Analysevejledning P Adrenocorticotropt hormon; stofk. NPU Initialer Navn Dato. Udarbejdet af: VT Vivi Terslev Dec.

Transkript

1 Analysevejledning P Adrenocorticotropt hormon; stofk. NPU01785 Initialer Navn Dato Udarbejdet af: VT Vivi Terslev Dec Sidst revideret af: TP Torben Pedersen 18. okt Gennemlæst af: Gennemlæst af: Gennemlæst af: Godkendt af: Revisionsskema Udgave Ikrafttrædelsesdato: Kapitel og afsnit: okt ; 6.2; mar Ombrudt Distribution: (1) Vejledningsarkiv, (2) Analyseplads Side 1 af 15

2 INDHOLDSFORTEGNELSE INDHOLDSFORTEGNELSE FORMÅL OG BAGGRUND ANALYSE- OG MÅLEMETODE KEMIKALIER OG REAGENSER Reagenser Reagensfremstilling UDSTYR PRØVEMATERIALE KALIBRERING OG KVALITETSKONTROL Kalibrering Kvalitetskontrol - (Produktionskontrol/procesovervågning) Analysespecifikationer Måleområde FREMGANGSMÅDE Praktisk udførelse Aflæsning på RIA Counter Beregningsmetode RESULTATVURDERING SVARAFGIVELSE MANGELLISTER REFERENCEINTERVAL NØDPROCEDURE IKKE MEDTAGET DIVERSE IKKE MEDTAGET LITTERATUR ARBEJDSPLADSBRUGSANVISNINGER BILAG Bilag 1: Fremstilling af Kalibratorer til P Adrenocortropt hormon; stofk Bilag 2: Fremstilling af Kontroller til P Adrenocortropt hormon; stofk Bilag 3: Regneark til P ACTH analyse Side 2 af 15

3 1 FORMÅL OG BAGGRUND Adrenocorticotrope hormon (ACTH) er et peptidhormon af 39 aminosyrer (molekylevægt 4500) der dannes og lagres i adenohypofysen (koglekirtlen) som forstadiet proopiomelanokortin. Proopiomelanokortin spaltes af et enzym i hypofysegranula, hvorefter det biologisk aktive ACTH frigives til blodbanen. ACTH s primære funktion er at regulere sekretionen af cortisol fra binyrebarken. Herudover stimulerer ACTH lipolyse i fedtvæv, optagelse af glukose og aminosyrer i muskelvæv, samt fri sætning af insulin fra bugspytkirtlen og væksthormon fra adenohypofysen. Sekretionen af ACTH stimuleres af hormonet corticotropin releasing factor (CRF). Sekretionen varierer gennem døgnet, med maksimal sekretion om morgenen og minimal sekretion omkring midnat. Sekretionen af ACTH hæmmes ved negativ feed-back af cortisol og andre glucocortikoider. ACTH s halveringstid er på få minutter, men biologisk inaktive nedbrydningsprodukter kan cirkulere i blodet længere tid. Det syntetiske peptid Synacten, der ofte anvendes diagnostisk ved stimulationstesten synacten test svarer til aminosyrerne 1-24 i ACTH og medbestemmes ikke i aktuelle analyse. Abnorme værdier af ACTH ses ved: Lave værdier Cushing s sygdom, hvor en autonom cortisol produktion i binyrerne undertrykker ACTH produktionen. Primær hypofyseinsufficiens. Høje værdier Cushing s sygdom, hvor der er en øget produktion af ACTH fra hypofysen og en her af følgende øget cortisol produktion. ACTH værdier på op til 80 pmol/l kan ses. Addisons sygdom, hvor et primært binyrebarksvigt gør at ACTH er høj, idet den negative feed-back fra cortisol er ophævet. ACTH værdier over 90 pmol/l kan ses. Nelson s syndrom, hvor ACTH produceres af en hypofysetumor. Ektopisk ACTH produktion, hvor ACTH produceres i en tumor for eksempel i lungerne. Værdier over 70 pmol/l kan ses. 2 ANALYSE- OG MÅLEMETODE Koncentrationen af ACTH bestemmes ved et RadioImmuneAssay (RIA). Der benyttes 2 antistoffer og en fast fase. Den faste fase er en plastkugle (bead = kugle). Det ene antistof er monoklonalt og det andet er polyklonalt. Begge antistoffer har høj affinitet og specificitet til den aminosyre region på ACTH-molekylet de er rettet mod. Det monoklonale antistof er rettet mod ACTH-molekylets N-terminal. Det polyklonale antistof er rettet mod ACTH-molekylets C-terminal. Det monoklonale antistof er 125-I-mærket. Det polyklonale antistof er bundet til biotin. Plastkuglen er coated med avidin. Avidin har høj affinitet til biotin. Dette udnyttes til at koble det polyklonale antistof til plastkuglen. Når prøvematerialet kommer i kontakt med de to antistoffer dannes der et immunkomplex, hvor ACTH molekylet befinder sig som midterlaget i en sandwich. 125-I-AB - ACTH 1-39 AB-Biotin Side 3 af 15

4 Det dannede immunkomplex vil sætte sig på plastkuglen, idet biotinen på det polyklonale antistof vil reagere med avidin på plastkuglerne. Det overskydende radioaktive antistof bortvaskes. Det bundne radioaktivt mærkede antistof er direkte proportional med koncentrationen af det intakte ACTH i prøven, og måles på en gammatæller. Tælletallene omsættes til koncentrationsenheder ved hjælp af en kalibreringskurve. Ved denne metode bestemmes det intakte ACTH 1-39 molekyle, ACTH fragmenter medbestemmes ikke. 3 KEMIKALIER OG REAGENSER Reagenser skal ved anbrud og fremstilling mærkes med initialer og dato. 3.1 Reagenser ACTH Adrenocorticotropic Hormone Kit Nichols Institute Diagnostics, Cat No Reagent A: Avidin Coated Beads ( ) 130 stk. Avidin coated polystyrene beads, 8 mm diameter Reagent B: 125 I-ACTH Antibody Solution ( ) 4 x 3,3 ml 125 I-mærket monoklonal ACTH 1-17 antistof. Radioaktivitet < 240 kbq/flaske. Biotin bundet polyklonal ACTH antistof i hepes buffer med protein stabilisator. Tilsat natriumazid < 1g/l. Reagent C: ACTH Zero Standard ( ) 1 x 4 ml Frysetørret hesteserum med 1 % EDTA. Tilsat natriumazid < 1 g/l. Reagent D1: ACTH Standard ( ) OBS anvendes ikke Reagent D2 -H: ACTH Standards ( til 0627) 5 x 2 ml Frysetørret humant serum tilsat ACTH 1-39, 1 % EDTA og natriumazid < 1 g/l. Koncentrationsangivelse medfølger, se logbog Technical Data Sheet Reagent I: Wash Solution Concentrate ( ) 2 x 50 ml Phosphat buffer med saline. Tilsat natriumazid < 1 g/l. Side 4 af 15

5 Reagent J-K: ACTH Controls ( , 0629) 2 x 2 ml Humant ACTH 1-39 frysetørret i hesteserum samt indeholdende human serum, 1 % EDTA og natriumazid < 1 g/l. Koncentrationsinterval medfølger, se logbog Technical Data Sheet OPBEVARING: 4 ºC HOLDBARHED: se udløbsdato. Andre reagenser Kontrol BIORAD Lyphochek Immunoassay kontrol BIORAD niveau I, II, III. Indhold: Humant frysetørret serum, der er undersøgt for Hepatitis B (HBV). Hepatitis C (HCV), HIV-1, HIV-2, HTLV-I, HTLV-II. OPBEVARING: ved 4 ºC. HOLDBARHED: Se udløbsdato. Sterilt vand H:S apotek, vnr ml OPBEVARING: rumtemperatur HOLDBARHED: efter anbrud 1 uge HOLDBARHED: før anbrud se udløbsdato. 3.2 Reagensfremstilling Kalibratorbrugsopløsning Udfyld et Fremstillingsark ACTH Kalibratorer, se bilag 1 Til standard C tilsættes 4,00 ml sterilt vand. Til standard D2-H tilsættes 2,00 ml sterilt vand Henstand 5 min ved rumtemperatur. Omhyggelig blanding. Kalibratorerne dybfryses så hurtigt som muligt. OPBEVARING: - 20 ºC HOLDBARHED: se udløbsdato. Kontrolbrugsopløsning Udfyld et Fremstillingsark ACTH Kontroller, se bilag 2 Tilsæt 2,00 ml sterilt vand. Henstand 5 min ved rumtemperatur. Omhyggelig blanding. Kontrollerne dybfryses så hurtigt som muligt. OPBEVARING: - 20 ºC HOLDBARHED: se udløbsdato. Side 5 af 15

6 Vaskebrugsopløsning Wash Solution Concentrate 50 ml Destilleret vand ad 500 ml OPBEVARING: 4 ºC HOLDBARHED: se udløbsdato. 4 UDSTYR Polystyrenrør 12 x 75 mm Dekanteringsstativ Finnpipette 250 µl Eppendorf dispenser Combi tips 5-50 ml Parafilm AllegroTM Bead Dispenser Isbad Whirlimixer. RIA Counter PRØVEMATERIALE Der anvendes: Plasma fra rør med K 3 EDTA. Kølecentrifugeres efter standardmetode. Plasma afpipetteres straks i polystyrenrør 70 x 11 mm. Det optøede prøvemateriale opblandes og centrifugeres som ovenstående. OPBEVARING HOLDBARHED Før centrifugering rumtemperatur 30 min Efter centrifugering afpipetteret plasma - 20 ºC 2 måneder Side 6 af 15

7 6 KALIBRERING OG KVALITETSKONTROL 6.1 Kalibrering Kalibreringsmateriale, se punkt 3. Kalibrering udføres ved hver analysering. Se analyseopstilling punkt 7.1 Godkendelse af kalibreringskurve, se punkt Kvalitetskontrol - (Produktionskontrol/procesovervågning) Kontrolanalysering, se Analyseopstilling, pkt.7.1. Kontrolværdierne indføres på kontrolkort og Levey-Jennings plot. På kontrolkort og Levey-Jennings plot er kontrolintervallet angivet svarende til middelværdien ±3 SD. Ligger kontrollerne inden for ±2 SD, accepteres de og analyseresultaterne kan afgives. Falder en kontrol uden for middelværdien ±2 SD vurderes ved brug af nedenstående Westgard-kontrolregler om kontrolresultatet fører til godkendelse (evt. med advarsel) eller forkastelse af analyseresultaterne. 2 Kontrolniveauer 1 3s En kontrolprøve overskrider middelværdi ±3SD 2 2s a) 2 kontrolprøver med forskellige niveauer knyttet til samme analyseserie, overskrider til samme side enten middelværdi +2SD eller middelværdi 2SD b) 2 på hinanden følgende kontrolprøver med samme niveau (adskilt af én analyseserie) overskrider til samme side enten middelværdi +2SD eller middelværdi 2SD Tabel 1: Forkastelse for præcisionskontrol. Som advarselsregler ved afvikling af intern kvalitetskontrol anvendes som udgangspunkt reglerne i Tabel 2. Udløsning af disse advarsler medfører ikke umiddelbar forkastelse af analyseserien. Advarselsreglen og komponenten noteres i den til instrumentet hørende logbog. Afdelingsbioanalytikeren har ansvaret for, at det efterfølgende udredes, om årsagen skyldes, at den indlagte værdi for middelværdien ikke er helt korrekt - eller om udløsning af advarselsreglen skyldes et analyseskred. Side 7 af 15

8 2 kontrolniveauer 4 1s 4 på hinanden følgende kontrolprøver med samme eller evt. forskellige niveau(er) overskrider den samme grænse: middelværdi +1SD eller middelværdi 1SD 10x 10 på hinanden følgende kontrolprøver, med samme eller evt. forskellige niveau(er), ligger på samme side af middelværdien Tabel 2: Advarselsregler mod analysemæssigt skred ved præcisionskontrol. Deltagelse i ekstern kvalitetskontrol: UK NEQAS 6.3 Analysespecifikationer Præcision KB3011, se Metodeliste Detektionsgrænse Analytisk detektionsgrænse beregnet af producenten. Standard C (0 + 2SD) = 0,22 pmol/l Specificitet Ifølge Nichols er der ikke observeret krydsreaktivitet Interferens Der er ingen oplysninger i kit insert Korrekthed Er ikke undersøgt 6.4 Måleområde Total måleområde: pmol/l Standardmåleområde pmol/l Udvidet apparat: nej Manuel fortynding: ja (1 + 4) 7 FREMGANGSMÅDE 7.1 Praktisk udførelse Analysen strækker sig over 2 dage. Opsætning af analysen foregår på isbad, da det intakte ACTH(1-39) molekyle er meget ustabilt. Der udføres dobbeltbestemmelse. Analysen udføres i polystyrenrør 12 x 75 mm. Kalibratorer, kontroller og patientplasma optøes langsomt (bedst ved rumtemperatur), efter optøningen anbringes kalibratorer og kontroller straks på isbad. Patientprøverne kølecentrifugeres efter standardmetode, hvorefter de anbringes på isbad. Side 8 af 15

9 Analyseopstilling: Prøvemateriale Glas mærkning Standard C C Standard D2 D2 Standard E E Standard F F Standard G G Standard H H Kontrol Kit J-K Patientprøver 1-10 Kontrol J Patientprøver Kontrol K DAG Polystyrenrørerne mærkes efter analyseopstillingen sættes i dekanteringsstativ. Stativet anbringes på isbad µl prøvemateriale afpipetteres i bunden af de respektive rør, anvend Finnpipette. 1.3 Tilsæt 100 µl Reagent B, 125 I-ACTH Antibody Solution, anvend Eppendorf dispenser. 1.4 Der blandes på Whirlimixer coated kugle Reagent A tilsættes i hvert testrør, anvend AllegroTM Bead Dispenser 1.6 Ryst stativet, dæk rørerne med parafilm. 1.7 Inkubering i 22 timer ± 2 timer, ved rumtemperatur. DAG "Dekanteringslåget" monteres på dekanteringsstativet. 2.2 Kuglerne vaskes med 2,0 ml vaskereagens brugsopløsning. Tilsæt vaskereagenset langs testrørets side, således at kuglen løfter sig fra bunden. Undgå skumdannelse. 2.3 Hæld vaskereagenset fra. Lad kuglerne dryppe af på cellestof. 2.4 Punkterne 2.2 og 2.3 gentages. 2.5 Rørene med kuglerne er nu klar til tælling på gammatæller RIA Counter Aflæsning på RIA Counter 1200 RIACOUNTER TYPE 1200 er altid tændt. Tænd for IBM pc, skærm og printer. Indstil RIA COUNTER på 60 sekunder med PRESET TIME. Vælg isotop: 125 I Main menu: (1) RIACOUNTER TYPE 1200 (2) MANUAL DATA INPUT (3) CALIBRATION PROCEDURES (4) UTILITY FUNKTION Side 9 af 15

10 Kontrol tælling af bakker Vælg 3 CALIBRATION PROCEDURES Vælg 3 RAW COUNTS Resultater skal ikke printes ud. Tast N Følg teksten på skærmen. Noter ok på vedligeholdelsesskema hvis tælletal < 100 cpm. Hvis tælletal > 100 udskift tællerøret. Tælling af analyseserie Tiden: 60 sekunder Vælg isotop: 125 I Vælg RAW COUNTS Resultater skal printes ud. Tast Y 7.3 Beregningsmetode Kalibratorerne og kontrollernes massekoncentrationer er opgivet i pg/ml. Omregnes til stofkoncentrationer Massekoncentration i pg/ml x pmol/l 4500 pg / ml Prøver med mindre raw counts end Standard D2 beregnes efter formlen: cpm. prøve cpm. St. C Prøvekoncentration pmol/l = x St. D2 s koncentration. cpm. St. D2 cpm. St. C De øvrige resultater beregnes ved hjælp af kalibreringskurve. Dette foregår v.h.a. et elektronisk regneark. L:\Analyseskemaer\Gruppe 2\VT\ACTH. (se eks. bilag 3) Indtast standardernes koncentrationer samt tælletal i kolonne 2,3 og 4. Grafisk fremstilling af standardkurve nedenfor. Vurder og godkend standardkurven. Indtast Pt. ID i kolonne 2. Indtast kontroller og patient-prøve-tælletal i kolonne 3 og 4. Spredning på dobbeltbestemmelser < 10 %. Slet og ret aldrig noget i kolonnerne 5, 6 og 8. Udskriv regnearket og arkiver dette i analysemappe mrk ACTH. 8 RESULTATVURDERING Kalibreringskurven skal godkendes. Kontrollerne skal ligge inden for de fastlagte grænser. Analyseresultater > 100 pmol/l fortyndes 1 + 4: 100 µl prøvemateriale µl Standard C og reanalyseres. Analyseresultatet multipliceres med 5, eller fortyndingsfaktoren 5 indtastes i regnearket i kolonne 7 for den fortyndede prøve. Side 10 af 15

11 9 SVARAFGIVELSE Analyseresultaterne afgives uden decimaler. Analyseresultater < 1 pmol/l afgives som sådan. Analyseresultater > 500 pmol/l afgives som sådan. Alle analyseresultater indtastes i laboratoriets informationssystem via terminal. 10 MANGELLISTER Analysen udføres 1 gang ugentligt. Der udtages mangelliste til dags dato, uden startdato og tidspunkt Kvantitet Fra-dato: tid: Til-dato: tid: kl.? 11 REFERENCEINTERVAL P Adrenocorticotropt hormon; stofk. = 2 11 pmol/l 12 NØDPROCEDURE ikke medtaget 13 DIVERSE ikke medtaget 14 LITTERATUR Kit insert 15 ARBEJDSPLADSBRUGSANVISNINGER ikke medtaget 16 BILAG Bilag 1: Fremstilling af Kalibratorer til: P Adrenocortropt hormon; stofk. Bilag 2: Fremstilling af Kontroller til P Adrenocortropt hormon; stofk. Bilag 3: Regneark til P ACTH analyse Side 11 af 15

12 Bilag 1: Fremstilling af Kalibratorer til P Adrenocortropt hormon; stofk. Side 12 af 15

13 Bilag 2: Fremstilling af Kontroller til P Adrenocortropt hormon; stofk. Side 13 af 15

14 Bilag 3: Regneark til P ACTH analyse. Side 14 af 15

15 Side 15 af 15

16 Analyselogbog for P Adrenocorticotropt hormon; stofk. Prøvetagningsrør Dato Init. Prøvetagningsrør Bemærkninger 1984 Heparinrør Tilsat Trasylol Sep HGH Heparinrør Tilsat Trasylol 1989 VT EDTA-plasma Centrifugeres indenfor 1 time, opbevaring 20 ºC Marts 2004 VT/AO EDTA-plasma Centrifugeres indenfor 1 time, opbevaring 20 ºC Metode og reagens Dato Init. Metode Reagens Bemærkninger 1984 RIA KB HGH RIA KB HGH RIA KB VT RIA Nichols Institute Allegro Marts 2004 VT/AO RIA Nichols Institute Allegro

17 Analyselogbog for P Adrenocorticotropt hormon; stofk. Referenceinterval og enhed Dato Init. Referenceinterval Enhed Bemærkninger 1984 < 36 pmol/l 1985 HGH < 36 pmol/l 1986 HGH < 36 pmol/l 1989 VT 2 11 pmol/l fra kitfolder Marts 2004 VT/AO 2-11 pmol/l fra kitfolder

18 Analyselogbog for P Adrenocorticotropt hormon; stofk. Kalibrator Dato Init. Kalibrator Bemærkninger Dec pmol/l ACTH1-39 peninsula nr HGH pmol/l ACTH1-39 peninsula nr Sep HGH pmol/l ACTH1-39 peninsula nr Aug VT pg/ml Allegro HS-ACTH Marts 2004 VT/AO pg/ml Allegro HS-ACTH

19 Analyselogbog for P Adrenocorticotropt hormon; stofk. Revideret / gennemset Udgave/dato Init. Årsag til revision Dec.1985 HGH Analyseforskriften forbedret Sep HGH Ændringer i kalibreringen samt fremgangsmåden Aug VT Overført til Kit fra Allegro Nichols Institute 10/ Marts 2004 VT/AO Ifølge SOP003 11/ okt TP Diverse håndrettelser indskrevet