Detektion og klinisk betydningen af DNA fragmentation i humane sædceller

Detektion og klinisk betydningen af DNA fragmentation i humane sædceller Et kort overblik over den tilgængelige litteratur Af Preben Christensen, PhD & Anders Birck, PhD SPZ Lab A/S Fruebjergvej 3, 2100 København Ø Tlf: 39 17 97 84, e-mail: info@spzlab.com www.spzlab.com Indhold Resumé...2 Introduktion...2 Metoder til påvisning af DNA fragmentation...3 Klinisk betydning af DNA fragmentation...5 Klinisk anvendelse af SCSA -metoden i Sydsverige...8 Litteratur...9 Dette notat er udarbejdet af SPZ Lab A/S, som udfører SCSA -analyser kommercielt i Danmark. Det har været vores mål at præsentere den videnskabelige litteratur på området så objektivt som muligt. Hvis du har kommentarer til indholdet eller ønsker en kopi af den citerede litteratur er du velkommen til at kontakte os. 2007 SPZ Lab A/S 1

Resumé I de seneste årtier er mængden af information om den kliniske betydning af DNA fragmentation i humane sædceller steget markant. Det kan således være svært at danne sig et overblik over den samlede litteratur på området. En lang række publikationer viser, at DNA fragmentation har betydning for succesraten ved forskellige typer af fertilitetsbehandlinger. Information om sædcelle DNA fragmentation ser med andre ord ud til at kunne bruges til at vælge den mest optimale fertilitetsbehandling. Forskningsmæssigt er der anvendt flere forskellige metoder til påvisning af DNA fragmentation i forbindelse med retrospektive studier. Selv om disse studier har bidraget med værdifuld information er det dog en begrænsning, at de anvendte metoder ofte har dårlig præcision eller er baseret på en subjektiv vurdering. Til klinisk brug er der behov for objektive og præcise metoder, således at det kan sikres at rådgivningen af den enkelte patient/par er korrekt. SCSA -metoden og TUNEL kan i kombination med flowcytometri tilfredsstille disse krav til klinisk anvendelighed. SCSA -metoden er i foråret 2007 implementeret i offentligt regi i den Sydsvenske region. Analyse af mandens sæd for DNA fragmentation vil fremover være afgørende for det behandlingstilbud det enkelte par kan modtage med støtte fra det offentlige i Sydsverige. Den politiske beslutning tager udgangspunkt i en ny videnskabelig publikation (Bungum et al. 2007), som viser at cirka hvert 4. par ikke bør modtage inseminationsbehandling, men derimod bør anbefales ICSI behandling med det samme. Det forventes, at den sydsvenske beslutning vil reducere de offentlige behandlingsomkostninger og samtidig bidrage til en mere målrettet behandling af det enkelte par. Introduktion Nærværende notat er udarbejdet med henblik på at give en beskrivelse af anvendte metoder til påvisning af DNA fragmentation, samt at belyse disses potentiale ved vurdering af mandlig fertilitet in vivo samt ved intra uterin inseminering (IUI), reagensglasbefrugtning (IVF) og mikroinsemination (ICSI). Forskelle på de anvendte metoder til påvisning af DNA fragmentation har medført, at det kan være vanskeligt at danne sig et overblik over den samlede litteratur på området. Modstridende information med hensyn til den kliniske betydning af DNA fragmentation skyldes i en del tilfælde et utilstrækkeligt klinisk materiale. Den kompakte kromatinstruktur og tætte association mellem DNA og protamin i sædcellernes kerne gør påvisning af enkelt og dobbeltstrengede DNA-skader (såkaldte DNA strand breaks eller DNA fragmentation ) mere vanskelig end i somatiske celler. Anvendelse af nye teknologier har gennem de seneste årtier bidraget til, at mængden af information om DNA fragmentation i sædceller er steget markant. Den øgede mængde af data nødvendiggør, at man forstår de vigtige forskelle mellem de anvendte metoder samt de begrænsninger metoderne har med henblik på at blive anvendt som et klinisk diagnostisk redskab. I forbindelse med klinisk anvendelse og rådgivning af par i fertilitetsbehandling er det vigtigt at kunne have tillid til den diagnostiske test. Metoden skal derfor have 2007 SPZ Lab A/S 2

høj præcision og være objektiv (uafhængig af observatør) således at en etableret grænseværdi kan anvendes til at rådgive parret med hensyn til den mest optimale behandling (IUI, IVF eller ICSI). De to eneste metoder, som opfylder disse krav pt. er TUNEL og SCSA -metoden, som ved hjælp af flowcytometri sikre et objektivt og præcist resultat. Den seneste udgave af WHO manualen (WHO 1999) nævner antallet af undersøgte sædceller (counting error) samt prøvevariation, som to af de væsentligste kilder til variation i undersøgelsesresultater. Ved kvalitativ vurdering af mikroskopiske præparater har det stor betydning, at der er subjektive forskel mellem observatører. Samtidig er der ofte variation på de enkelte præparater og også variation indenfor det enkelte præparat. Desuden er det velkendt, at fluorescenspræparater falmer i løbet af undersøgelsestiden, hvilket bidrager yderligere til variationen (Boe-Hansen 2005, Chohan et al. 2006). Flere af de metoder, der er anvendt forskningsmæssigt, har en eller flere af ovennævnte problemer og er derfor uegnet til klinisk anvendelse. Metoder til påvisning af DNA fragmentation TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dudp nickend labelling) Metoden er udviklet til somatiske celler og blev senere adapteret til brug på sædceller (Gorczyza et al. 1993, Sailer et al. 1995). Princippet ved metoden er binding af et mærket nukleotid til den frie 3'-OH gruppe, hvor der er brud på DNA ved brug af terminal deoxynucleotidyl transferase. Der er flere kommercielle kits på market, hvor mærkningen enten kan kvantificeres ved hjælp af lysmikroskopi (Høst et al. 2000, Benchaib et al. 2007) eller fluorescens mikroskopi (Duran et al. 2002, Carrell et al. 2003, Henkel et al. 2003, Henkel et al. 2004). Som nævnt i indledningen indebærer mikroskopi problemer med antallet af sædceller som vurderes samt subjektive forskelle mellem observatører. Forskel på rapporterede grænseværdiers betydning for fertilitet skyldes bl.a. forskelle på observatører, men også at de forskellige kommercielle kits varierer mht. probernes tilgængelighed for sædcellernes DNA samt binding til dette (Høst et al. 2000, Henkel et al. 2003, Benchaib et al. 2007). I enkelte publikationer er TUNEL kombineret med flowcytometri, hvilket muliggør objektiv analyse af flere tusinde sædceller per prøve og dermed stor præcision samt en objektiv analyse (Seli et al. 2004). Med hensyn til præparation er TUNEL en relativt arbejdskrævende metode og kombination med flowcytometri begrænser brugen til ganske få speciallaboratorier. SCSA -metoden (Sperm Chromatin Structure Assay) SCSA -metoden er udviklet specifikt til sædceller (Evenson et al. 1980). Metodens princip er baseret på denaturering af sædcellens DNA ved lavt ph, hvorefter arvematerialet farves med akridin orange. Som følge af de metakromatiske egenskaber ved akridin orange vil denatureret, enkeltstrenget DNA give rødt fluorescenssignal, mens intakt, dobbeltstrenget DNA vil resultere i et grønt signal. Metoden giver således et indirekte mål for forekomsten af brud på DNA et, idet disse hovedsageligt vil forekomme i områder hvor DNA kan denatureres. Ved 2007 SPZ Lab A/S 3

SCSA -metoden bestemmes fluorescens ved hjælp af flowcytometri, hvor intensiteten af rød og grøn fluorescens kan bestemmes ca. 500 gange mere nøjagtigt end ved fluorescensmikroskopi. Samtidig opnåes en meget høj præcision ved analysen, da der typisk undersøges 5000 sædceller pr. prøve. DNA fragmentation angives oftest ved et DNA fragmentations index (DFI værdi). Jo højere DFI værdi, jo større er procentdelen af sædceller med fragmentation af DNA et. Ved beregning af DNA fragmentations indexet kræver SCSA -metoden, at der anvendes et software, som kan beregne mængden af rød fluorescens i forhold til den totale (rød + grøn) fluorescens fra den enkelte sædcelle. Da der i slutningen af 90'erne kom betydelig interesse for SCSA -metoden, var der flere forskergrupper som publicerede resultater, hvor softwareanalysen ikke var korrekt og blot beregnede et forhold imellem rød og grøn fluorescens. For at opnå en bedre standardisering af metoden, udviklede SCSA Diagnostics Inc. (Brookings, SD, USA) efterfølgende et specifikt software (SCSASoft ) og beskrev en detaljeret protokol for SCSA -metoden (Evenson og Jost 2000). For at kunne opnå et korrekt resultat med SCSA -metoden er det vigtigt at være opmærksom på faktorer, som kan have indflydelse på analyseresultatet (Boe-Hansen et al. 2005). Blandt andet er akridin orange et ligevægts farvestof, hvor forholdet imellem farvemolekyler og sædceller kan give betydelig variation i resultatet. Præcis bestemmelse af sædcellekoncentrationen er således nødvendig i forbindelse med SCSA -analysen. Andre metoder til bestemmelse af DNA fragmentation TUNEL ved brug af mikroskopi eller akridin orange testen (AOT), hvor der ligeledes anvendes mikroskopi, er ikke velegnet til klinisk diagnostik (Chohan et al. 2006, Evenson og Wixon 2006). Tilsvarende problemer gør sig gældene for andre farvemetoder som aniline blå eller toludin blå (Erenpreiss et al. 2004). Comet-metoden, som er baseret på enkelt celle elektroforese med migration af små DNA fragmenter og dannelse af en såkaldt komet, benytter ligeledes mikroskopi til vurdering. Da antallet af vurderede sædceller oftest ligger på 100 til 200 er præcisionen dårlig, og metoden er tillige meget tidskrævende (Boe-Hansen 2005, Evenson og Wixon 2006). Ved sperm chromatin dispersion test (SCD) undersøges migration af små DNA fragmenter i agarose ved hjælp af farvning med DAPI og fluorescens mikroskopi. Metoden er tidskrævende, subjektiv og unøjagtig som følge af vurdering af få hundrede sædceller (Chohan et al. 2006). Endelig er der det såkaldte in situ nick translation assay, hvor enkelt-strengede brud på DNA mærkes ved indsætning af biotinyleret dutp ved hjælp af DNA polymerase I. Metoden kvantificerer endogen DNA skade, men har ind til videre ikke vist en sammenhæng til fertilitetsresultater (Irvine et al. 2000). Påvisning af apoptose Det er vigtigt at forstå begrebet apoptose, da dette i flere publikationer er blevet anvendt synonymt med DNA fragmentation. Programmeret celle død (apoptose) er vigtig for kontrol med produktionen af mandlige gameter (Blanco-Rodriguez og Martinez-Garcia 1996). Apoptose er en aktiv process som er afhængig af proteinsyntese. Under dannelsen af sædcellen mistes ribosomerne, og klassisk 2007 SPZ Lab A/S 4

apoptose er derfor ikke mulig i de sene stadier af spermiogenesen. Imidlertid kan apoptotiske markører (bl.a. Fas, Sakkas et al. 1999) findes på ejakulerede sædceller, hvilket formodes at skyldes en ufuldendt apoptotisk process (Cayli et al. 2004). Enkelte forfattere (bl.a. Barroso et al. 2000) har anvendt Annexin V til identifikation af phospatidylserine som en indikator for apoptose, men den nyeste forskning på området indikerer at lignende ændringer opstår i sædcellernes membraner under kapaciationprocessen (Birck 2007). Flere forfattere (bl.a. Høst et al. 2000, Henkel et al. 2003) har anvendt begrebet apoptose synonymt med DNA strand breaks i forbindelse med TUNEL analyse på ejakulerede sædceller. For at undgå misforståelser, bør begrebet apoptose dog kun anvendes, såfremt der er tale om egentlig programmeret celledød. Enkelt og dobbeltstrengede brud på DNA i sædceller kan imidlertid opstå efter spermiation sfa. tilstedeværelse af såkaldte reactive oxygene species (ROS). Alle respirerende celler producerer ROS i forbindelse med intracellulære redox aktiviteter, og sædcellen er ingen undtagelse. I de sene stadier af spermatogenesen og tidlige stadier af modningen i bitestiklerne er sædcellerne i særlig grad modtagelig for de skadelige effekter af ROS, da kondenseringen af DNA et stadig ikke er afsluttet og sædcellernes DNA reparationsmekanismer samtidig er ophørt (Golan et al. 1996, Aitken et al. 1998). Klinisk betydning af DNA fragmentation Begrebet DNA fragmentations index (DFI) kan bidraget til forvirring, da det anvendes i forbindelse med SCSA -metoden (Evenson og Jost 2000) og desuden i nogle publikationer med TUNEL metoden (bl.a. Benchaib et al. 2007). Med SCSA - metoden sker der ved en DFI værdi på 25 til 30 % en markant reduktion i chancen for at opnå graviditet in vivo samt ved IUI. Denne grænseværdi har endvidere betydning for valget af fertilitetsbehandling. Med TUNEL metoden er der tilsvarende en grænseværdi, men den varierer fra 4 % til 36 % i de forskellige studier (Høst et al. 2000, Henkel et al. 2003, Evenson og Wixon 2006). Variationen skyldes bl.a. subjektive forskelle i de mikroskopiske vurderinger samt typen af anvendte kits i de forskellige studier. Samlet set er der dog stor enighed om, at øget DNA fragmentation har en negativ indflydelse på mandens reproduktionsevne, uanset om der er tale om in vivo fertilitet eller fertilitetsbehandling. Flere studier er imidlertid baseret på et begrænset klinisk materiale. Hvis der er tale om par, som henvender sig med henblik på fertilitetsbehandling, vil cirka hver 5. mand, have en DFI værdi over 30 % med SCSA -metoden. Da studierne ofte sammenligner 2 eller flere behandlingsmetoder, kan sammenligningsgrundlaget blive meget tyndt, hvis der kun er inkluderet f.eks. 100 par i studiet. Et andet meget indlysende problem ved de kliniske studier er behovet for at klarlægge eventuelle faktorer hos kvinden som mulig medvirkende årsag til infertilitet. 2007 SPZ Lab A/S 5

DNA fragmentationens betydning for in vivo fertilitet De to største studier hvor SCSA -metoden er anvendt i forbindelse med in vivo fertilitet er Evenson et al. (1999) og Spano et al. (2000), hvor henholdsvis 165 og 215 par blev fulgt i forbindelse med at de forsøgte at opnå graviditet på normal vis. Evenson et al. (1999) fandt at DFI værdien var under 15 % for 85 % af de par, som opnåede graviditet inden for de første 3 måneder, mens dette kun var tilfældet for 50 % af de par, som opnåede graviditet efter 4 til 12 måneder. Samtidig blev det observeret, at en DFI værdi over 30 % resulterede i manglende graviditet eller at det tog lang tid at opnå graviditet. Spano et al. (2000) fulgte 215 par til de opnåede graviditet (dog max. i 2 år) og opnåede data for 1301 cykli. Resultaterne viste, at sandsynligheden for at opnå graviditet var 13,3 % per cyklus, når DFI værdien var under 20 %. Ved en DFI værdi på 20 til 40 % faldt sandsynligheden for at opnå graviditet til 7,5 %, mens en DFI værdi på over 40 % gav en sandsynlighed for graviditet på 1,7 % per cyklus. DNA fragmentationens betydning for intra uterin insemination (IUI) Det største studium med SCSA -metoden og IUI omfatter 387 cykli (Bungum et al. 2007). Procent fødte børn per behandlet cyklus var 19,0 % ved en DFI værdi under 30 % (n=321), mens gruppen med DFI værdi over 30 % resulterede i en succesrate på 1,5 %. Boe-Hansen et al. (2006) anvendte SCSA -metoden i forbindelse med 48 par i IUI behandling. Kun to af disse par havde en DFI værdi over 30 % og ingen af dem opnåede graviditet. Saleh et al. (2003) anvendte SCSA -metoden i forbindelse med IUI behandling af 19 par. Der blev ikke opnået graviditet ved IUI behandling af de 12 par, hvor DFI værdien var over 28 %. Duran et al. (2002) har anvendt TUNEL metoden ved mikroskopi i forbindelse med IUI behandling af 119 par (154 cykli) og fandt, at der ikke blev opnået graviditet, hvis DNA fragmentation var til stede i mere end 12 % af sædcellerne. Betydning af DNA fragmentation i forbindelse med IVF og ICSI behandling De første studier med SCSA -metoden i forbindelse med IVF og ICSI behandling var mht. antallet af patienter alt for små i forhold til de konklusioner, der blev draget vedr. behandling når DFI værdien var over 30 %. De forkerte konklusioner, som blev draget i studierne af Larson et al. (2000) samt Larson-Cook et al. (2003), har medført at der er blevet stillet tvivl om værdien af SCSA -metoden i forbindelse med fertilitetsbehandling. Det er stadig ikke klart, hvorfor disse konklusioner ikke blev dementeret af Virro et al. (2004), som var et studium udført i samarbejde mellem Virro, Larson-Cook og Evenson. Studiet af Larson-Cook et al. (2003) var baseret på 89 par i IVF/ICSI behandling, hvor af kun 10 par havde en DFI værdi over 27 %. Studiet af Larson et al. (2000) var på et endnu tyndere grundlag, da der kun deltog 24 mænd, hvoraf 10 havde en DFI værdi på over 27 %. I de to studier opnåede ingen par graviditet, hvis DFI værdien var over 27 %. Da dette resultat var næsten identisk med den 2007 SPZ Lab A/S 6

grænseværdi for DFI, som var observeret ved in vivo studier (Evenson et al. 1999, Spanno et al. 2000), konkluderede Larson et al. (2000) og Larson-Cook et al. (2003) at IVF/ICSI behandling var uhensigtsmæssigt, hvis DFI værdien var over 27 %. I 2004 blev der publiceret to større studier med SCSA -metoden og IVF/ICSI behandlinger (Virro et al. 2004, Bungum et al. 2004) som var baseret på hhv. 249 og 306 par. I studiet af Virro et al. (2004) blev parrene fulgt til 3. graviditetsmåned. Konklusionerne i studiet var, at en DFI værdi på over 30 % ikke påvirkede selve befrugtningsprocessen, mens blastocystrate samt sandsynligheden for at opnå graviditet var reduceret. Virro et al. (2004) gjorde ikke op med den DFI grænseværdi, som var foreslået af Larson et al. (2000) og Larson-Cook et al. (2003). Tværtimod anbefalede Virro et al. (2004) at brug af donor sæd blev overvejet, hvis DFI værdien var over 30 %. Bungum et al. (2004) konkluderede derimod, at forfatterne ikke kunne bekræfte en grænseværdi ved 27 % i DFI værdi ved IVF/ICSI behandling. Bungum et al. (2004) rapporterede, at IVF og ICSI behandling er velegnet i forbindelse med DFI værdier over 30 %. Boe-Hansen et al. (2006) bekræftede, at en DFI værdi over 27 % ikke udelukker succesfuld fertilitetsbehandling ved IVF eller ICSI. Lignende observationer blev set i studier af Gandini et al. (2004), Payne et al. (2005) og Check et al. (2005), men disse studier var dog foretaget på et væsentligt mindre materiale. Der er dog ingen tvivl om, at forhøjet DNA fragmentation har en negativ indflydelse på sandsynligheden for at opnå graviditet ved IVF og ICSI behandling, og en lang række artikler rapporterer om reduceret blastocystrate og forøget risiko for ufrivillig abort (Carrell et al. 2003, Henkel et al. 2004, Seli et al. 2004, Virro et al. 2004, Check et al. 2005, Benchaib et al. 2007). Er ICSI behandling bedre end IVF, når DFI værdien er over 30 %? Bungum et al. (2004) observerede, at ICSI behandling ved en DFI værdi over 30 % havde større chance for at resultere i graviditet, end hvis behandlingen var IVF. Denne signifikante observation var ny i forhold til SCSA -metoden og bekræftede de resultater Høst et al. (2000) opnåede med TUNEL metoden. I flere andre studier (bl.a. Boe-Hansen et al. 2006) sås en lignende tendens, men de pågældende studier var med hensyn til antal af patient for små til at opnå statistisk signifikans. Bungum et al. (2007) har bekræftet observationen fra deres publikation i 2004 og rapporterer, at når DFI værdien er over 30 % er sandsynligheden for at opnå graviditet ved hjælp af ICSI behandling 1,6 gange større end ved IVF behandling. Den teoretiske årsag til at ICSI behandling medfører et bedre resultat end ved IUI og IVF formodes at være, at processen sparer sædcellen for det oxidative stress, der er forbundet med sædcellens hyperaktivering samt penetration af zona pellucida. Det kan dog ikke udelukkes, at zygoten ved ICSI behandling samtidig er bedre i stand til at reparere brud på sædcellens DNA. Desuden skal det nævnes, at ICSI behandling blev udført på 2007 SPZ Lab A/S 7

kvinder med en gennemsnits alder, som var 30,8 år i forhold til 32,1 år for IVF gruppen (Bungum et al. 2007). Kontroverser mht. DNA fragmentation Studierne af Larson et al. (2000) og Larson-Cook et al. (2003) medførte en betydelig diskussion af grundlaget for at implementere SCSA -metoden rutinemæssigt i forbindelse med ART behandling og evt. anbefale brug af donor sæd, hvis DFI værdien var over 27 % (Virro et al. 2004). Samtidig blev der igangsat flere studier, hvor SCSA -metoden blev anvendt i forbindelse med IVF og ICSI behandling (Gandini et al. 2004, Check et al. 2005, Payne et al. 2005). Disse studier konkluderede at IVF og ICSI behandling netop har en berettigelse, når der er problemer med DNA fragmentation i sædcellerne. Imidlertid var nogle af konklusionerne af Payne et al. (2005) for vidt gående, da forfatterne konkluderede at den laveste graviditetsrate blev opnået ved lave DFI værdier. Forfatterne vurderede ikke data kritisk i forhold til faktorer hos kvinderne, som bidrog til reduceret fertilitet (bl.a. endometriose, PCO mv., Evenson 2006). Den seneste rapport fra The Practice Comittee of the American Society for Reproductive Medicine (ASRM Practice Comittee, 2006) er bl.a. baseret på ovennævnte diskussion samt det faktum at flere metoder til påvisning af DNA fragmentation er dårligt valideret (Schlegel og Paduch 2005, Fernandez et al. 2005). Samtidig næves at grundlaget for at behandle mandlige fertilitetspatienter med antioxydanter eller anvendelse af testikulære spermier ind til videre er baseret på et videnskabeligt tyndt grundlag (Greco et al. 2005a, 2005b). Klinisk anvendelse af SCSA -metoden i Sydsverige Som anført i ovennævnte er det vigtigt at en SCSA -analyse udføres i overensstemmelse med Evensons protokol, samt at der anvendes et specielt udviklet software (SCSAsoft ) til data analyse (Evenson og Jost 2000, Boe-Hansen et al. 2005). Cirka hver 4. mand, som kommer i fertilitetsbehandling, vil have en DFI værdi på over 25 %. Da en høj DFI værdi også ses hos patienter med normale klassiske parametre (volumen, koncentration, motilitet og morfologi, Saleh et al. 2002), anbefaler Bungum et al. (2007), at SCSA -undersøgelsen foretages på alle patienter i starten af behandlingsforløbet. Hvis DFI værden er over 25% bør det undersøges, om der er disponerende faktorer for den høje værdi. Her tænkes bl.a. på om patienten har haft høj feber inden for de seneste 2 mdr. eller har leukocytospermi eller varicocele. Desuden kan mandens alder være en medvirkende årsag (Wyrobek et al. 2006). Den Sydsvenske region (Skåne, Halland, Blekinge og Kronoberg) har netop i marts 2007 besluttet, at SCSA -metoden skal anvendes rutinemæssigt for alle par i regionen, som ønsker at få foretaget inseminationsbehandling i offentligt regi (Södre Regionvårdsnämnden, 2007). 2007 SPZ Lab A/S 8

Det regelsæt der fra 1. april 2007 anvendes vedr. SCSA -metoden på Reproduktions Medicinsk Centrum ved Universitetshospitalet i Malmø er som følger: DFI-værdi under 25%: Det er efter alt at dømme ikke DNA fragmentation, som er årsagen til infertiliteten. Det almindelige behandlingsforøb (IUI, IVF og evt. ICSI bør følges jf. øvrige kliniske observationer for det enkelte par). DFI-værdi over 25%: Sandsynligheden for at opnå graviditet ved IUI ligger på ca. 2-3 % (Bungum et al. 2007), og det anbefales derfor at gå direkte til IVF eller ICSI. Da sandsynligheden for at opnå graviditet ved ICSI behandling er større, anbefales ICSI frem for IVF behandling. Litteratur Aitken RJ, Gordon E, Harkiss D, Twigg JP, Milne P, Jennings Z, Irvine DS. Relative impact of oxidative stress on the functional competence and genomic integrity of human spermatoza. Biol Reprod 1998;59:1037-1046. ASRM Practice Comittee. The clinical utility of sperm DNA integrity testing. Fertil Steril 2006;86, suppl 4:S35-S37. Barroso G, Morshedi M, Oehninger S. Analysis of DNA fragmentation, plasma membrane translocation of phosphatidylserine and oxidative stress in human spermatozoa. Hum Reprod 2000;15:138-1344. Benchaib M, Lornage J, Mazoyer C, Lejeune H, Salle B, Guerin JF. Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as a prognostic indicator of assisted reproductive technology outcome. Fertil Steril 2007;87:93-100. Birck A. The acrosome reaction - its induction, detection and relationship to fertility. PhD-Thesis. Copenhagen University. Faculty of Life Science. 2007. Copenhagen. Blanco-Rodriguez J, Martinez-Garcia C. Spontaneous germ cell death in the testis of the adult rat takes the form of apoptosis:re-evaluation of cell types that exhibit the ability to die during spermatogenesis. Celll Prolif 1996;29:13-31 Boe-Hansen GB. Sperm DNA fragmentation in humans, bulls, and boars. Thesis. Royal Veterinary and Agricultural University, 2005. Copenhagen. Boe-Hansen GB, Ersbøll AK, Christensen P. Variability and Laboratory Factors Affecting the Sperm Chromatin Structure Assay in Human Semen. J Androl 2005;26:360-368. 2007 SPZ Lab A/S 9

Boe-Hansen GB, Fedder J, Ersbøll AK, Christensen P. The sperm chromatin structure assay as a diagnostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod 2006;21:1576-1582. Bungum M, Humaidan P, Spano M, Jepson K, Bungum L, Giwercman A. The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters for the outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI. Hum Reprod 2004;19:1401-1408. Bungum M, Humaidan P, Axmon A, Spano M, Bungum L, Erenpreiss J, Giwercman A. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assissted reproduction technology outcome. Hum Reprod 2007;22:174-179. Carrell DT, Liu L, Peterson CM, Jones KP, Hatasaka HH, Erickson L, Campell B. Sperm DNA fragmentation is inceased in couples with unexplained recurrent pregnancy loss. Arch Androl 2003;49:49-55. Cayli S, Sakkas D, Vigue L, Ramazam D, Husar G. Cellular maturity and apoptosis in human sperm: creatine kinase, capase-3 and Bcl-XL levels in mature and diminshed maturity sperm. Mol Hum Reprod 2004;10:365-372. Check JH, Graziano V, Cohen R, Krotec J, Check ML. Effect of an abnormal sperm chromatin structural assay (SCSA) on pregnancy outcome following IVF with ICSI in previous IVF failures. Arch Androl 2005;51:121-124. Chohan KR, Griffin JT, Lafromboise M, De Jonge CJ, Carrell DT. Comparison of chromatin assays for DNA fragmentation evaluation in human sperm. J Androl 2006;27:53-59. Duran EH, Morshedi M, Taylor S, Oehninger S. Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study. Hum Reprod 2002;17:3122-3128. Erenpreiss J, Jepson K, Giwercman A, Tsarev I, Erenprisa J, Spano M. Toludine blue cytometry test for sperm DNA conformation: comparison with the flow cytometric sperm chromatin structure and TUNEL assay. Hum Reprod 2004;19:2277-2282. Evenson DP, Darzynkiewicz Z, Melamed MR. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science 1980;240:1131-1133. Evenson DP, Jost LK, Marshall D, Zinaman MJ, Clegg E, Purvis K, de Angelis P, Claussen OP. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod 1999;14:1039-1049. Evenson DP, Jost LK. Standard procedure for the SCSA. Current Protocols in Flow Cytometry. 2000; 7.13.1-7.13.27. 2007 SPZ Lab A/S 10

Evenson DP. Letter to the Editor of Fertilty and Sterility. 2006;85:810. Evenson DP, Wixon R. Clinical aspects of sperm DNA fragmentation detection and male infertility. Theriogenology 2006;65:979-991. Fernandez JL, Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosalvez J, Enciso M, LaFrommboise M, De Jonge C. Halosperm is an easy, available, and costeffective alternative for determining sperm DNA fragmentation. Fertil Steril 2005;84:860. Gandini L, Lombardo F, Paoli D, Caruso F, Eleuteri P, Leter G, Ciriminna R, Culasso F, Dondero F, Lenzi A, Spano M. Full-term pregnancies achieved with ICSI despite high levels of sperm chromatin damage. Hum Reprod 2004;19:1409-1417. Golan R, Cooper TG, Oschry Y, Oberpenning F, Schulze H, Shochat L, Lewin LM. Changes in chromatin condensation of human spermatozoa during epididymal transit as determined by flow cytometry. Hum Reprod 1996;11:1457-1462. Gorczyza W, Gong J, Darzynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assay. Cancer Res 1993;53:1945-1951 Greco E, Romano S, Iacobelli M, Ferreo S, Baroni E, Minasi MG, Ubaldi F, Rienzi L, Tesarik J. ICSI in cases of sperm DNA damage: beneficial effect of oral antioxydant treatment. Hum Reprod 2005a;20:2590-2594. Greco E, Scarselli F, Iacobelli M, Rienzi L, Ubaldi F, Ferreo S, Franco G, Anniballo N, Mendoza C, Tesarik J. Efficient treatment of infertility due to sperm DNA damage by ICSI with testicular spermatozoa. Hum Reprod 2005b;20:226-230. Henkel R, Kierspel E, Hajimohammad M, Stalf T, Hoogendijk C, Mehnert C, Menkveld R, Schill W, Kruger TF. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproductive technology. RBM Online 2003;7:477-484. Henkel R, Hajimohammad M, Stalf T, Hoogendijk C, Mehnert C, Menkveld R, Gips H, Schill W, Kruger TF Influence of deoxyribonucleic acid damage on fertilization and pregnancy. Fertil Steril 2004;81:965-972. Høst E, Lindenberg S, Smidt-Jensen S. The role of DNA strand breaks in human spermatozoa used for IVF and ICSI. Acta Obstet Gynecol Scand 2000;79:559-563. Irvine DS, Twigg JP, Gordon EL, Fulton N, Milne PA, Aitken RJ. DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality. J Androl 2000;21:33-44. Larson KL, De Jonge CJ, Barnes AM, Jost LK, Evenson DP. Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques. Hum Reprod 2000;15:1717-1722. 2007 SPZ Lab A/S 11

Larson-Cook KL, Brannian JD, Hansen KA, Kasperson KM, Aamold ET, Evenson DP. Relationship between the outcomes of assisted reproductive techniques and sperm DNA fragmentation as measured by the sperm chromatin structure assay. Fertil Steril 2003;80:895-902. Payne JF, Raburn DJ, Couchman GM, Price TM, Jamison MG, Walmer DK. Redefining the relationship between sperm deoxyribonucleic acid fragmentation as measured by the sperm chromatin structure assay and outcomes of assisted reproductive techniques. Fertil Steril 2005;84:356-364. Sailer BL, Jost LK, Evenson DP. Mammalian sperm DNA susceptibility to in situ denaturation associated with the presence of DNA strand breaks as measured by the terminal deoxynucleotidyl transferase assay. J Androl 1995;16:80-87. Sakkas D, Mariethoz E, John JC. Abnormal sperm parameters in humans are indicative of an abortive apoptotic mechanism linked to the Fas-mediated pathway. Exp Cell Res. 1999;251:350-355. Saleh RA, Agarwal A, Nelson DR, Nada EA, El-Tonsy MH, Alvarez JG, Thomas AJ, Shama RK. Increased sperm nuclear DNA damage in normozoospermic infertile men:a prospective study. Fertil Steril 2002;78:313-318. Saleh RA, Agarwal A, Nada EA, El-Tonsy MH, Sharma RK, Meyer A, Nelson DR, Thomas AJ. Negative effects of increased sperm DNA damage in relation to seminal oxidative stress in men with idiopatic and male factor infertility. Fertil Steril 2003;79, suppl 3:1597-1605. Seli E, Gardner DK, Schoolcraft WB, Moffatt O, Sakkas D. Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in vitro fertilitzation. Fertil Steril 2004;82:378-383. Schlegel PN, Paduch DA. Yet another test of sperm chromatin structure. Fertil Steril 2005;84:854-859. Spano M, Bonde JP, Hjøllund HI, Kolstad HA, Cordelli E, Leter G. Sperm chromatin damage impairs human fertility. Fertil Steril 2000;73:43-50. Virro MR, Larson-Cook KL, Evenson DP. Sperm chromatin structure assay (SCSA ) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertil Steril 2004;81:1289-1295. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Fourth Edition. Cambridge University Press, Cambridge, (1999). United Kingdom. Wyrobek AJ, Eskenazi B, Young S, Arnheim N, Tiemann-Boege I, Jabs EW, Glaser RL, Pearson FS, Evenson D. Advancing age has differential effects on DNA 2007 SPZ Lab A/S 12

damage, chromatin integrity, gene mutations, and aneuploidies in sperm. Proc. Natl. Acad. Sci. 2006;103:9601-9606. 2007 SPZ Lab A/S 13