Fikseringstidens indvirkning på antigenisiteten og DNAbevarelsen

Transkript

1 Fikseringstidens indvirkning på antigenisiteten og DNAbevarelsen i væv Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen VIA UC, Campus Aarhus Nord Udarbejdet af: Nina Hagemann Ribold I-Vejleder: Birte Bunch Larsen Lektor, cand scient. K-Vejleder: Susanne Rønn Jakobsen - Bioanalytikerunderviser Antal tegn: tegn 1

2 Resumé Formålet med dette professionsbachelorprojekt var at undersøge, om svartiden kunne reduceres ved at forkorte fikseringstiden, uden at påvirke kvaliteten af de immunhistokemiske farvninger, vævsmorfologien af HE-farvningen og bevarelsen af DNA. Prøvematerialet bestod af normal hud fikseret ved 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer. Kvaliteten af HE- og immunfarvningerne blev scoret på baggrund af vævssnit fra disse tider. Scoringen af disse snit blev af projektgruppen foretaget ublindet, mens en ekspert på området scorede kvaliteten af de farvede snit blindt. Endvidere blev der oprenset DNA fra fikseringstiderne, og bevarelsen af DNA et blev vurderet ved brug af kapilærgelelektroforese Den følgende gennemgang af resultater viste, at svartiden kan reduceres, hvis man er villig til at acceptere en mindre god vævsmorfologi ved HE-farvning, en mindre god farveintensitet. Bevarelsen af DNA ved forskellige fikseringstider viste ikke tegn på forringelse. 2

3 Forord Jeg vil gerne takke Afdeling for Klinisk Patologi på Aarhus Universitetshospital for at give mig muligheden for udførelse af mit bachelorprojekt hos dem, samt deres støtte og rådgivning i forbindelse med projektet. Særligt vil jeg gerne takke Immunhistokemisk Laboratorium, nærmere betegnet Vibeke Jensen, Tom Nordfeldt og Peter Lauridsen på Tage-Hansens Gade for at have hjulpet til med immunfarvning af de skårne snit og for udlevering af læsestof vedrørende projektet. Jeg vil også gerne takke Kristina Lund Lauridsen og Jesper Berthelsen fra Udviklingslaboratoriet PAI på Nørrebrogade for hjælp til scanning af HE- og immunfarvede snit og til oprensning af DNA og udførelse af multiplex PCR og gelelektroforese. En speciel tak gives til professor i patologi og overlæge dr. Med. Torben Steiniche for at have indvilliget i at score og vurdere vores HE- og immunfarvede snit. En stor tak skal gives til klinisk vejleder Susanne Rønn Jakobsen og Lektor, Cand. Scient. Birte Bunch Larsen for vejledning igennem projektet. Sidst, men ikke mindst vil jeg sige tak til mine medstuderende Mirna Abde, Stefny Neosan og Charlotte Fischer Rasmussen, der under hele forløbet har været en fantastisk hjælp. 3

4 Indholdsfortegnelse Resumé... 2 Forord... 3 Indholdsfortegnelse... 4 Indledning... 6 Problembaggrund... 6 Formål... 7 Problemformulering... 7 Målformulering... 7 Baggrund... 8 Hudens opbygning... 8 Fiksering Markørantigener (4) Immunhistokemi DNA-bevarelse Materialer Metode Resultat Fikseringstidens påvirkning på HE-farvning Skema for scoring af HE-farvninger Fikseringstidens påvirkning på immunhistokemiske farvninger Skema for scoring af immunhistokemiske farvninger Resultat for DNA-bevarelse fragmentering og kapilærgelelektroforese Diskussion Sammenligning af resultater Fikseringstidens indflydelse på vævsmorfologien vurderet ved HE farvning Fikseringstidens indflydelse på farveintensiteten vurderet ved immunfarvning Fikseringstidens indflydelse på DNA-bevarelse Fikseringstidens betydning for HE- og immunhistokemiske farvninger Diskussion af metode

5 Konklusion Perspektivering Renferenceliste Liste over Bilag

6 Indledning Problembaggrund I 2007 blev det besluttet af regeringen og Danske regioner at indføre pakkeforløb for alle patienter med begrundet mistanke om kræft og patienter med kræft, og i januar 2009 blev alle pakkeforløbene implementeret. Beslutningen om at indføre pakkeforløb kom efter en sammenligning af kræftpatienters overlevelse i de nordiske lande viste, at overlevelsen for de mest udbredte kræftsygdomme var ringere i Danmark end i de øvrige nordiske lande. Formålet med pakkeforløbene er dermed at tilbyde patienter en optimal udredning og behandling uden unødvendig ventetid og således forbedre prognosen, livskvaliteten og mindske utrygheden ved ventetid. Et pakkeforløb omfatter hele forløbet fra begrundet mistanke om kræft, udredning, diagnose, behandling og efterbehandling. Pakkeforløbene beskriver de nødvendige undersøgelser og behandlinger, herunder fagligt begrundede forløbstider (1)(2). Således er det interessant indenfor patologien at bidrage til pakkeforløbene ved at undersøge, om svartiden på de histologiske undersøgelser kan forkortes, idet lange ventetider kan betyde yderligere sygdomsudvikling og dermed forringet udsigt til helbredelse. Da fiksering af de histologiske prøver er en af de præanalytiske procedurer, der varer længst, er det relevant at undersøge, om fikseringstiden kan nedsættes. Histologiske vævsprøver fikseres med 4 % neutral buffet formaldehyd (4 % NBF), som er et gelerende fiksativ, og standardtiden for fikseringen er i dag timer (3). Da 4 % Neutral NBF forårsager maskering af antigene epitoper i væv, er det desuden relevant at undersøge, om fikseringstiden har indvirkning på bevarelsen af disse antigene epitoper (4). Dette vil undersøges ved immunhistokemisk påvisning (IHC) af forskellige antigener. Endvidere er det interessant at undersøge om ændringen af fikseringstiden har indflydelse på bevarelsen af DNA, idet molekylærbiologien i stigende grad i dag anvendes til diagnostisk og valg af behandling indenfor patologien. 6

7 Formål Formålet med dette professionsbachelorprojekt er at undersøge, om svartiden kan reduceres ved at forkorte fikseringstiden, således at kvaliteten af de immunhistokemiske farvninger og vævsmorfologien af Hæmatoxylin-Eosin (HE) farvningen ikke forringes. Der medtages desuden en fikseringstid på 72 timer, da nogle vævspræparater kan opbevares i 4 % NBF weekenden over. Her vil der påvises, om denne fikseringstid medfører optimale resultater. Endvidere vil det blive undersøgt, om fikseringstiden har indvirkning på DNA-bevarelsen, da molekylærbiologiske analyser i stigende grad anvendes til diagnostik og valg af behandling indenfor patologien. Problemformulering Hvilken betydning har fikseringstiden i forhold til morfologien, antigenisiteten og bevarelsen af DNA i væv, der er fikseret i 4 % NBF. Målformulering For at undersøge og vurdere, hvordan fikseringstiden påvirker vævsmorfologi og immunhistokemiske farvninger: - Anvendes et hudstykke, der udskæres i seks dele, som fikseres med 4 % NBF i henholdsvis 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer - Skæres snit fra hver fikseringstid i tre niveauer: Niveau 1 og 3 anvendes til immunhistokemisk farvning - Farves det første snit fra henholdsvis niveau 1 og 3 med HE - Foretages immunhistokemisk påvisning af antigenerne AE 1/3, CD34, CD45, CK7, Ki-67, Melan-A, S100 og Vimentin. - Anvendes et scoringssystem på de HE-farvede snit til vurdering af vævsmorfologien - Anvendes et scoringssystem på de immunhistokemiske farvninger 7

8 - Sammenholdes resultater opnået ved standardfikseringstiden med resultater opnået ved de øvrige fikseringstider for HE-farvningen og immunhistokemien For at undersøge fikseringstidens betydning for bevarelsen af DNA: - Anvendes renskåret snit fra niveau 2 til oprensning af DNA - Anvendes multiplex PCR på det oprensede DNA - Sammenholdes resultater opnået ved standardfikseringstiden med resultater opnået ved de øvrige fikseringstider for molekylærbiologien Baggrund Hudens opbygning Huden består af tre lag: epidermis, dermis (corium) og tela subcutanea (subcutis). De to første lag hænger fast sammen og ligger på det løsere bindevævslag tela subcutanea. (5) Epidermis, også kaldet overhuden, består af et flerlaget pladeepitel. Epidermis består af keratinocytter, melanocytter og Langerhans celler. Keratinocytter er i alle lagene i epidermis, og de har en varierende morfologi. Det inderste lag langs basalmembranen består af en enlaget række af lavt cylindriske eller kubiske celler med ovale kerner kaldet stratum basale, som udgør stamcellerne for epitelet. Det næste lag er stratum spinosum, som udgør flere lag celler, der hviler direkte på basallaget af celler. Ovenpå stratum spinosum findes stratum granulosum, som oftest består af to-tre lag celler, som bliver tiltagende affladede op mod overfladen af huden. Her taber cellerne mitokondrier og endoplasmatisk reticulum, og cellekernerne opløses. Stratum lucidum er en kraftig eosinofil zone mellem lagene stratum granulosum og stratum corneum. Zonen består af nogle få lag af flade, tætte celler, og cellekernen kan anes svagt i enkelte celler. 8

9 Som beskyttelse mod den ydre overflade kommer endelig stratum corneum, hvor cellerne ikke længere er levende, idet keratinocytterne har mistet deres kerne og organeller. Disse betegnes som hornceller. Laget ses som en kraftig eosinofil masse af lameller, hvor man ikke kan skelne cellerne fra hinanden. Superficielt sker der en stadig afskalning af horncellerne. Dette lag kaldes stratum disjunctum. Melanocytterne er melanindannende celler. De færdige melanosomer fagocytteres af keratinocytterne. Melaninet findes over kernerne i de basale keratinocytter, og keratinocytterne tager melaninet med sig på deres vej gennem epidermis. De er forsynet med lange udløbere, som trænger ind imellem keratinocytterne i stratum basale og den ydre del af stratum spinosum Fra epidermis dannes desuden følgende strukturer: hår, negle, talgkirtler, apokrine og ekkrine svedkirtler, som således alle er epidermale strukturer. Dermis (corium), også kaldet læderhuden, er opbygget af celler, fibre og grundsubstans. Den øverste del af dermis kaldes stratum papillare, den nederste del stratum reticulare Cellerne i dermis udgøres af fibroblaster, lymfocytter, mastceller og makrofager. Fibroblasterne er ansvarlige for syntese af kollagen, der udgør størstedelen af huden. I dermis er der spredte lymfocytter, som primært findes perivaskulært. Desuden er der spredte makrofager. Kollagen, som udgør 70 % af bindevævets tørvægt, er sammensat af fibriller og indeholder to specielle aminosyrer, hydroxyprolin og hydroxylysin. Kollagenmolekylet dannes af fibroblaster. Retikulinfibre findes lige under epidermis og er formodentlig forstadier til kollagene fibre. Elastiske tråde udgør 2 % af bindevævets tørvægt og dannes ligesom kollagen af fibroblaster. Bindevævets grundsubstans består primært af vand, uorganiske salte, kulhydrater, aminosyrer, peptider og glykosaminoglycaner, som binder vand. Subcutis består af bindevæv med celler, som er specialiserede i fedtoplagring. Fedtdepotets størrelse er bestemt af arvelige faktorer, fødetilbud og hormonale faktorer. Fedtet beskytter mod traumer og kulde. 9

10 Fiksering Fiksering af væv finder oftest sted øjeblikkeligt efter, at det pågældende væv er fjernet fra sit oprindelige sted i kroppen.(3) Efter at vævet er fjernet fra sine naturlige omgivelser, sættes der gang i en skadegørende proces for vævets celler, da disse ikke længere har adgang til næring og ilt via blodet. Manglen på ilt er meget afgørende, da cellernes ATPproduktion falder meget i fraværet af ilt. ATP er med til at holde de pumpemekanismer, der opretholder cellernes Na + /K + balance og Ca + koncentration i gang. Uden opretholdelsen af Na + /K + balancen og Ca + koncentrationen svulmer cellerne op og brister. Ødelæggelse af cellen og dens lysosomer frigør lysosomernes hydrolytiske enzymer, der igangsætter autolyse af vævet. Endvidere vil der påbegyndes en forrådnelse af vævet grundet bakterier. Ved fiksering af væv går fiksativet ind og stabiliserer og immobiliserer vævets og cellens bestanddele. Alt efter hvilket fiksativ der vælges, opnås denne stabilisering og immobilisering forskelligt, da uidentiske fiksativer bevarer vævskomponenter og makromolekyler forskelligt. Derfor stilles der visse kriterier til valget af fiksativ alt efter hvad der ønskes at bevare.(6) Krav til fiksativer: 1. Det valgte fiksativ skal have den samme osmolaritet som vævet, så vævet ikke skrumper eller svulmer op. 2. Fiksativet må ikke opløse komponenterne i vævet, ej heller føje nye komponenter til vævet. 3. Fiksativet skal kunne uskadeliggøre svampe, vira og bakterier. 4. Fiksativet skal standse de autolytiske enzymer. 5. Fiksativet skal immobilisere og stabilisere komponenterne i vævet, så komponenterne kan modstå en videre behandling. 6. Reaktionen mellem fiksativet og vævet skal finde sted øjeblikkeligt. 7. Proceduren for fiksering skal være reproducerbar. Ud fra de givne kriterier vælges der gerne et fiksativ, der kan bevare de fleste komponenter og makromolekyler i vævet. Et sådan fiksativ kaldes også for et allround fiksativ. Da de fleste makromolekyler i væv er proteiner, er det derfor en fiksering af proteiner, der finder sted. 10

11 Til fiksering af proteiner kan der bruges gelerende og koagulerende fiksativer. Gelerende fiksativer Gelerende fiksativer fikserer proteinerne i vævet ved at danne tværbroer mellem aminosyrerne i polypeptidkæderne mellem et protein og proteinet ved siden af. Således opstår der et net af tværbroer, eller methenbroer mellem proteinerne, og disse låses fast eller gelerer i et netværk bestående af hydrofile polymere molekyler fastgjort ved tværbindinger, hvis masker er fyldt med vand. Gelerende fiksativer er additive, da fiksativets molekyler indgår i tværbroer ved en kemisk reaktion. Med additive gelerende fiksativer sker der ikke en ændring af proteinets struktur, idet proteinet ikke skal udfoldes for at danne tværbroer mellem aminosyrerne i proteinet og fiksativet. Dog kan dannelsen af tværbroerne forandre eller blokere for proteinernes egenskaber, da fiksativet kan binde til grupper, der indgår i epitoper og i de aktive kæder i enzymer. Ved additive gelerende fiksativer sikres der en god morfologi og en god stabilisering af vævet, således at vævets proteiner ikke koagulerer så meget under den efterfølgende vævsfremføring. Derudover er gelerende fiksativer for det meste reversible i deres fiksering. Det mest anvendte gelerende additive fiksativ er 4 % neutral phosphatbufferet formaldehyd (4 % NBF). Standardfikseringstiden for dette fiksativ er undersøgt til at være mellem 24 og 48 timer. Grundet gelerende fiksativers evne til at bevare proteinets tertiære struktur, epitoper og reaktive grupper vælges disse fiksativer, når der fx udføres immunhistokemiske farvninger. I immunhistokemisk sammenhæng(4) skal et fiksativ kunne: 1. Immobilisere antigener. 2. Bevare antigenisitet. 3. Bevare vævs- og cellestruktur. 4. Bevare permeabiliteten for immunreagenser (antistoffer mv.) På trods af en stabilisering i stort set oprindelig konformation påvirkes antigenisiteten for mange antigener negativt af gelerende fiksering. Da antigenisiteten påvirkes negativt, er det ikke optimalt for antistofferne, da de får sværere ved at binde til antigenerne. Der opstår en såkaldt maskering af epitoperne. 11

12 Koagulerende fiksativer Ved koagulerende fiksering bruges der ofte ethanol som fiksativ. Ved en koagulerende fiksering bevares proteinernes tertiære struktur ikke på samme måde som ved en gelerende fiksering. Her sker der en udfældning af proteinerne, og den tertiære struktur bevares ikke, men åbnes derimod, og proteinets reaktive og hydrofile grupper afdækkes. Under fremkomsten af større aggregater danner de hydrofile og reaktive grupper et netværk af tværbroer med hinanden. Under dannelsen af tværbroerne og fremkomsten af aggregater vil der ske en ændring og en destruktion af proteinets struktur og dermed også proteinets egenskaber. Udfældningen af proteinet giver en grovere morfologi af vævet, skrumpning af cellerne og en anden farvbarhed. Udover fiksering af proteiner, kan koagulerende fiksativer også fiksere nukleinsyrer. Hvor gelerende fiksativer primært bruges histologisk materiale, bruges koagulerende fiksativer til cytologisk materiale. Markørantigener (4) AE1/3 er en blanding af to mabs, der er rettet mod cytokeratiner (CK). AE 1 er rettet mod de fleste sure CK (CK10, 14,15, 16 og 19), hvor AE 3 er rettet mod de basiske CK (CK 1-8) CD34, også betegnet myeloid progenitor celle antigen, er et enkeltkædet transmembran glykoprotein. Funktionerne af CD34 er stort set ukendt, men nylige beviser foreslår en rolle for CD34 i celleadhæsion og inhibering af hæmatopoiese. CD34 findes i forstadier til erytrocytter, myoloide celler og lymfoide celler. CD34 findes også i endotelceller og ses som en moderat til stærk cytoplasmafarvning. CD 45, også betegnet leucocyt common antigen, er et membran glykoprotein og ses i næsten alle hæmopoietiske/lymfoide celler med undtagelse af erytrocytter, plasmaceller og megamakrofager. Farvningen ses som en stærk cytoplasmafarvning. CK7 tilhører en gruppe af proteiner af typen intermediært filament, som findes i alle epitelceller. Farvning med anti-ck7 ses som en moderat til stærk cytoplasmareaktion i cylinderepitelceller i sved- og talgkirtler. 12

13 KI-67 er et nukleoprotein, der udtrykkes i alle prolifererende celler. I benigne celleforandringer vil proliferationsraten være forholdsvis lav, hvor der derimod i maligne celleforandringer ses en høj proliferationsrate. Derfor ses der et højere antal ki-67-positive kerner ved præmaligne og maligne tilstande. Farvningen ses som en stærk kernefarvning. Melan-A (anti-mel-a) er en melanocytmarkør, betegnes også som et melanocytært differentieringsantigen, der påvises i aktiverede såvel som hvilende melanocytter samt pervaskulære celler ved en stærk cytoplasmareaktion. S-100 repræsenterer en multigen familie af sure calciumbindende proteiner. S-100 findes i cellekernen, cytoplasmaet og cellemembranen. S-100 er hos mennesket lokaliseret til kromosom 1q21p, der blandt andet omfatter en række gener, der koder for proteiner i det epidermale differentieringskompleks. Farvningen for S-100 ses som en stærk særskilt kerne- og cytoplasmareaktion. Anti-Vimentin (anti-vim) er et intermediært filament med strukturel funktion i cellens cytoplasma. Vimentin findes i næsten alle mesenkymale celler, fx fibroblaster og ses som en moderat til stærk cytoplasmareaktion. Immunhistokemi Immunhistokemi (IHC) er en teknik, der anvendes til diagnostiske formål. Den grundlæggende idé i IHC er lokalisering af antigener i vævssnit ved hjælp af specifikke primære antistoffer.(4)(7) Når antistof-antigen-bindingen sker, skal den visualiseres med en farvereaktion, som kan ses i et mikroskop. Det specifikke, primære antistof kan holde det signalgenererende molekyle og give direkte visualisering af bindingen. Alternativt kan indirekte visualiseringsmetoder forlange yderligere trin for at lokalisere det specifikke antistof og dermed skabe et signal. De mest almindelige indirekte metoder anvender et sekundært antistof rettet mod grupper af primært antistof og et enzym med et tilsvarende substrat-kromogen-system. Denne kombination resulterer i en farvet udfældning på stedet for den specifikke antistofbinding. Immunhistokemisk påvisning af antigener i histologisk og cytologisk materiale tillader en mere oplagt identifikation og klassifikation af strukturer i vævet, sygdomsprocesser og tumorer. 13

14 Ventana Benchmark XT Til udførelse af immunhistokemiske farvninger anvendes den fuldautomatisk maskine Benchmark XT, automated slide preperation system. (8) De forskellige moduler i maskinen, farvningsmodulet, reagens/bulkvæskemodulet og affaldsmodulet gør det muligt at optimere miljøet for automatiseret fremstilling og forarbejdning af IHC. Ved brug af bulkvæsker som EZ prep (Bilag 1), Reaction Buffer (Bilag 2), Liquid coverslip (Bilag 3) og CC1 (Bilag 4) og CC2 (Bilag 5), antistoffer, ultraview Universal DAB Detection Kit (UV DAB) (Bilag 6) og ultraview Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit (UV AP) (Bilag 7) gør Benchmark XT det muligt at fuldautomatisere immunhistokemiske farvninger. Figur 1 illustrerer Ventanas ICH-farvesmaskine, Benchmark XT (8) Teknikken er blevet optimeret gennem et præcist kontrolleret miljø. Farvningsmodulet indbefatter Air Vortex Mixere, Liquid Coverslip (LC), varmeplader og E-Bar barcode slide label systemet. Air Vortex Mixeren blander det vandige lag under det låg, som LC danner. Her mixes reagenser for at sikre ensartede reaktioner over hele overfladen af objektglasset. LC skaber et reaktionskammer på overfladen af hvert objektglas, der kontrollerer fordampning og beskytter vævet. På hver af de 30 objektglasholdere er der placeret varmeplader, der muliggør opvarmning af objektglassene under demaskering. De enkelte 14

15 varmeplader giver en meget præcis opvarmning over hele overfladen af hvert glas. Dette kaldes Heat Induced Epitop Retrieval(7)(9) og er med til at forårsage demaskeringen af antigenerne. E-Bar barcode slide label systemet muliggør patientidentifikation samt aflæsning af hvilke antistoffer, der skal bruges til farvning af vævssnittene. Selve princippet for immunhistokemiske farvninger afhænger af teknikken, nemlig direkte teknikker og indirekte teknikker. UV DAB og UV AP detekterer specifikke murine antistoffer bundet til et antigen i paraffinindstøbte vævssnit Komplekset visualiseres med hydrogenperoxidsubstrat og 3, 3 - diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) kromogen, der danner en brun udfældning og Fast Red, der danner en rød udfældning.. Farvningen består af flere trin, hvor reagenser inkuberes i bestemte tidsrum ved bestemte temperaturer. Ved afslutningen af hvert trin skylles snittene, for at fjerne overskydende materiale og påføre LC, der minimerer fordampning. Efter montering af dækglas kan snittene vurderes med et mikroskop. Figur 2 illustrerer den indirekte metode brugt ved IHC, UV DAB, Aarhus Universitetshospital, Tage- Hansens Gade. (Bilag 6) 15

16 Figur 3 illustrerer den indirekte metode brugt ved IHC, UV AP Aarhus Universitetshospital, Tage-Hansens gade. (Bilag 7) DNA-bevarelse Oprensning Metoden for DNA-oprensning består af 6 trin. (Bilag 8) 1. Opløsning af paraffin ved brug af Xylene. 2. Prøven lyseres under denaturerende betingelser med proteinase K 3. n ubation ved C gør formalintværbindingerne reversible 4. Binding af DNA til en membran og fjernelse af urenheder. 5. Resterende urenheder vaskes væk 6. Opsamling af rent, koncentreret DNA Kittet er optimeret til oprensning af DNA fra formalinfikserede vævssnit. Det bruger veletableret DNA mikroteknologi til oprensning af blandt andet genomisk DNA fra små vævsprøver. Specielt optimerede lyseringsbetingelser tillader, at genomisk DNA effektivt kan oprenses fra væv uden behov for inkubation natten over. Inkubation ved en forhøjet temperatur efter tilsætning af proteinase K fjerner delvist formalintværbinding af det frigivne DNA for at forbedre udbyttet af DNA-resultater i efterfølgende assays. Graden af 16

17 fragmentering afhænger af typen og alder af prøven, valget af fiksativ og varigheden af fikseringen(10)(11). PCR Polymerase Chain Reaction, PCR, er en enzymatisk teknik til opformering af DNA in vitro. På mindre end en dag kan man mangedoble få DNA-strenge til milliarder af DNAstrenge.(11)(12) Princippet i PCR er en eksponentiel opformering af et DNA-område, der på forhånd er bestemt, også kaldet target-dna. Ved hjælp af forskellige reagenser blandes en Mastermix, bestående af bufferkomponenter, target-dna, DNA-polymerase, nukleotider til DNA (dntp) og primere. PCR-reaktionen muliggøres ved at udsætte blandingen for forskellige temperaturer i det, der kaldes cyklusser. PCR er en reaktion der gennemgår x antal cyklusser, hvor hver cyklus består af 3 trin. 1. Denaturering af target-dna ved - C. 2. Annealing af primere til de nu to template-strenge ved a - C. 3. DNA-syntese ved C. For hver cyklus fordobles mængden af DNA indtil reaktionen er forløbet ved sidste cyklus. Ved Multiplex PCR er der tilsat mere end et primerpar med henblik på at opformere flere DNA-sekvenser. Kapilærgelelektroforese QIAxcel systemet anvender kapilærgelelektroforese, som muliggør hurtig adskillelse af nukleinsyrer baseret på deres størrelse (Bilag 9). Til forskel fra den traditionelle agarosegelele troforese, er ads illelsen udført i et apillærrør i en færdigstøbt gel Hver prøve indlæses automatisk i et individuelt apillærør og tilføres spænding De negativt ladede nukleinsyrer vandrer gennem kapillærrøret til den positivt ladede ende i gelen. Mens nukleinsyrerne vandrer, passerer de en detektor som detekterer nukleinsyrernes fluorescerende signal. En fotomultiplikatordetektor konverterer signalet til data, der overføres til en tilkoblet computer til yderligere behandling ved hjælp ved hjælp af QIAxcel ScreenGel software. Dette finder sted i apparatet QIAxel Advanced. 17

18 Til udførelse af kapilærgelelektroforese anvendes to gelmarkører. QX Alignement Marker (AM) og QX DNA Size Marker (SM). AM benyttes som en markør for gelens øvre og nedre grænser for detektion af fragmentstørrelser. SM benyttes som en størrelsesmarkør. Ud fra størrelsesmarkørens bånd an man vurdere størrelsen på det opformerede DNA s fragmenter. Materialer Prøvemateriale: Hud udtaget fra raskt bryst ved brystformindskende operation. (Bilag 10) Immunkontroller: M1 kontrol Naevus kontrol Apparatur til klargøring af snit: Vævsfremføringsmaskine: Vacuum Infiltration Processor (VIP) 2000 (Bilag 11) Indstøbningsmaskine: Tissue Tek TEC TM 5 Tissue Embedding Console System - Sakura Rotationsmikrotom: MICROM HM360 Apparatur til immunhistokemisk farvning: Ventana Benchmark XT Antistoffer: Anti-Ki-67: cell marque ref. Nr. 275R-16 (lotnr D) (Bilag 12) Anti-Melan-A: cell marque ref. Nr. 281M-86 (lotnr D) (Bilag13) Anti-S-100 DAKO ref. Nr. Z0311 (lotnr ) (Bilag 14) Anti-CD45 DAKO ref. nr. M0701 (lotnr ) (Bilag 15) Anti-CD34 Immunotec ref.nr. PN 1M0786 (lotnr. 19) (Bilag 16) Anti-CK7 DAKO ref.nr. M7018 (lotnr ) (Bilag 17) Anti-AE1/3 DAKO ref.nr. M3515 (lotnr ) (Bilag 18) 18

19 Anti-Vimentin Ventana ref.nr (lotnr ) (Bilag 19) Apparatur til HE-farvning: Combitec Slide Stainer 4009 Histolab products (NBG)(Bilag 20) Tissue Tek Prisma inkl. Heating station + Tissue Tek Glas Sakura (THG)(Bilag 21) Apparatur til DNA-oprensning: Heraeus Pico 17 centrifuge Thermo Scientific Heraeus Pico 21 centrifuge Thermo Scientific Thermomixer comfort 1,5 ml Eppendorf Heidolph Reax control (mixer) Buch & Holm A/S Apparatur til OD-måling (Optimal Density): Nanophotometer TM Implen Apparatur til Multiplex PCR: Minister silverline (minicentrifuge) VWR CapsuleFuge PMC 060 Tomy Biometra T3000 Thermocycler Apparatur til gelelektroferese: QIAxel Advanced Qiagen QIAxel ScreenGel, software program tilknyttet QIAxel Advanced Qiagen. Apparater til scanning og scoring: Hammamatsu NanoZoomer 2,0HT Softwareprogram tilknyttet NanoZoomer: NanoZoomer Digital NDP viewer Jf. Bilag 22 for oversigt over reagenser og utensilier 19

20 Metode Indsamling og klargøring af prøvemateriale Efter aftale med Plastikkirurgisk Afdeling, Afdeling Z, på Aarhus Universitetshospital Nørrebrogade, leveres et ufikseret hudstykke fra brystet. Dette hudstykke udskæres i seks dele, og hver del fikseres i 4 % NBF til tiderne 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer. For hver tid fikseres tre hudstykker for at sikre nok prøvemateriale. Denne proces udføres af samme person for at sikre ensartethed i udskæring. Vævsfremføring og indstøbning: De fikserede hudstykker fremføres i VIP 2000 og paraffinindstøbes efterfølgende. I vævsfremføringen fikseres hudstykkerne i 4 % NBF i yderligere 2½-3 timer, før vævet udsættes for dehydrering i stigende procenter alkohol (fra 70 % til 99 % ethanol). Til sidst infiltreres vævet med paraffin. Efter vævsfremføringen indstøbes vævet i paraffin. For at vævsfremføringen af de korteste fikseringstider (3, 6 og 12 timer) kunne lade sig gøre, blev der inddraget tre VIP 2000 maskiner til forsøget. Mikrotomi af prøve De paraffinindstøbte blokke med de forskellige fikseringstider skæres ved hjælp af en rotationsmikrotom med en tykkelse på 3µm. Først skæres et snit fra 1. niveau fra hver af de seks blokke til HE-farvning. Dernæst skæres otte snit fra 1. niveau til immunhistokemisk farvning. Inden skæring af snit til oprensning af DNA rengøres arbejdspladsen og instrumenter i henhold til protokollen for mikrotomi til DNA- og RNA-ekstraktion (Bilag 23). Herefter skæres seks snit med en tykkelse på 10 µm fra 2. niveau til oprensning af DNA. De seks snit fra hver fikseringstid overføres til hver deres eppendorfrør. Efterfølgende skæres et snit fra 3. niveau fra hver af de seks blokke til HE-farvning. Dette gøres for at se, om der er forskel. Til slut skæres igen otte snit til immunhistokemisk farvning fra 3. niveau. Denne proces udføres af samme person at sikre ensartethed i mikrotomi af snit. Trods udskæring af tre hudstykker og indstøbning i tre blokke til hver fikseringstid, er det kun muligt at få snit fra et niveau for fiksering ved 24 timer. 20

21 Kontroller Der medtages en multiblokkontrol (M1) på alle objektglas med væv, der skal farves med immunhistokemiske teknikker (IHC). Multiblokken, der indeholder vævsstykker fra pancreas, appendix, tonsil og hepar, er en positiv kontrol. Mindst ét af vævstykkerne i denne blok er positiv for anti-ae 1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki-67, anti-s- 100 og anti-vim, og alle vævsstykker er negative for anti-mel-a. Den positive kontrol sikrer, at den immunhistokemiske farvning er optimal, og at der ikke opnås falske negative resultater. Den negative kontrol sikrer, at der ikke opnås falske positive resultater. Ligeledes medtages en naevuskontrol på objektglassene. Denne kontrol indeholder et hudstykke med modne og aktive melanocytter, og er en positiv kontrol for anti-mel-a og en negativ kontrol for de resterende antistoffer. HE-farvning Ved HE-farvning af de skårne snit blev der brugt to farvemaskiner. Snittene med fikseringstiderne 48 og 72 timer blev farvet på den semiautomatiske farvemaskine Combitec Slide Stainer 4009 efter at have stået i varmeskab i 15 min. Snittene med fikseringstiderne 3, 6, 12 og 24 timer blev farvet på den fuldautomatiske farvemaskine Tissue Tek Prisma inkl. Heating station + Tissue Tek Glas fra Sakura. Immunfarvning Snittene, der skal immunfarves, anbringes i varmeskab ved 60⁰C i 60 min. for at tørre disse og fastsætte vævssnittene til objektglassene. Herefter placeres objektglassene på Ventana Benchmark XT, hvor der farves med antistofferne anti-ae 1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki-67, anti-mel-a, anti-s-100 og anti-vim. For at sikre ensartethed af farveproceduren, vil placeringen foregå således, at vævene på objektglassene, der skal farves med samme antistof, farves på samme tidspunkt. Der bruges to forskellige visualiseringskit under immunfarvningen. Chromogenet DAB og enzymlabelen, Horse Radish Peroxidase (HRP) bruges til at visualisere anti-ae 1/3, anti- CD34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki-67, anti-s100 og anti-vimentin. Chromogenet Fast Red TR/Naphthol-AS-MX Phosphat (Fast Red TR) og Alkalisk Phosphatase (AP) bruges til at visualisere anti-mel A. 21

22 Efter farvning vaskes snittene i rindende varmt vand, herefter dehydreres de i stigende % ethanol, hvorefter de tørres og får lagt dækglas på. Scanning af snit De farvede snit, HE såvel som IHC, scannes ved brug af NanoZoomer 2,0HT. Softwareprogrammet NanoZoomer Digital NDP viewer, der er tilknyttet scanneren, gør det muligt at vurdere farvning af snittene på en computer i stedet for et mikroskop. Før scanning af snittene fjernes dækglaskanter, der overskrider objektglassets kanter, med en skalpel, og dækglassets overflade pudses for at fjerne fedtpletter. Scoring af immunfarvningerne Ved scoring af immunfarvningerne er der taget udgangspunkt i Nordiqcs kriterier for optimal farvning med nedenstående antistoffer. I henhold til kriterierne scores de farvede snit ud fra farvelokalisation og farveintensitet. Da ikke har opstillet kriterier for optimal farvning af alle af de nedenstående antistoffer, er oplysningerne indhentet fra datasheets om det pågældende antistof fra hjemmesiden Da der ikke opstilles kriterier for Good, Borderline og Poor på rask hud fra Nordiqc, vurderes disse kriterier på baggrund af sammenligning af egne snit: Good: - En moderat til stærk farvning Borderline: - Moderat farvning evt. med let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor: - Ingen til svag farvning med uspecifik farvning. Alle billeder i de kommende skemaer er immunkontroller, farvet sammen med snittene med fikseringstiderne 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer. Immunkontrollerne viser den optimale farvning og lejring af de otte antistoffer anti-ae 1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki-67, anti-melan-a, anti-s-100 og anti-vimentin. 22

23 Tabel 1) Anti-AE1/3: Moderat til stærk cytoplasmareaktion i plade- og cylinderepitelceller. 10 X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 23

24 Tabel 2) Anti-CD34: Moderat til stærk cytoplasmareaktion med fremhævelse ved membranen på næsten alle endotelceller i alle væv.10 X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 24

25 Tabel 3) Anti-CD45: Stærk membranfarvning i de normale lymfocytter. 10 X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 25

26 Tabel 4) Anti-CK7: Moderat til stærk cytoplasmareaktion i cylinderepitelceller i sved- og talgkirtler. 10 X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 26

27 Tabel5) Anti-Ki-67: Stærk kernefarvning i prolifererende basale og parabasale celler i flerlaget pladeepitel. Ingen eller svag baggrundsfarvning. 10 X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 27

28 Tabel 6) Anti-Melan-A: Stærk cytoplasmafarvning i melanocytter i basalmembranen evt. med brune udløbere til omkringliggende celler. 10X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 28

29 Tabel 7) Anti-S100: Stærk særskilt kerne- og cytoplasmafarvning i de normale melanocytter og i de myoepiteliale celler i svedkirtlerne i huden. Ingen farvning i pladeepitelceller. Stærk særskilt kerne- og cytoplasmareaktion i fedtceller og makrofager. 10X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 29

30 Tabel 8) Anti-Vimentin: Moderat til stærk farvning af cytoplasma i næsten alle endotelceller og fibroblaster. 10 X Appendix Tonsil Hepar Pancreas 30

31 Scoringen af immunkontrolsnittene er fremkommet ved konsensus blandt de projektansvarlige. Grænsen for en acceptabel farvning af antistofferne går ved scoren Good, alt under denne score forkastes. Semi-kvantitativ scoring af vævsmorfologien ud fra HE-farvningerne Ved scoring af snittene til HE-farvningen lægges der vægt på vævsmorfologien, skrumpningen af celler og kerner i epitelet samt skrumpning af celler, kerner og strukturer i bindevævet De HE-farvede snit kan inddeles i tre vurderinger i henhold til vævsarkitekturen: Poor: Størstedelen af kernerne i overfladeepitel er ikke velbevarede og cellelagene er ikke afgrænset og usammenhængende i bindevæv. Borderline: Størstedelen af kernerne i overfladeepitelet er velbevarede og cellelagene er let afgrænsede og tydelige i bindevæv Optimal: Størstedelen af kernerne i overfladeepitelet er velbevarede og cellelagene er afgrænsede og tydelige i bindevæv. Ekstern vurderingen af farvede snit Som en ekstern vurdering af de farvede snit har klinisk professor i patologi og overlæge dr. Med. Torben Steiniche indvilliget i at score disse efter ovenstående kriterier. Torbens scoring sammenlignes med den scoring, vi selv har fortaget for at se, om der er uoverensstemmelse mellem de to scoringer i vurdering af vævsmorfologien ved HEfarvning og farvekvaliteten ved IHC-farvning. Torben Steiniches scoring er baseret på en samlet vurdering af snittene. Således ses kun et resultat for hver fikseringstid, da der ikke er blevet taget hensyn til de forskellige niveauer i vævssnittene. Endvidere er denne scoring blindet med hensyn til fikseringstider for at undgå prædetermineret scoring. DNA-oprensning Til oprensning af DNA fra det fikserede og paraffinindstøbte væv bruges oprensningskittet QIAamp DNA FFPE Tissue Kit fra Qiagen.(Bilag 8) Efter oprensningen bestemmes koncentrationen af DNA ved at måle absorptionen ved 260nm i IMPLEN nanophotometer. 31

32 Dette foregår ved at udvælge en hætte, som kan indeholde 4 µl prøvemateriale. Apparatet nulstilles med ATE Buffer. Efter hver måling skal hætten tørres af med en cellestofserviet. Herefter kan prøvematerialet afpipetteres over i hætten, en prøve ad gangen. Der oprenses DNA fra 3,6,12,24,48 og 72 timer to gange for at lave en dobbeltbestemmelse. Denne proces udføres af samme person at sikre ensartethed i oprensning og koncentrationsmåling af DNA. Multiplex PCR Ved fremstilling af PCR mix ganges reagensernes mængder med antallet af PCR-prøver. Da der medtages en positiv og negativ kontrol er der 14 prøver, hvor der udføres multiplex PCR. (24) Primerne er en blanding af 5 primerpar, der er designet således at de viser fragmenter af størrelserne 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp og 600bp(Bilag 25). Den positive kontrol indeholder DNA fra en blodprøve, da dette er det rene DNA, der kan oprenses. Den negative kontrol indeholder miliq H 2 O, da denne ikke indeholder PCR mix, DNA fra prøverne. Den positive og den negative kontrol tilsættes de respektive rør. PCR-rørene anbringes i Biometra T3000 fra Thermocycler, hvor det oprensede DNA amplificeres (Bilag Bilag 26) Gelelektroforese Til udførelse af kapilærgelelektroforese anvendes apparatet QIAxcel Advanced fra Qiagen. Softwareprogammet QIAxel ScreenGel tilknyttet QIAxcel Advanced tillader, at man kan vurdere kapilærgelelektroforesen på en computer. (Bilag 9) Inden udførelsen af gelelektroforesen loades PCR-produkterne og en gelplade på apparatet. Der loades ligeledes QX Alignement marker samt QX DNA Size Marker. Herefter startes apparatet og afpippetteringen af reagenserne til gelelektroforesen påbegyndes automatisk. Slutprodu tet viser et billede af DNA ets fragmentering 32

33 Resultat På følgende sider ses scoringsskemaer med billeder af HE-farvninger og immunfarvninger, der viser, hvordan scoringen er foretaget. Ind imellem ses skema med oversigt over alle scoringer ved HE- og immunfarvninger. Der henvises desuden til metodeafsnittet om scoring af HE- og immunfarvninger. 33

34 Fikseringstidens påvirkning på HE-farvning Oversigt 2,5X Scoring for HE Optimal Close-up, 5X Tabel 9) Optimal: Størstedelen af kernerne i overfladeepitelet er velbevarede og cellelagene er afgrænsede og tydelige i bindevæv. Oversigt, 2,5X Scoring for HE Borderline Close-up, 10 X Tabel 10) Borderline: Størstedelen af kernerne i overfladeepitelet er velbevarede og cellelagene er let afgrænsede og tydelige i bindevæv 34

35 Scoring for HE Poor Oversigt, 2,5 X Close-up, 10 X Tabel 11) Poor: Størstedelen af kernerne i overfladeepitel er ikke velbevarede og cellelagene er ikke afgrænset og usammenhængende i bindevæv. Skema for scoring af HE-farvninger Niveau 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer 1 O O O P B/O 3 B O O O P P Tabel 12) viser en oversigt over scoringer af HE-farvninger foretaget af de ansvarlige for projektet. B/O betyder at vurderingen er på grænsen mellem Optimal og Borderline, men fokus på Borderline. Fiksering ved 24 timer er markeret med orange. Niveau 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer 1 B O B P P 3 B O B B B B Tabel 13) Viser en oversigt over scoringer af HE-farvninger foretaget af klinisk professor i patologi og overlæge dr. Med., Torben Steiniche. Fiksering ved 24 timer er markeret med orange. 35

36 Fikseringstidens påvirkning på immunhistokemiske farvninger Optimal (O) - 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En moderat til stærk cytoplasmareaktion i epitelceller Scoring for anti-ae 1/3 Good (G) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor Tabel 14) viser scoring af immunfarvning ved anti-ae1/3 36

37 Optimal (O): En moderat til stærk cytoplasmareaktion med fremhævelse ved membranen på næsten alle endotelceller i alle væv. Scoring for anti-cd34 Good (G) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor Tabel 15) viser scoring af immunfarvning ved anti-cd34 37

38 Optimal (O) - 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En stærk membranfarvning i de normale lymfocytter. Scoring for anti-cd45 Good (G) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor Tabel 16) viser scoring af immunfarvning ved anti-cd45 38

39 Optimal (O) - 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: Moderat til stærk cytoplasmareaktion i cylinderepithelceller i sved- og talgkirtler. Scoring for anti-ck7 Good (G) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor Tabel 17) viser scoring af immunfarvning ved anti-ck7 39

40 Optimal (O) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En stærk kernefarvning af prolifererende basale og parabasale celler i flerlaget pladeepitel. Scoring for anti-ki-67 Good (G) 10X. Fikseret i 12 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline Poor Tabel 18) viser scoring af immunfarvning ved anti-ki-67 40

41 Optimal (O) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: Stærk farvning af melanocytter cytoplasma i basalmembranen med evt. brune udløbere til omkringliggende celler. Scoring for anti-mel-a Good (G) 10X. Fikseret i 72 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 12 timer, niveau 1: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor (P) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: Ingen til svag farvning med uspecifik farvning. Tabel 19) viser scoring af immunfarvning ved anti-mel-a 41

42 Optimal (O) 10X. Fikseret i 72 timer, niveau 1: En stærk særskilt kerne- og cytoplasmafarvning i de normale melanocytter og i de myoepiteliale celler i svedkirtlerne i huden. Ingen farvning i pladeepitelceller. En stærk særskilt kerne- og cytoplasmareaktion i fedtceller og makrofager. Scoring for anti-s100 Good (G) 10X. Fikseret i 24 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor (P) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Ingen til svag farvning med uspecifik farvning. Tabel 20) viser scoring af immunfarvning ved anti-s

43 Optimal (O) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En moderat til stærk farvning af cytoplasma i næsten alle endotelceller og fibroblaster. Scoring for anti-vimentin Good (G) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline Poor Tabel 21) viser scoring af immunfarvning ved anti-vim. 43

44 Skema for scoring af immunhistokemiske farvninger 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer Anti-AE1/3 Niveau 1 O O G G G Niveau 3 O Kunne ikke scores, pga. dårlig billedkvalitet O O G/B B/G Anti-CD34 Niveau 1 G G G/B B B Niveau 3 G B G G/B B B Anti-CD45 Niveau 1 O O B/G G B Niveau 3 O G O G B B Anti-CK7 Niveau 1 O O O G B Niveau 3 G O O O G B Anti-Ki-67 Niveau 1 O O G O G Niveau 3 O G G G G G Anti-Mel-A Niveau 1 G O/G B B B Niveau 3 G G B B P B Anti-S100 Niveau 1 O G G B B Niveau 3 O G G G B P Anti-Vimentin Niveau 1 O O G G G Niveau 3 O G G G G G Tabel 22) viser en oversigt over scoringer af immunfarvninger foretaget af de projektansvarlige. Fiksering ved 24 timer er markeret med orange. Snit med dobbeltscoring er markeret med grøn bogstavet der står først, fx B/G, indikerer at der lægges vægt på scoren Borderline frem for Good. 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer Anti-AE1/3 G G O O G B Anti-CD34 B O G O G G Anti-CD45 G O G G G G Anti-CK7 G B G G G B Anti-Ki-67 B G B O G B Anti-Mel-A O O B B B G Anti-S100 G O G O B B Anti-Vimentin O G O G G G Tabel 23) viser en oversigt over scoringer foretaget af klinisk professor i patologi og overlæge dr. Med., Torben Steiniche. Scoringen for et antistof gælder begge niveauer i vævet. Fiksering ved 24 timer er markeret med orange. 44

45 ng/µl Resultat for DNA-bevarelse fragmentering og kapilærgelelektroforese. Skema for OD-måling 3 timer 6 timer 12 timer 24 timer 48 timer 72 timer OD-måling, ng/µl 1. oprensning , ,5 2. oprensning , Tabel 24) viser en måling af Optimal Density, ng/µl, for det oprensede DNA ved de forskellige fikseringstider OD-måling, DNA-mængden ,5 18,5 21, timer 12 timer 24 timer 48 timer 72 timer 1. oprensning 2. oprensning Figur 4) viser sammenhængen mellem fikseringstid og DNA-koncentrationen 45

46 Fikseringstidens påvirkning på DNA-bevarelse. Figur 5) illustrerer en kapilærgelelektroforese. For hver fikseringstid er der oprenset DNA to gange, for at lave dobbeltbestemmelse på DNA-fragmentering. Dette vises ved at sætte tallet 1 og 2 efter den enkelte fikseringstid i navngivning af prøven i skemaet. På gelbilledet ses 2 grønne markørlinjer, QX Alignement Marker, der viser den nedre (15 bp) og øvre (1 kb) grænse for fragmenternes størrelse. Søjle 1 viser QX Size Marker, der for hver 50 bp laver et bånd, således man kan aflæse DNA fragmenternes størrelse. Søjle 2-13 viser det opformerede DNA s fragmentstørrelser, hvor fi sering ved 3 timer ses først og fi sering ved 72 timer ses sidst.. Søjle 14 viser den positive kontrol, som indikerer, at Multiplex PCR-reaktionen er forløbet korrekt. Søjle 15 viser den negative kontrol, som indikerer, at multiplex PCR-reaktionen er forløbet korrekt. 46

47 Diskussion Formålet med dette professionsbachelorprojekt var at undersøge, om svartiden kunne reduceres ved at forkorte fikseringstiden, således at kvaliteten af vævsmorfologien af HEfarvningerne og de immunhistokemiske farvninger ikke forringes. Endvidere blev det undersøgt, om fikseringstiden har indvirkning på DNA-bevarelsen, da molekylærbiologiske analyser i stigende grad anvendes til diagnostik og valg af behandling indenfor patologien I de nedenstående afsnit vil jeg redegøre for de valg, vi har taget gennem projektforløbet, betydningen af disse valg samt hvilke fejlkilder, der opstod og en diskussion af disse. Her vil jeg diskutere mine resultater og metoder i henhold til min problemformulering og andre undersøgelser omkring fikseringstidens betydning for immunhistokemi og molekylærbiologiske metoder. Sammenligning af resultater Fikseringstidens indflydelse på vævsmorfologien vurderet ved HE farvning Der blev foretaget HE-farvninger på to snit fra hver fikseringstid, undtaget væv fikseret ved 24 timer. De to snit repræsenterer hvert sit niveau fra hver fikseringstid for at fastslå, om der var forskel på vævsmorfologien grundet fikseringstiden, da HE-farvningen er rutineanalyse på patologiske afdelinger. Denne farvning anvendes før andre farvemetoder(6) for at sikre et overblik over vævet, og derfor burde denne farvemetode også godkendes først ved ændrede fikseringstider. De HE-farvede snit blev scoret af de projektansvarlige og, som en blindet undersøgelse, af klinisk professor i patologi og overlæge dr. Med. Torben Steiniche, ud fra kriterier fastslået af de projektansvarlige. Herefter sammenlignes egne resultater, tabel 12, med resultater fra Torben Steiniche, tabel 13. Ved sammenligning af tabel 12 og 13 ses det, at de projektansvarlige er mere tilbøjelige til at give scoringen Optimal for de HE-farvede snit, uanset fikseringstid. Scoren Optimal blev i alt givet seks gange af de projektansvarlige i modsætning til Torben Steiniche, som kun gav scoren Optimal to gange. Torben har derimod givet scoren Borderline syv gange mod de projektansvarliges en gang. Derudover ses der enighed ved scoren af HE- 47

48 farvninger ved begge niveauer for fiksering ved 48 timer, 2. niveau for fiksering ved 72 timer og 1. niveau for fiksering ved 6 timer. De projektansvarliges scoring og forskellen i forhold til Torbens scoring af HE-farvninger kan skyldes begrænset erfaring og viden inden for dette område. Årsagen til forskellen kunne være, at de projektansvarlige startede med at score de immunfarvede snit, da antallet af immunfarvede snit oversteg antallet af HE-farvede snit, og på daværende tidspunkt virkede det som en god ide at få scoret de immunfarvede snit først. Generelt gælder denne regel ikke, da HE-farvning er den første farvning, der udføres på fikseret væv. Hertil kommer, at HE-farvede snit generelt er mere overskuelige end de immunfarvede snit, da HE-farvningen netop er en oversigtfarvning, der tillader et overblik over vævets morfologi. Umiddelbart ville det være nemmere for projektgruppen at score snit, der tillader os at få en forståelse for vævets opbygning og struktur for derefter at score de immunfarvede snit. Altså kan overgangen til immunscoringen være mere iøjnefaldende og have indflydelse på projektgruppens scoring, hvilket kan resultere i en mindre præcis score. På den anden side lægger scoringen for HE-farvning vægt på vævets strukturer frem for farveintensiteten af farvningen, som scoringen for immunfarvningen lægger vægt på. En årsag til, at de HE-farvede snit har opnået forskellige gradueringer kan være, at der blev inddraget to forskellige farvemaskiner til HE-farvningen. Snittene fikseret ved 72 og 48 timer er farvet på Combitec Slide Stainer 4009, og disse snit har fået den bedste score både hos projektgruppen og Torben Steiniche. Mens snittene med fikseringstiderne 24, 12, 6 og 3 timer, der er farvet på den fuldautomatiske farvemaskine Tissue Tek Prisma, generelt har fået en dårligere score hos gruppen og Torben Steiniche. Da der ikke er forskel på opløsningen af Eosin Y i begge farvemetoder, skyldes den bedre score sandsynligvis en bedre bevarelse af vævet gennem en længere fiksering. Ellers er forskellen på de to farvninger antallet af minutter, snittene er i hvert bad.(bilag 20) (Bilag 21) Der bruges også en ammoniakopløsning til blåning af Hæmatoxylinen på farvemaksinen på THG, hvor der kun bruges H 2 O på farvemaskinen på NBG. Desuden ses der en længere dehydrering ved farvemetoden på THG, og om dette kan have en yderligere koagulerende effekt på snittene fikseret ved korte fikseringstider, ved jeg ikke. Af ovenstående grunde kan HEfarvningerne for alle fikseringstiderne ikke sidestilles, da de ikke er blevet udsat for de samme betingelser ved farveproceduren. 48

49 Skal farvekvaliteten vurderes, kan begge farvemaskiner bruges, da begge HE-farvninger farver vævsstrukturerne efter forskriften. Jeg vurderer derfor, at scoringerne foretaget af Torben Steiniche vægter højest, da han besidder den største erfaring inden for scoringer af HE-farvning af hud. Af den grund er det interessant at rette fokus på netop Torben Steiniches scoring af HE-farvning for fiksering ved 24 timer. Da fiksering på patologiske laboratorier er standardiseret ved 24(- 48) timer, er det vedkommende, at netop farvningen for denne fikseringstid scores Borderline og dermed ikke betragtes som en optimal farvning. Herved opstår der et dilemma, da standardfikseringstiden skal forestille at give det bedste resultat ved farvning med HE. Men tabel 12 og 13 viser, at der opnås en mere optimal farvning med fiksering ved 48 timer. Ud fra dette vurderer jeg, at den optimale fikseringstid for væv med henblik på HE-farvning er 48 timer frem for standardfikseringstiden 24 timer. På den anden side kan scoren ved 24 timers fiksering måske forklares ud fra niveauet, fra hvilket dette snit blev skåret. Grundet materialemangel blev der kun skåret et snit fra 3. niveau til HE-farvning ved 24 timer. Dette snit kan være blevet skåret så dybt, at der ikke er sket en ordentlig fiksering af vævet. En anden mulig forklaring på den utilfredsstillende score kan være, at de autolytiske processer allerede var begyndt at forløbe inden vævet blev fikseret. Det viser sig, at der gik ca. 30 minutter fra at vævet var blevet udtaget fra kroppen til en egentlig udskæring af vævet fandt sted. Hans Lyon et al. opfordrer i Kompendium i Kemiske og Biokemiske Analyseprincipper(3) om at skære det netop udtagne væv i mindre stykker, ca. 3 mm, for derefter at udsætte vævet for afkøling for at hindre netop de autolytiske processer. Det udtagne væv befandt sig på køl, da undertegnede begyndte udskæring, men indtil da var det udtagne væv stadig i et stykke. Fra udskæringen af vævet fandt sted til igangsætning af fiksering med 4 % NBF må man regne med op til en times udsættelse for stuetemperaturer og atmosfærisk luft. Fikseringstidens indflydelse på farveintensiteten vurderet ved immunfarvning Der blev foretaget immunfarvninger på to snit fra hver fikseringstid, undtaget væv fikseret ved 24 timer. De to snit repræsenterer hvert sit niveau fra hver fikseringstid for at fastslå, om der var forskel på intensiteten af farvningerne i det fikserede væv. Disse snit blev scoret af de projektansvarlige og af klinisk professor i patologi og overlæge dr. Med. 49

50 Torben Steiniche ud fra kriterier fastslået af de projektansvarlige og Nordiqc. Herefter sammenlignes egne resultater, tabel 22, med resultater fra Torben Steiniche, tabel 23. Ved sammenligning af tabel 22 og 23 ses det, at Torben Steiniche generelt giver en højere score end de projektansvarlige. Tabel 22 illustrerer, at de projektansvarlige giver en optimal score i alt 23 gange i modsætning til Torben Steiniche, som scorer Optimal 12 gange, men da hver scoring gælder for begge niveauer i vævet, er scoren for optimal farvning givet 24 gange. Torben Steiniche har også givet scoren Good 48 gange mod de projektansvarliges 30 gange. Ved scoren Borderline har de projektansvarlige givet 19 snit denne score, hvorimod Torben Steiniche har givet scoren 24 gange. Scoren Poor er givet to gange for de projektansvarliges vedkommende, hvor Torben ikke har givet scoren til nogle af snittene. Projektgruppen har også scoret fem snit med en dobbelt scoring, da der opstod uenighed om disse snit (se tabel 22, felter markeret med grønt). Endvidere har projektgruppen ikke kunne score immunfarvningen AE 1/3 for fikseringstiden 48, 2. niveau, da billedkvaliteten for dette billede ikke muliggjorde en scoring. Denne forudsætning, at projektgruppen har scoret ved hjælp af billeder og Torben Steiniche har scoret ved hjælp af mikroskop, har højst sandsynligt også en indflydelse på scoringen. Da mange af billederne har haft en lettere forringet kvalitet, kan det have haft indflydelse på den dårligere score givet af projektgruppen. Da Torben Steiniche har haft det sande billede af snittene foran sig, har han mås e haft en bedre forudsætning for at score dem mere optimalt. I tabel 22 og 23 ses der en oversigt over den score, der er blevet givet hver fikseringstid ved de forskellige immunfarvninger. For at få et bedre overblik over immunfarvningerne, vil hver enkelt immunfarvning med hvert antistof gennemgås her. Ved immunfarvning med anti-ae 1/3 vurderes det af de projektansvarlige, at farvningerne ved alle fikseringstider, på nær 2. niveau fra fiksering ved 3 timer, kan accepteres ud fra de givne kriterier ved scoring af dette antistof fastslået i metodeafsnittet om scoring af IHC. Torbens score viser det samme, på nær hans scoring af immunfarvning med AE 1/3 ved tre timers fiksering, hvor begge niveauer er vurderet til at være Borderline. Herved opstår der, med god tilnærmelse, konsensus mellem de projektansvarliges og Torben Steiniches scoring. Jeg vurderer derfor, baseret på denne konsensus, at der kan farves med anti-ae 1/3 på væv fikseret ned til 6 timer. 50

51 Ved immunfarvning med anti-cd34 vurderes det af de projektansvarlige, at farvningerne ved fikseringstiderne 72, 48, 24 og 12 timer kan accepteres ud fra de givne kriterier fastslået i metodeafsnittet om scoring af IHC. Torben Steiniches scoring viser dog en udelukkelse af farvning med dette antistof ved 72 timer. Baseret på Torben Steiniches erfaring og ekspertise, vurderer jeg, at hans scoring har den største rigtighed, og at der kan farves med anti-cd34 ned til 3 timer. Grunden til denne uenighed mellem de projektansvarliges scoring og Torben Steiniches scoring, kan være den manglende erfaring i graduering af immunhistokemiske farvninger fra projektgruppens side. Ved immunfarvning med anti-cd45 vurderes det af de projektansvarlige, at farvningerne ved fikseringstiderne 72, 48, 24, 12 og 6 timer 1. niveau kan accepteres ud fra de givne kriterier fastslået i metodeafsnittet om scoring af IHC. Ud fra Torben Steiniches scoring af snittene kan anti-cd45 bruges til immunhistokemisk farvning af vævssnit fikseret helt ned til kun 3 timer, uanset niveau. Idet Torben Steiniche besidder den største erfaring, vægter jeg hans scoring højest. Ved immunfarvning med anti-ck7 vurderes det af de projektansvarlige, at farvningerne ved fikseringstiderne 72, 48, 24, 12 og 6 timer kan accepteres ud fra de givne kriterier fastslået i metodeafsnittet om scoring af IHC. Torben Steiniches scoring af farvning med anti-ck7 udelukker snittene med fikseringstiderne 48 og 3 timer. Der kunne stilles spørgsmålstegn ved Torben Steiniches vurdering af farvningen af vævssnit fikseret ved 48 timer ikke kan accepteres, mens farvningen af vævssnit fikseret ved 72 timer accepteres. Idet farvningen accepteres ved væv fikseret ved 72 timer burde farvningen også accepteres ved 48 timer. Grundet uoverensstemmelsen i Torben Steiniches scoring, vægter jeg de projektansvarliges scoring højest. Men da scoring af snit bygger på en subjektiv indstilling, er det derfor ikke muligt at komme med et endegyldigt rigtigt resultat. Ved immunfarvning med anti-ki-67 vurderes det af de projektansvarlige, at farvningerne ved fikseringstiderne 72, 48, 24, 12, 6 og 3 timer kan accepteres ud fra de givne kriterier fastslået i metodeafsnittet om scoring af IHC. Idet Torben Steiniche scoringer viser de samme resultater, opstår der konsensus mellem hans og de projektansvarliges scoringer. Baseret på denne konsensus, vurderer jeg, at der kan farves med anti-s-100 på væv fikseret ved 72, 48, 24 og 12 timer. Ved immunfarvning med anti-mel-a vurderes det af de projektansvarlige, at farvningerne ved fikseringstiderne 72 og 48 timer kan accepteres ud fra de givne kriterier fastslået i 51

52 metodeafsnittet om scoring af IHC. Torben Steiniches scoring viser de samme resultater, på nær hans scoring af farvningen ved tre timers fiksering, hvor begge niveauer er vurderet til at være Good. Eftersom der, med god tilnærmelse, er opstået konsensus mellem de projektansvarliges og Torben Steiniches scoringer, vurderer jeg, baseret på denne konsensus, at der kan farves med anti-mel-a på væv fikseret ved 48 og 72 timer. Ved immunfarvning med anti-s-100 vurderes det af de projektansvarlige, at farvningerne ved fikseringstiderne 72, 48, 24 og 12 timer kan accepteres ud fra de givne kriterier fastslået i metodeafsnittet om scoring af IHC. Idet Torben Steiniche scoringer viser de samme resultater, opstår der konsensus mellem hans og de projektansvarliges scoringer. Baseret på denne konsensus, vurderer jeg, at der kan farves med anti-s-100 på væv fikseret ved 72, 48, 24 og 12 timer. Ved immunfarvning med anti-vim vurderes der af de projektansvarlige, at farvningerne ved fikseringstiderne 72, 48, 24, 12, 6 og 3 timer kan accepteres ud fra de givne kriterier fastslået i metodeafsnittet om scoring af IHC. Idet Torben Steiniche scoringer viser de samme resultater, opstår der konsensus mellem hans og de projektansvarliges scoringer. Baseret på denne konsensus, vurderer jeg, at der kan farves med anti-vim på væv fikseret ved 72, 48, 24, 12, 6 og 3 timer. Ud fra sammenfatningen af de otte immunfarvninger ved forskellig fikseringstid vurderer jeg, ud fra de projektansvarliges scoring, at der opnås bedre resultater inden for IHC med væv fikseret ved 24, 48 og 72 timer. Ud fra Torben Steiniches scoring vurderer jeg, at der opnås de bedste resultater inden for IHC med væv fikseret ved 48 og 12 timer. Fikseringstidens indflydelse på DNA-bevarelse Der blev foretaget to oprensninger af DNA fra hver fikseringstid. Multiplex PCR blev foretaget med det oprensede DNA, hvorefter en udførelse af kapilærgelelektroforese fastlagde DNA ets fragmentering. Teorien(10)(11) omkring bevarelsen af DNA fra fikseret væv dikterer, at alderen, fikseringstiden og valget af fiksativ har indvirkning på størrelsen af DNA-fragmenterne, når der skal oprenses DNA. Teoretisk set burde DNA fra væv fikseret ved korte fikseringstider, så som 3, 6 og 12 timer, derfor være mindre fragmenteret end DNA fra væv, fikseret ved længere fikseringstider. Endvidere er koncentrationen af DNA i væv 52

53 fikseret ved kortere tider højere end væv fikseret ved længere tider. Dette betyder, at optimale betingelser for oprensning af DNA ville være at foretage en oprensning på frisk, ufikseret væv. Da dette ikke er muligt at udføre praktisk set, er man nødt til at acceptere de tilgængelige metoder, der er til bevaring af væv, hvilket i de fleste tilfælde er fiksering ved 4 % NBF. D P Jackson et al.(11) har i deres undersøgelse bevist, at der oprenses op til 40 gange så meget DNA ved frisk væv, frem for væv fikseret i 4 % NBF. Dog er der blevet indført Biobank(13)(14)(15) til netop sådanne formål. Biobanken sikrer blandt andet en hurtig nedfrysning af væv og cytologisk materiale til senere brug, men indeholder også paraffinindstøbt materiale. Nedfrysningen af væv tillader en nativ bevarelse af proteiner og strukturer af vævet. Tabel 24 og figur 4 understøtter teorien om, at frisk og ufikseret væv indeholder mest DNA, da der med god tilnærmelse ses en sammenhæng mellem fikseringstiden og mængden af DNA i vævet. Figur 5 illustrerer DNA-bevarelsen ved de forskellige fikseringstider, og i modsætning til teorien har fikseringstiden eller koncentrationen af DNA tilsyneladende ingen indvirkning på bevarelsen af DNA i vævet. Den eneste uregelmæssighed ses ved fikseringstiden 12 timer. Visualiseringen af båndene, der indikerer størrelsen af DNA-fragmenterne ved fikseringstiden 12 timer er ikke nær så tydelige som ved de andre fikseringstider. Båndene ved 12 timers fiksering ligger heller ikke på linje med de andre bånd for samme fragmentstørrelse, hvil et an indi ere en fejl i oprensningen af DNA et eller en ringe opformering af DNA et under PCR Med god vilje an båndene dog svagt anes, og dermed er der detekteret DNA-fragmenter på 400 og 600 basepar fra væv fikseret ved 12 timer. På baggrund af figur 5 vurderer jeg, at der kan udføres molekylærbiologiske metoder på væv fikseret i 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer. D P Jackson et al.(11) har i deres undersøgelse også bevist, at det DNA, der oprenses fra frisk væv, har en højere molekylevægt end formalinfikseret væv, hvilket betyder, at det ikke er nær så fragmenteret. Dette betyder, at der ved ingen, eller lavere fikseringstider, kan detekteres større grupper af basepar. Samtidig viste deres undersøgelse også, at en forlængelse af Proteinase K inkubationen på op til fem dage, kan give et større udbytte af DNA oprenset fra formalinfikseret væv. 53

54 Fikseringstidens betydning for HE- og immunhistokemiske farvninger Som tidligere nævnt vægter jeg Torben Steiniches graduering af HE- og de immunhistokemiske farvninger højest, da han er i besiddelse af erfaring og ekspertise. Men da hans scoringer ikke understøtter teorien om fiksering ved 24 timer som den optimale betingelse for videre behandling af væv, er jeg tilbøjelig til enten at vægte de projektansvarliges scoring højere end Torben Steiniches, eller vurdere, at udførelsen af projektet ikke understøtter andres undersøgelser omkring fiksering af væv med henblik på videre behandling. Ved HE-farvningen skal fikseringen af vævet stabilisere og bevare strukturerne og morfologien, samt bevare de enkelte celler i vævet, således at der ved HE-farvning skabes et realistisk overblik over vævets bestanddele i deres originale lejring. Derfor er det af afgørende betydning, at fikseringen standardiseres, således at der kan opnås et reproducerbart resultat hver eneste gang. Ifølge teorien omkring fiksering af væv er standardtiden for fiksering 24(-48), og med fiksering ved 24 timer skulle der efter sigende fås det bedste resultat. Jeg vurderer derfor at Torben Steiniches og projektgruppens resultater viser, at fiksering ved 48 timer giver den mest optimale HE-farvning. Ved immunhistokemiske farvninger skal fikseringen ikke kun stabilisere og bevare strukturerne i vævet. Fikseringen skal også kunne bevare antigenisiteten, således at denne ikke går tabt under fikseringen. Ved fiksering med 4 % NBF skaber fiksativet methenbroer, der maskerer antigenerne. Teoretisk set burde væv med en kortere fikseringstid end 24 timer derfor være mere modtagelig over for farvning med antistoffer, da der netop ikke er dannet den samme mængde af methenbroer, der maskerer antigenerne. Selvom dette burde være tilfældet, ses der generelt en dårligere farvning ved fikseringstiderne 3 og 6 timer, jf. tabel 22 og 23. Min vurdering af grunden til denne dårligere farvning tager udgangspunkt i demaskeringen af de aktive områder i antigener, nemlig epitoperne. Under demaskeringen af epitoperne varmes vævssnittet op for at springe methenbroerne. Hertil anvendes kogebuffere med forskellig ph for at optimere denne demaskering. Valget af ph og ionstyrke for disse buffere og kombinationen af HIER har en positiv indflydelse på demaskeringen og derved også farvningen med antistofferne. (4)(16). Idet vævet ikke er fikseret ordentlig, og som følge heraf ikke er stabiliseret ordentligt, beskadiger demaskeringen vævet mere end den genopretter. En anden grund til denne dårlige farvning ved fikseringstiderne 3 og 6 timer kunne være udsættelsen for et 54

55 koagulerende fiksativ i forbindelse med vævsfremføringen, hvor vævet fremføres i stigende procenter af ethanol. Da koagulerende fiksativer ikke bevarer proteinets tertiære struktur, er det ikke alle antistoffer, der kan binde sig til de nu blotlagte epitoper. Der kan også opstå uspecifik baggrundsfarvning og en dårlig vævsmorfologi(17). Omvendt er der også antistoffer, der farver optimalt ved en koagulerende fiksering(18), blandt andet CK og Vimentin(4) Da baggrundsfarvning ikke ses ved fiksering ved 24 og 48 timer, og da disse fikseringstider har opnået de bedste scorer ved IHC, vurderer jeg, at væv fikseret ved korte fikseringstider ikke opnår samme kvalitet ved immunhistokemiske farvninger som væv fikseret ved længere fikseringstider, så som 24 og 48 timer. Diskussion af metode I projektet har vi fra starten foretaget nogle valg, der begrænsede omfanget af forsøget. Fra starten ønskede vi at fortage undersøgelser på væv for at undersøge bevarelsen af antigenisiteten og DNA ved forskellige fikseringstider. Ønsket var også, at der skulle medtages væv fra mere end en patient, men tidsbegrænsningen afgjorde, hvad der var realistisk at nå. Derudover medtog vi kun normalt væv for ikke at komplicere scoringen af vores snit mere end højst nødvendigt. Beslutningen om at bygge forsøget på normalt væv, begrænsede antallet af muligheder for prøvemateriale. Derfor faldt valget af prøvemateriale på hud, da dette er et mere tilgængeligt stykke normalt væv end andet. Omvendt kunne undersøgelsen have været mere aktuel, hvis der også blev inkluderet unormalt væv, da undersøgelser på unormalt væv måske viser andre resultater ved ændrede fikseringstider, og endelig fordi at mange undersøgelser finder sted på grund af anormaliteter i væv. Da udskæringen af vævet fandt sted før fikseringen, kunne det også være interessant at undersøge større vævsstykker end det udskårne væv. Valget af analyser faldt på HE-farvning og immunhistokemiske farver, samt PCR, da HEfarvning i dag indgår som en rutinefarvning af væv, mens immunhistokemiske farvninger og molekylærbiologiske metoder benyttes oftere og oftere. Valget af antistoffer blev besluttet i samråd med vores kliniske underviser, Susanne Rønn Jakobsen og klinisk professor i patologi og overlæge dr. Med. Torben Steiniche med henblik på at finde antigener, der kan lokaliseres i hud. 55

56 Ved valget af scoringssystem blev der benyttet to systemer, et til HE-farvning og et til immunfarvninger. Begge systemer tager udgangspunkt i kriterier for graduering givet fra hvorefter de er tilpasset projektets opbygning. Scoringen af snittene, HEfarvede såvel som de immunfarvede, blev vurderet samlet og ublindet af gruppen for at opnå en større enighed blandt scoringen. På den anden side kan jeg nu se fordelen ved at have scoret de HE- og immunfarvede snit ublindet, antistof for antistof, idet der ikke opnås en forudindtaget opfattelse af de farvede snit på baggrund af viden om de enkelte farvningers fikseringstid. Undervejs i scoringsprocessen blev scoringssystemet ændret. Som følge heraf er scoringen foretaget af de projektansvarlige og Torben Steiniche ikke sket under de samme forudsætninger. Hvis projektgruppen havde indviet Torben Steiniche i de nye scoringssystemer, havde scoringsresultaterne måske set anderledes ud, da der ville have været en scoring for hvert niveau ved hver fikseringstid og for hvert antistof. Ved udarbejdelse af scoringssystemerne kunne projektgruppen med fordel have designet et system, der tilgodeså begge farvninger. Efter udførelse af begge farvninger er det blevet tydeligt for mig, at scoringen for immunfarvninger er ufuldstændig, da der ikke blev lagt vægt på fikseringens bevarelse af vævsmorfologien. Ved oprensning af DNA kunne vi have afprøvet en længere inkubation med Proteinase K for at se, om undersøgelsen foretaget af D. P. Jackson et al. også gør sig gældende for vores forsøg. Det kunne være interessant at undersøge hvor store fragmenter, der så kunne oprenses fra væv fikseret ved 24 timer. Endvidere kunne det også være vedkommende at undersøge, hvorledes fikseringstiden havde indflydelse på oprensning af RNA, da dette er et mere ustabilt molekyle end DNA. Til sidst kan der sættes fokus på, om man kan acceptere en dårligere IHC og morfologi ved HE-farvningen for en bedre DNA-stabilitet og et hurtigere pakkeforløb. Eller om man vil gå på kompromis med DNA-stabiliteten til fordel for en bedre kvalitet ved HE- og immunfarvning, og følge de nuværende metoder på PAI, Aarhus Universitetshospital. Endvidere skal der overvejes om en sådan ændring overhovedet kan implementeres uden forstyrrelse af den daglige arbejdsgang og effektivitet på afdelingen. Ifølge Torben Steiniche var der ikke et eneste snit, han ikke kunne stille en diagnose på, uanset den givne score. Derfor er det værd at overveje, om der skal laves om på proceduren 56

57 omkring fikseringen af histologisk materiale, så som små modermærker eller lignende størrelser væv. Konklusion Formålet med dette professionsbachelorprojekt var at undersøge, om svartiden kunne reduceres ved at forkorte fikseringstiden, uden at påvirke kvaliteten af de immunhistokemiske farvninger og vævsmorfologien af HE-farvningen ikke forringes. Endvidere var formålet at undersøge om fikseringstiden havde indvirkning på DNAbevarelsen, da molekylærbiologiske analyser i stigende grad anvendes til diagnostik og valg af behandling indenfor patologien. Jeg konkluderer, at fikseringstiden kan nedsættes med henblik på HE-farvninger, men at man skal være villig til at gå på kompromis med bevarelsen af vævet ved en kortere fikseringstid. I forbindelse med nedsættelsen af fikseringstiden vedrørende HE, konkluderer jeg også, at fikseringstiden kan nedsættes til 12, da HE ved 6 og 3 timer viser et uacceptabelt niveau. Jeg konkluderer, at fikseringstiden i nogle tilfælde kan nedsættes med henblik på immunfarvninger, men at man skal være villig til at gå på kompromis med farveintensiteten og bevarelsen af vævet ved en kortere fikseringstid. Dette kræver også en større undersøgelse af hvert antistof ved nedsatte fikseringstider for at kunne fastsætte en nedre grænse for fikseringstid ved hvert antistof. Jeg konkluderer også, at en forlænget fikseringstid ikke havde nogen synlig indvirkning på DNA-bevarelsen. Samlet set er det muligt at reducerer svartiden for HE- og immunhistokemiske farvninger og molekylærbiologiske metoder. 57

58 Perspektivering Fiksering af hud ved kortere tider har vist sig muligt med henblik på reducering af svartiden for DNA-bevarelse, HE- og immunfarvning. Mere interessant kunne det også være at udvide forsøget, så det indeholder flere elementer. Her tænker jeg på at undersøge, om ovenstående gælder for andre vævstyper end hud, og om det også gælder for normalt som unormalt væv. Det kunne også være interessant at undersøge, om dette også gør sig gældende for større vævsstykker end de udskårne, der ca. måler i cm 3*3*10/15mm. Endvidere kunne det være interessant at se effekten af en kortere fikseringstid på længere sigt. Og vigtigst af alt, kan det overhovedet integreres i afdelingens hverdag, kan det betale sig økonomisk set og har den enkelte patient gavn af den kortere svartid, som en kortere fikseringstid kan medføre. 58

59 Renferenceliste 1. Sundhedsstyrelsen. Pakkeforløb for modermærkekræft Tilgængelig fra: aspx 2. Sundhedsstyrelsen. Kræftplan II sundhedsstyrelsens anbefalinger til forbedringer af indsatsen på kræftområdet Tilgængelig fra: %20Sundhedsstyrelsens%20anbefalinger%20til%20forbedringer%20af%20indsats en%20paa%20kraeftomraadet.aspx 3. Lyon H, Prentø P. Kompendium i kemiske og biokemiske analyseprincipper. Bioanalytikeruddannelsen. Odontologisk Boghandel, 1 udgave, 2. oplag. København, Mogens Vyberg Anvendt immunhistokemi. Odontologisk boghandel Finn Geneser. Histologi på molekylærbiologisk grundlag. 1 udgave. 8. oplag Munksgaard Danmark. 6. K. Hallager et al. Farvning af celler og væv. VIA University College, Bioanalytikeruddannelsen. 2. udgave, november Shan-Rong Shi et al. Antigen Retrieval in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissues: An Enhancement Method for Immunohistochemical Staining Based on Microwave Oven Heating of Tissue Sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry Shuji Yamashita et al. Application of Heat-induced Antigen Retrieval to Aldehydefixed Fresh Frozen Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Mythily Srinivasan et al. Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids. American Journal of Pathology, Vol. 161, No. 6, December D P Jackson et al. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology Vivi Kielberg et al. DNA og RNA en håndbog. 1. udgave, 1 oplag. C. E. C Gads forlag

60 13. for%20forskningen_ aspx Katsura Emoto et al. Mechanisms of Heat-induced Antigen Retrieval: Does ph or Ionic Strength of the Solution Play a Role for Refolding Antigens? Journal of Histochemistry & Cytochemistry Volume 53(11), CM van der Loos. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry Hector Battifora el al. The Influence of Protease Digestion and Duration of Fixation on the Immunostaining of Keratins. A Comparison of Formalin and Ethanol Fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry,

61 Liste over bilag Bilag findes på vedhæftet CD bagerst i opgaven. 1. EZ Prep datasheet 2. Reaction Buffer datasheet 3. Liquid Coverslip datasheet 4. CC1datasheet 5. CC2 datasheet 6. UV DAB datasheet 7. UV AP datasheet 8. Håndbog om DNA-oprensning 9. Håndbog om QIAxcel Advanced 10. Billeder af prøvemateriale 11. VIP 2000 protokol 12. Anti-Ki-67 protokol 13. Anti-Melan-A protokol 14. Anti-S-100 protokol 15. Anti-CD45 protokol 16. Anti-CD34 protokol 17. Anti-CK7 protokol 18. Anti-AE 1/7 protokol 19. Anti-Vimentin protokol 20. Combitec Slide Stainer 4009 Histolab products (NBG) protokol 21. Tissue Tek Prisma inkl. Heating station + Tissue Tek Glas Sakura (THG) protokol 22. Reagenser og Utensilier 23. Mikrotomi til DNA- og RNA-ekstraktion 24. Skema over PCR mix 25. Fragmentstørrelse af DNA 26. Skema over PCR cyklusser 61