Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen VIA University College, Aarhus N. Marlene Egeskov Vigen,

Transkript

1 Verificering af Mueller Hinton plader fra Becton Dickinson Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen VIA University College, Aarhus N Udarbejdet af: Anne Dissing Dæncker, @via.dk Fransine Carrara, @via.dk Marlene Egeskov Vigen, @via.dk Trine Harup Holm, @via.dk K-vejledere: Kirsten Inger Paulsen, kip@rn.dk Anette Søgaard, a.soegaard@rn.dk I-vejleder: Birte Sivebæk, bis@via.dk Antal tegn: Dato for aflevering:

2 Indhold Forord... 4 Læsevejledning... 5 Resumé... 6 Introduktion... 7 Baggrund... 7 Formål... 8 Problemformulering... 9 Målformulering... 9 Teori Bakteriers tilpasningsevne Antibiotika Antibiotika virkende på cellevægssyntesen Antibiotika virkende på proteinsyntesen Antibiotika virkende på DNA/RNA-syntesen Øvrige antibiotika Normalfordeling EUCAST Agardiffusionsmetoden Påvirkning af zonestørrelsen reglen Materialer Metode Forforsøg - Intermediær præcision og individuel kalibrering Primært forsøg Forsøg med kliniske bakteriestammer Litteratur og afgrænsning Måling af zonestørrelser i forhold til range defineret af EUCAST Sammenligning af zonestørrelser på MH-plader Forsøg med kliniske bakteriestammer Diskussion Range defineret af EUCAST Sammenligning af MH-pladerne Patientperspektiv Side 2 af 45

3 Forsøg med kliniske bakteriestammer Diskussion af metode Perspektivering Konklusion Referencer Side 3 af 45

4 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udført på Klinisk Mikrobiologisk Afsnit på Aalborg Universitetshospital i perioden 10. oktober til 21. december Projektet omhandler verificering af Mueller Hinton plader fra Becton Dickinson med henblik på implementering i laboratoriet. Professionsbachelorprojektet er rettet til bioanalytikere, bioanalytikerstuderende samt andre interesserede inden for dette felt. En stor tak til Kirsten Inger Paulsen, Anette Søgaard og Birte Sivebæk for fremragende vejledning og samarbejde, både praktisk og teoretisk, gennem hele projektet. En særlig tak skal det lyde til medarbejderne på Klinisk Mikrobiologisk Afsnit, Aalborg Universitetshospital, for hjælp til blandt andet indsamling af kliniske bakteriestammer til udarbejdelse af projektet. Tak for jeres interesse i vores projekt og godt humør. Side 4 af 45

5 Læsevejledning Forkortelser Gennem projektet er der anvendt forkortelser, som angives i parentes første gang de nævnes. EUCAST KM ATCC MH-plade BioM E&O BD ISO MeSH European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Klinisk Mikrobiologisk Afsnit, Aalborg Universitetshospital American Type Culture Collection Mueller Hinton plade BioMérieux E&O Laboratories Ltd. Becton Dickinson International Organization for Standardization Medical Subject Heading Referencer Referencerne angives numerisk og referencelisten er udarbejdet i Vancouver format. Bilag Undervejs i opgaven henvises til bilag, som findes vedlagt opgaven og nævnes numerisk og med titel. Bilag 1 - Kvalitetskontrol til resistensbestemmelse Bilag 2 - Sekundær resistensbestemmelse Bilag 3 - Protokol for intermediær præcision og individuel kalibrering Bilag 4 - Protokol for primært forsøg Bilag 5 - Protokol for forsøg med kliniske bakteriestammer Bilag 6 - Resultater til primært forsøg Bilag 7 - Instruks for verificering og validering af undersøgelsesmetoder Side 5 af 45

6 Resumé Indledning: På KM anvendes på nuværende tidspunkt to forskellige MH-plader, til resistensbestemmelse, fra to forskellige producenter. Der er på laboratoriet observeret forskel på de nuværende MH-plader, i form af manglende vækst af enkelte kliniske bakteriestammer. Der ønskes undersøgt om MH-plader fra BD er ens og lever op til range defineret af EUCAST og hermed finde ud af om disse kan erstatte de nuværende MH-plader i laboratoriet. Metode: Der er anvendt 4 kontrolstammer til projektet: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC og E. faecalis ATCC med tilhørende NEO- SENSITABS, hvor i alt 3298 zonestørrelser blev aflæst. Der anvendes agardiffusionsmetoden. 13 Indsamlede kliniske bakteriestammer udsås på MH-plader fra E&O, BioM og BD for at vurdere vækst. Resultater: Resultaterne viser at 243 ud af 3298 målinger af zonestørrelser ligger uden for range. Der ses en generel tendens til at zonestørrelserne er større på 12x12 cm MH-pladen end zonestørrelserne på 9 cm MH-pladen, når de sammenlignes parvis. Derudover ses ingen forskel på MH-pladerne fra E&O, BioM og BD i forhold til vækst af indsamlede kliniske bakteriestammer. Konklusion: Der konkluderes, at MH-pladerne fra BD (9 cm og 12x12 cm) ikke bør benyttes med KM s nuværende procedure for sekundær resistensbestemmelse. Side 6 af 45

7 Introduktion Baggrund I forbindelse med diagnosticering af bakterielle infektioner udføres resistensbestemmelse ved agardiffusionsmetoden. Resistensbestemmelse giver mulighed for at vurdere, om en bakterie er sensitiv, intermediær eller resistent til et givent antibiotikum og dermed give patienten en optimal behandling. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) er en organisation, der fastsætter retningslinjer for udførelse af resistensbestemmelse i Europa og fastsætter kliniske brydepunkter for, hvornår en bakterie er sensitiv, intermediær eller resistent (1). Fordelen ved en ensretning af brydepunkter i Europa er; at projektresultater fra forskellige lande kan sammenlignes og at viden kan deles. Dette giver laboratorier mulighed for at sammenligne sig med andre laboratorier (2). EUCAST blev i februar 2010 indført på Klinisk Mikrobiologisk Afsnit, Aalborg Universitetshospital (KM). KM anvender dagligt American Type Culture Collection (ATCC) kontrolstammer til kvalitetssikring af proceduren og de tilhørende utensilier til resistensbestemmelse, se bilag 1 - Kvalitetskontrol til resistensbestemmelse. På KM anvendes på nuværende tidspunkt to forskellige Mueller Hinton (MH) plader til resistensbestemmelse - en rund Mueller Hinton E agar fra BioMérieux (BioM) med en diameter på 9 cm og en firkantet Mueller Hinton Agar (BBL) fra E&O Laboratories Ltd. (E&O) på 12x12 cm. Der benyttes tre forskellige teknikker til udsåning af henholdsvis gram-negative stave, grampositive kokker i hobe og enterokokker, se bilag 2 - Sekundær resistensbestemmelse. Der er på laboratoriet observeret forskel på de nuværende MH-plader. Forskellen ses på kontrolstammernes zonestørrelser ved anvendte antibiotika i forbindelse med den daglige interne kvalitetskontrol. Derudover er der observeret kliniske bakteriestammer, der ikke vokser på 9 cm MH-pladen fra BioM, men vokser på 12x12 cm MH-pladen fra E&O. Side 7 af 45

8 I perioden 22. juni 2016 til 17. oktober 2016, er der indsamlet 13 kliniske bakteriestammer (E. faecalis, E. faecium og S. aureus), der kun vokser på MH-pladen fra E&O. Disse forskelle er grundlaget for at undersøge om BBL Mueller Hinton II Agar fra Becton Dickinson (BD) kan implementeres og erstatte de to nuværende MH-plader fra BioM og E&O. BD udbyder MH-plader på både 9 cm og 12x12 cm. En implementering af MH-plader fra BD kan muligvis bidrage til en ensartethed i forbindelse med resistensbestemmelse, idet der anvendes én producent frem for to forskellige producenter. KM skal til marts 2017 akkrediteres efter International Organization for Standardization (ISO) (3). Dette betyder, at alle afdelingens gældende procedurer skal verificeres. På nuværende tidspunkt er gældende procedure for sekundær resistensbestemmelse med MHpladerne fra BioM og E&O verificeret. Vi vil med dette projekt undersøge BD s MH-plader i forhold til kontrolstammernes zonestørrelser, dermed vil projektet være et led i verificering af MH-plader fra BD. Projektet udarbejdes i to dele, som omfatter et primært forsøg og et forsøg med kliniske bakteriestammer. I forbindelse med det primære forsøg opstilles et forforsøg, hvor der udføres en intern kalibrering med henblik på aflæsning af zonestørrelser. Dette gøres både for at sikre, at der maksimalt aflæses med en intern variation på 3 mm mellem gruppens medlemmer og at der samtidig måles inden for range defineret af EUCAST. Formål Formålet med projektet er at undersøge, om zonestørrelser på kontrolstammer, udsået på MHpladerne fra BD, lever op til range defineret af EUCAST. Formålet med projektet er at undersøge, om gældende procedure for sekundær resistensbestemmelse er årsagen til forskellige zonestørrelser på afdelingens nuværende MHplader (9 cm fra E&O og 12x12 fra BioM) eller om forskellen skyldes, at der i laboratoriet anvendes MH-plader fra to forskellige producenter. Side 8 af 45

9 Formålet med projektet er at undersøge, om de kliniske bakteriestammer, der ikke vokser på MH-pladen fra BioM, kan vokse på begge plader fra BD. Problemformulering Hvilken betydning har det for kontrolstammernes zonestørrelser, i forhold til range defineret af European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, at Mueller Hinton plader fra Becton Dickinson anvendes med den nuværende procedure for sekundær resistensbestemmelse fra Klinisk Mikrobiologisk Afsnit, Aalborg Universitetshospital? Hvilken forskel ses på Mueller Hinton pladerne fra E&O Laboratories Ltd., BioMérieux og Becton Dickinson i forhold til vækst af indsamlede kliniske bakteriestammer? Målformulering Vi vil undersøge, om zonestørrelser på E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC og E. faecalis ATCC 29212, udsået på MH-pladerne fra BD, lever op til range defineret af EUCAST. Der anvendes KM s nuværende procedure for sekundær resistensbestemmelse. Resultaterne fremstilles i histogrammer udarbejdet i Excel Vi vil parvis sammenligne 9 cm og 12x12 cm MH-plader fra BD, hvor der fra samme suspension udsås på begge MH-plader. Der laves i alt 72 suspensioner per kontrolstamme, der hver udsås på en 9 cm og en 12x12 cm MH-plade fra BD, hvor der påsættes tilhørende NEO-SENSITABS. Forsøget udføres over tre dage på henholdsvis: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC og E. faecalis ATCC Resultaterne fremstilles i Bland-Altman plot udarbejdet i Excel Vi vil undersøge, om de 13 indsamlede kliniske bakteriestammer, der ikke vokser på MH-plader fra BioM, kan vokse på MH-pladerne fra BD. Dette gøres ved at udså samme suspension på MH-pladerne fra E&O, BioM og begge MH-plader fra BD. Side 9 af 45

10 Dette gøres for at vurdere og sammenligne væksten på alle MH-pladerne. Der påsættes ikke NEO-SENSITABS. Teori Dette afsnit vil belyse relevant teori omhandlende; bakteriers tilpasningsevne, antibiotika, normalfordeling, EUCAST og agardiffusionsmetoden. Afsnittet omhandlende bakteriers tilpasningsevne knytter sig til forsøget med de kliniske bakteriestammer. Bakteriers tilpasningsevne Bakterier har en god tilpasningsevne, derfor kan bekæmpelse af patogene bakterier være en stor udfordring, eksempelvis grundet erhvervet antibiotikaresistens. Bakterier kan tilpasse sig forandringer i levevilkår og miljø og af den grund findes mange variationer inden for samme art. Ofte vil der være mindst én bakterie, der overlever en udfordring eksempelvis ved hjælp af mutationer. Mutationer kan opstå spontant eller fremprovokeres fysisk eller kemisk. Dette kan eksempelvis være temperaturændringer eller udsættelse for kemiske stoffer. Mutationer eller ændrede levevilkår kan medføre, at bakterien ændrer sig fænotypisk. Nogle bakterier har en evne til at overføre plasmider indeholdende gener, som kunne være fordelagtig for andre bakterier - dette kunne blandt andet være antibiotikaresistens (4 6). Antibiotika Antibiotika er en samlet betegnelse for lægemidler, der har effekt mod mikroorganismer. Antibiotika kan fremstilles naturligt (antimikrobielle stoffer), men fremstilles oftest kemisk (kemoterapeutika). Den ønskede opnåede effekt med behandling af antibiotika er, at bekæmpe de mikroorganismer, der er årsag til infektionen. Samtidig ønskes mindst mulig beskadigelse på kroppens egne celler og gavnlige mikroorganismer i normalfloraen. Der findes to måder hvorpå antibiotika kan virke; bakteriostatisk og baktericid. Hæmning af mikroorganismers vækst kaldes bakteriostatisk. Baktericid er betegnelsen for når mikroorganismer dræbes. Derudover kan antibiotika opdeles i bredspektrede og smalspektret antibiotika. Bredspektrede antibiotika virker på flere forskellige mikroorganismer, hvorimod Side 10 af 45

11 smalspektret antibiotika virker mere specifik og målrettet på få eller enkelte mikroorganismer (5). Antibiotika har forskellige virkemekanismer og inddeles herefter. Visse antibiotika kan hæmme cellevægssyntesen, hvor andre antibiotika kan hæmme proteinsyntese eller DNA/RNA-syntesen (7). Antibiotika virkende på cellevægssyntesen β-lactamer β-lactamer hæmmer cellevægssyntesen og virker hermed baktericidt. Fælles for disse antibiotika er, at disse indeholder en β-lactam-ring. Denne β-lactam-ring binder sig til bakteriens penicillinbindende protein og herved forhindres opbygningen af cellevæggen. Penicilliner (ampicillin, mecillinam og piperacillin+tazobactam), cefalosporiner (cefotaxime, ceftazidime og cefoxitin) og carbapenemer (imipenem) tilhører denne gruppe (5,7). Glycopeptider Glycopeptider virker ved at hæmme cellevægssyntesen i gram-positive bakterier og virker baktericidt. Vancomycin tilhører denne gruppe (7). Antibiotika virkende på proteinsyntesen Aminoglykosider Aminoglykosider virker på bakteriecellens proteinsyntese og virker baktericidt. Aminoglykosider binder sig irreversibelt til 30S-delen på bakteriecellens ribosomer. Denne irreversible binding bevirker, at der dannes store proteiner og skaber en dysfunktion af bakteriecellen. Tobramycin og gentamicin tilhører denne gruppe (4,5,7). Makrolider Makrolider virker ved at hæmme proteinsyntesen i gram-positive bakterier og virker bakteriostatisk. Makrolider bindes reversibelt til 50S-delen på bakteriecellens ribosomer. Denne reversible binding bevirker at proteinsyntesen blokeres. Erythromycin og clindamycin tilhører denne gruppe (5,7). Side 11 af 45

12 Fucidin Fucidin virker ved at hæmme bakteriens proteinsyntese og virker bakteriostatisk. Fucidin anvendes til lokalbehandling forårsaget af visse stafylokokinfektioner (5,7). Oxazolidinoner Oxazolidinoner hæmmer proteinsyntesen og virker baktericidt overfor streptokokker. Disse virker ved at blokere dannelsen af bakteriecellens 70S kompleks og herved kan proteiner ikke dannes. Linezolid tilhører denne gruppe (7). Antibiotika virkende på DNA/RNA-syntesen Fluorquinoloner Fluorquinoloner virker på bakteriecellens DNA-replikation og -transkription, ved at hæmme DNA-gyrase. Hermed virker fluorquinoloner baktericid. Ciprofloxacin tilhører denne gruppe (7). Øvrige antibiotika Ud over ovenstående er følgende antibiotika udvalgt til projektet: Mupirocin, trimethoprim, rifampicin og nitrofurantoin. For yderligere information om deres virkemekanismer se tabel 1. Virkemekanisme Antibiotikagruppe NEO-SENSITABS Virkende på cellevægssyntesen Penicilliner Cefalosporiner Carbapenemer Ampicillin Mecillinam Piperacillin+tazobactam Cefotaxime Ceftazidime Cefoxitin Imipenem Glycopeptider Vancomycin Side 12 af 45

13 Virkende på proteinsyntesen Aminoglykosider Gentamicin Tobramycin Makrolider Erythromycin Clindamycin Fucidin Mupirocin Oxazolidinoner Linezolid Virkende på DNA/RNAsyntesen Fluorquinoloner Ciprofloxacin Trimethoprim Rifamyciner Rifampicin Andre antimikrobielle midler Nitrofurantoin Tabel 1 - Oversigt over virkemekanismer, antibiotikagrupper og NEO-SENSITABS der er udvalgt til projektet (5,7). Normalfordeling Ved gentagne målinger af en population behæftet med en vis variation, vil målinger fremstå normalfordelte. Dette kan eksempelvis være målinger af zonestørrelser. Histogrammer er en hjælp til at vurdere, hvordan en population er fordelt. I et histogram fremstår normalfordelt data klokkeformet, hvor toppunktet angiver middelværdien og bredden af kurven angiver spredningen for populationen (8). EUCAST EUCAST er en organisation, der standardiserer proceduren for resistensbestemmelse i Europa, som tilbud til laboratorier, der udfører resistensbestemmelse. EUCAST fastsætter kliniske brydepunkter for hver bakterieart, dette gøres på baggrund af indsamlet data fra forskellige laboratorier. Laboratorierne indsender data om zonestørrelser for en bakterieart til Side 13 af 45

14 et givent antibiotikum. Dette viser en normalfordeling i zonestørrelser for vildtypen, herfra kan EUCAST fastsætte brydepunkter, hvilket illustreres herunder (9). Billede 1 - EUCAST s data til ampicillin ved E. coli. Brydepunktet er fastsat ved 14 mm. R<14 mm og S 14 mm (9). Det er vigtigt, at brydepunkterne fastsættes korrekt, så der ikke fejlagtigt angives, at en bakterie er sensitiv, når den er resistent, eller omvendt. Der skelnes mellem major og minor fejl. Major fejl opstår, når en bakterie, som er resistent, vurderes som værende sensitiv. Resultatet heraf vil være, at patienten fejlbehandles. Minor fejl opstår, når en bakterie, som er sensitiv, vurderes som værende resistent. Resultatet heraf vil være, at patienten kommer i behandling, men med et andet virkende antibiotikum (10). Side 14 af 45

15 EUCAST anbefaler, at der dagligt udføres intern kvalitetskontrol på resistensbestemmelse i laboratorierne. Den interne kvalitetskontrol, udført på internationalt anerkendte referencestammer (ATCC), giver laboratorierne mulighed for, at observere eventuelle afvigende tendenser på zonestørrelserne (1,11). Kvalitetssikring af proceduren for resistensbestemmelse er nødvendig for, at et laboratorie kan udføre korrekt resistensbestemmelse. Der findes mange producenter, der udbyder MHplader, antibiotikadisks og -tabletter. EUCAST anbefaler ikke nogen specifik producent, men opstiller generelle krav til resistensbestemmelse for at kunne anvende deres kliniske brydepunkter (11,12). Agardiffusionsmetoden Agardiffusion er en af de ældste metoder til resistensbestemmelse. Metoden anvendes som rutine i mange laboratorier på verdensplan og er den metode som EUCAST også anvender (1,13). Agardiffusion er en indirekte metode til bestemmelse af MIC (minimum inhibitory concentration). Denne metode udføres, ved at fremstille en suspension med rette McFarland alt efter bakteriefund, oftest benyttes McFarland 0,5. Fra suspensionen tilsås en agarplade, dette gøres for at opnå rette inokulum og derved konfluerende vækst. Agarpladen udvælges på baggrund af bakteriefund, dog anvendes MH-plader oftest til resistensbestemmelse. Efter udsåning påsættes relevante antibiotikatabletter. MH-pladen inkuberes og antibiotika diffunderer ud i agaren, hvor der opstår et konkurrenceforhold mellem hvert enkelt antibiotikum og bakterie. MIC defineres indirekte ved zonestørrelsens afgrænsning (6,13). Zonestørrelserne bliver tolket ved hjælp af SIR-systemet. Der angives om en bakterie er sensitiv (S), intermediær (I) eller resistent (R) til et givent antibiotikum. Aflæses bakterien til at være sensitiv, betyder dette, at det pågældende antibiotikum som udgangspunkt kan anvendes, medmindre bakterien eksempelvis er naturlig resistent hertil. Ved optimal behandling opnås en koncentration svarende til 5x MIC på infektionsstedet. Side 15 af 45

16 Aflæses bakterien til at være intermediær, betyder dette, at det pågældende antibiotikum kan anvendes. Koncentrationen af antibiotikummet skal dog være højere for at opnå en ønsket virkning. Aflæses bakterien til at være resistent, betyder dette, at der ikke opnås effekt ved behandling med det pågældende antibiotikum (6,13). Påvirkning af zonestørrelsen Der findes forskellige faktorer, der kan påvirke zonestørrelser ved agardiffusion (14). Dette er blandt andet: - Inokulum - Mængden af suspension på MH-pladen - Inkubationstemperatur - Substratets ionsammensætning, tykkelse og fasthed - Antibiotikatablet/disk koncentration - Antibiotikas evne til at diffundere ud i agaren Det er vigtigt, at der fremstilles en suspension med en tæthed svarende til McFarland 0,5. Dette gøres for at opnå det rette inokulum. Hvis suspensionen har en tæthed større end McFarland 0,5, kan dette resultere i reducerede zonestørrelser. Hvis suspensionen har en tæthed mindre end McFarland 0,5, kan dette resultere i forstørrede zonestørrelser eller ikkekonfluerende vækst (1). Mængden af suspension på MH-pladen, kan påvirke zonestørrelserne. Hvis mængden af suspension er for stor, kan dette resultere i reducerede zonestørrelser. Omvendt kan en mindre mængde suspension resultere i forstørrede zonestørrelser. Mængden af suspension doseres med en vatpind. Vatpinden dyppes i suspensionen og overskydende væske fjernes, ved at trykke vatpinden mod glassets kant. Det gør sig specielt gældende ved gram-negative bakterier. For at opnå konfluerende vækst, fordeles suspensionen med vatpinden, ved at sprede i 3 retninger over MH-pladen (1). Faktorer som laboratoriet ikke har indflydelse på er indholdet i agarpladen blandt andet ph og ionsammensætning. Ses der på ionsammensætningen vides det, at zonestørrelser uden for Side 16 af 45

17 range ved P. aeruginosa ATCC til aminoglykosider skyldes en for høj eller for lav koncentration af kationer i mediet (15). Derudover vides det, at zonestørrelser under range ved E. faecalis ATCC til trimethoprim, skyldes et højt indhold af thymidin (12) reglen EUCAST har fastsat en retningslinje omhandlende tidsintervaller i forbindelse med udsåning og inkubation ved resistensbestemmelse. Optimalt skal suspensionen benyttes inden for 15 minutter efter fremstilling, dog kan denne anvendes inden for 60 minutter. Der må maksimalt gå 15 minutter efter suspensionen er udsået på MH-pladen, til antibiotikatabletter/disks påsættes. Såfremt dette ikke overholdes, har bakterien mulighed for at vokse uden påvirkning af antibiotika og dette kan resultere i en reducering af zonestørrelserne. Efter påsætning af antibiotikatabletter/disks, må der maksimalt gå 15 minutter inden MHpladerne inkuberes. Såfremt dette ikke overholdes, kan antibiotikaet diffundere ud i agaren inden bakterien får optimale vækstbetingelser. Dette kan resultere i forstørrede zonestørrelser (1). Materialer Kontrolstammer E. coli ATCC P. aeruginosa ATCC S. aureus ATCC E. faecalis ATCC Kliniske bakteriestammer 13 kliniske bakteriestammer herunder: 4 stk. S. aureus 5 stk. E. faecalis 4 stk. E. faecium Side 17 af 45

18 Rosco - NEO-SENSITABS E.coli Ampicillin 10 µg (AMP10) REF: LOT: Cefotaxime 5 µg (CTX05) REF: LOT: Ciprofloxacin 5 µg (CIPR5) REF: LOT: Gentamicin 10 µg (GEN10) REF: LOT: Mecillinam 10 µg (MEC10) REF: LOT: Nitrofurantoin 100 µg (NI100) REF: LOT P. aeruginosa Ceftazidime 10 µg (CAZ10) REF: LOT: Ciprofloxacin 5 µg (CIPR5) REF: LOT: Gentamicin 10 µg (GEN10) REF: LOT: Imipenem 10 µg (IMI10) REF: LOT: Piperacillin+tazobactam 30+6 µg (PTZ36) REF: LOT: Tobramycin 10 µg (TOB10) REF: LOT: S. aureus Cefoxitin 30 µg (CFO30) REF: LOT: Clindamycin 2 µg (CLI.2) REF: LOT: Erythromycin 15 µg (ERY15) REF: LOT: Fucidin 10 µg (FUC10) REF: LOT: Mupirocin 200 µg (MP200) REF: LOT: Rifampicin 5 µg (RIF5) REF: LOT: E. faecalis Ampicillin 10 µg (AMP10) REF: LOT: Linezolid 10 µg (LIZ10) REF: LOT: Nitrofurantoin 100 µg (NI100) REF: LOT Trimethoprim 5 µg (TRIM5) REF: LOT: Vancomycin 5 µg (VANC5) REF: LOT: Side 18 af 45

19 Substrater 41 stk. Blodagarplader 5 %. Statens Serums Institut REF: 0677 LOT: stk. E&O Laboratories Mueller Hinton Agar (BBL) 12x12 cm LOT: stk. BioMérieux Mueller Hinton E agar 9cm LOT: stk. BBL Mueller Hinton II Agar Becton Dickinson 12x12 cm REF: LOT: stk. BBL Mueller Hinton II Agar Becton Dickinson 9 cm REF: LOT: Apparaturer Thermo Scientific - Heraeus varmeskab Utensilier Poderedskaber (vatpinde og øser) Remel McFarland 0,5 Equivalence Turbidity Standard 0,5 REF: R20410 LOT: FRESENIUS KABI 9 mg/ml Natriumklorid LOT: NEO- SENSITABS -dispensorer For detaljeret materialeliste; se bilag 3 - Protokol for intermediær præcision og individuel kalibrering, bilag 4 - Protokol for primært forsøg og bilag 5 - Protokol for forsøg med kliniske bakteriestammer. Metode I følgende afsnit vil metoden for de forskellige forsøg blive beskrevet. Afsnittet omhandler; forsøgsdesign, metode, aflæsning af zonestørrelser og litteratursøgning. Der vil blive inddraget figurer og billeder, hvor det findes relevant. Generel metode Den generelle metode, der er anvendt til udførelse af resistensbestemmelse, er agardiffusion. Til fremstilling af suspensioner anvendes en McFarland 0,5 standard og ikke turbidimetri. Da begge metoder er beskrevet af EUCAST, er valget truffet på baggrund af proceduren for sekundær resistensbestemmelse på KM, se bilag 2 - Sekundær resistensbestemmelse. Side 19 af 45

20 Gennem hele projektet anvendes NEO-SENSITABS fra Rosco og ikke disks som beskrevet i EUCAST s disk diffusion method (1). Dette er muligt, da Rosco har tilpasset antibiotikakoncentrationen i NEO-SENSITABS, så range og de kliniske brydepunkter fra EUCAST kan anvendes (16). På og i artiklen: Comparison of Rosco Neo- Sensitabs with Oxoid paper disks in EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing on Mueller Hinton agar af U. S. Justesen et. al understøttes dette (17). I forbindelse med aflæsningen af zonestørrelserne er EUCAST s reading guide benyttet. MH-pladen aflæses bagfra med mørk baggrund og belysningen skal rettes mod MH-pladen. Zonestørrelserne måles med lineal og MH-pladen skal have en afstand på 30 cm til øjet (18). Der tages forbehold, når zonestørrelserne på kontrolstammerne aflæses. Ses der kontaminering på MH-pladen, udsås kontrolstammen på ny. Dette gøres for at sikre renhed af bakterien og dermed en korrekt aflæsning. Ved S. aureus, måles zonestørrelsen til den inderste kant, hvor der observeres vækst - se billede 2. Der skal tages forbehold for måling af ampicillin til enterobakterier. Her ignoreres den inderste zone og der måles fra den yderste zoneafgrænsning - se billede 3. Der skal ligeledes tages højde for mecillinam til E. coli, her ignoreres enkeltliggende kolonier, der vokser i aflæsningszonen. Dette gør sig gældende da mecillinam er specielt inokulumafhængig - se billede 4 (18). Billede 2 - Korrekt aflæsning af zonestørrelser af S. aureus. Billede 3 - Korrekt aflæsning af zonestørrelser til ampicillin ved enterobakterier. Billede 4 - Korrekt aflæsning af zonestørrelser ved mecillinam til E. coli. Side 20 af 45

21 Forforsøg - Intermediær præcision og individuel kalibrering En forudsætning for udførelse af det primære forsøg er, at der mellem gruppens medlemmer måles præcist og korrekt. Derfor opstilles et forforsøg med henblik på den intermediære præcision og den individuelle kalibrering. Ved den intermediære præcision menes der, at hver måling af samme zonestørrelse aflæst af alle gruppens medlemmer, internt må variere med maksimalt 3 mm. Ved kalibrering menes der, at målte zonestørrelser skal ligge inden for range defineret af EUCAST. Såfremt målingerne af zonestørrelserne ikke ligger inden for range genmåles disse. Kalibreringen udføres for at træne øjet til at aflæse korrekt. Hensigten med forforsøget er, at aflæsningen i det primære forsøg kan anses for at være pålidelig og samtidig kan arbejdet fordeles mellem gruppens medlemmer. Valget af de 4 kontrolstammer og tilhørende NEO-SENSITABS, vælges på baggrund af kontrolstammerne udvalgt til det primære forsøg - forklaringen herpå ses i metodeafsnittet for det primære forsøg. Inden projektets start udarbejdes et system til mærkning af MH-pladerne. MH-pladerne markeres med kontrolstammens initialer, se nedenfor. Ec = E. coli Pa = P. aeruginosa Ef = E. faecalis Sa = S. aureus Side 21 af 45

22 Figur 1 - Visuel fremstilling af forforsøgets udførsel per dag. De gule plader repræsenterer MH-pladerne fra BioM og den grønne plade repræsenterer MH-pladen fra E&O. Over 5 dage udsås de 4 kontrolstammer på i alt 60 MH-plader med tilhørende NEO- SENSITABS. Første dag udsås kontrolstammerne (E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC og E. faecalis ATCC 29212). Disse inkuberes i timer og aflæses derefter af alle gruppens medlemmer. Der fremstilles dagligt, per kontrolstamme, tre suspensioner med McFarland 0,5. De tre suspensioner udsås på henholdsvis to MH-plader fra BioM og én MH-plade fra E&O med tilhørende NEO-SENSITABS - se figur 1 - Visuel fremstilling af forforsøgets udførsel per dag. Zonestørrelser aflæses efter EUCAST s reading guide (18). Alle zonerstørrelser aflæses af alle gruppens medlemmer. Der kontrolleres, at hver enkelt zonestørrelse blandt gruppens medlemmer ikke afviger med mere end 3 mm. Såfremt der observeres forskelle over 3 mm måles zonerne igen. Aflæsningen blindes, så der undgås en eventuel påvirkning af målinger fra gruppens øvrige medlemmer. Efterfølgende sammenlignes zonestørrelserne med range defineret af EUCAST. Såfremt en zone måles uden for range, måles denne igen. Forsøget gentages indtil alle målte Side 22 af 45

23 zonestørrelser ikke varierer med mere end 3 mm internt i gruppen og at alle målte zonestørrelser ligger inden for range. Range for ampicillin til E. faecalis vurderes efter KM s range på mm og ikke EUCAST s range på mm. Dette gøres da KM anvender NEO-SENSITABS med en koncentration på 10 µg og EUCAST benytter en disk på 2 µg (19). For mere udførlig fremgangsmåde, se bilag 3 - Protokol for intermediær præcision og individuel kalibrering Primært forsøg Ud fra EUCAST s kvalitetskontrol til resistensbestemmelse er de 4 kontrolstammer udvalgt til projektet: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC og E. faecalis ATCC Ydermere er det fordelagtigt at anvende kontrolstammer, hvor EUCAST allerede har defineret range (19). Derudover anvendes disse kontrolstammer i praksis, til kvalitetskontrol af resistensbestemmelse, på MH-plader. Kontrolstammerne er derfor relevante i forhold til afprøvning af BD s MH-plader. De udvalgte NEO-SENSITABS til projektet ses i tabel 1 i teoriafsnittet. Disse er udvalgt for at repræsentere relevante antibiotikagrupper med forskellige virkemekanismer. Der fremstilles i alt 72 suspensioner per kontrolstamme. Hver suspension udsås på en 9 cm og en 12x12 cm MH-plade fra BD, så der i alt udsås på 576 MH-plader. Der påsættes seks forskellige NEO-SENSITABS ved kontrolstammerne; E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC og fem forskellige NEO-SENSITABS til kontrolstammen E. faecalis ATCC Dette giver i alt 3312 zoner, der skal aflæses. Til hver kontrolstamme fremstilles 24 suspensioner per dag. Disse navngives med et suspensionsnummer fra Hver suspension udsås på en 9 cm og en 12x12 cm MH-plade, så disse har samme suspensionsnummer og dette udgør således et par, se figur 2. Side 23 af 45

24 Figur 2 - Visuel fremstilling af udførelsen til det primære forsøg pr. dag pr. person. Hver person fremstiller 6 suspensioner pr. kontrolstamme pr. dag. Arbejdet fordeles mellem gruppens medlemmer. Dette gøres for at efterligne arbejdsgangen på KM, hvor der dagligt roteres mellem arbejdsstationerne. Udsåningen foretages i henhold til bilag 2 - Sekundær resistensbestemmelse, hvor teknikken afhænger af, hvilken bakteriestamme der udsås. Forsøget gentages over tre dage. For at opnå pålidelige resultater opstilles et blindet forsøgsdesign. Dette gøres ved, at range er ukendt mens målingerne af zonestørrelserne foretages. Derudover blindes resultaterne for pladerne parvis, så der undgås en mulig påvirkning af tidligere målte zonestørrelser. Resultaterne omhandlende zonestørrelser og range fremstilles i histogrammer udarbejdet i Excel version 2010, hvor målingerne for 9 cm og 12x12 cm MH-plader begge fremgår i samme histogram. Resultaterne omhandlende en eventuel forskel på MH-pladerne, fremstilles i et Bland-Altman plot udarbejdet i Excel version 2010, hvor målingerne fra MH-pladerne fremgår parvis. For mere udførlig fremgangmåde, se bilag 4 - Protokol for primært forøg. Side 24 af 45

25 Forsøg med kliniske bakteriestammer Der er på KM observeret kliniske bakteriestammer, der ikke vokser på MH-plader fra BioM. I perioden 22. juni til 17. oktober 2016 blev der indsamlet og nedfrosset 13 kliniske bakteriestammer; henholdsvis fem E. faecalis og fire E. faecium og fire S. aureus. Der vurderes vækst på i alt 52 MH-plader. Der fremstilles én suspension per klinisk bakteriestamme med McFarland 0,5. Hver suspension udsås på fire MH-plader (BioM, E&O, 9 cm og 12x12 cm fra BD). MH-pladerne inkuberes i timer. Der udsås på MH-pladerne fra BioM og E&O, for at bekræfte den manglende vækst på pladen fra BioM og sammenligne med pladen fra E&O. Der udsås på begge MH-plader fra BD for at se, om denne tendens gør sig gældende på disse plader. Der anvendes ikke NEO- SENSITABS, da der udelukkende skal vurderes vækst. For mere udførlig fremgangsmåde, se bilag 5 - Protokol for forsøg med kliniske bakteriestammer. Litteratur og afgrænsning Til baggrundsviden samt teoriafsnit blev søgemaskinen Google anvendt. Lærebøger, fra bioanalytikeruddannelsen, VIA-bibliotekerne og KM, er anvendt til teoriafsnittet og generel baggrundsviden. Da en stor del af opgaven omhandler EUCAST, har dokumenter fra hjemmesiden været en primær kilde gennem hele projektet. Til udarbejdelse af protokoller og metodeafsnit er KM s procedurer fra Qpulse benyttet. Databaserne Pubmed og Embase er anvendt til litteratursøgning. I databasen PubMed er Medical Subject Heading -søgninger (MeSH) primært benyttet og efterfølgende har kaskadesøgninger af artiklers referencelister været brugbare. Derudover er databasen Embase benyttet, hvor fritekstsøgninger er anvendt. Side 25 af 45

26 Vi har afgrænset vores søgninger til artikler på dansk og engelsk. Derudover er søgningerne yderligere afgrænset til artikler, som ikke er ældre end 5 år, såfremt dette har været muligt. I tabel 2 ses relevante søgestrenge. Database Metode Søgeord Underemner Afgrænsning Resultater Pubmed MeSH Disk Diffusion Method 5 år 58 Antimicrobial Tests Standards Dansk/ engelsk Embase Fritekst- Quality control AND 5 år 6 søgning Mueller Hinton agar Dansk/ engelsk Embase Fritekst- Pseudomonas Dansk/ 21 søgning aeruginosa AND engelsk Mueller Hinton agar AND aminoglycoside Tabel 2 - Oversigt over søgestrenge til litteratursøgning. Ud fra de 58 resultater fra PubMed er artiklen Wide variation in activity of antibiotic discs from nine manufacturers udarbejdet af G. Kahlmeter udvalgt. Ud fra de 6 resultater fra Embase er artiklen Comparison of Rosco Neo-Sensitabs with Oxoid paper disks in EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing on Mueller Hinton agar udarbejdet af U.S. Justesen Ud fra de 21 resultater fra Embase er artiklen Effect of Ionized Calcium and Soluble Magnesium on the Predictability of the Performance of Mueller-Hinton Agar Susceptibility Testing of Pseudomonas aeruginosa with Gentamicin udarbejdet af Edmundo Casillas et.al. udvalgt. Side 26 af 45

27 Resultater I følgende afsnit bliver resultaterne for projektet præsenteret skematisk, i histogrammer og Bland-Altman plots. Der er udarbejdet opsummerende tabeller for at skabe et samlet overblik over alle resultater. Der udvælges enkelte histogrammer og Bland-Altman plots for at give et repræsentativt billede af resultaterne. De resterende histogrammer og Bland-Altman plots ses i bilag 6 - Resultater til primært forsøg. Måling af zonestørrelser i forhold til range defineret af EUCAST Nedenfor ses tabeller for hver kontrolstamme, der opsummerer resultater. Tabellerne udarbejdes på baggrund af histogrammer, der er udarbejdet fra rådata. Grøn: Alle målinger ligger inden for range. Rød: Nogle målinger ligger uden for range. (+): Antallet af målinger over range. (-): Antallet af målinger under range. Side 27 af 45

28 Tabel 3 - Opsummering af resultater af zonestørrelser i forhold til range. Tabellen viser hver kontrolstamme med tilhørende antibiotika og om målinger af zonestørrelser, på både 9 cm og 12x12 cm MH-plader, ligger inden for range. Nedenfor ses histogram 8, som er et eksempel på, at alle målinger af zonestørrelserne ligger inden for range. Dette gør sig ligeledes gældende for: E. coli: Ampicillin og cefotaxime. P. aeruginosa: Imipenem, gentamicin og piperacillin+tazobactam. S. aureus: Cefoxitin. E. faecalis: Ampicillin, linezolid, nitrofurantoin, trimethoprim og vancomycin. Side 28 af 45

29 Histogram 8: 144 målinger af zonestørrelser til ciprofloxacin ved P. aeruginosa. 144 målinger ligger inden for range. Range er angivet med stiplede blå linjer. Medianen er angivet ved den orange prikkede linje. Ud af x-aksen ses zonestørrelse i mm, ud af y-aksen ses antal målinger. Nedenfor ses histogram 12, som er et eksempel på, at målinger både på 9 cm og 12x12 cm MH-pladerne ligger over range. Dette gør sig ligeledes gældende for: S. aureus: Erythromycin og rifampicin. Histogram 12: 144 målinger af zonestørrelser til tobramycin ved P. aeruginosa. 123 målinger ligger inden for range. 13 målinger ligger over range på 12x12 MH-pladen. 8 målinger ligger over range på 9 cm MH-pladen. Range er angivet med stiplede blå linjer. Medianen er angivet ved den orange prikkede linje. Ud af x-aksen ses zonestørrelse i mm, ud af y-aksen ses antal målinger Side 29 af 45

30 Nedenfor ses histogram 7, som er det eneste eksempel på, at målingerne af nogle zonestørrelser ligger under range på begge MH-plader. Histogram 7: 144 målinger af zonestørrelser til ceftazidime ved P. aeruginosa. 129 målinger ligger inden for range. 4 målinger ligger under range på 12x12 MH-pladen. 11 målinger ligger under range på 9 cm MH-pladen. Range er angivet med stiplede blå linjer. Medianen er angivet ved den orange prikkede linje. Ud af x-aksen ses zonestørrelse i mm, ud af y-aksen ses antal målinger Nedenfor ses histogram 6, som er et eksempel på, at målinger af nogle zonestørrelser på 12x12 cm MH-pladen ligger over range. Dette gør sig ligeledes gældende for: E. coli: Ciprofloxacin, gentamicin og mecillinam. S. aureus: Clindamycin og mupirocin. Histogram 6: 142 målinger af zonestørrelser til nitrofurantoin ved E. coli. 125 målinger ligger inden for range. 17 målinger ligger over range på 12x12 MH-pladen. Range er angivet Side 30 af 45

31 med stiplede blå linjer. Medianen er angivet ved den orange prikkede linje. 2 plader udgik pga. kontaminering. Ud af x-aksen ses zonestørrelse i mm, ud af y-aksen ses antal målinger Nedenfor ses histogram 16, som er det eneste eksempel på, at målinger af nogle zonestørrelser på 9 cm MH-pladen ligger under range. Histogram 16: 144 målinger af zonestørrelser til fucidin ved S. aureus. 139 målinger ligger inden for range. 5 målinger ligger under range på 9 cm MH-pladen. Range er angivet med stiplede blå linjer. Medianen er angivet ved den orange prikkede linje. Ud af x-aksen ses zonestørrelse i mm, ud af y-aksen ses antal målinger Nedenfor ses histogram 18, hvor 31 målinger ligger inden for range. Histogram 18: 144 målinger af zonestørrelser til rifampicin ved S. aureus. 31 målinger ligger inden for range. 58 målinger ligger over range på 12x12 MH-pladen. 55 målinger ligger over range på 9 cm MH-pladen. Range er angivet med stiplede blå linjer. Medianen er Side 31 af 45

32 angivet ved den orange prikkede linje. Ud af x-aksen ses zonestørrelse i mm, ud af y-aksen ses antal målinger Sammenligning af zonestørrelser på MH-plader Nedenfor ses histogrammer, der opsummerer resultaterne for sammenligning af MHpladerne. Histogrammerne udarbejdes på baggrund af Bland-Altman plots, der er udarbejdet fra rådata. Blå: Antal målinger, hvor zonestørrelser på 9 cm MH-pladen måles større end 12x12 cm MH-pladen. Rød: Antal målinger, hvor zonestørrelser på 9 cm og 12x12 cm MH-plader er lig hinanden. Grøn: Antal målinger, hvor zonestørrelser på 9 cm MH-pladen måles mindre end 12x12 cm MH-pladen. Side 32 af 45

33 Tabel 4 - Opsummering af resultater for sammenligning af pladerne. Zonestørrelser på 9 cm og 12x12 cm MH-plader sammenlignes. Ud af x-aksen ses NEO-SENSITABS, ud af y-aksen ses antal målinger. Nedenfor ses Bland-Altman plot 17, hvor zonestørrelsen måles mere end 3 mm større på 12x12 cm MH-pladen. Dette gør sig ligeledes gældende for: E. Coli: Cefotaxime, ciprofloxacin og nitrofurantoin. S. Aureus: Cefoxitin, clindamycin, erythromycin, fucidin og rifampicin. E. faecalis: Linezolid, nitrofurantoin og trimethoprim. Side 33 af 45

34 Bland-Altman plot 17: Differencen på pladerne (parvis, målt i mm) til mupirocin ved S. aureus. Ved 69 målinger (værdier >0) ses større zoner på 12x12 cm MH-pladen. Ved 2 målinger (værdier <0) ses større zoner på 9 cm MH-pladen. Ved 1 måling (værdier =0) ses ingen forskel i zonestørrelserne. Ud af x-aksen ses opslæmningsnummer, ud af y-aksen ses differencen mellem 12x12 cm og 9 cm MH-pladen. Nedenfor ses Bland-Altman plot 12. Her ses ingen målinger, hvor differencen er over 3 mm. Dette gør sig ligeledes gældende for: E. coli: Ampicillin, gentamicin og mecillinam. P. aeruginosa: Ciprofloxacin, imipenem, gentamicin og piperacillin+tazobactam. E. faecalis: Ampicillin og vancomycin. Bland-Altman plot 12: Differencen på pladerne (parvis, målt i mm) til tobramycin ved P. aeruginosa. Ved 25 målinger (værdier >0) ses større zoner på 12x12 cm MH-pladen. Ved 16 Side 34 af 45

35 målinger (værdier <0) ses større zoner på 9 cm MH-pladen. Ved 31 målinger (værdier =0) ses ingen forskel i zonestørrelserne. Ud af x-aksen ses opslæmningsnummer, ud af y-aksen ses differencen mellem 12x12 cm og 9 cm MH-pladen Forsøg med kliniske bakteriestammer Tabel 5 viser resultaterne fra forsøget med kliniske bakteriestammer. (+): angiver vækst Nuværende MH-plader MH-plader fra BD Kliniske Bakteriestammer BioM E&O BD (9 cm) BD (12x12 cm) 1 - E. faecium S. aureus S. aureus S. aureus E. faecalis S. aureus Kontamineret Kontamineret Kontamineret Kontamineret 7 - E. faecium E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecium E. faecalis E. faecium Tabel 5 - Resultaterne for forsøget med kliniske bakteriestammer. Der ses vækst på alle 4 MH-plader ved alle kliniske bakteriestammer. 6 - S. aureus udgik, da pladerne var kontamineret. Side 35 af 45

36 Diskussion I dette afsnit, vil der blive diskuteret på; resultaterne sammenlignet med range defineret af EUCAST, BD s MH-plader sammenlignet med hinanden og forsøget med de kliniske bakteriestammer. Patientperspektiv, samt metode, diskuteres inden konklusionen foreligger. Grundet et vellykket forforsøg kan en eventuel mistanke om aflæsningsfejl udelukkes. Videnskabelig litteratur inddrages, hvor det findes relevant. Range defineret af EUCAST Betragtes resultaterne i forhold til range defineret af EUCAST, ses at 92,6 % af alle målte zonestørrelser ligger inden for range. Resultat 8 ciprofloxacin, P. aeruginosa, se bilag 6 - Resultat til primært forsøg, viser et eksempel hvor; målingerne er normalfordelte, ligger inden for range og middelværdien ses ved medianen. Det ses at 7,4 % af alle målinger ligger uden for range. Der en generel tendens til, at zonestørrelserne ligger i den høje ende af range. Tendensen er ligeledes, at de målinger, der ligger uden for range, ligger over range, se tabel 3. Dette gør sig gældende ved 224 ud af 3298 målte zonestørrelser, svarende til 6,8 %. 169 målinger (5,1 %) ligger over range med 1 mm, 55 målinger (1,7 %) ligger over range med mere end 1 mm. Maksimalt ligger målingerne 3 mm over range. Tendensen til de generelt høje zonestørrelser visualiseres blandt andet i resultaterne 1-6 for E. coli, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg. En mulig forklaring på de generelt store zonestørrelser, kan skyldes KM s nuværende procedure for sekundær resistensbestemmelse, hvor der anvendes 3 forskellige teknikker til udsåning. Hertil kan det tolkes individuelt, hvordan et let/hårdt tryk skal udføres og dette kan blandt andet bevirke, at zonestørrelserne bliver større, se bilag 2 - Sekundær resistensbestemmelse. I resultaterne for E. faecalis ses, at alle målinger ligger inden for range, men samtidig er større end medianen, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg. KM s procedure for udsåning af E. faecalis stemmer overens med EUCAST disk diffusion method (1), hvor kun den overskydende væske fjernes ved udsåning af gram-positive bakterier. Dette kan muligvis Side 36 af 45

37 være en grund til at alle zonerne til E. faecalis ligger indenfor range, i forhold til de øvrige kontrolstammer. Her varierer KM s procedure fra EUCAST s disk diffusion method (1). Når der påføres mindre suspension til MH-pladen, kan dette muligvis resultere i større zonestørrelser. Dette visualiseres i resultaterne for S. aureus, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg. KM s procedure beskriver, at der skal foretages et let tryk af vatpinden, hvorimod EUCAST beskriver at overskydende væske skal fjernes. Her kan det igen tolkes individuelt om et let tryk og fjernelse af overskydende væske, i bund og grund beskriver samme teknik. Som beskrevet i teoriafsnittet kan MH-pladens indhold have betydning for, hvordan zonestørrelserne ligger i forhold til range. Det vides, at zonestørrelsen for trimethoprim til E. faecalis er afhængig af thymidinkoncentrationen i MH-pladen (12). En høj koncentration af thymidin vil resultere i zonestørrelser, som ligger under range. Ses dette i forhold til resultat 22 trimethoprim, E. faecalis, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg, tyder det på, at koncentrationen af thymidin i MH-pladen er passende, da alle målinger af zonestørrelser til trimethoprim ligger inden for range. Derudover vides det, at zonestørrelser til aminoglykosider ved P. aeruginosa påvirkes af kationindholdet i MH-pladen. De aminoglykosider, som er anvendt i projektet til P. aeruginosa er tobramycin og gentamicin. I resultat 12 for tobramycin, P. aeruginosa, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg, ses at alle målinger er større end medianen og 21 målinger ligger over range. I resultat 10 for gentamicin, P. aeruginosa, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg, ses at alle målinger ligger inden for range, men er større end medianen. Ses der udelukkende på de to ovenstående resultater, kan det tyde på, at indholdet af kationer i MH-pladen er for lav, da zonestørrelserne er store (15). Da den generelle tendens for alle målinger i forsøget er, at zonestørrelserne ligger i den høje ende af range, kan det ikke udelukkes at disse resultater ligeledes afviger af samme grund Ved resultat 7 ceftazidime, P. aeruginosa og resultat 16 fucidin, S. aureus, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg, ses de eneste 20 ud af 3298 målte zonestørrelser, som ligger under range, svarende til 0,6 % (alle med 1 mm). Betragtes resultat 7 og 16, ses det at Side 37 af 45

38 målingerne er normalfordelte. Dette var som forventet, dog ses en forskydning af målingerne, så alle ligger i den lave ende af range og dermed modsat den generelle tendens. En forklaring på de lave zonestørrelser til ceftazidime og fucidin, kan muligvis være, at disse har en ringere evne til at diffundere ud i agaren på netop BD s MH-plader end øvrigt anvendt antibiotika. En yderligere forklaring kan være, at koncentration i NEO-SENSITABS fucidin og ceftazidime, er lavere end hvad producenten har angivet. Det vides på baggrund af artiklen Wide variation in activity of antibiotic discs from nine manufacturers udarbejdet af G. Kahlmeter, at den reelle koncentration kan afvige fra den oplyste koncentration. Dette kunne muligvis også forklare resultat 18 rifampicin, S. aureus, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg, hvor kun 31 målinger ligger inden for range. Det tyder på, at koncentrationen af antibiotikummet er højere end den oplyste koncentration. I resultat 18 ses en markant forskydning af de ellers normalfordelte resultater og i samspil med de generelt store zonestørrelser, kan dette forklare det enkeltstående eksempel (11). Det er bemærkelsesværdigt, at der på samme MH-plade kan være så stor forskel på målinger af zonestørrelser i forhold til range, når den eneste varierende faktor er antibiotika. Et eksempel herpå er P. aeruginosa resultat 7 ceftazidime sammenlignet med resultat 12 tobramycin og S. aureus resultat 16 fucidin sammenlignet med resultat 18 rifampicin, se bilag 6 - Resultater til primært forsøg. Eksemplet ses nedenfor. Histogram 16 og 18: Målinger af zonestørrelser til fucidin og rifampicin ved S. aureus. Kun målinger for 9 cm MH-pladen. Range er angivet med stiplede blå linjer. Medianen er angivet ved den orange prikkede linje. Ud af x-aksen ses zonestørrelse i mm, ud af y-aksen ses antal målinger Side 38 af 45

39 Der kan stilles spørgsmålstegn ved, hvorvidt Roscos NEO-SENSITABS og BD s MHplader er en god kombination eller ej. I artiklen Wide variation in activity of antibiotic discs from nine manufacturers udarbejdet af G. Kahlmeter, beskrives variationen af zonestørrelser på kontrolstammer, set i forhold til EUCAST s range, ved anvendelse af disks fra forskellige producenter. Artiklen beskriver, at der findes mange forskellige kombinationer af disks og MH-plader, dog skal det sikres, at kontrolstammernes zonestørrelser lever op til range defineret af EUCAST, som forudsætning for benyttelse af EUCAST s kliniske brydepunkter (11). Artiklen kan dog ikke sammenlignes direkte til det udarbejdede forsøg, da der i forsøget anvendes NEO-SENSITABS og ikke disks som nævnt i artiklen. På baggrund af artiklen Comparison of Rosco Neo-Sensitabs with Oxoid paper disks in EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing on Mueller Hinton agar udarbejdet af U.S. Justesen, formodes der, at samme tendens for disks også vil gøre sig gældende for antibiotikatabletter. Artiklen belyser, at der er variation på kontrolstammernes zonestørrelser ved anvendelse af disks og NEO-SENSITABS. Sammenligningen af disks og NEO-SENSITABS viser også, at i de tilfælde, hvor zonestørrelserne til disks ligger uden for range, gør dette sig også gældende for zonestørrelserne til NEO-SENSITABS. Dermed kan de substituere hinanden (17). Sammenligning af MH-pladerne Arealet på 9 cm MH-pladen er 64 cm 2 og arealet på 12x12 cm MH-pladen er 144 cm 2, det vil sige at forholdet mellem pladerne er 1:2,25. Arealet på 12x12 cm MH-pladen er dermed over dobbelt så stort som arealet på 9 cm MH-pladen. Betragtes resultaterne knyttet til sammenligning af MH-pladerne parvis, ses der en generel tendens til at zonestørrelserne på 12x12 cm MH-pladen er større end zonestørrelserne på 9 cm MH-pladen, se tabel 4. En forklaring på dette kan være, at mængden af suspension, der fordeles ud på MH-pladerne er den samme, trods arealforskellen. KM s procedure for sekundær resistensbestemmelse, se bilag 2 - Sekundær resistensbestemmelse, tager ikke højde for, om der udsås på en 9 cm MH-plade eller 12x12 cm MH-plade. Hvis forskellen på zonestørrelserne skyldes KM s procedure, ville en mulig løsning være, at udarbejde to forskellige procedurer til henholdsvis 9 cm og 12x12 cm MH-pladerne. Side 39 af 45