resistens skal detekteres. Generelt anvender alle de forskellige adspurgte KMA er vancomycin tabletten i resistensbestemmelse efterfulgt af en MIC-bestemmelse og en molekylær biologisk metode (PCR) til detektionen VRE. På baggrund af resultaterne opnået i nærværende projekt anbefales KMA, OUH, i rutinediagnostikken af VRE, at resistensbestemmelsen af VRE fortsat udføres vha. diskdiffusionsmetoden ved anvendelse af antibiotikatabletter fra Rosco. Ved påvisning af ampicillin-resistens anbefales fortsat udførelse af resistensbestemmelsen for vancomycin med E- test. I tilfælde af påvisning af VRE bør der udføres Real time PCR. Viser det sig ved yderligere undersøgelser af ulden/ikke ulden metoden at denne er effektiv til påvisning af VRE, vil indførelse af vancomycin-tabletten sammen med de øvrige antibiotikatabletter fra Rosco, betyde at vancomycin resistens kan vurderes en dag tidligere end når den først bestemmes med E-test. Efter vurdering af vancomycinresistens vha. ulden/ikke ulden Side 28 af 45

30 bekræftes dette fortsat ved Real time PCR. Denne ændring vil medføre at patienten kan komme i behandling en dag tidligere, hvilket kan være afgørende for helbredelse. Konklusion I nærværende projekt blev Real time PCR, efter opsætning heraf, anvendt som golden standard til detektionen af vancomycin-resistente Enterococcus med vana, vanb og vanc i en kollektion af 64 Enterococcus stammer isoleret fra blod med henblik på at sammenligne med E-test og ulden/ikke ulden fænomenet. På baggrund af de anvendte VRE stammer blev følgende assays valgt; In-house 2 vana assay, inhouse 1 vanb assay, in-house 1 vanc1 og vanc2 assays, 23s som intern kontrol, samt E. faecium vana(2)-stamme, E. faecalis vanb1-stamme samt E. gallinarum vanc1-stamme og E. casseliflavus vanc2-stamme, som positive kontroller, til opsætning af Real time PCR. Disse valg vil ved yderligere verifikation kunne anvendes rutinemæssigt til detektion af VRE på KMA, OUH. Opsætning af Real time PCR skal derfor undersøges med en større VRE population da 7 VRE stammer vurderes til at være utilstrækkelig. Ved sammenligning af E-test og ulden/ikke ulden med Real time PCR opnås en sensitivitet og specificitet på 100 % for E-test og sensitivitet og specificitet på 100 % og 80 % for ulden/ikke ulden ved undersøgelse af de 64 Enterococcus stammer. Resultater på de 64 Enterococcus stammer opnået ved E-test, stemmer fuldstændig overens med resultaterne opnået ved Real time PCR. Dette peger på at E-test metoden kan være en god fænotypisk metode til detektion af VRE, men da metodens anvendelse er forbundet med en risiko for fejlvurdering i forbindelse med detektionen af vanb low-level stammer, som ligger i gråzonen, er det nødvendigt ifølge det nærværende projekt at anvende Real time PCR i rutinediagnostik af VRE da analysen specifikt påviser van-gener, vana, vanb og vanc. Det nærværende projektets resultater underbygger den nuværende praksis på KMA, OUH. Perspektivering Det biomedicinske arbejde indebærer bl.a. kvalitetssikring, således at de opnåede resultater kan betragtes som troværdige og pålidelige, så der på baggrund af dem kan træffes beslutninger vedrørende diagnose og behandling. Real time PCR i nærværende projekt kan kvalitetssikres ved yderligere undersøgelse af assays med en større kendt VRE population. Side 29 af 45

31 Det vil være interessant at undersøge de 64 Enterococcus stammer med en anden molekylær biologisk analyse, f.eks. simpel multiplex PCR. I betragtning af at der ved denne PCR metode anvendes flere primerpar kan flere gener f.eks. van-gener, vana, vanb og vanc undersøges samtidig. Fordelen ved denne PCR metode er at der kan opnås en lettere arbejdsgang, således at detektionen af VRE kan foregå hurtigere og dermed kan patienten komme hurtigere i behandling. Endvidere kan det være interessant at undersøge om glykopeptidet teicoplanin kan anvendes diagnostisk for vana og vanb VRE stammer, da disse to typer adskiller sig fra hinanden ved at vana ud over vancomycin viser resistens over for teicoplanin, hvilket vanb ikke gør [17]. Side 30 af 45

32 Litteraturliste 1. Jens Kjølseth Møller, Bekæmpelse af resistente hospitalsbakterier-mindre antibiotika og mere infektionsforebyggelse, Kliniske Mikrobiologisk Afdeling Vejle, ugeskrift for læger, 173/37, september 2011, Side Sundhedsstyrelsen, Antibiotikaforbrug og resistens, 2012, [ ], Lokaliseret på: resistens&url=http%3a%2f%2fwww.ssi.dk%2fsmitteberedskab%2fom+overvaagning%2fantibi otikaforbrug.aspx%3fpdf%3d1 3. Bonten MJM, Willems Rob, Weinstein RA, Vancomycin-resistant enterococci: why are they here, and where do they come from?, The Lancet Infectious Diseases, 2001; 1, Side Arias CA, Barbara EM, The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance, NIH Public Acces Author Manuscript, 2013; 10 (4), Side 2 5. Kuriyama T, Williams DW, Patel M, Lewis MAO, Jenkins LE, Hill DW, et al., Molecular characterization of clinical and environmental isolates of vancomycin-resistant Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis from a teaching hospital in Wales, Journal of Medical Microbiology, 2003, Side Griffin PM, Price GR, Schooneveldt JM, Schlebusch S, Tilse MH, Urbanski T, et al.,use of Matrixassisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry to identify Vancomycin- Resistant Enterococci and investigate the epidemiology of an outbreak, Journals. ASM.org, 2012, Side Yarlagadda V., Akkapeddi P., Manjunath G.B., Haldar J, Membrane active Vancomycin analogues: Astrategy to Cambat Bacterial resistance, Journal of Medicinal Chemistry, 20140, Side Praharaj I, Sujatha S, Parija SC, Phenotypic & genotypic characterization of vancomycin resistant Enterococcus isolates from clinical specimens, Department of Microbiology, Jawaharlal Institute of Postgraduate Medical Education & Research, Puducherry, India, 2013 Side STATENS SERUM INSTITUT, DANMAP rapport, Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark, 2013, besøgt d , Lokaliseret på: Side 31 af 45

33 13/DANMAP% ashx S James Versalovic Karen C. Carroll at el. Manual of clinical microbiology, 10. udgave, 2011, American Society for Microbiology,Washington, DC, Side Barbara E. Murray, The Life and Times of the Enterococcus, Microbiology, Reviews, 1990, Side Brian L. Hollenbeck and Louis B. Rice, Intrinsic and acquired resistance mechanisms in Enterococcus, August 2012, Landes Bioscience, Side Brett D. Shepard, Michael S. Gilmore, Antibiotic-resistant enterococci: the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance, Microbes and Infection, 2002, Side Tripathi A, Shukla SK, Singh A, Prasad KN, A new approach of real time polymerase chain reaction in detection of vancomycin-resistant enterococci and its comparison with other methods, Indian Journal of Medical Microbiology, 2013; 31 (1) Side Neil Woodford, David M. Livermore, Infection caused by Gram-positive bacteria: a review of the global challenge, Journal of Infection, 2009, s Francisco Soriano, David Greenwood, Action and interaction of penicillin and gentamicin on enterococci, Journl of Clinical Pathology, 1979, s Guido Werner, Ingo Klare, Carola Fleige, Uta Geringer et. Al, Vancomycin-resistant vanb-type Enterococcus faecium isolates expressing varying levels of vancomycin resistance and being highly prevalent amon neonatal patients in a single ICU, 2012, Antimicrobial Resistance&Infection Control, Side Anton Mak, Mark A. Miller et. Al., Comparison of PCR and Culture for Screening of Cancomycin- Resistant Enterococci: Highly Disparate for vana and vanb, American Society for Microbiology, 2009, Side EUCAST-Disk diffusion Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing, version 4.0, 2014, lokaliseret på: e_v_4.0.pdf S Side 32 af 45

34 20. Qualiware: Metoder til identifikation af Enterokokker, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, OUH, version 16/ Annesophie Harders Thyesen, Professionsbachelorprojekt, modul 14, University College Lillebælt, Modul 13 Eksamensopgave, bioanalytikeruddannelse, UCL, oktober, 2013, skrevet af Reem Kazem, Side Buckingham L, Molecular Diagnostics, Fundamentals, Methods & Clinical Applications, 2. udgave, 2012, F.A. Davis Companys Side Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM, Buckwalter SP, Jones MF, Vetter EA, et al., Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing, Clinical Microbiology Reviews, 2006, Side Klaringsrapport, 2004, Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi. Side Qualiwear: Aflæs terapeutisk resistens, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, OUH 27. European committee on antimicrobial susceptibility testing, EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance, 2013 version 10, s. 32, BakerCN, Stocker SA, Culver DH, Thornsberry C, Comparison of the E test to Agar Dilution, Broth Microdilution, and Agar Diffusion Susceptibility Testing Techniques by Using a Special Challenge Set of Bacteria, Journal Of Clinical Microbiology, 1991, 29 (3) Side Citron DM, Ostovari MI, Karlsson A, Goldstein EJC, Evaluation of the E test for Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria, Journal Of Clinical Microbiology, 1991, 29 (10) Side Schulz JE, Sahm DF, Reliability of the E test for Detection of Ampicillin, Vancomycin, and High-Level Aminoglycoside Resistance in Enterococcus spp., Journal Of Clinical Microbiology, 1993, 31 (12) S Schuetz AN, Antimicrobial Resistance and Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria, Antimicrobial Resistance, 2014 Side 701 Side 33 af 45

35 32. Hodon Ryu, Michael Henson, Michael Elk el at., development of Quantitative PCR Assays Targeting the 16 s rrna genes of Enterococcus spp. And their Application to the Identification of Enterococcus Species in Environmental Samples, 2013 s. 198, H. Fang, A. K. Ohlsson, G.X. Jiang og M.Ullerg, Screening for vancomycin-resistant enterococci: an efficient and economical laboratory-developed test, 2010 s Taek Soo Kim, Hye Lin Kwon, Sang Hoon Song et.al., Real-time PCR surveillance of van for vancomycin-resistant Enterococcus faecium, Molecular Medicine Reports, Statnoter, Noter I statistik, bioanalytikeruddannelsen, besøgt d. 12/ , lokaliseret på: M.Tiane,A. Paula, Detection of vanc1 gene transcription in vancomycin-sesceptible Enterococcus faecalis, Mem inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2013, s. 453 Side 34 af 45

36 Bilag Bilag 1: svar opnået vha. en elektronisk spørgeundersøgelse Spørgsmål der er sendt ud til kma er i dk Hej Vi er en bachelor gruppe på KMA, OUH, der arbejder på om E-test og ulden/ikke ulden kan valideres til detektion af vancomycin resistente enteorokokker udfra en opsætning af real time PCR. I denne henseende synes vi at det vil være interessant at vide hvordan diverse Kliniske Mikrobiologiske Afdelinger i Danmark detekterer vancomycin resistente enterokokker. Vi håber at høre fra dig/jer og på forhånd mange tak. Venlig Hilsen Reem Kazem, Sara Dallal, Asmaa Dallal, Ditte Bertelsen, Laura Pedersen og Mette Erichsen. Bioanalytikeruddannelsen M14, UCL Blangstedgårdsvej, Odense. Sygehus Svar Bodil Hansen Vi laver disc - diffusion med Vanco og hvis zonen er <12 eller zonekanten (boh@regionsjaelland.dk) er uskarp udføres E-test for Vancomycin. Vancomycinreststente Slagelse/Nykøbing Falster sygehus enterococcer sendes til SSI til overvågning. Helga Schumacher På KMA Midt-Vest er vi efter nylig foretaget analyse af metoder til påvisning af VRE gået over til følgende metodologi: Mikrobiologisk afdeling Midt- Vest Urinanalyser: der anvendes Vitek 2 Hospitalsenheden Midt Alt andet, hvor resistens er indiceret: der anvendes disk diffusion, hvor Regionshospitalet Viborg man tolker på zonekanten. Er denne ulden svares bakterien som Resistent og isolatet sendes til SSI. Vi laver ikke konfrimatorisk MIC-us. da en sådan er mindre følsom end tolkning af zonekant. Kirsten Inger Paulsen Afsnitsledende bioanalytiker kip@rn.dk I Aalborg undersøger vi først for vancomycin med diskdiffusion (Mueller Hinton agar med tablet fra Rosco). Hvis zonen er diffus eller zonestørrelsen for lille laver vi Etest (BioMerieux). Finder vi stammen resistent sender vi den til SSI til konfirmatorisk test. AALBORG Side 35 af 45

37 Anne Bonde Jensen Bioanalytikerunderviser Region Sjælland Sygehus Syd Klinisk Mikrobiologisk afdeling Ingemannsvej Slagelse Jeg har sakset det her fra vores procedure. Håber det er svar nok og ellers må du skrive igen ) Vancomycin resistente Enterokokker (VRE) - Rektalpodning eller fæces 3.3 Udsåning Dag 0: Opformering i opformeringsbouillon (BHI med Vancomycin 4 mg/l og 60 mg/l Aztreonam) Rektalpodning: Slagelse: prøverøret rystes, væsken fra E-swab hældes over i opformeringsboullionen og låget skrues på. Nykøbing F.: Kulpodepinden overføres i opformeringsbouillonen og låget skrues på. Fæces: En 10 µl øjepodenål dyppes i prøven og prøvemateriale svarende til ca. ærtestørrelse overføres til opformeringsbouillonen. Inkuberes ved 35 C uden CO 2 i 1 døgn. 3.4 Aflæsning og sekundær udsåning: Dag 1: Udsåning på chromogen plade (chromid VRE, biomérieux). Rektalpodning: Slagelse: En 10 µl øjepodenål dyppes i bouillonen og efter omrøring afsættes materialet i 1. strøg på chromogen plade. Nykøbing F.: Ved hjælp af podepinden røres opformeringsbouillonen om og der afsættes materiale i 1. strøg på chromogen plade. Fæces: En 10 µl øjepodenål dyppes i bouillonen og efter omrøring afsættes materialet i 1. strøg på chromogen plade. Med en steril podenål foretages en trekantspredning. Inkuberes ved 35 C uden CO 2 i 2 døgn. 3.5 Resultatvurdering og svarafgivelse: Dag 2 og 3: Aflæsning 1. Ved manglende vækst efter 2 døgns inkubation svares ud med stempeltekst: "Ingen vækst af Vancomycin resistente Enterokokker (VRE)". 2. Ved vækst af VRE-lignende kolonier (E. faecium: violette, E. faecalis: blågrønlige kolonier) udføres identifikation med MALDI- TOF. 3. Ved førstegangsfund af VRE hos patienten bekræftes resultatet med E-test for vancomycin. Der laves ikke yderligere resistensbestemmelse. 4. Ved vækst af vancomycin resistente enterokokker svares prøven ud med: "Vækst af E. faecium" eller "Vækst af E. faecalis" uden resistensbestemmelse, og med stempeltekst: Vækst af Vancomycin resistente Enterokokker (VRE)". 5. VRE-positive prøver skal flagmarkeres (VRE), fryses, sendes til SSI (Annette Hammerum) og sendes som OBS post til LAB-2 læge. Side 36 af 45

38 Marianne Kragh Thomsen, overlæge Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aarhus Universitetshospital Tel Fax KMA, Skejby undersøger vancomycinresistens hos enterokokker ved diskdiffussion (EUCAST) og real time PCR. Er zonen < 12 mm eller er der en ulden zonekant (uanset zonestørrelse) udføre vi PCR. Tabel 1: svar opnået vha. en elektronisk spørgeundersøgelse Side 37 af 45

39 Bilag 2: liste over 65 Enterococcus stammer Prøve nr.: Prøve Prøve nr.: Prøve Prøve nr.: Prøve Prøve nr.: Prøve E. faecalis E. faecium E. faecalis E. durans E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. avium E. faecalis E. faecium E. faecium E. faecium E. casseliflavus E. faecium E. avium E. raffinosus E. gallinarum E. gallinarum E. faecalis E. avium E. faecalis E. faecium E. faecium E. raffinosus E. avium E. faecium E. casselflavus E. avium E. faecium E. faecium E. faecium E. gallinarum E. faecium E. faecium E. durans E. casseliflavus E. faecium E. faecium E. durans E. gilvus E. faecium E. faecium E. dispar E. casseliflavus E. faecium E. faecalis E. casseliflavus E. casseliflavus Side 38 af 45

40 E. 14casseliflavus E. durans E. avium E. casseliflavus E. faecium E. faecalis E. mundtii E. avium E. faecium E. pseudoavium E. gallinarum E. faecalis E. durans E. gallinarum E. durans 34 (udgået) E. durans E. raffinosus Tabel 2: liste over 65 Enterococcus stammer Side 39 af 45

41 Bilag 3: Eksempel på PCR-pladelayout over 11 prøver Figur 1: Eksempel på PCR-pladelayout over 11 prøver Side 40 af 45

42 Bilag 4: tabeller over ct-værdier og middelværdier opnået ved anvendelse af forskellige assays In-house 1 vana-assay In-house 2 vana-assay Kontrol-stamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) 16,44 16,42 16,43 18,56 18,58 18,57 (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) 15,42 15,35 15,39 17,06 17,13 17,10 (B ) E. faecium vanb 38,11 37,50 37, (N-AST 4) E. faecalis vanb (N-AST 9) E. faecium vanb (N-AST 5) E. gallinarum vanc1 (G ATCC ) E. casseliflavus vanc2 (H ATCC 12755) Negativ kontrol (Rnase frit vand) Tabel 3: viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vana-assays. In-house 1 vanb-assay In-house 2 vanb-assay Kontrol-stamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) (B ) E. faecium vanb 22,11 20,67 21,39 21,48 20,38 20,93 (N-AST 4) E. faecalis vanb1 19,41 19,13 19,27 19,72 18,10 18,91 (N-AST 9) E. faecium vanb2 25,40 25,29 25,39 25,82 24,48 25,15 (N-AST 5) E. gallinarum vanc1 (G ATCC ) E. casseliflavus vanc2 (H ATCC 12755) Negativ kontrol (Rnase frit vand) Side 41 af 45

43 Tabel 4: viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vanb-assays. In-house 1 vanc1-assay In-house 2 vanc2/3-assay Kontrol-stamme ct-værdier Middelværdi ct-værdier Middelværdi E. faecium vana (1) (A ATCCA 51559) E. faecium vana (2) (B ) E. faecium vanb (N-AST 4) E. faecalis vanb (N-AST 9) E. faecium vanb (N-AST 5) E. gallinarum 21,48 21,18 21, vanc1 (G ATCC ) E. casseliflavus ,28 21,36 21,32 vanc2 (H ATCC 12755) Negativ kontrol (Rnase frit vand) Tabel 5: viser af ct-værdier i dobbeltbestemmelser, samt middelværdier af disse, opnået ved anvendelse af vanc-assays. Til udregning af middelværdien er følgende formel anvendt: x x x x x n n Overføres ovenstående på de opnåede resultater fås følgende: ct 1 ct x 2 2 Nedenstående er eksempel på beregning af middelværdi med udgangspunkt i en dobbeltbestemmelse opnået ved anvendelse af vanc1-assay (tabel 3): x 21,48 21,18 21,33 2 Side 42 af 45

44 Bilag 5: rådata Figur 2: Skemaet viser en oversigt over de indsamlede data fra de samme stammer analyseret med E-test, ulden/ikke ulden og Real time PCR. Resultaterne fra E-test og ulden/ikke ulden holdes op mod resultaterne fra real time PCR som en golden standard, hvor fra der er bedømt om de er falsk negative (FN), sandt negative (SN), sandt positive (SP) eller falsk positive (FP), som ses i de 8 sidste kolonner under tolkning. Dette er gjort for at kunne validere E-test og ulden/ikke ulden som anvendes i dagligt brug. U=undetected, der er ikke detekteret et van gen for den pågældende stamme. Side 43 af 45