Kombineret cytogenetik og NGS ved maligne hæmatologiske sygdomme. 20. februar 2017

Transkript

1 Kombineret cytogenetik og NGS ved maligne hæmatologiske sygdomme 20. februar 2017 Maj Westman * og Mette Klarskov Andersen Kromosomlaboratoriet, Klinisk Genetisk Klinik Rigshospitalet *) Centrum för Molekylär Diagnostik (CMD), Lund

2 Baggrund Kromosomanalyse FISH NGS MDS MPN

3 Genetiske afvigelser ved maligne hæmatologiske sygdomme (erhvervede) Patogenese ved de maligne hæmatologiske sygdomme Founder mutationer Subklonale koopererende mutationer Udredning & diagnose (indkorporeret i sygdomsklassifikation og risiko-stratifikation) Prognostisk betydning Behandling specifik behandling målrettet den molekylære defekt: Tyrosinkinasehæmmere ved CML (kronisk myeloid leukæmi) A-vitaminsyre ved akut myeloid leukæmi med t(15;17) Indikation for knoglemarvstransplantation, palliation etc. Monitorering

4 Genetiske defekter i den maligne celle Kromosomforandringer Abnorm ekspression af gener Genmutationer DNA Transkriptionsfaktorer DNA methylering Regulering af kromatinstruktur Signal transduktion RNA splicing Cellecyklus kontrol og apoptose

5 Techniques to detect genetic abnormalities Technique Target Detectable type of abnormality G-banding All chromosomes Aneuploidy, translocations, deletions, amplification FISH Specific DNA targets Aneuploidy, Translocations (gene fusion) deletion, amplification DNA index Measurement of DNA content Abn. resolution Low Medium Sensitivity Low Medium Aneuploidy - High RT-qPCR Fusion transcript (RNA) Translocation (gene fusion) High High MLPA SNP/CGH array Targeted NGS Multiple specific DNA target sequences Simultaneous evaluation of tens of thousands of SNPs/DNA probes across the genome Targeted DNA sequences of multiple genes Copy number alterations (gain/loss) Copy number alterations (gain/loss) Aneuploidy LOH (SNP array only) High Very high Medium Medium Gene mutations Very high Medium/hig h Resolution: minimal size of lesion detected Sensitivity: minimal proportion of cells allowing for detection

6 Grov screening af genomet på enkeltcelleniveau Kan definere kloner og subkloner Kromosomforandringer karakteristiske/specifikke Foretages på dyrkede celler Kræver celler i deling (metafaser) Kan suppleres af andre analyser: FISH, PCR, array-baserede teknikker Kromosomanalyse

7 Kromosomforandringer Translokation Inversion Deletion Monosomi/trisomi Duplikation/ amplifikation

8 Translokationer ved malign hæmatologisk sygdom Et gens kodende sekvenser flyttes hen i nærheden af et regulatorisk element af et andet gen Fusion af to forskellige gener Fusionstranskript Overekspression Eksempel: Modne B-celle sygdomme (IGH) Abnormt protein Eksempler: akutte leukæmier, Kronisk myeloid leukæmi (CML)

9 21 t(8;21) AML 8 Gen Intron Exon RUNX1 (21q22) Gen RUNX1T1 (8q22) Fusions gen brudpunkt RUNX1- RUNX1T1 mrna Fusionstranskript Abnormt fusionsprotein

10 Cytogenetiske afvigelsers betydning for overlevelsen ved AML Inv(3) Grimwade et al. 2010

11 Grimwade et al. Blood 2010

12 Döhner et al, Blood 2017

13 Döhner et al, Blood 2017

14 Hvordan udføres kromosomanalyse? Prøven modtages Celledeling standses i prometafase Tilsættes dyrkningsmedie Deles i flere kulturer Cellerne høstes, tilsættes hypoton KCl dryppes på slides, farves Dyrkes i inkubator 2, 24 og 48 timer Slides scannes, metafaser opsøges og fotograferes

15 Kromosomer analyseres

16 Kromosomanalyse metafaseceller analyseres Strukturelle eller numeriske afvigelser? Simpel/kompleks karyotype Klon 2 eller flere celler med den samme strukturelle afvigelse eller gevinst af samme kromosom 3 eller flere celler med tab af samme kromosom 53~54,XY,+X,dup(1)(q32q42),+4,+6,+10,+21,+21, +3mar[cp14]/46,XY[11] Ploidy: 2n = 46 kromosomer Karyotypen skrives ifølge International System for human Cytogenetic Nomenclature (ISCN)

17

18 Begrænsninger ved konventionel kromosomanalyse Kun celler i deling kan undersøges ikke velegnet ved lavt mitotisk indeks Tidskrævende Normal karyotype inkonklusiv Uspecifikke forandringer påvises Kryptiske forandringer overses Lav sensitivitet ved monitorering af restsygdom Årsager til mislykket analyse Dårlig in-vitro vækst af ALL celler For lang transport tid Blod kontaminering For lidt materiale Ukorrekt håndtering af prøven (koagulering)

19 Fluorescence in situ hybridisering FISH

20 Hvad kan FISH? Detektere ubalance i genomet (aneuploidi/ er der for lidt eller for meget genetisk materiale?) Rearrangementer/translokationer (er der flyttet rundt på gener?) Lokalisere brudpunkter -Men man får kun svar på det, man spørger om!

21 FISH Visualisering af specifikke DNA sekvenser i morfologisk bevarede strukturer Baseret på evnen til at danne hybrider med komplementære DNA sekvenser Interfase- og metafaseceller

22 13q14 13q34 13 Deleteret 13

23 Typer af Prober Kromosom maleprobe (WCP) Centromer-specifik (aneuploidi) Subtelomer-probe Locus-specifik probe (translokationsprober)

24 Ph-positive by FISH

25 Dual color, break apart KMT2A (MLL) probe

26 Dual color, break apart probe KMT2A (MLL) rearrangements Normal Translocation KMT2A > 60 partner genes in ALL and AML t(4;11), t(6;11), t(9;11), t(10;11), t(11;19)

27 Anvendelse af FISH i hæmatologien Screening for specifikke abnormiteter ALL i NOPHO protokol, CLL, myelomatose på CD138-positive celler Monitorering/relaps undersøgelser For at be-/afkræfte mistænkt abnormitet fundet ved konventionel kromosomanalyse Mislykket kromosomanalyse

28 Screening for specifikke abnormiteter FISH myelomatose med plasmacelleidentifikation Targets: 1p/1q, 13q14/13q34, TP53, IGH IGH-positiv: t(4;14), t(11;14), t(14;16) etc. 1p/1q 1p(g) 1q21(r) 13q14 (r) TP53 (r) IGH Sonneveld et al, Blood 2016

29 FISH relapsundersøgelse Sent relaps af t(12;21) 2-årig dreng med t(12;21) positiv ALL I remission efter standard terapi 7 år senere hovedpine og svimmelhed CNS relaps? FISH på cytospin af spinalvæske med t(12;21) probe

30 70-årig mand, MDS? 5p15(g) 5q31 (r) 5p15(g) 5q31(r) 46,XY,der(1)add(1)(p11)add(1)(q41),-5,der(7)t(1;7)(p32;p11) Er 5q31/EGR1 involveret i der(1)?

31 FISH ved MDS? FISH prober: 5p15/5q31, cen 7/7q31, cen 8, TP53, 20q, cen Y Hvis man alene bruger det anbefalede FISH panel, ville et betydeligt antal komplekse karyotyper blive forkert rubriceret som good prognosis ifølge IPSS-R 45,XX,dic(3;18)(p11;q11),der(5)t(5;18)(q12;q12), der(7)t(7;8)(q36;q23),del(12)(p11)

32 65-årig mand med MDS Juni 2015: dry tap, intet aspirat til kromosomanalyse. Imprints af biopsi til FISH: 133/200 interfaseceller med 3 centromer 8 signaler svt. trisomi 8. 5p15/5q31, CEP7/7q31, TP53/17p13, 20q12 normale Trisomi 8? (IPSS-R intermediær/2) Juli 2015: Ny KM til kromosomanalyse Kompleks karyotype > 3 forandringer IPSS-R: poor/ ,XY,der(2)add(2)(p21)del(2)(q35),add(5)(p15.1),+8,+19,+mar[21]/46,XY[4]

33 MDS problematik i diagnostik Diagnostik vanskelig (morfologi, immunfænotype) MDS eller anden årsag til dysplasi eller cytopeni? Idiopatisk cytopeni af ukendt årsag (ICUS) 50% har normal karyotype (ingen cytogenetiske klonale afvigelser) Er der her undertyper, der har høj risiko for transformation til AML? MDS med del(5q) Lav risiko, men samtidig TP53 mutation resistens overfor lenalidomide

34 Mutationer hos patienter med MDS Diagnose: 2-3 driver mutations Overlap med AML Flere associeret med høj-risiko Papaemmanuil et. al., Blood 2013

35

36 . Endelig NGS

37 Sanger Hvad er Next-generation sequencing (NGS)? Teknikker som sekventerer millioner af DNA templates samtidigt (massive parallele sequencing) Sanger sekventering: en sekvens/prøve NGS NGS: tusinde eller millioner sekvenser/prøve

38 Ion Torrent teknologi Teknologi for NGS (next generation sequencing) som muliggør massiv parallel sekventering af f.eks DNA Sekventering udføres på et chip som indeholder millioner mikro-brønde Ion semiconductor sequencing DNA sekventering baseres på detektion af hydrogenioner Ion Torrent teknologien er enkel, hurtig og relativt billig

39 Ion Torrent work flow Dag 1-2 Dag 2-3 (natten over) Dag 3-4 Dag 4+ Variant allel frekvens

40 Targeted sekventering med Ion Torrent platform Genomisk DNA fra PB/BM amplificeres med specifikke primers (multiplex) Fragmenter mærkes med unikke barkoder og adaptors Fragmenter oprenses med Ampure Library kvantificeres med q-pcr

41 Template-præparering (Ion Chef) Templat-præparering udføres automatisk på Ion Chef instrumentet Library-fragmenter amplifieres klonalt på Ion Sphere partiklar ved hjælp af emulsion-pcr Ion Sphere partikler overtrukket med template appliceres på en Ion Chip og fordeles over chippens brønde ved hjælp af centrifugering

42 Teknologi 4 nukleotider strømmes sekventielt over chippens brønde En ph sensor er det eneste som bruges til detektion

43 Hvad er allelfrekvens? (VAF) VAF 50% Alle celler har mutationen VAF 25% 50% af cellerne har mutationen

44 Targeteret NGS panel med hyppigste MDS targets 60 patienter med persisterende cytopeni > 6mdr. (ICUS) 62% med 1 eller flere mutationer 7 patienter myeloid neoplasi (2 eller flere mutationer ved progression) so called ICUS patients

45

46 Targets for custom ampliseq panel for MDS Target gene Gene region IDH1 exon 4 IDH2 exon 4 TET2 all coding exons DNMT3A exon 7-23 ASXL1 exon 14 TP53 exon 3-11 NRAS exon 2,3 KRAS exon 2,3 CBL exon 8,9 JAK2 exon 14 GATA2 all coding CEBPA all coding RUNX1 exon 3-8 SF3B1 exon U2AF1 Hot spot region (p.s34, p.q157) SRSF2 Hot spot region (p.p95) ZRSR2 all coding exons EZH2 all coding exons SETBP1 exon 3 ETV6 all coding exons

47 Custom ampliseq panel for MDS Panel specifications MDS panel Target regions 21 Amplicon range bp Primer pools 2 Amplicons 280 Missed bp 0 Coverage 100% Size 38 kb

48 Set-up PGM: Custom ampliseq panel for MDS Technical/ quality parameters MDS panel Chip set-up Number of samples per chip TAT (theoretical) TAT (IRL) Uniformity (hvor godt et panel performer over hele target regionen) 318 chip 5-6 samples 5 days 7-28 working days 94% Average depth* Target base coverage (500X)* 100% *Coverage/dybde: det gennemsnitlige antal gange en base læses. Cancerdiagnostik: 500X

49 Custom ampliseq panel for MDS Mulige MDS patienter med normal cytogenetik Results parameter MDS panel Number of samples (Jan. Nov. 2016) 70 Number of patients with 1 mutation 28 (40%) Number of patients with 1 mutation 9 Number of patients with 2 mutations 8 Number of patients with 3 mutations 8 Number of patients with 4 mutations 2 Number of patients with 5 mutations 1

50 Gene mutations in 28 patients TET2 (20) DNMT3A (7) ASXL1 (6) RUNX1 (5) ZRSR2 (4) SRSF2 (4) U2AF1 (4) CEBPA (1) ETV6 (1) EZH2 (1) IDH1 (1) JAK2 V617F (2) KRAS (1) NRAS (1) GATA2 (1) SETBP1 (1) SF3B1 (2)

51 Clinical case 1: Diagnosis & prognosis Male (74 years) Diagnosis: MDS obs? NGS results: Missense mutation in TET2 genet: p.pro174his (49%) Duplication in ASXL1:p.Gly646Trpfs*12 (VAF?) ASXL1 duplication can not be detected due to technical issues Missense mutation in NRAS genet: p.gly12ser (38%) Deletion in ZRSR2: p.his191leufs*47 (95%) Missense mutation in SETBP1 genet 46% (p.asp868asn) ASXL1 and SETBP1 mutations are of prognostic significance in MDS

52 Clinical case 2: Germline mutations Male (70 years) trombocytopenia Diagnosis: MDS obs NGS results: Missense mutation in ETV6: p.arg264his (50%) In a highly conserved gene region Not described in the normal European population Missense mutations in ETV6 has previously been described in familial thrombocytopenia Patient records indicate possibility of familial hematological malignancy Patient is referred to genetic counseling

53 PMF Thrombocytopenia NGS panel ETV6 mutation VAF 50% MGUS

54 MDS Diagnostik Kromosomanalyse -Evt. FISH Targeteret NGS panel Lavrisiko MDS med normal cytogenetik eller del(5q) Alle med MDS under 50 år ICUS Ikke MDS ved morfologi Normal cytogenetik Cytopeni > 6 mdr. Andre årsager udelukket

55 Perspektiver ASXL1, RUNX1 og TP53 mutationer har ved MDS betydning for effekt af transplantation Association mellem RUNX1, NRAS, SETBP1 og ASXL1 mutationer og overlevelse hos patienter med CMML

56 Myeloproliferative neoplasi (MPN) Kroniske knoglemarvssygdomme karakteriseret ved øget produktion af myeloide celler

57 Diagnostik MPN Identificere diagnostiske og evt. prognostiske klonale markører Klampf., T et.al.; NEJM 2013

58 Algoritme for mutationsundersøgelse af klassisk MPN JAK2 V617F (q-pcr) Diagnostik + Follow-up Negativ JAK2 V617F mutation eller < 3% Essentiel trombocytose Polycytemia vera Myelofibrose MPL CALR JAK2 exon 12 Baseret på UK guidelines for detection of JAK2 V617F and other relevant mutations. Bench et al, BJH 2012

59 Incitament for at ændre fra golden standard tekniker (et gen ad gangen) til targeteret NGS Bedre work-flow i lab Bedre work-flow i klinikken Alle patienter undersøges for samme targets Muligt at finde diagnostiske & prognostiske markører indenfor 30 dage NGS panelet indeholder genetiske markører for flere forskellige MPN undertyper

60 Muterede gener i MPN Langabeer et al., Eur J Haematol. 2015;95:270-9

61 Targets for custom ampliseq panel for MPN Targets Gene Target Region Disease JAK2 p.v617 (hotspot) PV, ET, MF JAK2 JAK2 exon 12 PV MPL exon 10 ET, MF CALR exon 9 ET, MF KIT p.d816 (hotspot) Mastocytosis CSF3R exon CNL, acml SETBP1 exon 3 CNL, CMML ASXL1 exon 13 MF, CMML SRSF2 exon 1 (hotspot p.p95) MF, CMML U2AF1 p.s34, p.q157 (hotspots) MF SF3B1 Exon MF PV= polycythemia vera, ET= essentiel thromocytosis, MF= Myelofibrosis, CNL= chronic neutrophilic leukemia, acml= atypical CML, CMML = Chronic Myelomonocytic Leukemia

62 Custom ampliseq panel for MPN Panel specifications MPN panel Target regions 12 Amplicon range bp Primer pools 2 Amplicons 54 Missed bp 117 bp Coverage 98,5% Size 9,3 kb

63 Set-up PGM: Custom ampliseq panel for MPN Technical/ quality parameters MPN panel Chip set-up 316 or 318 chip Number of samples per chip 8-16 samples * TAT (theoretical) 5 working days TAT (IRL) 7-21 working days Uniformity 100% Average depth Target base coverage (500X) 100% * Number of samples per chip depends on type of chip

64 Results: Custom ampliseq panel for MPN Results parameter MPN panel Number of samples (Jan. Nov. 2016) 450 Number of patients with 1 mutation 67 (15%) Number of patients with 1 mutation 51 Number of patients with 2 mutations 11 Number of patients with 3 mutations 2 Number of patients with 4 mutations 3

65 Gene mutations in 67 patients ASXL1 (24) SRSF2 (14) CALR (18) JAK2 V617F (17) CSF3R (5) MPL (3) SF3B1 (3) SETBP1 (3) KIT D816V (3) JAK2 C618 (2) U2AF1(1)

66 Case 1 Mand (69 år) tidligere blevet fundet positiv for JAK2 V617F mutation (0,2%) Ikke sikker diagnose (ET?) NGS resultat: Missense mutationer i JAK2 p.v617f (12%) og p.c618r (12%) Deletion i ASXL1 p.e365fs* (40%) Missense mutation i SRSF2 p.p95h (16%) Mutation i primer site for q-pcr assay underestimerer VAF for JAK2 V617F

67 Case 2 70 årig mand udredes for MPN Tidligere fundet positiv for JAK2 V617F (ca. 1%) NGS resultater: Missense mutation in U2AF1: p.q157p (46%) JAK2 V617F (1%) Mutationer i U2AF1 er beskrevet ved MDS og myelofibrose. Har prognostisk betydning

68 Case 3 38 årig tidligere rask mand med trombocytose, ET? MPN panel på blodprøve: SF3B1 missense mutation c.2098a>g, allel frekvens 29% Mutationen velbeskrevet i litteraturen ved myeloide sygdomme (MPN, MDS) Kromosomanalyse på knoglemarv 46,XY,t(2;3)(p21-23;q26)[25] FISH bekræfter rearrangement af MECOM/EVI1 specifik for MDS, variant af inv(3)(q21q26) SF3B1 mutationer karakteristiske for MDS/AML med MECOM/EVI1 rearrangement Gröschel et al Blood 2015 Patienten henvist til allogen HSCT

69

70

71 Algoritme for mutationsundersøgelse af klassisk MPN JAK2 V617F (q-pcr) Diagnostik + Follow-up Negativ JAK2 V617F mutation eller < 3% MPN NGS panel Evt. kromosomanalyse

72 Udfordringer NGS - Fortolkning Detektion af nye varianter og varianter af ukendt betydning (VUS) Detektion af varianter med lav allel frekvens Lav frekvente mutationer i ASXL1, TET2 og DNMT3A ses også i den ældre raske befolkning Detektion af mutationer definerer ikke en diagnose og skal ses i kombination med andre undersøgelser Flere af targets/gener i MPN og MDS panelet er karakteristiske for MPN/MDS men ikke specifikke og kan også ses ved andre diagnoser Incidental findings Detektion af mulige germline varianter (familiær MDS/AML) Svar til klinikere SKAL indeholde konklusion og fortolkning inkl. evt. anbefaling af andre undersøgelser