Validering af A 1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) ved metodesammenligning og holdbarhedsforsøg

2014 Validering af A 1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) ved metodesammenligning og holdbarhedsforsøg Validation of A 1, Lu a and Lu b phenotyping on NEO (Immucor) by method comparison and storage experiment Figur 1: NEO (Immucor). Reference: NEO Brochure lokaliseret på: http://www.immucor.com/global/products/documents/immucor_ne O-Brochure_US_web.pdf Camilla Thinggård Jacobsen studienr. 32109596 Professionsbachelor i perioden fra 06.09.2014 til 19.12.2014 Bioanalytikeruddannelsen på University College Lillebælt Blangstedgårdsvej Vejledere: Helle Isak Adal Wihan, Bioanalytiker underviser på Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital og Tone Elisabeth Bernchou, Adjunk/Molekulær- og cellebiolog samt underviser på University College Lillebælt Antal anslag:77.964

Forord Jeg vil gerne sige tak til Klinisk Immunologisk Afdeling på Odense Universitetshospital for at give mine forsøgssamarbejdspartner og jeg, lov til at udføre vores forsøg til bachelorprojektet på deres afdeling i speciallaboratoriet. Projektet henvender sig til personalet på Klinisk Immunologisk afdeling, Odense Universitetshospital som skal bruge valideringen af NEO (Immucor). Særlig tak til Mette Henneby og sekreterne på Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital som har hjulpet os med at booke donorer med den sjældne Lutheran fænotype. Stor tak til Marianne Grønholdt Pedersen, Afdelingsbioanalytiker på Klinisk Immunologisk Afdeling, for hjælp til problemer på NEO (Immucor). Samtidig vil jeg også gerne sige særligt tak til Diannie Boysen, produktchef hos Triolab, for hjælp til brug af NEO (Immucor) og fejludregninger. Stor tak til Ulrik Sprogøe, analyseansvarlig overlæge på Klinisk Immunologisk Afdeling, for hjælp til statistik. Jeg vil gerne takke mine to vejledere Helle Isak Adal Wihan, Bioanalytiker underviser på Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital og Tone Elisabeth Bernchou, Adjunk/Molekulær- og cellebiolog samt underviser på University College Lillebælt i Odense for god hjælp og vejledning samt støtte gennem projektet. Til sidst vil jeg gerne takke Sandra Gaedt Schmidt, Ida Niebuhr Moser Hausted og Lisa Maria Mathiesen for et godt samarbejde samt støtte undervejs gennem hele projektet. Side 2 af 76

Indhold Forord... 2 Resumé... 6 Problembaggrund:... 6 Metode:... 6 Resultater:... 6 Konklusion:... 6 Introduktion... 7 Problemformulering:... 8 A 1... 9 Lutheran-antigenerne... 9 Antigeners holdbarhed... 10 Analyseprincipper... 10 NEO(Immucor)... 10 Søljeagglutinationsteknik... 11 Glasteknik... 11 Metodiske overvejelser:... 11 Prøvemateriale:... 11 Antal dage til holdbarhedsforsøg... 12 Kontroller:... 13 Aflæsning af resultater... 13 Databehandling... 14 Materialer... 15 Apparatur... 15 Utensilier... 15 Reagenser til manuel teknik... 15 Reagenser til NEO(Immucor)... 16 Prøvemateriale... 16 Metode... 17 Manuel fænotypebestemmelse... 17 Søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, Lu a og Lu b... 18 Glasteknik, A 1... 18 Automatiseret fænotypebestemmelse... 19 Side 3 af 76

Hæmagglutinationsteknik med IgM-antistoffer på NEO(Immucor) til A 1 fænotypebestemmelse... 19 Fast fase teknik med IgG-antistoffer på NEO (Immucor) til Lu a og Lu b fænotypebestemmelse... 20 Tolkning af resultater på NEO (Immucor)... 21 Databehandling... 21 Resultater... 24 Metodesammenligning mellem manuel teknik og NEO (Immucor)... 24 A 1... 24 Lu a... 24 Lu b... 25 Holdbarhedsforsøg... 27 A 1... 27 A 1 prøver opbevaret ved 4 C... 27 A 1 prøver opbevaret ved stuetemperatur... 27 Lu a... 28 Lu a prøver opbevaret ved 4 C... 28 Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur... 30 Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur... 33 Lu b prøver opbevaret ved 4 C... 34 Lu b prøver opbevaret ved stuetemperatur... 35 Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur... 36 Diskussion... 38 Metodesammenligning og holdbarhed for A 1... 38 Metodesammenligning for Lu a fænotypen... 38 Holdbarhed for fænotypen Lu a ved 4 C... 39 Holdbarhed for fænotypen Lu a ved stuetemperatur... 40 Metodesammenligning for fænotypen Lu b... 41 Holdbarhed for fænotypen Lu b ved 4 C... 41 Holdbarhed for fænotypen Lu b ved stuetemperatur... 42 Fordele og ulemper ved NEO(Immucor) vs. manuelle teknikker... 43 Forsøgsdesign... 44 Konklusion... 45 Perspektivering... 46 Litteraturliste:... 47 Side 4 af 76

Bilag 1 Indlægsseddel for Anti-A1 Lectin... 49 Bilag 2 - Aflæsning: Graduering af agglutination i søjleagglutinationsteknik... 51 Aflæsning: Graduering af agglutination i glasteknik... 52 Bilag 3 Indlægsseddel for Rh-Hr Control til NEO (Immucor)... 53 Bilag 4 NEO (Immucor) cut-off værdier til fænotypebestemmelse af A 1, Lu a og Lu b... 55 Bilag 5 - NEO (Immucor), Konklusion for fænotypebestemmelser... 57 Bilag 6 Forskrifter for manuelle teknikker... 58 Bilag 7 - Konklusion for manuelle fænotypebestemmelser... 59 Bilag 8 - Uddrag af NEO s (Immucor) forskrift Vask af donorerytrocytter:... 60 Bilag 9 Flowcharts over fremgangsmetode til fænotypebestemmelse på NEO (Immucor)... 61 Bilag 10 Databehandling af rådata... 64 Fishers Eksakte test- Metodesammenligning... 64 Lu a... 64 Lu b... 65 Undersøgelse af Normalfordeling - Holdbarhedsforsøget... 65 Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved 4 C, hvor dag 1,2,4,7,10 og 14 sammenholdes... 67 Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved 4 C, hvor dag 1,2,4,7 og 10 sammenholdes... 68 Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7,10 og 14 sammenholdes... 69 Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7 og 10 sammenholdes... 70 Friedman test på Lu b prøver opbevaret ved 4 C, hvor dag 1,2,4,7, 10 og 14 sammenholdes... 71 Friedman test på Lu b prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7, 10 og 14 sammenholdes... 72 Resultatark for metodesammenligning ved fænotypebestemme af A 1... 73 Resultatark for metodesammenligning ved fænotypebestemme af Lu a... 74 Resultatark for metodesammenligning ved fænotypebestemme af Lu b... 76 Side 5 af 76

Resumé Problembaggrund: Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital fænotypestemmer på nuværende tidspunkt A 1 manuelt ved glasteknik og Lu a og Lu b manuelt ved søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, men har et ønske om fremadrettet at få gjort fænotypebestemmelserne automatiseret på NEO (Immucor). NEO (Immucor) anvender hæmagglutinationsteknik til fænotypebestemmelse af A 1 og fast fase teknologi til fænotypebestemmelse af Lu a og Lu b. Ligeledes ønsker afdelingen at donorblodprøver skal kunne opbevares i 14 dage ved 4 C. Metode: Det undersøges ved metodesammenligning mellem manuel fænotypebestemmelse af A 1 ved glasteknik, Lu a og Lu b ved manuel søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort og hæmagglutinationsteknik og fast fase teknologi på NEO (Immucor) om fænotyperne kan blive automatiseret på NEO (Immucor). Ved et holdbarhedsforsøg undersøges det om opbevaringstemperaturen påvirker donorblodprøverne når disse opbevares ved hhv. 4 C og stuetemperatur i 14 dage. Resultater: Begge metoder finder samme analysesvar for fænotypebestemmelserne af A 1 og Lu b, også efter 14 dages opbevaring ved hhv. 4 C og stuetemperatur. For fænotypebestemmelsen af Lu a på NEO (Immucor) bestemmes mange donorblodprøver inkonklusive og efter 14 dage ved hhv. 4 C og stuetemperatur bliver alle donorblodprøver bestemt negative. Konklusion: Fænotypebestemmelserne for A 1 og Lu b kan blive automatiseret på NEO (Immucor) og har en holdbarhed på 14 dage ved hhv. 4 C og stuetemperatur. Fænotypebestemmelsen for Lu a kan på nuværende tidspunkt ikke automatiseres og har ikke en holdbarhed på 14 dage ved hverken 4 C eller stuetemperatur. Det kræver derfor yderligere undersøgelser for at kunne få fænotypebestemmelsen af automatiseret. Side 6 af 76

Introduktion Problembaggrund Patienter kan i forbindelse med blodtransfusioner danne irregulære antistoffer rettet mod fremmede blodtypeantigener. Det er derfor vigtigt, at fænotypebestemme donorerytrocytterne med henblik på at kunne give forligeligt blod ved efterfølgende transfusioner og herved undgå transfusionskomplikationer [1]. Ved transfusionskomplikationer forstås, at patientens antistoffer binder til det korresponderende blodtypeantigen på donorerytrocytternes overflade, hvilket fører til hæmolysering af erytrocytterne [2]. Ved en fænotypebestemmelse bestemmes sammensætningen af blodtypeantigenerne på overfladen af donorerytrocytterne. På nuværende tidspunkt foretager Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital (KIA, OUH) fænotypebestemmelsen af A 1 manuelt ved glasteknik og fænotypebestemmelsen af Lu a og Lu b manuelt ved søljeagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort. Afdelingen fænotypebestemmer A 1 på donorerytrocytter for at differentiere mellem A 1 og A 2 antigener, da afdelingen anvender fænotypen A 2 til validering af nyt apparatur, for at sikre at det kan detekterer svage reaktioner. KIA bruger også A 2 som modtagekontrol til f.eks. gelkort og testsera, for at sikre at en ny leverance af samme testmateriale har samme kvalitet som tidligere leverancer. KIA undersøger forud for transfusion patienter for irregulære antistoffer rettet mod Lu a (anti-lu a ) og Lu b (anti-lu b ) vha. en antistofscreentest. Ved en antistofscreentest undersøges patientens irregulære antistoffer i plasma over for donorerytrocytter med kendte antigener. Har patienten irregulære antistoffer ses en agglutination med det pågældende antigen [2]. Afdelingen skal kunne fremskaffe donorer med fænotyperne Lu(a-) og Lu(b-) til de patienter, der danner irregulærer antistoffer. Da Lu(b-) fænotypen er sjælden vil KIA gerne undersøge alle donor for fænotypen Lu(a+) i håb om, at finde flere Lu(b-) bloddonorer [3]. Men, da Lu(b-) fænotypen er sjælden, er der tilsvarende også sjældent patienter der danner anti-lu b. Tilfælde forekommer dog, og KIA vil derfor gerne have fænotypebestemt bloddonorer for kunne give forligeligt blod. Af hensyn til økonomi og personaleressourcer har KIA derfor et ønske om, fremadrettet at få gjort fænotypebestemmelserne af A 1, Lu a og Lu b automatiseret på NEO (Immucor). Fænotypebestemmelserne kan blive automatiseret på NEO (Immucor), såfremt den automatiserede metode findes at være valid. Ved overflytning af manuelt fænotypebestemmelse til NEO (Immucor) er det relevant at udføre en metodevalidering, herunder en metodesammenligning. Formålet med en metodesammenligning er, at sikre at analyserne finder frem til samme svar, enten positiv eller negativ [4]. På KIA valideres Side 7 af 76

en metode ved en metodesammenligning hvis metoden skal overføres til nyt apparatur [TMS]. Ved validering af nyt apparatur fastlægges kontrol- og cut-off værdier. Det undersøges, om apparaturet er installeret korrekt i henhold til manualer, indlægssedler og leverandøroplysninger. Apparaturet afprøves med donorblodprøver for at undersøge analysens robusthed og egnethed [5]. Da KIA allerede anvender NEO (Immucor) til rutineprøver, er den derfor allerede blevet valideret [6]. Det er derfor ikke relevant at udføre en metodevalidering, men i stedet lave en metodesammenligning for at undersøge og vurderer, om NEO (Immucor) får de samme resultater som glasteknik og søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort. KIA opbevarer på nuværende tidspunkt deres donorblodprøver til fænotypebestemmelse ved stuetemperatur, men ønsker fremadrettet at opbevarer dem ved 4 C. Ifølge producenten af NEO (Immucor) bør EDTA-prøver, der ikke analyseres inden 24 timer, opbevares ved 1-10 C og ikke længere end 14 dage [7]. Afdelingen har før oplevet problemer ved fænotypebestemmelse af prøver, der er ældre end en uge, ved analysering med IgG-antistoffer på NEO (Immucor), hvor brøndene i mikrotiterpladerne ikke coates ordentligt [8]. KIA vil indføre fænotypebestemmelserne A 1, Lu a og Lu b som en del af rutinen, hvor de skal analyseres én gang ugentligt. I tilfælde af reanalysering skal prøvernes holdbarhed kunne holde yderligere en uge. Det er i den forbindelse relevant, at undersøge om donorblodprøvernes holdbarhed korresponderer med afdelingens behov, ved at undersøge om opbevaring ved 4 C og stuetemperatur (stuetemp.) i op til 14 dage påvirker reaktionsstyrken for fænotyperne A 1, Lu a og Lu b. Problemformulering: Hvilken betydning har det for resultatet af A 1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelsen at anvende hæmagglutinationsteknik og fast fase teknologi på NEO (Immucor) frem for manuel glasteknik og søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs kort, og hvordan påvirker opbevaring af donorblodprøver ved hhv. 4 C og stuetemperatur i op til 14 dage resultatet af A 1, Lu a og Lu b fænotypebestemmelsen på NEO (Immucor)? Side 8 af 76

A 1 Blodtypeantigenet A 1 er en fænotype som hører under AB0 blodtypesystemet. Antigenerne i blodtypesystemet AB0 består af oligosakkarider, som er bundet til enten proteiner eller lipider i erytrocytmembranen. Individer med blodtypen A kan opdeles i flere subtyper, hvor de to hyppigst forekommende er A 1 og A 2. Disse fænotyper adskiller sig ved, at A 1 individer både udtrykker A-antigen og A 1 -antigen på overfladen af erytrocytterne, mens A 2 individer kun udtrykker A-antigener [2][8][9]. A 1 -antigener agglutinerer hurtigere og giver stærkere agglutinater end A 2 -antigener [2]. Det kan forekomme, at A 2 individer danner antistoffer imod A 1 -antigen, jf. bilag 1, [9]. Antistoffet imod A 1 (anti-a 1 ) kan i sjældne tilfælde reagere ved 37 C, men har normalt ikke nogen klinisk relevans, da disse ikke reagerer ved temperaturer over 25 C [2][9]. Frekvensen for blodtype A i Europa er 40-60 % [2]. Lutheran-antigenerne Lu a og Lu b tilhører blodtypesystemet Lutheran. Lutheran systemet består af 20 forskellige antigener, hvoraf Lu a og Lu b er de hyppigst forekomne. Lu a og Lu b er glykoproteiner, der tilhører immunoglobulin superfamilien, og fungerer som adhæsionsmolekyler, der binder til laminin i ekstracellulær matrix [8][10]. Lu a og Lu b inddeles i homo- og heterozygot, hvilket betyder, at de inddeles efter hvilke blodtypeantigener erytrocytterne udtrykker på deres overflade. Har et individ en fænotype Lu(a+ b-), beskrives denne som homozygot, da der kun er Lu a blodtypeantigener udtrykt på overfladen af erytrocytterne. En heterozygot fænotype Lu(a+ b+) har både Lu a og Lu b udtrykt [3]. Individer der er heterozygote for Lu a, dvs. Lu(a+ b+) kan mellem deres erytrocytter, variere i styrke[8]. Dette kan give inkonklusive resultater ved anvendelse af for svagt antisera [8]. For at en analysemetode kan anvendes til detektion af blodtypeantigenet Lu a, skal den kunne detektere Lu(a+ b+) for, at sikre at den kan detekterer de svage reaktioner [8]. Der er for blodtypeantigenet Lu b ligeledes variation i styrke, da det er forskelligt for individer hvor mange antigener der er udtrykt på overfladen af erytrocytterne. Denne variation er nedarvet [3]. Fænotypernes frekvens for de fleste populationer er som følgende: Lu(a+ b+) 7,4 %, Lu(a+ b-) 0,2 %, Lu(a- b+) 92,4 % og Lu(a- b-) sjælden [3][11]. Antistoffer imod Lu a (anti-lu a ) reagerer normalt ikke ved 37 C, og er derfor af mindre klinisk relevans [12]. Antistoffer mod Lu b (anti-lu b ) kan i sjældne tilfælde forårsage mild og/eller forsinket hæmolytisk transfusions reaktion (HTR) [3][12]. Lu a og Lu b antigener er kun lidt udviklede hos fostre og nyfødte, og derfor forårsager antistofferne sjældent hæmolytisk sygdom hos fostre og nyfødte [11][12]. Side 9 af 76

Antigeners holdbarhed Studier af Hess et al. og Sparrow et al. har vist, at opbevaring af fuldblod forårsager forskellige biokemiske og morfologiske ændringer af erytrocytterne samt forandringer eller reducering af blodtypeantigener [13][14][15]. Erytrocytter anvender glykolysen for at danne energi, adenosin trifosfat (ATP), hvor affaldsprodukterne gør at ph falder. Ved opbevaring i 4 C vil glykolysen og dannelsen af ATP falde med 10-15 % pr. grader celsius. Opbevares erytrocytter derimod ved 25 C vil de metaboliserer 10 gange hurtigere end ved 4 C og bliver derved langsommere hæmolyseret [16]. Er der leukocytter tilstede sammen med erytrocytter, vil disse, når de nedbrydes, frigive enzymer som protease, lipase og glycosidase der kan angribe og nedbryde proteiner, dvs. formentligt blodtypeantigenerne på erytrocytternes membran [16]. Analyseprincipper NEO(Immucor) Hæmagglutinationsteknik og fast fase teknologi og på NEO (Immucor) er baseret på antigenantistof reaktion i en mikrotiterplade. Ved hæmagglutinationsteknik på NEO (Immucor) tilsættes donorerytrocytter og testsera til en ucoated mikrotiterplade. IgM-antistoffer i testsera vil bindes til donorerytrocytterne, hvis det korresponderende blodtypeantigen udtrykkes derpå, og dermed dannes et agglutinat. Ved positivt resultat ses et eller flere agglutinater, mens der ved negativt resultat ingen agglutinater er, hvilket ses som en rød sky fordelt i brønden. Ved fast fase teknologi anvendes IgG-antistoffer. Ved denne teknik er mikrotiterpladerne coated med antistoffer imod erytrocytter (anti- RBC) hvortil donorerytrocytter kan immobiliseres og denne immobilisering betegnes monolayer. Antistoffer i testsera vil binde til deres korresponderende blodtypeantigen, hvis dette udtrykkes på donorerytrocytterne. Indikatorceller som er sensibiliserede med anti humant IgG vil, ved tilsætning, bindes til de bundne antistoffer på donorerytrocytterne. Ved et positiv resultat binder indikatorcellerne til de bundne antistoffer på erytrocytterne og dette ses som en rød sky fordelt i brønden. Ved negativt resultat binder antistofferne ikke til indikatorcellerne og vil derfor lægge sig som et pellet. Figur 2: Fast fase teknologi med anvendelse af IgGantistoffer på NEO (Immucor). Side 10 af 76

Søljeagglutinationsteknik Ved søjleagglutinationsteknik anvendes Indirekte Agglutinationsteknik (IAT) i LISS Coombs gelkort. Gelen i LISS Coombs kortene er opbygget som et netværk og er tilsat Lav Ion Styrke Saltvand (LISS), anti- IgG og anti- C3d der muliggør, at IgG antistoffer kan danne agglutinater med donorerytrocytter, der udtrykker det pågældende blodtypeantigen. LISS er et medie der indeholder et reduceret antal af positive og negative ioner, hvilket gør, at den negativt ladede ionsky der omgiver erytrocytterne reduceres, således positivt ladede antistoffer lettere og hurtigere kan bindes hertil [17][18]. Ved anvendelse af LISS, nedsættes inkubationstiden [18]. Da sensibilisering med IgG-antistoffer ikke kan ses med det blotte øje, er gelen i LISS Coombs gelkort tilsat Anti- IgG og C3d, der binder til de sensibiliserede erytrocytterne, dvs. binder til antistofferne i testsera, hvorved sensibiliseringen synliggøres ved at danne agglutinat [17][18]. Ved agglutination vil erytrocytterne blive liggende øverst i gelen efter centrifugering, da agglutinaterne ikke kan trænge gennem gelens netværk og resultatet er derved positivt. Ved negativt resultat bliver ikke-agglutinerede erytrocytter centrifugeret ned i bunden af gelen, da der ingen agglutination er sket, jf. bilag 2. Glasteknik Ved glasteknik sker direkte hæmagglutination, som er baseret på agglutinationsreaktioner mellem blodtypeantigener på erytrocytterne og specifikke IgM-antistoffer i testsera. Ved positiv reaktion vil antistoffet i testsera bindes til donorerytrocytterne som udtrykker det pågældende blodtypeantigen, og herved dannes et agglutinat. Ved negativ reaktion ses ingen agglutinater, jf. bilag 2. Metodiske overvejelser: Prøvemateriale: Antallet af donorblodprøver er valgt efter, at variationen mellem donorerne er meget lav ved de respektive fænotyper. Det ikke nødvendig med stort antal prøver, da der kun kan undersøges for to variationer, nemlig positiv eller negativ. Derudover tages hensyn til afdelingens økonomi. Prøvernes fænotype er bekræftet på forhånd og fremsøgt i KIA s laboratoriesystem ProSang, hvor donors blodtyper og fænotyper fremgår. I ProSang fremgår det ikke ud fra hvilken teknik fænotyperne er bestemt ved. For at sikre at NEO (Immucor) kan detektere de svageste reaktioner, medtages derfor homo- og heterozygote fænotyper for Lu a og Lu b. De svageste reaktioner er fra heterozygote fænotyper, hvor der udtrykkes færre blodtypeantigener på overfladen af erytrocytterne end ved fænotyper som er Side 11 af 76

homozygote. Til metodesammenligningen indsamles 20 donorblodprøver i alt. Den fænotype prøverne analyseres for, markeres i det efterfølgende med fed. Til fænotypebestemmelse af Lu a indsamles fem donorblodprøver med fænotypen Lu(a+ b-) og 10 donorblodprøver med fænotypen Lu(a+ b+), hvoraf fem af disse anvendes til fænotypebestemmelse af Lu b. Til fænotypebestemmelse af Lu b indsamles også fem prøver med fænotypen Lu(a+ b+). Ligesom der anvendes 10 positive fænotyper for Lu a og Lu b, indsamles også 10 donorblodprøver, der er positive for A 1, for at have samme antal. Der anvendes fem prøver fra donor med svagere fænotyper f.eks. A 2 for at sikre at NEO (Immucor) kan ikke finder falsk positive, da donorerytrocytter med blodtypeantigener med A 2 giver en negativ reaktion med anti-a 1 testsera [2]. Til holdbarhedsforsøget anvendes 10 donorblodprøver til Lu a fænotypen, hvoraf fem af prøverne har fænotypen Lu(a+ b-), mens de resterende fem har fænotypen Lu(a+ b+). Til fænotypebestemmelse af Lu b anvendes ligeledes 10 i alt, hvor af fem har fænotypen Lu(a+ b+) og de resterende fem har fænotypen Lu(a- b+). For fænotypebestemmelse af A 1 anvendes fem A 1 prøver i holdbarhedsforsøget, men ingen A 1 negative prøver (A 2 ), da der ikke ville kunne ses en ændring når blodtypeantigenet ikke er til stede på overfladen af donorerytrocytterne. Fænotypen Lu(a- b-) medtages ikke i nogle af forsøgene, da denne forekommer yderst sjældent [3]. For at undersøge om opbevaringstemperatur kan ændre på analysesvar, deles hver prøver til holdbarhedsforsøget i to, hvor den ene halvdel opbevares ved 4 C og den anden opbevares ved stuetemperatur. Prøver mærkes så det fremgår hvilken temperatur de opbevares ved og hvilke prøver der hører sammen. Resultaterne fra dag 1 i holdbarhedsforsøget anvendes som resultater til metodesammenligningen, da dette er mere tidsbesparende og billigere og der anvendes mindre testsera. Forud for valideringen undersøges det, om der er nok prøvemateriale i én donorblodprøve, når prøven deles i to, til hhv. analysering på NEO (Immucor) og ved manuel teknik, når der yderligere skal analyseres seks gange pr. prøve i holdbarhedsforsøget. Antal dage til holdbarhedsforsøg Antallet af dage til holdbarhedsforsøget vurderes ud fra anbefalinger fra producenten af NEO (Immucor) samt ønsker fra KIA om en holdbarhed på 14 dage, da prøverne skal analyseres en gang ugentligt og i tilfælde af reanalysering skal de kunne stå til ugen efter [7]. Det vurderes at dag 1, 2, 4, 7, 10 og 14 er relevante at analysere prøverne på. Dag 1 er valgt, da KIA analysere deres prøver den dag og dag 2 for at se om der allerede sker en forandring der. Dag 7 og 14 er valgt på baggrund af afdelingens ønske om analysering én gang ugentlig, evt. reanalysering en uge senere samt efter Side 12 af 76

anbefalinger fra producenten af NEO (Immucor). Dag 10 er valgt for at se om der sker en ændring af blodtypeantigerne mellem dag 7 og 14. Tappedagen er dag 0. Kontroller: For at sikre at analysen, ved søjleagglutinationsteknik til fænotypebestemmelse af Lu a, kan finde de svage reaktioner der kan være ved heterozygote donorprøver, anvendes derfor homo- og heterozygote kontroller. Den heterozygote donorblodprøve anvendes som negativ kontrol, da blodtypeantigenet ikke er til stede på overfalden af testerytrocytterne, mens den homozygote donorblodprøve anvendes som positiv kontrol, da testerytrocytterne har det korresponderende blodtypeantigen udtrykt på overfladen. Ved fænotypebestemmelsen af A 1 via glasteknik anvendes en positiv kontrol, fra panel 16 der er en 5 % erytrocytsuspension (fortyndingsmedie og pakkede erytrocytter fra donor), hvor A 1 - blodtypeantigener udtrykt på erytrocytternes overflade. Der skelnes ikke mellem homo- og heterozygot, da dette ikke bestemmes serologisk, men genomisk. Derudover skal yderligere anvendes en negativ kontrol til fænotypebestemmelse af A 1. Den negative kontrol vil blive fremsøgt i ProSang under rutine 330, (kontrollen er en komponent til blodportionerne klar til transfusion), da den skal være negativ for A 1. Den negative kontrol vil derfor være positiv for A 2 eller A 3 blodtypeantigener. På NEO (Immucor) skal der anvendes en Rh-kontrol, som består af et fortyndingsmedie, til analyser, hvor der anvendes hhv. IgM- og IgGantistoffer. Ved hæmagglutinationsteknik, hvor der anvendes IgMantistoffer, medtages Rh-kontrollen for at undersøge om donors blodlegemer agglutinerer spontant jf. bilag 3, og ved fast fase teknik, hvor der anvendes IgG-antistoffer, medtages Rh-kontrollen til hver prøve for at undersøge om donor er Coombs positiv. Aflæsning af resultater For at sikre ens aflæsning for alle resultater til aflæsningen af fænotyperne Lu a og Lu b ved søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort og for fænotypen A 1 i glasteknik, skal samme person stå for aflæsningen, da der kan variation i den måde der aflæses på. Da KIA graduerer deres resultater, vil resultaterne i metodesammenligningen blive behandlet med samme graduering i Figur 3: Til venstre graduering ved manuel glastenik. Til højre aflæsningen af hæmagglutionasteknik på NEO (Immucor). Side 13 af 76

projektet, se bilag 4. Resultaterne vil blive gradueret fra til ++++, hvor - er negativ, mens ++++ er stærkes positiv. Til holdbarhedsforsøget vil der blive anvendt talværdier (score) som NEO (Immucor) måler, for at anvende relevant statistik og derved undersøge om der sker ændring af blodtypeantigenerne over tid. Der kan ikke udføres statistiske beregninger med gradueringer. Databehandling Resultater fra metodesammenligningen skal indføres i en kontigenstabel i format 3x3 der sammenholder frekvenser. I denne tabel skal metoderne sættes overfor hinanden med antallet af de prøver de hver især finder positive, inkonklusive eller negative. Kontigenstabellen i 3x3 format er valgt for at kunne lave en χ 2 -test og undersøge om antallet af inkonklusive resultater er uafhængigt af hvilken metode der anvendes. Resultaterne for holdbarhedsforsøget skal fremvises med beskrivende statistik, hvor hver fænotype afbildes i et xy-plot for at visualisere prøvernes forløb over antallet af analyseringsdage. Ved disse plots kan der vurderes om der er en klinisk betydning og om prøverne ændre svar fra positiv til inkonklusiv eller til negativ. For at vurdere om temperaturen har en indflydelse på reaktionsstyrkerne opstilles for hver analyseringsdag, et xy-plot hvor temperaturerne angives på akserne. Hver prøves score for hhv. 4 C og stuetemp. plottes og der indtegnes en identitetslinje (x=y) med skæring i (0,0), hvorved det kan ses om temperaturen har indflydelse på reaktionsstyrkerne. Jo tættere punkterne ligger på linjen, jo mindre afhænger reaktionsstyrkerne af opbevaringstemperaturen. Ligger punkterne mere på den ene side af identitetslinjen, jo mere har opbevaringstemperaturen en indflydelse på reaktionsstyrkerne. I alle grafer vil der blive indtegnet NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdi samt afdelingens positive cut-off værdi, så det visuelt kan ses hvilke prøver som accepteres som positive, inkonklusive og negative. Er scoren for A 1 fænotypen under 23,000 på NEO (Immucor) accepteres denne som negativ, ligger den mellem 23,000 og 50,000 vurderes den som inkonklusiv, mens den accepteres som positiv over en score på 50,000, se bilag 5. Afdelingens cut-off værdier er de samme, se bilag 6. Er scoren for fænotyperne Lu a og Lu b under 20,000 på NEO (Immucor) accepteres disse som negative, ligger scoren mellem 20,000 og 40,000 vurderes de som inkonklusive og ligger scoren over 40,000 accepteres de som positive, se bilag 5. Afdelingens positive cut-off ligger på 72,000, mens den negative er den samme som NEO s (Immucor) negative cut-off, se bilag 6. Side 14 af 76

Materialer Apparatur - Hettich Zentrifugen ROTINA 46 blev anvendt til centrifugering af blodprøver og til centrifugering af widalglas anvendt til glasteknik - ID- centrifuge 24 S fra DiaMed ID Micro Typing System (Schweiz) blev anvendt til centrifugering af LISS Coombs gelkort - ID-Incubator 37 S II fra DiaMed ID Mirco Typing System (Schweiz) blev anvendt til inkubation af LISS Coombs gelkort - Galileo NEO fra Immucor, Gamma (Rödermark, Tyskland) blev anvendt til fænotypebestemmelse af A 1, Lu(a+ b+), Lu(a- b+) og Lu(a+ b-) Utensilier - Widalglas (Rundbodengläser) 75x12x0,8-1 mm blev anvendt at lave suspensioner til manuelle teknikker og til deling af prøver - Reagensglas 75x9,85x0,7 mm fra Buch og Holm (Herlev, Danmark) blev anvendt manuel fænotypebestemmelse af A 1 ved glasteknik - LISS Coombs gelkort fra BIO-RAD (Schweiz) - Spejl blev anvendt til aflæsning af resultater fra manuel fænotypebestemmelse af A 1 ved glasteknik - Capture-R Select fra Immucor, Gamma (USA) mikrotiterplader, 96 brønde blev anvendt til fast fase teknologi - Neutrale mikrotiterplader med 96 brønde fra Triolab (Brøndby, Danmark) blev anvendt til hæmagglutinationsteknik - Stirrballs fra Immucor, Gamma (Tyskland) til Capture-R Ready Indicator-cells blev anvendt blanding af reagens på NEO (Immucor) Reagenser til manuel teknik - ID-Cellstab fra BIO-RAD (Schweiz) blev anvendt som suspensionsmedie til fænotypebestemmelse - Seraclone TM Anti-A1 fra BIO-RAD (Tyskland) blev anvendt til fænotypebestemmelse af A 1 og anvendt ved glasteknik - Anti-Lu a fra BIO-RAD (Tyskland) blev anvendt som testsera til fænotypebestemmelse af Lu(a+) og Lu(a-) anvendt ved søjleagglutinationsteknik Side 15 af 76

- Anti-Lu b fra BIO-RAD (Tyskland) blev anvendt som testsera til fænotypebestemmelse af Lu(b+) og Lu(b-) anvendt ved søjleagglutinationsteknik - Testerytrocytter fortyndet til 0,8 % erytrocytsuspension fra et panel. Panel donor 1, 3 og 5 godkendt 22.09 2014 og 21.10 2014 af KIA, OUH (Danmark) og blev anvendt som kontroller. Panel 1 som Lu(a-), panel 3 som Lu(b-)og panel 5 som Lu(a+) og Lu(b+) ved søjleagglutinationsteknik - Testerytrocytter fortyndet til 5 % erytrocytsuspensioner fra et panel. Panel donor 16 godkendt 09.10 2014 fra KIA, OUH (Danmark) blev anvendt som positiv kontrol ved glasteknik til fænotypebestemmelse af A 1 - To blodprøver tilhørende komponent fra donor med kendt A 1 negativ fænotype med nr. V0014452366 og V0014452412 blev anvendt som negativ kontrol ved glasteknik. - Blodprøver i EDTA-glas fra donorer Reagenser til NEO(Immucor) - System Liquid Concentrate fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO til fortynding af pakkede erytrocytter i Capture-R Select, samt vask af brønde i mikrotiterplader. - Galileo diluent fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO til fortynding pakkede erytrocytter i neutrale mikrotiterplader ved hæmagglutination - Capture LISS fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO til Capture-R Select - Capture-R Ready Indicator-cells fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO til Capture-R Select - ImmuClone Rh-hr kontrolreagens fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO som kontrol til A 1 og Lu a - Anti-A 1 testsera fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO til fænotypebestemmelse af A 1 - Anti-Lu a testsera fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO til fænotypebestemmelse af Lu a - Anti-Lu b testsera fra Immucor, Gamma (Tyskland) anvendt af NEO til fænotypebestemmelse af Lu b Prøvemateriale Forinden projektets start blev der, med hjælp fra donorsekretariatet, booket fem donorer med den sjældne fænotype Lu(a+ b-). Disse prøver er indsamlet fra donorer i Region Syddanmark i uge 41 2014. Øvrige blodprøver til projektet blev indsamlet blandt daglige prøver til fænotypebestemmelse Side 16 af 76

i blodtypelaboratoriet indsamlet fra donorer i Region Syddanmark i perioden uge 41 43 2014. I afdelingens EDB-system, ProSang, i patientrutine 386, fremgår det under fænotyper om donors Lutheran og A 1 fænotype er bestemt. ProSang er blevet anvendt for at indsamle prøver med fænotyperne A 1, Lu(a+ b+) og Lu(a- b+). Holdbarhedsforsøget blev startet op af flere hold, i alt 4 hold afhængig af hvornår prøver med de ønskede fænotyper kunne fremsøges. Resultater fra dag 1 i holdbarhedsforsøget anvendes til metodesammenligningen, hvor alle prøver til Lutheran fænotypebestemmelse blev analyseret for både Lu a og Lu b. Der blev indsamlet 10 prøver med fænotypen Lu(a+ b+), 5 prøver Lu(a+ b-), 5 prøver Lu(a- b+), 10 prøver A 1 og 5 A 1 - negative prøver. Metode Indsamlede donorblodprøver til holdbarhedsforsøget blev grundigt vendt for at opnå homogenitet, hvorefter de blev delt i to, hvoraf den ene blev opbevaret ved 4 C og den anden ved stuetemp.. Med en automatpipette blev 2 ml fuldblod fra EDTA prøveglasset afpipetteret til widalglas. Med hjælp fra sekretærerne i donorsekretariatet var der forinden udskrevet ekstra tappeformularer fra blodprøveglassene som blev påsat det tilhørende widalglas. Prøverne blev delt i to stativer, et opbevaret i afdelingens karantæne kølerum (4 o C) og et ved stuetemperatur. Stativerne blev påsat mærkater for at overskueliggøre, hvilket hold, hvilken fænotype den enkelte prøve havde og hvad der specifikt skulle analysere på prøven. På hver prøve blev der desuden noteret hvilken temperatur den skulle opbevares ved, hvilket hold den tilhørte og hvilken fænotype der skulle bestemmes. Prøverne blev derefter centrifugeret i ROTINA 46 (Hettich Zentrifugen) i 5 min. ved 1800 g og 3000 rpm, jf. 4. Prøver til opbevaring ved 4 o C blev herefter placeret i kølerum, således de så vidt muligt kunne opfylde anbefalingen fra indlægssedler om, at prøver skal på køl senest 24 timer efter tapning, jf. bilag 3. Manuel fænotypebestemmelse Prøver til dag 1 ved stuetemp. i holdbarhedsforsøget, uanset hold, blev analyseret manuelt og på NEO (Immucor), således at resultatet kunne bruges til metodesammenligningen. Ved den manuelle analysering blev medtaget negative kontroller til alle fænotypebestemmelser. Der blev ligeledes medtaget positive kontroller, hvor der til fænotypebestemmelse af Lu a og Lu b blev brugt en positiv heterozygot kontrol til, for at sikre at svagt positive reaktionsstyrker kan påvises. Til fænotypebestemmelse af A 1 blev en positiv kontrol fra panel 16 medtaget.. Kontrollerne til Lu a Side 17 af 76

og Lu b fænotypebestemmelsen bestod af paneldonor 1, 3 og 5, der er fortyndet blodsuspensioner med donor erytrocytter, og blev fundet i afdelingens paneldonor af testerytrocytter (0,8 %). Den positive kontrol til A 1 fænotypebestemmelsen bestod af panel 16 og blev fundet i afdelingens panel af testerytrocytter (5 %), mens den negative kontrol (A 1 -) blev fremsøgt i erytrocytlaboratoriets EDB- system, ProSang i rutine 330. Alle prøver der ved manuel analysering blev vurderet inkonklusiv (+) blev jf. afdelingens praksis reanalyseret, se bilag 7. Søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, Lu a og Lu b For at fremstille erytrocytsuspensioner for hver prøve blev 1 ml cellstab overført til widalglas, hvorefter 8 µl pakkede erytrocytter fra donorblodprøven blev tilsat. 50 µl 0,8 % erytrocytsuspension blev afpipetteret til de respektive brønde ovenover gelen i LISS Coombs gelkortet. Derefter blev 25 µl anti-lu a og anti-lu b afpipetteret øverst i brønden ovenover gelen. LISS Coombs gelkortet blev inkuberet i 15 min. ved 37 C i ID-Incubator 37 S II, og derefter centrifugeret i 10 min. ved 910 rpm 1800 g i ID- centrifuge 24 S. Ved brug af aflæsningsskema blev resultaterne af reaktionerne gradueret fra til ++++, hvor betyder, at alle erytrocytter ligger i bunden af søjlen. ++++ plus betyder, at alle erytrocytter ligger i toppen af gelen, jf. bilag 2, da disse bliver tilbageholdt af gelens netværk. Ved tvivl blev der konfereret med erfarne bioanalytikere på afdelingen. De samme to personer aflæste resultaterne. Glasteknik, A 1 For at fremstille 5 % erytrocytsuspensioner for hver prøve anvendt i analysen blev 1 ml cellstab overført til widalglas hvorefter 50 µl pakkede erytrocytter fra donorblodprøven blev tilsat. Ved samme fremgangsmåde blev suspensionen fra blodprøven, tilhørende den fremsøgte A 1 - blodkomponent (negativ kontrol) fremstillet. 50 µl 5 % erytrocytsuspension blev afpipetteret over i nyt reagensglas hvorefter 50 µl testsera Seraclone TM anti-a 1 blev afpipetteret i glasset. Reagensglassene blev inkuberet ved stuetemp. i 5 min. og centrifugeret i ROTINA 46 (Hettich Zentrifugen) ved 1000 rpm i 1 min. ved 200 g, jf. bilag 4. Aflæsningen foregår ved at vippe glasset forsigtigt over et spejl og reaktionerne graduereres fra til ++++ vha. aflæsningsskema. Ved (negativ) ses ved en homogen blanding, mens ++++ ses som et fuldkomment agglutinat uden frie erytrocytter i supernatanten. Den samme person aflæste alle resultater. Side 18 af 76

Automatiseret fænotypebestemmelse Hold 2, 3 og 4 til holdbarhedsforsøget blev analyseret dag 1, 2, 4, 7, 10 og 14 efter tapning. På prøve nr. 14453735 (Lu(a+ b+)), fra hold 3, blev der detekteret clot på dag 7 og denne prøve er derfor ikke analyseret før dag 10. Alle prøver fra hold 1 blev analyseret dag 1, 2, 4, 7 og 10. Lu(a- b+) prøver fra hold 1 i holdbarhedsforsøget blev analyseret dag 16 i stedet for dag 14, mens de resterende prøver fra hold 1 blev analyseret dag 14. På prøve nr. 14453902 (Lu(a+ b+)) fra hold 3, blev der på dag 14 detekteret clot. Prøvens pakkede erytrocytter blev vasket 2 x med PBS, jf. anbefalinger i forskrift for NEO (Immucor), se bilag 8. Fænotypebestemmelserne foregik på NEO (Immucor), hvor der var medtaget Rh-kontrol til hver prøve undtagen ved Lu b fænotypebestemmelsen. Hæmagglutinationsteknik med IgM-antistoffer på NEO(Immucor) til A 1 fænotypebestemmelse Reagenser (Galileo diluent, anti-a 1 Lectin testsera, Rh-kontrol) blev varmet op til stuetemperatur og holdbarheden samt mængden blev kontrolleret. Herefter blev prøver, reagenser og neutrale mikrotiterplader loaded på NEO (Immucor). Mikrotiterpladen blev aflæst af CCD kamera for at kontrollere korrekt mængde af strips og om de var anvendelige til analysen. For hver prøve blev der fremstillet 0,9 % erytrocytsuspensioner af pakkede erytrocytter samt fortyndet med diluent direkte i brønden. En mængde erytrocytsuspension blev overført til Rh-kontrol brønden. Herefter blev Rh-kontrol og testsera afpipetteret til de respektive brønde, hvorefter mikrotiterpladen blev inkuberet. Efter endt inkubation blev mikrotiterpladen centrifugeret og reaktionsstyrken blev aflæst af CCD kamera, for ovenstående metode se bilag 9. Et positivt resultat ses som et eller som flere mindre agglutinater, mens der ved en negativ resultat ikke ses agglutination, se figur 4. Figur 4: Billedet til venstre viser et positivt resultat, mens billedet til højre viser et negativt resultat. Billederne er fra NEO (Immucor). Side 19 af 76

Fast fase teknik med IgG-antistoffer på NEO (Immucor) til Lu a og Lu b fænotypebestemmelse Reagenser (Capture LISS, Capture-R Indikatorceller, Rh- kontrol, anti-lu(a) og anti-lu(b) testsera) blev varmet op til stuetemperatur og holdbarhed samt mængde blev kontrolleret. Indikator, der påviser om kittet til Capture-R SELECT mikrotiterplader har været udsat for fugt, blev kontrolleret for farveskrift. Herefter blev blodprøver, reagenser og mikrotiterplader loaded på NEO (Immucor). Mikrotiterpladen blev aflæst af CCD kamera for at kontrollere korrekt mængde af strips samt om de var anvendelige til analysering. Havde stripsene været udsat for fugt kunne der ikke dannes et korrekt monolayer i bunden af brøndene. For at undgå spild og kontaminering af øvrige brønde afpiptteres system liquid solution til hver brønd i Lu a fænotypebestemmelsen. For hver prøve til fænotypebestemmelse af Lu a blev der fremstillet 3,2 % erytrocytsuspensioner af pakkede erytrocytter som blev fortyndet med system liquid solution direkte i brønden. Til fænotypebestemmelse af Lu b blev 4,1 % erytrocytrosuspensioner fremstillet ved samme fremgangsmetode. Ved Lu a fænotypebestemmelsen blev en mængde erytrocytsuspension overført videre til Rh-kontrol-brønden. Mikrotiterpladen blev centrifugeret for at fremme bindingen mellem anti-rbc coated til brønden, og donor erytrocytter (monolayer). Mikrotiterpladen blev efterfølgende vasket for at fjerne overskydende ubundende erytrocytter. For at sikre, at monolayer er korrekt, blev mikrotiterpladen aflæst af CCD kamera. 50 µl LISS, 15 µl Rh-kontrol og 25µl testsera blev efterfølgende afpipetteret til de respektive brønde. Mikrotiterpladen aflæses for at kontrollere at LISS, Rh-kontrol og testsera er afpipetteret til de korrekte brønde og herefter mikrotiterpladen blev inkuberet. Efter endt inkubation blev mikrotiterpladen vasket for at fjerne alt ubundet materiale i brøndene og dernæst aflæst. Efter blev 55 µl indikatorceller afpipetteret til alle brønde, hvorefter centrifugering blev foretaget for at fremme bindingen af indikatorceller til evt. bundne antistoffer. Herefter blev resultatet af reaktionsstyrkerne aflæst i CCD kamera, se bilag 9 for ovenstående metode. Et positivt resultat ses som en sky af indikatorceller som er bundet i brønden, mens et negativt resultat ses som et pellet, se figur 4. Ved endt analysering blev Rh-kontrollerne ved Lu a kontrolleret og godkendt, og evt. fejlmeddelelser blev gennemset. For at Rh-kontrollen er godkendt skal denne være negativ, er den positiv gentages analysen, jf. bilag 6. Side 20 af 76

Figur 5: Billedet til venstre viser en positiv reaktion, mens billedet til højre viser en negativ reaktion. Billederne er fra NEO (Immucor). Ved endt analysering blev Rh-kontrollerne kontrolleret og godkendt, og evt. fejlmeddelelser blev gennemset. For at Rh-kontrollen er godkendt skal denne være negativ, er den positiv gentages analysen, jf. bilag 6. Tolkning af resultater på NEO (Immucor) Apparaturet kan afgive svar på fire forskellige måder: ved graduering fra til ++++, ved et billede, score og positiv/negativ. Fra holdbarhedsforsøget blev rådata anvendt i form af den score NEO (Immucor) beregner, mens der til metodesammenligningen blev anvendt reaktionsstyrker gradueret fra til ++++, hvorefter at disse blev omsat til enten positiv, inkonklusiv eller negativ alt efter apparaturets samt afdelingens fastsatte cut-off værdier. Afdelingen accepterer donors fænotype positive ved +++ og ++++, mens NEO (Immucor) s positive cut-off værdi accepterer donors fænotyper positive ved +, jf. bilag 5 og 6. Databehandling Til behandling af rådata i metodesammenligningen blev opstillet en kontigenstabel i 3x3 format, én for hver fænotype, der sammenholder den manuelle teknik overfor automatiseret teknik på NEO (Immucor). I tabellen blev resultaterne inddelt i positive, inkonklusive og negative. For at undersøge om der evt. var en signifikant forskel mellem antallet af inkonklusive resultater for hver metode, blev anvendt en Fishers eksakte test anvendt. Pga. økonomiske årsager var stikprøven ikke stor nok til at kunne lave en χ 2 -test og derfor blev Fishers eksakte test anvendt i stedet for. For at kunne beregne Fishers eksakte test blev resultaterne fra metodesammenligningen konverteret til et 2x2 format, hvor det derfor var antallet af inkonklusive resultater holdt op mod antallet af konklusive resultater. Antallet af konklusive resultater udgøres af accepterede positive og negative resultater. H 0 hypotesen blev opstillet: H 0 -hypotese: Antallet af inkonklusive resultater afhænger ikke af hvilken metode der anvendes. Side 21 af 76

H A hypotese: Antallet af inkonklusive resultater afhænger af hvilken metode der anvendes. Fishers eksakte test blev udført vha. det statistiske værktøj på http://quantpsy.org/fisher/fisher.htm, og signifikansniveauet blev valgt til 0,05. Som resultat af denne test fås en p-værdi, der angiver sandsynligheden for at der begås en fejl, hvis H 0 hypotesen forkastes. Ved det anvendte signifikans niveau på 0,05 (α = 0,05) accepteres det, at der er op til 5 % sandsynlighed for at der tages fejl. Er p>0,05 accepteres H 0 hypotesen, men er p<0,05 forkastes H 0 og H A hypotesen accepteres. I figur 3 ses opstillingen til beregning af Fishers eksakte test for inkonklusive prøver på hhv. manuel teknik overfor automatiseret teknik på NEO (Immucor). I Gp 1, Class 1 er indtastet antallet af inkonklusive resultater ved manuel teknik. I Gp 1, Class 2 er indtastet differensen mellem totale antal konklusive prøver og antallet af inkonklusive. I Gp 2, Class 1 er indtastet antallet af inkonklusive resultater på NEO (Immucor) og i Gp 2, Class 2 er indtastet differensen mellem totale antal konklusive prøver og antallet af inkonklusive, se figur 6. Figur 6: Eksempel på beregning af Fishers eksakte test. For resultaterne fra holdbarhedsforsøget blev det undersøgt om de var normalfordelt. Dette blev undersøgt for hver fænotype vha. probit-plots, for hver analyseringsdag ved hhv. 4 o C og stuetemperatur, se bilag 10 for eksempel. Rådata fra holdbarhedsforsøget blev for hver fænotype samt hver temperatur opstillet i xy-plots for, at visualisere forløbet for hver prøve i tidsrummet dag 1-14. Afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier blev desuden indtegnet i hvert xy-plot. For at overskueliggøre resultaterne i disse xy-plots er der lavet yderligere to plots, hvor der i det ene fremvises alle de prøver der var accepteret positive ud fra afdelingens cut-off værdi dag 1, mens der i det andet fremvises alle de prøver der var vurderet inkonklusive for både afdelingens og NEO s (Immucor) cut-off dag 1. For at vurderer om der er en signifikant forskel mellem reaktionsstyrkerne og antallet af dage donorblodprøverne opbevares, blev der anvendt Freidman test. H 0 hypotesen blev opstillet: Side 22 af 76

H 0 hypotesen: Resultatet af fænotypebestemmelsen er uafhængigt af antal dage blodprøven opbevares. H A hypotese: Resultatet af fænotypebestemmelsen afhænger af antal dage blodprøven opbevares. Signifikansniveauet blev valgt til 0,05. Som resultat af denne test fås en p-værdi der angiver sandsynligheden for at der begås en fejl, hvis H 0 hypotesen forkastes. Ved det anvendte signifikans niveau på 0,05 (α = 0,05) accepteres det, at der er op til 5 % sandsynlighed for at der tages fejl. Er P>0,05 accepteres H 0 hypotesen. Er P<0,05 forkastes H 0 og H A hypotesen accepteres. Friedman test er beregnet i XLSTAT. Pga. clot i prøve nr. 14453735 ved 4 C blev denne ikke medtaget i Friedman testen, da dette værktøj ikke kunne udfører beregningen med manglende data. Side 23 af 76

Resultater Metodesammenligning mellem manuel teknik og NEO (Immucor) A 1 Resultaterne fra analysering af 15 donorblodprøver for blodtypeantigenet A 1 med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) ses i tabel 1 og er inddelt i positive, inkonklusive og negative ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier, der for denne fænotype er de samme. Af tabel 1 ses det, at ingen af de 10 positive prøver bestemt ved manuel teknik blev bestemt negative på NEO (Immucor). Af de 5 negative prøver bestemt ved manuel teknik blev ingen bestemt positive på NEO (Immucor). Hverken ved manuel teknik eller på NEO (Immucor) er der ved A 1 fænotypebestemmelsen fundet inkonklusive resultater. Inden af metoderne vurderer donorblodprøverne inkonklusive og derfor er Fishers eksakte test ikke relevant at udføre, se bilag 10. Manuelteknik Positiv Inkonklusiv Negativ Total Positiv 10 0 0 10 NEO Inkonklusiv 0 0 0 0 Negativ 0 0 5 5 Total 10 0 5 15 Tabel 1: Kontingenstabel i 3x3 format for fænotypen A 1, angiver antallet af positive, inkonklusive og negative resultater bestemt ved hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) inddelt efter afdelingens og NEO s (Immucor) cut-off værdier. Lu a Resultaterne fra analysering af 20 donorblodprøver for blodtypeantigenet Lu a med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) ses i tabel 2 og er inddelt i positive, inkonklusive og negative ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Ud fra afdelingens cut-off værdier ses det af tabel 2, at der ved manuel teknik er bestemt 13 prøver positive, hvoraf ingen af dem er bestemt negative på NEO (Immucor) og ingen af de 6 prøver bestemt positive på NEO (Immucor), er negative ved manuel teknik. Ud af de 13 positive prøver bestemt ved manuel teknik, blev 8 bestemt inkonklusive på NEO (Immucor). Af 2 prøver bestemt inkonklusive ved manuel teknik blev 1 prøve bestemt inkonklusiv, mens den anden prøve blev bestemt positiv på NEO (Immucor). Ud af 5 negative prøver bestemt ved manuel teknik var 1 prøve Side 24 af 76

bestemt inkonklusiv og 4 prøver negative på NEO (Immucor). Ud fra NEO s (Immucor) cut-off værdier, se tabel 2, ses det, at ingen af de 13 positive prøver bestemt ved manuel teknik er bestemt negative på NEO (Immucor) og at ingen af de 12 positive bestemt på NEO (Immucor) er bestemt negative ved manuel teknik. Ud af de 13 positive bestemt ved manuel teknik er 2 prøver bestemt inkonklusive og 11 prøver bestemt positive på NEO (Immucor). Ud af 2 prøver bestemt inkonklusive ved manuel teknik er den ene prøve bestemt positiv og den anden bestemt inkonklusiv på NEO (Immucor). Ud af 5 prøver bestemt negative ved manuel teknik er 4 prøver bestemt negative og 1 prøve bestemt inkonklusiv på NEO (Immucor), se bilag 10. Manuelteknik Positiv Inkonklusiv Negativ Total Positiv 5 (11) 1 (1) 0 (0) 6 (12) NEO Inkonklusiv 8 (2) 1 (1) 1 (1) 10 (4) Negativ 0 (0) 0 (0) 4 (4) 4 (4) Total 13 2 5 20 Tabel 2: Kontingenstabel i 3x3 format for fænotypen Lu a, angiver antallet af positive, inkonklusive og negative resultater fundet ved hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) ud fra afdelingens positive og negative cut-off værdier for begge metoder. Tallene i parentes angiver antallet af prøver der er angivet hhv. positive, inkonklusive eller negative sammenholdt med NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Ud fra afdelingens cut-off værdier sammenholdes antallet af inkonklusive og konklusive prøver fra hver metode overfor hinanden i Fishers eksakte test. P-værdien fås til 0,0069. Ved α=0,05 fås at 0,0069<0,05 og dermed forkastes H 0 hypotesen og H A hypotesen accepteres. Ud fra NEO s (Immucor) positive cut-off værdi sammenholdes antallet af inkonklusive og konklusive prøver bestemt ved hhv. manuel teknik overfor automatiseret teknik på NEO (Immucor) med Fishers eksakte test. P-værdien fås til 0,3307,sand. Ved α=0,05 fås at 0,3307>0,05 og H 0 hypotesen accepteres. Lu b Resultaterne fra analysering af 20 donorblodprøver for blodtypeantigenet Lu b med hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor), ses i tabel 3 og er inddelt i positive, inkonklusive og negative ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Ud fra afdelingens cut-off værdier ses det af tabel 3, at der ved manuel teknik er bestemt 11 prøver Side 25 af 76

positive, hvoraf ingen af dem er bestemt negative på NEO (Immucor) og ingen af de 15 positive prøver bestemt på NEO (Immucor) er bestemt negative ved manuel teknik. Af de 11 positive prøver bestemt ved manuel teknik blev 11 bestemt positive på NEO (Immucor). Ud af 5 inkonklusive prøver bestemt ved manuel teknik blev 1 prøve bestemt inkonklusiv og 4 prøver positive på NEO (Immucor). Ud af 4 prøver negative bestemt ved manuel teknik blev 1 prøve bestemt inkonklusiv og 3 prøver negative på NEO (Immucor). Ud fra NEO s (Immucor) cut-off værdier, ses i tabel 3, at ingen af de 11 positive prøver bestemt ved manuel teknik er bestemt negative på NEO (Immucor), og ingen af de 16 positive prøver bestemt på NEO (Immucor) er bestemt negative ved manuel teknik. Ud af 5 inkonklusive prøver bestemt ved manuel teknik er 5 prøver bestemt positive på NEO (Immucor). Ud af 4 negative prøver bestemt ved manuel teknik er 3 prøve negative og 1 prøve inkonklusiv på NEO (Immucor), se bilag 10. Manuelteknik Positiv Inkonklusiv Negativ Total Positiv 11 (11) 4 (5) 0 (0) 15 (16) NEO Inkonklusiv 0 (0) 1 (0) 1 (1) 2 (1) Negativ 0 (0) 0 (0) 3 (3) 3 (3) Total 11 5 4 20 Tabel 3: Kontingenstabel i 3x3 format for fænotypen Lu b, angiver antallet af positive, inkonklusive og negative resultater fundet ved hhv. manuel teknik og automatiseret teknik på NEO (Immucor) ud fra afdelingens positive og negative cut-off værdier for begge metoder. Tallene i parentes angiver antallet af positive, inkonklusive eller negative inddelt efter NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Én prøve var i ProSang angivet som Lu(b-), men blev ved begge metoder bestemt som Lu(b+) og blev fortsat medtaget. Ud fra afdelingens cut-off værdier sammenholdes antallet af inkonklusive og konklusive prøver bestemt ved hhv. manuel teknik overfor automatiseret teknik på NEO (Immucor) med Fishers eksakte test. P-værdien fås til 0,2037. Ved α=0,05 fås at 0,2037>0,05 og H 0 hypotesen accepteres. Side 26 af 76

Reaktionsstyrke, score Camilla Thinggård Jacobsen Bachelorprojekt, 19.12.2014 Holdbarhedsforsøg A 1 Ved analysering af 5 donorblodprøver med fænotypen A 1 på hhv. dag 1,2, 4, 7, 10 og 14 ved 4 C og stuetemp. på NEO (Immucor) er reaktionsstyrkerne inddelt ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Hvert prøvenummer har samme farve punkter og kurve i xy-plots ved hhv. 4 C og stuetemp.. A 1 prøver opbevaret ved 4 C Ud fra figur 7 ses, at alle 5 prøver opbevaret ved 4 o C, dag 1-14 bestemmes positive for A 1 ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) cut-off. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Holdbarhedsforsøg over 14 dage på A 1 ved 4 grader 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Analyseringsdage Prøvenr. 14452869 Prøvenr. 14452849 Prøvenr. 14453097 Prøvenr. 14453577 Prøvenr. 14453609 NEO/ Afd. Positiv cutoff Negativ cutoff Figur 7: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen A 1 opbevaret ved 4 C. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I plottet er indtegnet afdelingens og NEO s (Immucor) krav til positive og negative cut-off værdier A 1 prøver opbevaret ved stuetemperatur Ud fra figur 7 ses, at alle 5 prøver opbevaret ved stuetemp., dag 1-14 bestemmes positive for A 1 ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) cut-off. Side 27 af 76

Reaktionsstyrke, score Camilla Thinggård Jacobsen Bachelorprojekt, 19.12.2014 100 90 80 70 60 Holdbarhedsforsøg over 14 dage på A 1 ved stuetemp. Prøvenr. 14452869 Prøvenr. 14452849 Prøvenr. 14453097 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Analyseringsdage Prøvenr. 14453577 Prøvenr. 14453609 NEO/ Afd. Positiv cutoff Negativ cutoff Figur 8: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen A 1 opbevaret ved stuetemp.. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO s (Immucor) krav til positive og negative cut-off værdier. Friedman testen er undladt, da der ikke ses nogen betydelig ændring af reaktionsstyrkerne over analyseringsdagene for hhv. 4 o C og stuetemp. Yderligere er der ikke foretaget temperatursammenligninger ved xy-plot, da der ikke ses nogen ændring i reaktionsstyrkerne ved begge opbevaringstemperaturer, se figur 7 og 8. Lu a Ud fra xy- plot ses reaktionsstyrkerne ved analysering af 10 donorblodprøver med fænotypen Lu a opbevaret ved hhv. 4 C (figur 9) og stuetemperatur (figur 10) analyseret på dag 1,2, 4, 7, 10 og 14 på NEO (Immucor). Reaktionsstyrkerne er inddelt ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Hvert prøvenummer har samme farve punkter og kurve i xy-plots ved hhv. 4 C og stuetemp.. Lu a prøver opbevaret ved 4 C På figur 9 ses det af afdelingens cut-off dag 1, at 6 prøver accepteres som positive og 4 prøver som inkonklusive på. Dag 2 accepteres 4 prøver som positive og 6 prøver som inkonklusive. Dag 4 Side 28 af 76

accepteres 5 prøver som positive, mens 4 prøver vurderes som inkonklusive og 1 prøve som negativ. Dag 7 accepteres 2 prøver som positive, 7 prøver som inkonklusive og 1 prøve som negativ. Dag 10 accepteres 5 prøver positive, 4 prøver som inkonklusive og 1 prøve som negativ. Dag 14 ses, at 8 prøver er inkonklusive og 2 prøver negative. Af figur 9 ses det af NEO s (Immucor) cut-off værdier dag 1, at 8 prøver accepteres som positive og 2 prøver som inkonklusive. Dag 2 accepteres 9 prøver positive og 1 prøve som inkonklusiv. Dag 4 accepteres 7 prøver som positive, mens 2 prøver vurderes inkonklusive og 1 negativ. Dag 7 accepteres 7 prøver som positive, 2 prøver som inkonklusive og 1 prøve negativ. Dag 10 accepteres 7 prøver som positive, mens 2 prøver vurderes inkonklusive og 1 negativ. Dag 14 accepteres 3 prøver som positive, mens 5 inkonklusive og 2 negative. Hvert prøvenummer har samme farve punkter og kurve for hvert xy-plots ved hhv. 4 C og stuetemp.. Side 29 af 76

Figur 9: xy-plots ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lua opbevaret ved 4 C. Reaktionsstyrkerne beregnet som en score på NEO (Immucor) er afsat som funktion af analyseringsdagene. I plottet er indtegnet afdelingens og NEO s (Immucor) krav til positive og negative cut-off værdier. (1) Alle prøver er afbildet, (2) Prøver som ud fra afdelingens cut-off er positive dag 1 er afbildet, (3) Prøver som ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) cut-off er vurderet inkonklusive dag 1 er afbildet. Data for analysering af Lu a ved 4 C for alle analyseringsdage sammenholdes i en Friedman test og p-værdien fås til 0,002. Ved α=0,05 ses det, at 0,002< 0,05 og H 0 hypotesen forkastes. Ved derefter at sammenholde analyseringsdagene 1,2,4,7 og 10 fås p-værdien 0,573. Ved α=0,05 fås at 0,573>0,05 og H 0 hypotesen accepteres. Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur Af figur 10 ses det af afdelingens cut-off værdier dag 1, at 5 prøver accepteres som positive og 5 prøver som inkonklusive. Dag 2 accepteres 4 prøver som positive og 6 prøver som inkonklusive. Side 30 af 76

Dag 7 accepteres 1 prøve som positiv, 8 prøver som inkonklusive og 1 prøve som negativ. Dag 10 accepteres 3 prøver som positive, mens 5 prøver vurderes inkonklusive og 2 prøver som negative. Dag 14 er 8 prøver vurderes som inkonklusive og 2 prøver negative. Af figur 10 ses det af NEO s (Immucor) cut-off værdier dag 1, at 8 prøver er positive og 2 prøver er inkonklusive. Dag 2 accepteres 9 prøver som positive og 1 prøve vurderes inkonklusiv. Dag 4 accepteres 1 prøve positiv, mens 8 prøver vurderes inkonklusive og 1 prøve som negativ. Dag 7 accepteres 5 prøver som positive, mens 4 prøver vurderes inkonklusive og 1 prøve som negativ. Dag 10 accepteres 5 prøver som positive, mens 3 prøver vurderes inkonklusive og 2 som negativ. Dag 14 accepteres 2 prøver som positive, mens 6 prøver vurderes inkonklusive og 2 som negative. Side 31 af 76

Figur 10: xy-plots ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lu a opbevaret ved stuetemp.. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I grafen er indtegnet afdelingens og NEO s (Immucor) krav til positive og negative cut-off værdier. (1) Alle prøver er afbildet, (2) Prøver som ud fra afdelingens cut-off er positive dag 1 er afbildet, (3) Prøver som ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) cut-off er vurderet inkonklusive dag 1 er afbildet. Side 32 af 76

Data for alle analyseringsdage ved analysering af Lu a donorblodprøver opbevaret ved stuetemp. sammenholdes i en Friedman test og p-værdien fås til 0,014. Ved α=0,05 ses det, at 0,014< 0,05 og H 0 hypotesen forkastes hvorved H A hypotesen må accepteres. Når analyseringsdagene 1,2,4,7 og 10 sammenholdes fås p-værdien 0,181. Ved α= 0,05 fås at 0,181>0,05 og H 0 hypotesen accepteres. Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur Af figur 11 ses at de målte reaktionsstyrker ved hhv. 4 o C og stuetemperatur dag 1, 2 og 4 ligger tilnærmelsesvis på den indtegnede identitetslinje med skæring i (0,0). Dag 7 ligger 6 prøver over den indtegnede identitetslinje, mens 1 prøve ligger under. Dag 10 ses at 5 prøver ligger over identitetslinjen, mens 3 prøver ligger under. Dag 14 ligger 6 prøver over identitetslinjen, mens 4 prøver ligger under. Figur 11: xy-plot hvor reaktionsstyrker ved 4 C er sat som funktion af reaktionsstyrker ved stuetemperatur. Plottet viser sammenhængen mellem reaktionsstyrkerne ved Lu a fænotypebestemmelsen på 10 prøver opbevaret hhv. 4 C og stuetemperatur. Der er indtegnet en identitetslinje (x=y) med skæring i (0,0). Side 33 af 76

Ud fra xy-plot ses reaktionsstyrkerne ved analysering af 10 donorblodprøver med fænotypen Lu b opbevaret hhv. 4 o C (figur 6) og stuetemperatur (figur 7) analyseret på dag 1,2, 4, 7, 10 og 14 på NEO (Immucor). Reaktionsstyrkerne er inddelt ud fra afdelingens og NEO s (Immucor) positive og negative cut-off værdier. Hvert prøvenummer har samme farve punkter og kurve i samme xy-plots ved hhv. 4 C og stuetemp.. Lu b prøver opbevaret ved 4 C Af figur 12 ses det af afdelingens cut-off værdi dag 1, at 9 prøver accepteres som positive og 1 prøve vurderes inkonklusiv. Dag 2 accepteres 8 prøver positive og 2 prøver vurderes inkonklusive. Dag 4 accepteres 9 prøver positive og 1 prøve vurderes inkonklusiv. Dag 7 udgik prøve nr. 14453735 pga. clot og ved efterfølgende reanalysering var NEO (Immucor) ude af drift. Denne analyseringsdag accepteres 8 prøver som positive og 1 som inkonklusiv. Dag 10 accepteres 9 prøver positive og 1 prøve vurderes inkonklusiv. Dag 14 accepteres 10 prøver positive. Af figur 12 ses det af NEO s (Immucor) cut-off værdier dag 1, 2 og 4, at 10 prøver accepteres positive. Dag 7 accepteres 9 prøver som positive, da prøve nr. 14453735 pga. clot og at NEO (Immucor) og ved efterfølgende reanalysering var NEO (Immucor) ude af drift. Dag 10 og dag 14 accepteres 10 prøver positive. Side 34 af 76

Reaktionsstyrke, score Camilla Thinggård Jacobsen Bachelorprojekt, 19.12.2014 100 Holdbarhedsforsøg over 14 dage ved på Lu b ved 4 C 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Analyseringsdage Prøvenr. 14452801 Prøvenr. 14453967 Prøvenr. 14453902 Prøvenr. 14453735 Prøvenr. 14455991 Prøvenr. 14452956 Prøvenr. 14452940 Prøvenr. 14452939 Prøvenr. 14452899 Prøvenr. 14452878 Afd. Positiv cut-off NEO positiv cut-off Figur 12: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lu b opbevaret ved 4 C. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I plpootet er indtegnet afdelingens og NEO s (Immucor) krav til positive og negative cut-off værdier. Data for alle analyseringsdage ved analysering af Lu b prøver opbevaret ved 4 o C sammenholdes i en Friedman test. Prøve nr. 14453735 er ikke medtaget i beregningerne af Friedman test, da der ikke er data for dag 7. P-værdien fås til 0,874. Ved α=0,05 ses det at 0,874 >0,05 og H 0 hypotesen accepteres. Lu b prøver opbevaret ved stuetemperatur Af figur 13 ses det af afdelingens cut-off værdier dag 1, 2 og 4, at 9 prøver accepteres som positive og 1 inkonklusiv. Dag 7 accepteres 6 prøver positive, mens 4 prøver vurderes inkonklusive. Dag 10 accepteres 7 prøver positive, mens 3 prøver vurderes som inkonklusive. Dag 14 blev pakkede erytrocytter fra prøve nr. 14453902 vasket 2 x med PBS pga. clot. Herefter bestemmes 8 prøver positive og 2 prøver vurderes inkonklusive. Af figur 13 ses det af NEO s (Immucor) cut-off værdier dag 1,2 og 4 at 10 prøver accepteres som positive. Dag 7 og dag 10 accepteres 9 prøver er positive og 1 inkonklusiv. Dag 14 blev pakkede erytrocytter fra prøve nr. 14453902 vasket 2 x med PBS pga. clot, hvorefter at 10 prøver accepteres som positive. Side 35 af 76

Reaktionsstyrke, score Camilla Thinggård Jacobsen Bachelorprojekt, 19.12.2014 Holdbarhedsforsøg over 14 dage på Lu b ved stuetemp. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Analyseringsdage Prøvenr. 14452801 Prøvenr. 14453967 Prøvenr. 14453902 Prøvenr. 14453735 Prøvenr. 14455991 Prøvenr. 14452956 Prøvenr. 14452940 Prøvenr. 14452939 Prøvenr. 14452899 Prøvenr. 14452878 Afd. Positiv cut-off NEO positiv cut-off Negativ cut-off Figur 13: xy-plot ud fra holdbarhedsforsøg på prøver med fænotypen Lu b opbevaret ved stuetemp.. Reaktionsstyrkerne, beregnet som en score på NEO (Immucor), er afsat som funktion af analyseringsdagene. I plottet er indtegnet afdelingens og NEO s (Immucor) krav til positive og negative cut-off værdier. Data for alle analyseringsdage ved analysering af Lu b prøver opbevaret ved stuetemp. sammenholdes i en Freidman test og p-værdien fås til 0,026. Ved α=0,05 ses det, at 0,026< 0,05 og H 0 hypotesen forkastes og derved må H A hypotesen accepteres. Reaktionsstyrker sammenholdt ud fra opbevaringstemperatur Af figur 14 ses det, at de målte reaktionsstyrker ved hhv. 4 o C og stuetemperatur dag 1, 2, 4, 7, 10 og 14 ligeligt fordelt omkring den indtegnede identitetslinje med skæring i (0,0). Side 36 af 76

Figur 14: xy-plot hvor reaktionsstyrker ved 4 C er sat som funktion af reaktionsstyrker ved stuetemperatur. Plottet viser sammenhængen mellem reaktionsstyrkerne ved Lu b fænotypebestemmelsen på 10 prøver opbevaret hhv. 4 C og stuetemperatur. Der er indtegnet en identitetslinje (x=y) med skæring i (0,0). Side 37 af 76

Diskussion Metodesammenligning og holdbarhed for A 1 Som det fremgår af tabel 1, er NEO (Immucor) og glas teknik enige i fænotypebestemmelsen af A 1 og finder 10/10 positive prøver og 5/5 negative prøver. Der ikke er behov for at prøver skal reanalyseres, da der ikke er inkonklusive resultater. I et studie af Schmidt et al. finder manuel gelteknik og fast fase teknologi på Galileo (Immucor) ligeledes sammenlignelige resultater og det er derfor forventet at NEO (Immucor) og manuel gelteknik er enige [19]. Af figur 7 og 8 fremgår det, at der ikke sker nogen ændring af reaktionsstyrkerne for fænotypen A 1 efter opbevaring i 14 dage ved hhv. 4 C og stuetemp.. Opbevaringstemperaturen har derfor ikke nogen klinisk betydning for fænotypebestemmelse af A 1. Det kan på baggrund af resultaterne konkluderes, at fænotypebestemmelsen af A 1 fremover kan automatiseres på NEO (Immucor) efter opbevaring i 14 dage ved hhv. 4 C og stuetemp.. Producenten af NEO (Immucor) anbefaler at donorblodprøver i EDTA kan opbevares op til 14 dage [7] og derudover beskriver et studie af Vandromme et al. at erytrocytter kan opbevares op til 14 dage før, der begynder at ske ændringer [20]. Det antages på baggrund af dette, at blodtypeantigenerne derfor, på dag 14, endnu ikke er blevet nedbrudt af enzymerne lipase, glycosidase og protease, som frigives fra leukocytter, når disse nedbrydes [16][21]. Det kan derfor forventes at få stærke reaktionsstyrker de første dage og frem til dag 14. Metodesammenligning for Lu a fænotypen Af tabel 2 fremgår det af resultaterne, ud fra afdelingen cut-off værdier, at metoderne er enige om 5/13 positive prøver og 4/4 negative prøver. Ved Fishers eksakte test forkastes H 0 hypotesen og H A hypotesen accepteres, hvilket betyder, at antallet af inkonklusive resultater afhænger af hvilken metode der anvendes. Ved Fishers eksakte test ud fra NEO (Immucor) s positive cut-off værdi ses det at H 0 hypotesen kan accepteres. For at fænotypebestemmelsen af Lu a skal kunne blive automatiseret på NEO (Immucor) kan det på baggrund af resultaterne diskuteres, om afdelingen bør sætte deres cut-off værdi for positive resultater ned, for at få flere prøver accepteret positive for Lu a. For de donor der er heterozygote for Lu a, kan antallet antigener, der udtrykkes på deres erytrocytterne, varierer [8]. Selvom donorernes fænotype er positiv vil de blive vurderet inkonklusiv på NEO (Immucor), pga. de vil få svage reaktioner. Sammenlignet med fænotypebestemmelse for A 1 på NEO (Immucor) er det svære at detektere Lu a -antigenerne, da A 1 -antigenerne agglutinerer hurtigere og giver stærkere agglutinater [2]. Afdelingens cut-off værdi er sat på baggrund af andre fænotypebestemmelser som allerede er valideret på NEO (Immucor) og disse blodtypeantigener har nogle høje reaktionsstyrker [6]. Dog er Side 38 af 76

afdelingens positive cut-off værdi for fænotypebestemmelse af K og N sat ned, og disse fænotyper accepteres positive ved ++, jf. bilag 5. Sætter KIA ikke deres cut-off værdi ned, vil KIA ikke finde de svagt positive fænotyper og samtidig vil arbejdsbyrden for afdelingen blive stor, da alle de inkonklusive prøver skal reanalyseres. Den positive cut-off værdi må dog ikke sætte for lavt, da ellers negative fænotyper kan blive ende med at blive vurderet positive. Med hensyn til arbejdsbyrden, vil det på nuværende tidspunkt ikke være mere tidsbesparende at anvende automatiseret fænotypebestemmelse frem for manuel fænotypebestemmelse i LISS Coombs gelkort, da der på NEO (Immucor) er mange prøver der skal reanalyseres. Ved at sætte cut-off værdien for langt ned vil afdelingen risikere at få falsk positive resultater. Tidligere har KIA haft problemer med IgG-antistoffer hos donorblodprøver ældre end en uge. Dette problem blev løst med stærkere testsera, hvor der er en højere koncentration af antistoffer som kan binde til blodtypeantigenerne på donorerytrocytterne som igen binder til indikatorcellerne og derved fås en stærkere reaktion. Det kan evt. være en mulighed for denne fænotype, hvis ikke afdelingen ønsker at sætte deres positive cut-off værdi ned. Det er muligt at der kan forekomme flere agglutinater, som øger scoren for reaktionsstyrken ved, at forlænge inkubationstiden. Holdbarhed for fænotypen Lu a ved 4 C På figur 9 ses, at der er stor forskel på prøvernes reaktionsstyrke de enkelte dage. Reaktionsstyrkerne dag 2 for nogle af prøverne falder fra intervallet 80-90 (positiv) til en score på omkring 40 (inkonklusiv). En prøves score falder fra 90 (positiv) dag 4 til 50 (inkonklusiv) dag 7 og stiger igen til 87 (positiv) dag 10. Det samme mønster ses at være gentagende for to andre prøver. Variation mellem reaktionsstyrkerne af den enkelte prøve over flere dage kan enten skyldes, at prøverne er heterozygote og derved har færre antigener udtrykt overfladen af erytrocytterne[8], eller en analysevariation. Ved beregning af Friedman test fås p-værdien 0,002, hvor H 0 hypotesen må forkastes og H A hypotesen accepteres, hvilket betyder, at resultaterne af fænotypebestemmelsen afhænger af antal dage blodprøven opbevares. Det fremgår af figur 9, ud fra afdelingens positive cut-off værdi, at alle resultater bliver inkonklusive og negative dag 14. Dette betyder, at fænotyper der i virkeligheden er positive, vil blive bestemt som værende negative og dette kan være farligt for patienten hvis vedkommende har dannet anti-lu a imod Lu a -antigenet, hvorved der kan opstå hæmolytisk transfusionsreaktioner [2]. Det vurderes på baggrund af reaktionsstyrkerne vist i figur 8 på dag 14, at dag 14 undlades i endnu en Friedman test, hvor p-værdien fås til 0,573 og dermed kan H 0 hypotesen accepteres. Dette betyder, at der ses en signifikant forskel, hvor resultaterne af fænotypebestemmelsen afhænger af Side 39 af 76

antal dage blodprøven opbevares, mellem dag 10 og 14, det vides dog ikke af hvilken dag den signifikante forskel forekommer. Donorblodprøver kan derfor på nuværende tidspunkt ikke opbevares længere end 10 dage ved 4 C. Det kan formodes at blodtypeantigenerne på dag 14 er ved at blive nedbrudt af enzymer som protease, lipase og glycosidase, som frigives fra leukocytter, når disse nedbrydes [14][15]. Et stærkere testsera kunne igen være en løsning på problemet, da en større koncentration af antistoffer kan binde til flere erytrocytter og derved igen binde flere indikatorceller, hvorved scoren for reaktionsstyrken bliver større. Ved at sætte afdelingen positive cut-off værdi ned, vil det formentlig ikke ændre meget på antallet af positive fænotyper dag 14, da scoren for reaktionsstyrkerne ligger fra omkring 65 (inkonklusiv ud fra afdelingens positive cut-off værdi) og falder helt ned til omkring 15 (negativ). Holdbarhed for fænotypen Lu a ved stuetemperatur Af figur 10 ses fire positive prøver dag 1 og 2 som falder fra en score på omkring 75-87 (positiv) til en score på omkring 20 (inkonklusiv). De prøver der er bestemt inkonklusiv dag 1 og 2 har en score der varierer meget, men stadig inden for afdelingens inkonklusive område. En prøves score dag 2 var på 43 (inkonklusiv), hvor den dag 4 og 7 steg til 83 (positiv) og steg igen til 90 (positiv) på dag 10, hvilket kan skyldes analysevariation. For at gøre reaktionsstyrkerne højere kan ligeledes anvendes et stærkere testsera for de prøver der er opbevaret ved stuetemp., så der på donorerytrocytterne kan bindes mere antistof, som igen kan binde flere indikatorceller, hvorved reaktionsstyrken vil blive højere. I Friedman testen, fås p-værdien til 0,014, hvor H 0 hypotesen derfor må forkastes og H A hypotesen accepteres, hvilket betyder, at resultaterne af fænotypebestemmelsen afhænger af antal dage blodprøven opbevares. Som det ses af figur 10, ligger alle resultater i det inkonklusive eller negative område ud fra afdelingens cut-off på dag 14. Dette betyder, at fænotyper der i virkeligheden er positive, vil blive bestemt som værende negative og dette kan være farligt for patienten hvis vedkommende har dannet anti-lu a imod Lu a -antigenet, hvorved der kan opstå hæmolytisk transfusionsreaktioner [2]. For at undersøge om der på dag 14 forekommer en signifikant forskel undlades denne dag i en Friedman test, hvor p-værdien fås til 0,181. H 0 hypotesen kan herved accepteres. Dette betyder, at der ses en signifikant forskel, hvor resultaterne af fænotypebestemmelsen afhænger af antal dage blodprøven opbevares, mellem dag 10 og 14. Det vides dog ikke af hvilken dag den signifikante forskel forekommer. Det kan konkluderes ud fra p-værdien, hvor dag 14 er undladt, og ud fra figur Side 40 af 76

11 f, hvor prøverne ligger tilfældigt på begge sider af identitetslinjen, at donorblodprøverne ikke kan opbevares længere end 10 dage ved stuetemp. Som det også fremgår af figur 10, er reaktionsstyrkerne på dag 1, 2 og 4 næsten lig hinanden, dvs. x=y, hvor det på dag 7 og 10 kan ses, at prøverne ligger over identitetslinjen (x=y). Det fremgår derfor, at det har en betydning for blodtypeantigenerne at de bliver opbevaret ved 4 C, hvor de har en længere holdbarhed frem for ved opbevaring ved stuetemp., da erytrocytter der opbevares ved stuetemp metaboliserer 10 gange hurtigere end erytrocytter opbevaret ved 4 C [16]. Det kan formodes at blodtypeantigenerne på dag 14, er ved at blive nedbrudt af enzymerne protease, lipase og glycosidase, som frigivet fra leukocytter, når disse nedbrydes, da et studie af Hess et al. også bekræfter dette [14][15]. Metodesammenligning for fænotypen Lu b Af tabel 3 fremgår det ud fra afdelingens positive cut-off værdi, at NEO (Immucor) og manuel teknik, søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort, detekterer 11/15 positive prøver og 3/3 negative prøver. Den manuelle teknik vurderer fire prøver inkonklusive ud fra afdelingens positive cut-off værdi, hvor NEO (Immucor) accepterer disse som positive med +++ og ++++. En af de homozygote prøver havde en bekræftet fænotype Lu(a+ b-), men blev bestemt til Lu(a+ b+) på NEO (Immucor) med en graduering på ++ og for den manuelle teknik en graduering på +. Det kan på baggrund af disse resultater diskuteres om NEO (Immucor) er mere sensitiv end den teknik der tidligere er blevet anvendt til fænotypebestemmelse af denne prøve. Resultaterne fra NEO (Immucor), ved fænotypebestemmelse af Lu b, er generelt et + stærkere end resultaterne fra den manuelle teknik, se bilag 10, og samtidig finder NEO (Immucor) en Lu(a+ b-) donor til at være Lu(a+ b+). Årsagen til dette er, at der muligvis anvendes et stærkere testsera på NEO (Immucor) end der gøres ved manuel søjleagglutinationsteknik i LISS Coombs gelkort. KIA kan uden problemer flytte fænotypebestemmelsen af Lu b til NEO (Immucor). Afdelingen behøver ikke sætte deres positive cut-off værdi ned eller anskaffe stærkere testsera, da reaktionsstyrkerne generelt er høje, jf. bilag 10. Som det ligeledes kan være svært at detektere Lu a - antigener, kan det også være svært at detektere Lu b -antigener, da disse også kan varierer i styrke i mellem erytrocytterne [8]. Holdbarhed for fænotypen Lu b ved 4 C På figur 12 fremgår det, at prøvernes reaktionsstyrke ligger over afdelingens cut-off værdi alle analyseringsdage, bortset fra én prøve som bestemmes til at være inkonklusiv. Én prøve som bestemmes positiv dag 1, vurderes inkonklusiv dag 2 og dag 4 bliver denne positiv igen og forbliver Side 41 af 76

positiv. Variationen kan skyldes en analysevariation og denne prøve vil i rutinen blive reanalyseret og har derfor ingen klinisk betydning. Scoren for reaktionsstyrkerne for alle prøver ligger generelt mellem 80 og 100 (positive) for alle analyseringsdage, hvilket betyder, at donorblodprøverne har en holdbarhed i 14 dage ved 4 C, som producenten af NEO (Immucor) lover [7]. Under opbevaring ved 4 C i 14 dage når blodtypeantigenerne givetvis ikke at blive nedbrudt af enzymer, som protease, lipase og glycosidase der frigives fra leukocytter når disse nedbrydes [16][21]. Resultatet er forventet, da erytrocytterne forventes at kan opbevares i 14 dage ved 4 C. Sammenlignes resultaterne for fænotypebestemmelse af Lu a og Lu b på dag 14, burde Lu a -antigenerne også kunne opbevares i 14 dage ved 4 C. Men dette er ikke tilfældet og det kan derfor formodes, at der anvendes stærkere testsera til fænotypebestemmelse af Lu b end til fænotypebestemmelse af Lu a. I Friedman testen forkastes H 0 hypotesen og H A hypotesen accepteres, hvilket vil sige, at der er en signifikant forskel mellem analysedagene, som betyder, at resultaterne for fænotypebestemmelsen afhænger af antal dage blodprøven opbevares, mellem dag 10 og 14. Det vides dog ikke af hvilken dag den signifikante forskel forekommer. Denne signifikante forskel har ingen klinisk relevans, da analysesvarene ikke ændres. Figur 14 viser, at prøvernes reaktionsstyrker er en anelse højere ved 4 C end ved stuetemp., hvilket også var forventet ud fra studierne af Hess et al. Den ene prøve der vurderes inkonklusiv dag 1-10 accepteres positiv dag 14, hvilket er uforklarligt, men kan eventuelt skyldes analysevariation, da dens score ellers er inden for 40 til omkring 55. Ved stuetemp. forbliver denne prøve inkonklusiv dag 14, se figur 12. Grunden til at denne prøve vurderes inkonklusiv, kan givetvis være fordi at der er udtrykt færre blodtypeantigener på overfladen af donorerytrocytterne i denne prøve [8]. Holdbarhed for fænotypen Lu b ved stuetemperatur Det kan ud fra figur 12 og 13 ses, at reaktionsstyrkerne for prøverne variere mindre hos de prøver der er opbevaret ved 4 C frem for de prøver der er opbevaret ved stuetemp., hvor reaktionsstyrkerne ses at ligge mere spredt. Dag 7 bestemmes tre prøver inkonklusive, hvoraf to af prøverne forbliver inkonklusive på dag 10, men bliver igen accepteret som positiv på dag 14 og denne variation kan skyldes analysevariation. De tre prøver vil KIA, i rutinen, reanalysere og har derfor ingen klinisk betydning. Blev prøverne ved med at forblive inkonklusive ville det få en klinisk betydning, da det herved ikke ville kunne vurderes om fænotypen er positiv. Prøvenr. 14453902 som havde været opbevaret ved stuetemp. kunne på dag 14 ikke analyseres på grund af clot. Prøvens pakkede erytrocytter blev ifølge forskriften vasket med to gange med PBS, jf. bilag 8, hvorefter den blev analyseret. Ifølge forskriften burde alle prøver have været vasket efter Side 42 af 76

dag 7, men dette er ikke blevet udført. Det kan derfor diskuteres om det er nødvendigt at vaske alle prøver for at opnå valide resultater, da det fremgår af figur 13, at den prøve der blev vasket dag 14, har samme reaktionsstyrke som tidligere er målt. Hvis resultaterne er valide uden at de pakkede erytrocytter er blevet vasket, kan dette spare afdelingens personale for at udfører dette for prøver ældre end 7 dage. Det fremgår af figur 13, at variationen af reaktionsstyrkerne påvirkes meget lidt af opbevaringstemperaturen. Opbevaringstemperaturen for fænotypebestemmelsen af Lu b ikke har nogen klinisk betydning, da der ikke er nogle prøver som har været accepteres som positiv som falder i reaktionsstyrke og bliver accepteret som negativ. I Friedman testen må H 0 hypotesen forkastes og H A hypotesen accepteres, hvor der derfor er en signifikant forskel mellem analyseringsdagene. Dette betyder, at resultaterne for fænotypebestemmelsen afhænger af antal dage blodprøven opbevares, mellem dag 10 og 14. Dog vides det ikke af hvilken dag mellem dag 10 og 14 at den signifikante forskel forekommer. Den signifikante forskel har dog ingen betydning, da der ikke ses at være en klinisk betydning, da resultaterne ikke ændre analysesvar. Som det forventes på baggrund af studierne af Hess et al. og Vandromme et al. er blodtypeantigenerne ikke nedbrudt ved hverken 4 C eller stuetemp. Som producenten af NEO (Immucor) lover, kan KIA opbevare donorblodprøver i 14 dage ved 4 C [7]. Yderligere kan donorblodprøverne også opbevares i 14 dage ved stuetemp. Fordele og ulemper ved NEO(Immucor) vs. manuelle teknikker Ved manuel fænotypebestemme af A 1 ved glasteknik kan der under aflæsning forekomme fejl, da er chance for, at agglutinaterne rystes i stykker. Samtidig foregår resultataflæsning for både glasteknik og søjleagglutinationsteknik subjektivt og der kan derfor være forskel på hvordan f.eks. en erfaren og uerfaren bioanalytiker aflæser. Ved subjektiv aflæsning er der derfor en kilde til variation. Der er flere fordele ved at få automatiseret fænotypebestemmelserne, hvilket er relevant for bioanalytikerprofessionen. Den ene fordel er at NEO (Immucor) er tidsbesparende, da den hurtigere end de manuelle teknikker og samtidig kan der analyseres mange flere prøver på én gang. En anden fordel ved at få automatiseret fænotypebestemmelserne på NEO (Immucor) er, at resultater overføres automatisk til ProSang, så der ikke forekommer fejl i resultaterne ved indtastning af disse. Analysemetoden har været anvendt i årtier og sikre derfor at analysemetoden er valid [7]. Resultaterne fra NEO (Immucor) kan ikke sammenlignes direkte med resultaterne fra glasteknik og søjleagglutinationsteknik, da aflæsningen ikke foregår ens. NEO (Immucor) aflæser med CCD kamera og vurderer med en score om ud fra fastlagte cut-off værdier om prøverne vurderes positive, Side 43 af 76

inkonklusive eller negative, mens resultatet ved aflæses subjektivt for glasteknik og søjleagglutinationsteknik. Ud fra det antal prøver der blev brugt til metodesammenligningen, var det ikke mere tidsbesparende at anvende NEO (Immucor) frem for at udfører fænotypebestemmelserne manuelt, men ved større antal prøver vil det være mere tidsbesparende at anvende NEO (Immucor), da den samtidig kan have flere fænotypebestemmelser i gang på samme tid. Ved fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) kan bioanalytikeren have hænderne fri til at udfører andet arbejde, mens NEO (Immucor) automatisk analysere og aflæser prøverne. Modsat skal bioanalytikeren hele tiden skal udfører alle trin ved de manuelle teknikker, hvilket f.eks. kunne være afpippettering af prøverne, inkubation af widalglas eller gelkort, centrifugere og aflæse. Forsøgsdesign En artikel af Schoenfeld et al. beskriver valideringen af en FREELYS Nano system som skal anvendes til blodtypebestemmelse af AB0, Rh-fænotypebestemmelse og Kell (K) fænotypebestemmelse. I studiet blev der anvendt 304 prøver til valideringen for at kunne beregne analysens sensitivitet og specificitet. Antallet af prøver (stikprøven) til metodevalideringen af NEO (Immucor) burde ved sammenligningen af artiklen og KIA s valideringsrapport for NEO (Immucor), hvor der blev brugt over 100 prøver til validering af blodtyperne AB0, have været større for, at kunne bruge stikprøven til statistiske beregninger og samtidig gøre resultaterne mere valide [6][13]. For resultaterne er det undersøgt om disse er normalfordelte for at kunne udføre statistiske beregner, som en tosidet ANOVA uden gentagelser, til at undersøge om det er en signifikant forskel mellem analyseringsdagene i holdbarhedsforsøget. En tosidet ANOVA uden gentagelser er en stærkere analyse end Friedman testen, men stikprøven er ikke stor nok til at anvende ANOVA og samtidig var resultaterne ikke normalfordelte. En Frieman test kan anvendes til data som ikke er normalfordelt og derfor er denne test blevet anvendt [22]. Det har pga. økonomiske omkostninger ikke kunne lade sig gøre, men stikprøvens størrelse kan forsvares i forhold til, at resultaterne viser det KIA gerne ville have undersøgt, nemlig om NEO (Immucor) og de manuelle teknikker, glasteknik og søjleagglutinationsteknik finder frem til samme resultater. Der er også indirekte foretaget dobbeltbestemmelser i forbindelse med holdbarhedsforsøget, da den samme prøve på dag 1 er bestemt to gange, én gang for hver opbevaringstemperatur. For de prøver der har været opbevaret ved 4 C, har temperaturen ikke nået at have en effekt på erytrocytterne, da prøverne kun har stået på køl to-tre timer før analysering på NEO (Immucor). Det fremgår af figur 7,8,9,10,12 og 13 over holdbarhedsforsøget, at reaktionsstyrkerne for samme prøve der er opbevaret ved hhv. 4 C Side 44 af 76

og stuetemp. ligger inden for de samme cut-off værdier. Den variationen der er mellem reaktionsstyrkerne på dag 1 kan skyldes en analysevariation. Producenten af NEO (Immucor) nævner ingen steder noget om analysevariation. Konklusion Det kan på baggrund af resultaterne fra metodesammenligningen mellem NEO (Immucor) og manuel glasteknik til fænotypebestemmelse af A 1 konkluderes, at metoderne når frem til samme resultater og fænotypebestemmelsen kan derved overføres fra manuel glasteknik til automatiseret fænotypebestemmelse på NEO (Immucor). Holdbarheden på donorblodprøver til fænotypebestemmelse af A 1 opfylder afdelingens ønske om en holdbarhed på 14 dage ved opbevaring i 4 C. Det kan konkluderes på baggrund af resultaterne fra metodesammenligningen mellem NEO (Immucor) og manuel søjleagglutinationsteknik til fænotypebestemmelse af Lu a, at ud fra afdelingens positive cut-off værdi vil arbejdsbyrden blive større ved at automatiserer fænotypebestemmelsen på NEO (Immucor), da mange prøver bestemmes inkonklusive og derfor skal reanalyseres. En mulighed for at få fænotypebestemmelsen kan blive automatiseret på NEO (Immucor) er, at KIA sætter deres positive cut-off værdi ned eller anskaffer et stærkere testsera for at få stærkere reaktionsstyrker og derved få flere prøver accepteret positive. Donorblodprøver til fænotypebestemmelse af Lu a har på nuværende tidspunkt ikke en holdbarhed i 14 dage når de opbevares ved 4 C, da der er en signifikant forskel eller dag 10. Det kan på baggrund af resultaterne fra metodesammenligningen mellem NEO (Immucor) og manuel søjleagglutinationsteknik til fænotypebestemmelse af Lu b konkluderes, at NEO (Immucor) er mere sensitiv, da den finder flere donorblodprøver positive frem for den manuelle teknik og fænotypebestemmelsen kan derfor automatiseres på NEO (Immucor). Holdbarheden på donorblodprøver til fænotypebestemmelse af Lu b opfylder afdelingens ønske om en holdbarhed på 14 dage ved opbevaring i 4 C. Side 45 af 76

Perspektivering Hvis jeg fik en mulighed for at udfører projektet igen, ville jeg udføre fænotypebestemmelse for Lu a, hvor jeg vil analysere denne fænotype flere gange på samme donorblodprøve for, at se om reaktionsstyrkerne (analysesvarene) forbliver de samme eller om sker analysevariation, som kan have klinisk betydning for resultatet af fænotypebestemmelsen. Den kliniske betydning er hvor fænotypen f.eks. starter med at være positiv, men ved efterfølgende analysering bestemmes til at være negativ. Ved at analysere prøverne flere gange undersøges det ligeledes om de prøver der er bestemt inkonklusive kan bestemmelses ved efterfølgende reanalysering. I dag er stort set alle gener for de humane blodtypesystemer kortlagt og derved kan individers fænotype bestemmes ud fra deres DNA [23]. KIA kan i fremtiden anvende molekylelærbiologiske metoder, som polymerase chain reaction (PCR)-baserede metoder, til genotypebestemmelse af hvilke antigener donor og patienter har på overfladen af deres erytrocytter [2][23]. Det DNA der anvendes til molekylærbiologiske metoder er hyppigst fra ekstraheret fra celler der ikke udtrykker blodtypeantigenet på membranoverfladen, dvs. f.eks. leukocytter [24]. Ved genotypebestemmelse kan de donorer der har en svag blodtype, dvs. at donors alleller koder for et svagt antigen, nemmere bestemmes i forhold til bestemmelse ved serologiske analyser [24]. Det kan yderligere også bestemmes om donors fænotype er homo- eller heterozygot [24]. De donorblodprøver der bestemmes inkonklusive på NEO (Immucor) kan med fordel bestemmes vha. af en genotypebestemmelse frem for at prøverne skal reanalyseres flere gange og derved sikre, at fænotypen ikke bliver falsk negativ, hvilket kan fører et lavere antal af donorer som er antigennegative. Genotypebestemmelse er en dyre analyse end serologiske analyser, men der kan analyseres flere prøver ad gangen og udvikling indenfor områder har gjort at analyseringstiden er inden for en acceptabel tidsramme [2][23]. Af hensyn til økonomi er det ikke relevant at lave en genotypebestemmelse på alle donorblodprøver, da det vil betyde, at blodportionerne vil blive dyre, men i stedet kun udfører det på de donorblodprøver som bestemmes inkonklusive på NEO (Immucor). Samtidig kan det være en ulempe kun at genotypebestemme donor, hvis donorerytrocytterne ikke udtrykker de blodtypeantigener som donor har anlæg for, og dette vil også betyde færre antigen-negative donorer [23]. Side 46 af 76

Litteraturliste: 1. Sand O.; Menneskets anatomi og fysiologi, 2. udgave, Gad, Kbh, 2008. 2. Daniels G., Bromilow I.; Essential Guide to Blood Groups. John Wiley & Sons; 2013. 3. Reid M. E., Lomas-Francis C. and Olsson M. L., The Blood Group Antigen Factsbook, 3.rd edition, 2012, 31-51; 263-273 4. INFONET Region Syddanmark Vejledning til metodevalidering Lokaliseret den 14.11.14 kl. 15.06 på http://ekstern.infonet.regionsyddanmark.dk/ 5. Dansk Selskab for Klinisk Immunologi; Transfusionsmedicinske standarder version 3.5; 2014 Lokaliseret 14.11.2014 på http://tms-online.dk/files/tms-3.5-2014-final.pdf 6. Pedersen M. G., Lillevang S. T.; Valideringsrapport, resultater og konklusion - Fænotypebestemmelse, svag RhD screening, svag RhD supplering og donorkontroltypebestemmelse på NEO. 2013. 7. Immucor Gamma. Capture-R Select - Solid Phase System or the Immobilization of Human Erythrocytes. Immucor Gamma; 8. Daniels G.; Human Blood Groups. John Wiley & Sons; 2013. 9. McCullough J.; Transfusion Medicine. John Wiley & Sons; 2011. 607 p. 10. Pedersen J. S., Oliveira C. L. P., Lammie D., Wess T., Mohandas N.,et al.; The Laminin 511/521 binding site on the Lutheran blood group glycoprotein is located at the flexible junction of Ig domains 2 and 3; July 2007;American Society of Hematology 11. Klein H. G. and Anstee D. J.; Mollison s blood transfusion in clinical medicine; 12 th edition; 2014 12. Poole J., Daniels G.; Blood group antibodies and their significance in transfusion medicine. Transfus Med Rev. 2007 jan; 21(1):58 71. 13. Sparrow RL, Healey G, Patton KA, Veale MF. Red blood cell age determines the impact of storage and leukocyte burden on cell adhesion molecules, glycophorin A and the release of annexin V. Transfus Apher Sci Off J World Apher Assoc Off J Eur Soc Haemapheresis. 2006 feb; 34(1):15 23 14. Hess J. R.; Red cell storage; Journal Proteomics. 2010 jan;3;73(3):368-73 Lokaliseret den 14.11.2014 kl. 18.40 på http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19914410 15. Hess J. R.; Red cell changes during storage; Transfus Apher Sci. August 2010;43(1):51-9 Lokaliseret den 14.11.2014 kl. 18.44 på http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20558107 Side 47 af 76

16. Hess J. R.; Measures of stored red blood cell; Vox Sanguinis The International Journal of Transfusion Medicine; 2014; Review 17. Torreggianai, L.; Blodtypeserologiske metoder. 2 udgave. Odontologisk Forlag; 2008; side 36 18. Jensen, T.B.. Erytrocytserologiske teknikker og metoder. 1. udgave. Bioanalytikeruddannelsen Metropol 2012. 19. Schmidt A. M., Bendix B. J., Jacob E. K., Bryant S. C. and Stubbs J. R.; Single-center comparison of gel mircocolumn and solid-phase methods for antibody screening; Immunohematology; 2013; vol. 29, nr. 3, side 101-104 Lokaliseret den 09.12.2014 kl. 12.46 på http://www.redcross.org/images/media_customproductcatalog/m25895924_immuno_29 _3_05reader.pdf#page=5 20. Vandromme M.J., McGwin G.,and Weinberg J. A.; Blood transfusion in the critically ill: does storage age matter?; Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine; 2009, 17:35 21. Bagnis C.; Silencing and overexpression of human blood group antigens in transfusion: Paving theway for the next steps, Blood Rev; 2014 Lokaliseret den 03.12.2014 på http://ac.els-cdn.com/s0268960x14000861/1-s2.0- S0268960X14000861-main.pdf?_tid=7029050e-8191-11e4-a34f- 00000aab0f6b&acdnat=1418342418_079df469f4ee8f350b760a431dc74383 22. Lærd Statistics; Friedman Test in SPSS Lokaliseret den 14.12.2014 på https://statistics.laerd.com/spss-tutorials/friedman-test-usingspss-statistics.php 23. Reid M. E. and Denomme G. A.; DNA-Based Methods in the Immunohematology Reference Laboratory; Transfus Apher Sci. (Feb) 2011; 44(1): 65 72 Lokaliseret den 11.12.2014 kl. 21.08 på http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3058268/ 24. Reid M. E.; Transfusion in the age of molecular diagnostics; American Society of Hematology; (Jan) 2009; vol. 2009; nr. 1, side 171-177 Side 48 af 76

Bilag 1 Indlægsseddel for Anti-A1 Lectin Side 49 af 76

Side 50 af 76

Bilag 2 - Aflæsning: Graduering af agglutination i søjleagglutinationsteknik Side 51 af 76

Aflæsning: Graduering af agglutination i glasteknik Side 52 af 76

Bilag 3 Indlægsseddel for Rh-Hr Control til NEO (Immucor) Side 53 af 76

Side 54 af 76

Bilag 4 NEO (Immucor) cut-off værdier til fænotypebestemmelse af A 1, Lu a og Lu b Figur 15: NEO (Immucor) cut-off værdier til fænotypebestemmelse af A 1 Figur 16: NEO (Immucor) cut-off værdier til fænotypebestemmelse af Lu a Side 55 af 76

Figur 17: NEO (Immucor) cut-off værdier til fænotypebestemmelse af Lu b Side 56 af 76

Bilag 5 - NEO (Immucor), Konklusion for fænotypebestemmelser Side 57 af 76

Bilag 6 Forskrifter for manuelle teknikker KIA s forskrift for manuel fænotypebestemmelse for A 1 ved glasteknik: KIA s forskrift for manuel fænotypebestemmelse for Lu a og Lu b ved søjleagglutinationsteknik: Side 58 af 76

Bilag 7 - Konklusion for manuelle fænotypebestemmelser Kvalitetskontroller Reaktion med antigenpositive testerytrocytter skal være ³ ++ Reaktion med antigennegative testerytrocytter skal være - Patient / donor Reaktion med testsera Konklusion ³ ++ Positiv fænotype < ++ Fænotype gentages. Hvis ³ + konkluderes som positiv fænotype Mixed field (MF) - Negativ fænotype Fænotype kan ikke konkluderes. Undersøg om patienten er transfunderet med antigenpositiv erytrocytsuspension inden for de sidste 3 måneder. Side 59 af 76

Bilag 8 - Uddrag af NEO s (Immucor) forskrift Vask af donorerytrocytter: IgG fænotyper Vare EDTA eller CPD-A blodprøve (centrifugeres hvis de ikke har været opbevaret opretstående inden analysering) På bloddonorer skal der anvendes EDTA blodprøver (flag 10) for at kunne overføre til ProSang. Mængde pr. enhed Antal pr. enhed Blodprøver til IgG analyser skal helst være under en uge gamle. Er det nødvendigt at udføre IgG fænotypebestemmelse på ældre prøver, kan man gøre det på pakkede erytrocytter der forinden er vaskede to gange. Mikrotiterplade, select 12 profiler/plade anti-fy, Fy, Jk, Jk, S, s 5 ml 115 fænotyper/flaske anti- 2 ml 10 ml 40 fænotyper/flaske 200 fænotyper/ suspensionsglas LISS 11,5 ml 2 selectplader/flaske Indikatorceller 11,5 ml 2 selectplader/flaske Label med stegkode til anti-kpa og Wra: aktuelt lot nr. Vær opmærksom på at når der skiftes lot. nummer skal det nye lot nummer registreres på Neo af superbrugerne eller afsnitsansvarlige afdelingsbioanalytikere. Vær opmærksom på at der kun kan være ét igangværende lot nummer på Neo. Side 60 af 76

Bilag 9 Flowcharts over fremgangsmetode til fænotypebestemmelse på NEO (Immucor) Hænagglutinationsteknik på NEO (Immucor) med IgM-antistoffer til fænotypebestemmelse af A 1 1 2 Aflæsning af mikrotiterpladen med CCD kamera Afpipettering af 320 µl Galileo Diluent + 3 µl pakkede erytrocytter som blandes. Ved sidste blanding opsuges 270 µl og overfører 53 µl fortynding til Rh-kontrol brønd. 3 Afpipettering af 10 µl Rh- kontrol reagens Afpipettering af 10 µl Anti- A1 Lectin testsera 4 Inkubering af mikrotiterpladen i 300 sek (5 min) 5 Centrifugering af mikrotiterpladen i 60 sek. ved 80 g + i 60 sek. kraftig rystning + 10 sek. ved 15 g 6 Resultatet aflæses vha. CCD kamera Side 61 af 76

Fast fase teknik på NEO (Immucor) med IgG-antistoffer til fænotypebestemmelse af Lu a og Lu b 1 Aflæsning af mikrotiterpladen med CCD kamera 2 Afpipettering af 50 µl system liquid til fortynding 3 100 µl system liquid+ 5 µl erytocytter som blandes Ved sidste blanding opsuges 79 µl og 76 µl overføres til brønd til Rh-kontrol 3 Mikrotiterpladen centrifugeres i 60 sek. ved 150 g + 60 sek ved 500 g 5 Vask af mikrotiterpladen 6 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera (monolayer) 7 Apipettering 15 µl Rh-kontrol reagens Afpipettering 25 µl anti-lu(a) testsera Afpipettering 50 µl LISS 8 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera (LISS farveskift) 9 Inkubering ved 39 C i 1200 sek (20 min.) 10 Vask 11 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera 12 Afpipettering af 55µl Capture- R indikatorceller 13 Mikrotiterpladen centrifugeres i 90 sek. ved 600 g 14 Aflæsning af resultater vha. CDD kamera Figur 18: Flowchart over fænotypebestemmelsen for Lu a på NEO (Immucor) Side 62 af 76

1 Aflæsning af mikrotiterpladen med CCD kamera 2 Afpipettering af 70 µl system liquid + 3 µl pakkede erytrocytter som blandes. 3 Mikrotiterpladen centrifugeres i 60 sek. ved 150 g + 60 sek ved 500 g 4 Vask af mikrotiterpladen 5 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera (monolayer) 6 Afpipettering 25 µl anti-lu(b) testsera Afpipettering 50 µl LISS 7 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera (LISS farveskift) 8 Inkubering ved 39 C i 900 sek (15 min.) 9 Vask 10 Aflæsning af mikrotiterpladen vha. CCD kamera 11 Afpipettering af 55µl Capture- R indikatorceller 12 Mikrotiterpladen centrifugeres i 90 sek. ved 600 g 13 Aflæsning af resultater vha. CCD kamera Figur 19: Flowchart over fænotypebestemmelsen for Lub på NEO (Immucor) Side 63 af 76

Bilag 10 Databehandling af rådata Fishers Eksakte test- Metodesammenligning Lu a Ud fra afdelingens cut-off værdier: http://quantpsy.org/fisher/fisher.htm Ud fra NEO s (Immucor) cut-off værdier: http://quantpsy.org/fisher/fisher.htm Side 64 af 76

N(0,1)-Fraktil Camilla Thinggård Jacobsen Bachelorprojekt, 19.12.2014 Lu b Ud fra afdelingens cut-off værdier http://quantpsy.org/fisher/fisher.htm Undersøgelse af Normalfordeling - Holdbarhedsforsøget Rang Dag 1 4 C Sandsynlighed N(0,1)- Fraktil 1 33 0,090909091-1,335177736 2 36 0,181818182-0,908457869 3 42 0,272727273-0,604585347 4 56 0,363636364-0,348755696 5 78 0,454545455-0,114185294 6 80 0,545454545 0,114185294 7 81 0,636363636 0,348755696 8 83 0,727272727 0,604585347 9 84 0,818181818 0,908457869 10 95 0,909090909 1,335177736 1,5 1 0,5 Probit plot dag 1 ved 4 C for Lu a R² = 0,8817 0-0,5-1 -1,5 0 20 40 60 80 100 Målinger Serie1 Lineær (Serie1) Side 65 af 76

N(0,1)- fraktil Camilla Thinggård Jacobsen Bachelorprojekt, 19.12.2014 Dag 4 rang sandsynlighed fraktil 85 1 0,1-1,28155157 87 2 0,2-0,84162123 88 3,5 0,35-0,38532047 88 3,5 0,35-0,38532047 90 5,5 0,55 0,125661347 90 5,5 0,55 0,125661347 99 8 0,8 0,841621234 99 8 0,8 0,841621234 99 8 0,8 0,841621234 I følgende undersøgelse er prøve nr. 14453902 taget ud da denne prøve har langt lavere reaktionsstyrker gennem hele forløbet. 1,5 1 0,5 Probit plot dag 4 ved 4 C for Lu b R² = 0,893 0-0,5-1 -1,5 80 85 90 95 100 Målinger Serie1 Lineær (Serie1) Side 66 af 76

Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved 4 C, hvor dag 1,2,4,7,10 og 14 sammenholdes Side 67 af 76

Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved 4 C, hvor dag 1,2,4,7 og 10 sammenholdes Side 68 af 76

Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7,10 og 14 sammenholdes Side 69 af 76

Friedman test på Lu a prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7 og 10 sammenholdes Side 70 af 76

Friedman test på Lu b prøver opbevaret ved 4 C, hvor dag 1,2,4,7, 10 og 14 sammenholdes Side 71 af 76

Friedman test på Lu b prøver opbevaret ved stuetemperatur, hvor dag 1,2,4,7, 10 og 14 sammenholdes Side 72 af 76